Protocol
Etik uttalande: Alla djurförsök utfördes i strikt överensstämmelse med god djur praxis som definieras i de riktlinjer som finns i Guide för användning och skötsel av försöksdjur: åttonde upplagan från Institutet för försöksdjurs Research (ILAR 2011) och var godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Michigan (PRO0001553).
1. Mouse kirurgiska ingrepp
OBS: Använd 8-10 veckor gamla C57BL / 6-möss. Andra åldrar, bakgrunder och stammar av möss kan även användas för att testa olika villkor eller arvsmassa. För tenotomy delen av förfarandet, upprätthålla sterila förhållanden genom att använda ansiktsmask, hår motorhuv och sterila klänning, handskar och instrument. Kirurgiska platser bör sterilt beredd med povidon-jod och steril drapering. Undvik hypotermi genom användning av en veterinärvärmedyna och värmning återupplivnings lösningar till 37 ° C före admining.
- Söva musen med 2,5% inhalerad isofluran. Använd en noskon att lämna dorsum och hind-lemmar lättillgänglig. Anpassa storleken på isofluran administrering att upprätthålla lämplig andningsfrekvens och färgning av slemhinnor och för att säkerställa anestesi genom att kontrollera muskeltonus, tå nypa, och hornhinnereflex. Applicera intetsägande oftalmologiska salva till musens ögon för att förhindra torra ögon skada under förfarandet. Upprätthåll adekvat kroppstemperatur med hjälp av en veterinär värmedyna eller varmvattencirkulationspumpen under det kirurgiska området.
- Administrera buprenorfin, 0,1 mg / kg, subkutant omedelbart före operationen för smärtlindring.
- Noga raka operationsområdet på den vänstra baktassen med användning hårklippnings från hälen till knäet.
- Noga raka dorsum av musen, som börjar över ryggraden och sträcker det rakade området till vänster om den dorsala mittlinjen, clearing ett område som är minst 2 cm X 3 cm för att rymma brännskador.
- Förbered operationsområdet, inklusive baktassen till knäet med hjälp av 3 alternerande povidonjod skrubb.
- Utför en längsgående snitt längs den mediala sidan av den vänstra hälsenan. Utöka snittet så hälsenan kan enkelt visualiseras; ca 0,5 cm.
- Gör en Achilles tenotomy med skarp dissektion av senan vid mittpunkten med skarpa vävnads sax. Sätt ett blad av vävnads sax i vävnaden plan under senan och dissekera längs planet tills kniven är på senan mittpunkt. Stäng skärbladen att skära av senan kraftigt.
OBS: Se till att inkludera alla bakre senor inklusive Gastrocnemius, Soleus och plantaris senor. - Uppnå hemostas genom att sätta press med steril gasbinda (det bör vara minimal blödning) och stäng huden snitt med en 5-0 vicryl stygn.
- Utför rygg partiell tjocklek bränna med ett aluminiumblock som väger 35 g med ungefärliga measurements 2 cm X 2 cm X 3 cm upphettades till 60 ° C i ett vattenbad applicerades till den rakade ryggen på musen för 17 sek.
OBS: Uppnå lämplig bränningsdjupet genom att vila blocket ovanpå den sövda musen, vilket säkerställer att hela ytarean hos blocket är i kontakt med musen, dock undvika att tillämpa någon ytterligare tryck till blocket, dvs tillåta tyngdkraften att vara den enda kraft som håller blocket på plats. En tunn plasthandtag fäst vid en sida av blocket är praktiskt för manipulering, stabilisering, och hämtning från det varma vattenbadet. Detta kommer att skapa en total kroppsyta ca 30% brinna i en 8-10 veckor gamla C57BL / 6-mus. Denna kontakt bränna valdes framför andra metoder (låga eller skålla bränna) på grund av likformigheten bränna djup över såret och reproducerbarhet mellan djur. - Torka bränna plats med gasväv och applicera en Tegaderm dressing.
- Administrera värmas återupplivningsvätskor: Ringer-laktat lösning 1 mlintraperitoneal injektion och 0,5 ml subkutan injektion. Denna engångs administrering av återupplivning är tillräcklig för återhämtning från brännskador och tenotomy.
OBS: Skicka inte tillbaka sövda möss till bostads burar med andra möss, hus individuellt i rena burar enligt övervakning tills möss återhämtat sig helt. Typisk återhämtning sker inom 1-6 timmar. Burn platser läker vanligen inom 2-4 veckor och är sällan kompliceras av sårinfektion om de förvaras i rena boendemiljöer. - Administrera Buprenorfin 0,1 mg / kg subkutan injektion varje 12 h under 3 dagar efter proceduren. Övervaka HO tillväxt med serie μCT skanningar med lämpliga intervall. Ektopisk bentillväxt är första uppenbart ca 3 veckor efter op av μCT.
OBS: De flesta av HO utveckling är fullständig genom nio veckor post-op. Vi har inte sett en skillnad i HO volym eller plats med upprepad μCT skannar varannan vecka i 15 veckor, jämfört med en enda slutpunkt μCT skanna på 15 veckor.Vid slutet av experimenten, euthanize alla möss med CO 2 inandning enligt institutionens riktlinjer och kontrollera döden med halsdislokation efter 10 minuter.
2. μCT Förvärv och analys
- Säkra sövda musen på skannern i liggande ställning. Tejpa bakbenen säkert till sängen för att förhindra andningsrörelseartefakt. Inkludera luft, vatten och hydroxyapatit innehåller fantom under musen för bildkalibrering.
- Öppna Bone Analysis och definiera ett område av intresse (ROI) som omfattar både bakbenen från höftleden proximalt till spetsen på baktassen distalt. Skaffa en bild med hjälp av följande parametrar:. 80 kV, 500 iA och 1300 ms exponering, 48 um voxelstorlek 14,15
- Kalibrera bilden Hounsfield-enheter (HU) genom att dra en ROI i vart och ett av de tre fantomkamrarna och inmatning av medeldensitet i lämpliga fält iprogramvaran.
- Använda "grabber" verktyg i programvaran, åter orientera bilden så skenbenet i vänster bakben är parallellt längs Z-axeln för att tillåta den tydligaste anatomiska vy för avgränsningen av orthotopic kortikala benstrukturer och HO.
- Med början vid knäet, bläddra distalt genom bild skivor fram HO påträffas. Använda den manuella spline verktyg, göra en ROI kring ektopisk ben på var 5: e skiva fortsätter distalt genom tassen eller tills HO har överträffats. Använd SLUTA SIG TILL verktyg för att utvidga och sy ROI samman till en ROI som innehåller alla HO.
- Gör en 3D ROI och välj analysmenyn. Beräkna benvolymen genom att ställa in undre och övre tröskelvärden som bäst visar fönstret ben. Använd samma fasta tröskelvärden för alla skanningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den nu aktuella studien, är det protokoll som beskrivits för den tidigare publicerade modellen av trauma mus / bränna inducerad HO. 14-17 Detta innebär skapandet av samtidig lokal muskuloskeletal skada med en Achilles tenotomy och global inflammatorisk förolämpning med en partiell tjocklek brännskador. Detta resulterar i en tillförlitlig bildning av reaktiva ben vid tenotomy ställe som kan följas med seriell avbildning. Hittills har alla möss (mer än 50) som har lidit både Achilles tenotomy och brännskador utvecklat en mätbar mängd av HO på tenotomy platsen. För att kvantifiera bildningen av ektopisk ben, är en kalibrerad bild μCT protokoll som används vid varje önskad tidspunkt. Tillsatsen av en brännskada i kombination med Achilles tenotomy har visat sig vara nyckeln i induktion av betydande HO. Med både skador händer samtidigt finns det en betydande ökning av mängden av ektopisk ben som bildas vid tenotomy plats jämfört med AcHilles tenotomy ensam (Figur 1). 17
Figur 1. HO utveckling efter Achilles tenotomy med eller utan samtidig brännskador. Samtliga möss mottog en Achilles tenotomy av vänster bakben, hälften av mössen fick också en 30% TBSA partiell tjocklek brännskada på dorsum. μCT avsökningar genomfördes vid 5 dagar och 3, 5, 7, 9, och 15 veckor efter skada. (A). Representativa 3D rekonstruktioner visas med orthotopic ben vitt och HO blåfärgad. Röda cirklar indikerar niduses av HO. Ektopisk ben utvecklas i det område av tenotomy samt platser distala och proximala till skadestället i den nedre extremiteten. I likhet med HO sett clnically, kan denna reaktiva ben vara sammanhängande med skelettet eller utveckla fjärr i mjukvävnad. (B). Kvantifiering av HO var comförda med en kalibrerad bild protokoll och visas i diagrammet. HO har pågått längre än 15 veckor, dock utvecklings platåer mellan 9-15 veckor med störst tillväxthastigheten typiskt sett mellan 5-9 veckor. Data är medelvärden +/- standardavvikelse, n = 4 per grupp, Students t-test, * P <0,05 (Observera att detta tidigare har publicerat uppgifter, ändrade från 17). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | 664 | 8-10 weeks old |
| Isoflurane – Fluriso | VET one, Boise, ID | V1 501017 | |
| Buprenorphine – Buprenex | Reckitt Benckiser Healthcare | NDC 12496-0757-1 | 0.3 mg/ml solution |
| Betadine | Owens and Minor, Mechanicsville, VA | 2047PVP202 | |
| 5-0 Vicryl sutures | Ethicon, Summerville, NJ | J493 | |
| Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm | 3M | 1624W | Cut in half to properly cover burn site |
| µCT - GE eXplore Locus SP | GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada | ||
| Microview 2.2 Advanced Bone Analysis Application | GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada |
References
- Leblanc, E., et al. BMP-9-induced muscle heterotopic ossification requires changes to the skeletal muscle microenvironment. J Bone Miner Res. 26 (6), 1166-1177 (2011).
- Shore, E. M. Osteoinductive signals and heterotopic ossification. J Bone Miner Res. 26 (6), 1163-1165 (2011).
- Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. J Bone Miner Res. 27 (5), 1004-1017 (2012).
- Potter, B. K., et al. Heterotopic ossification following combat-related trauma. J Bone Joint Surg Am. 92, Suppl 2. 74-89 (2010).
- Van den Bossche, L., Vanderstraeten, G. Heterotopic ossification: a review. J Rehabil Med. 37 (3), 129-136 (2005).
- Chakkalakal, S. A., et al. An Acvr1 R206H knock-in mouse has fibrodysplasia ossificans progressiva. J Bone Miner Res. 27 (8), 1746-1756 (2012).
- Yu, P. B., et al. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic [corrected] ossification. Nat Med. 14 (12), 1363-1369 (2008).
- Culbert, A. L., et al. Alk2 regulates early chondrogenic fate in fibrodysplasia ossificans progressiva heterotopic endochondral ossification. Stem Cells. 32 (5), 1289-1300 (2014).
- Dinther, M., et al. ALK2 R206H mutation linked to fibrodysplasia ossificans progressiva confers constitutive activity to the BMP type I receptor and sensitizes mesenchymal cells to BMP-induced osteoblast differentiation and bone formation. J Bone Miner Res. 25 (6), 1208-1215 (1359).
- Peterson, J. R., et al. Burn injury enhances bone formation in heterotopic ossification model. Ann Surg. 259 (5), 993-998 (2014).
- Scott, M. A., et al. Brief review of models of ectopic bone formation. Stem Cells Dev. 21 (5), 655-667 (2012).
- Tannous, O., Griffith, C., O'Toole, R. V., Pellegrini, V. D. Heterotopic ossification after extremity blast amputation in a Sprague-Dawley rat animal model. J Orthop Trauma. 25 (8), 506-510 (2011).
- Tannous, O., et al. Heterotopic bone formation about the hip undergoes endochondral ossification: a rabbit model. Clin Orthop Relat Res. 471 (5), 1584-1592 (2013).
- Peterson, J. R., et al. Treatment of heterotopic ossification through remote ATP hydrolysis. Sci Transl Med. 6 (255), 255ra132 (2014).
- Peterson, J. R., et al. Early detection of burn induced heterotopic ossification using transcutaneous Raman spectroscopy. Bone. 54 (1), 28-34 (2013).
- Perosky, J. E., et al. Early detection of heterotopic ossification using near-infrared optical imaging reveals dynamic turnover and progression of mineralization following Achilles tenotomy and burn injury. J Orthop Res. 32 (11), 1416-1423 (2014).
- Peterson, J. R., et al. Effects of Aging on Osteogenic Response and Heterotopic Ossification Following Burn Injury in Mice. Stem Cells Dev. , (2014).
- Alfieri, K. A., Forsberg, J. A., Potter, B. K. Blast injuries and heterotopic ossification. Bone and Joint Research. 1 (8), 174-179 (2012).
- Hunt, J. L., Arnoldo, B. D., Kowalske, K., Helm, P., Purdue, G. F. Heterotopic ossification revisited: a 21-year surgical experience. J Burn Care Res. 27 (4), 535-540 (2006).
- Ring, D., Jupiter, J. B. Operative release of ankylosis of the elbow due to heterotopic ossification. Surgical technique. J Bone Joint Surg Am. 86-A, Suppl 1. 2-10 (2004).
- Crane, N. J., Polfer, E., Elster, E. A., Potter, B. K., Forsberg, J. A. Raman spectroscopic analysis of combat-related heterotopic ossification. Bone. 57 (2), 335-342 (2013).
