Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

فحص المواد الغذائية للفئة 1 Integrons وجين كاسيتات

Published: June 19, 2015 doi: 10.3791/52889
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Macquarie University

Introduction

كان اكتشاف المضادات الحيوية واحدة من أعظم الإنجازات العلمية في القرن التاسع 20. ومع ذلك، فقد أدى استخدام وإساءة استخدام المضادات الحيوية لتطور السريع للبكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية، وهذه تشكل الآن تهديدا خطيرا للصحة العامة في القرن الحادي و21. صعود سلالات بكتيرية مقاومة لمعظم خيارات العلاج يزيد من احتمال أننا ندخل عصر حيث العقاقير المضادة للميكروبات لم تعد فعالة 1،2.

الآلية الوراثية التي تمنح المقاومة للمضادات الحيوية هو نظام القديم، سبقت البشر والضغوط اختيار المضادات الحيوية من قبل الملايين من 3 سنوات. العناصر الجينية المحمولة، مثل البلازميدات والترانسبوزونات والجزر الجينومية والعناصر وintegrons اقترانية التكاملية يمكن نشر الجينات المقاومة للمضادات الحيوية (ARG) داخل وبين الأنواع البكتيرية 4 على حد سواء. من هذه، وقد لعبت integrons دورا مركزيا في انتشار ARG، على الرغم منحقيقة أنها تعتمد على البلازميدات والترانسبوزونات للتعبئة والإدراج في الجينوم البكتيري 5. Integrons التقاط أشرطة الجينات باستخدام integron-integrase، ومن ثم التعبير عن أشرطة باستخدام integron المشفرة المروج 6،7 (الشكل 1). Integron الجينات أشرطة عناصر المحمولة الصغيرة التي تتكون من واحد إطارات القراءة المفتوحة (ORF) الذي المنتجات يمكن أن تضفي مقاومة للمضادات الحيوية أو المطهرات 8. الفئة 1 integrons هي integrons تعافى الأكثر شيوعا من العزلات السريرية 5، حيث اكتسبت مجتمعة أكثر من 130 مختلفة أشرطة المقاومة للمضادات الحيوية الجينات 9.

انتشار الطبقة 1 integrons إلى المتعايشة والمسببة للأمراض البكتيريا المرتبطة الإنسان يولد تيارات النفايات البشرية التي تحتوي على أعداد كبيرة من هذه العناصر الجينية 10. يتم الافراج يقدر ب 10 19 البكتيريا التي تحتوي على الطبقة 1 integrons عن طريق مياه الصرف الصحي الحمأة كل ط العامن المملكة المتحدة (11). ولذلك ليس من المستغرب أن الطبقة 1 integrons يمنح المقاومة للمضادات الحيوية يجري حاليا الكشف عن الجراثيم في الطيور البرية والأسماك، وغيرها من 12-14 الحياة البرية الوطنية. الإفراج عن integrons مرة أخرى إلى البيئة يشكل خطرا كبيرا على الصحة العامة، منذ اقتناء أشرطة الجينات الجديدة وإعادة ترتيب معقدة مع عناصر المحمولة الأخرى مازالت تحدث، وخاصة في محطات معالجة مياه الصرف الصحي وغيرها من المسطحات المائية 15-18. البيئة الطبيعية ثم يصبح أرضا خصبة لتجنيد محددات مقاومة جديدة ومسببات الأمراض الانتهازية 19،20. يمكن للبكتيريا التي تحتوي على integron جديدة وسائط جديدة دائرة حول العودة الى المجتمع البشري من خلال المياه والأغذية الملوثة 21،22. مراقبة وسائط البيئية هي استراتيجية رئيسية لفهم وإدارة المقاومة للمضادات الحيوية في 23 في المستقبل. على وجه الخصوص، ينبغي إيلاء الانتباه إلى المواد الغذائية التي تؤكل نيئة أوالمطبوخة قليلا، لأن هذه تمثل أكبر تهديد لنقل عناصر متنقلة جديدة ومسببات الأمراض.

في هذا البروتوكول، واتباع نهج مبسط للكشف عن، تحديد وتوصيف الدرجة 1 integrons وأشرطة الجينات المرتبطة بها في المواد الغذائية وترد (الشكل 2). باستخدام مزيج من زراعة والبلمرة المتسلسل (PCR)، integrons يمكن الكشف عنها بسرعة في المجتمعات البكتيرية معقدة والعزلات الفردية. وترد أساليب لتحديد الأنواع من البكتيريا والتشكل والهوية من أشرطة الجينات المرتبطة integron. هذه الطريقة مناسبة لمجموعة واسعة من الأطعمة النباتية والحيوانية، ويتم إعطاء أمثلة على سير العمل النموذجية لكل من أنواع الطعام هذه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

المواد الغذائية التي تؤكل نيئة أو مطبوخة طفيفة هي الأكثر إثارة للقلق بالنسبة لصحة الإنسان. ومن الأمثلة سلطة الخضار والفواكه، والمحار والقشريات.

مجموعة 1. عينة

  1. جمع العينات تحت الظروف التي تقلل من التلوث، وتخزينها في منفصلة، ​​أكياس نظيفة أثناء النقل. مرة واحدة تم جمعها، يجب أن يتم تخزين العينات في 4 درجات مئوية، ومعالجتها في غضون 24 ساعة.

2. المخصب تحضير الثقافة

  1. فواكه وخضراوات:
    1. وضع حوالي 10 غرام من المواد في كيس من البلاستيك دائم. إذا تجهيز المواد بشكل اكبر، والتركيز على الجلد من الفاكهة أو الخضروات. إضافة 90 مل 0.1 M العازلة فوسفات الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.0 وعملية في خلاط المجذاف لمدة 30 ثانية. بدلا من ذلك، والمواد يمكن تحريكها يدويا إذا خلاط مضرب غير متوفر.
    2. جمع السائل الى قسمين 50 مل أنابيب الصقر. أنابيب الطرد المركزي في 4000 x ج لمدة 7 دقائق للبكتيريا بيليه. I>
    3. إزالة بعناية طاف ووقف البكتيريا مكعبات في 30 مل من معقم لوريا Bertani (LB) مرق.
    4. احتضان على شاكر O / N، وعقد أنبوب واحد عند 25 درجة مئوية والآخر في 37 ° C. يجب أن تهتز الثقافات في 200 التذبذبات في الدقيقة (OPM). متجر الثقافات في 4 درجات مئوية حتى المطلوبة.
  2. المأكولات البحرية:
    1. تشريح خارج المعدة (المحار) أو الجهاز الهضمي (القريدس) باستخدام ملقط معقم وملاقط ومكان في أنبوب معقم 1.5 مل تحتوي على 200 ميكرولتر من 0.1 M الصوديوم العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.0. أضعف العينة لإنشاء جناسة.
    2. الاستغناء عن 5 مل من مرق LB إلى قسمين معقمة 5 مل أنابيب، وتطعيم كل مع جناسة المأكولات البحرية.
    3. احتضان على شاكر O / N، وعقد أنبوب واحد عند 25 درجة مئوية والآخر 37 ° C. يجب أن تهتز الثقافات في 200 OPM. متجر الثقافات في 4 درجات مئوية حتى المطلوبة.

3. الثقافات للكشف عن Integrons

= "jove_content"> ملاحظة: يتم استخدام البروتوكولات PCR القياسية من خلال هذه المنهجية، وذلك باستخدام مخازن المتوفرة مع الإنزيم، والأخير تركيز MgCl 2 2.5 مم. إذا لزم الأمر، لورنز (2011) 24 وقد حددت PCR الأمثل واستكشاف الأخطاء وإصلاحها الأساليب في قضية سابقة من هذه المجلة.

  1. المغلي إعداد DNA:
    1. الاستغناء عن 100 ميكرولتر من ثقافة غنية في العقيمة 0.5 مل PCR أنبوب. تسخين العينة إلى 99 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، وذلك باستخدام حمام مائي أو كتلة الحرارة. المفاجئة البرد على الجليد لمدة 2 دقيقة.
    2. microcentrifuge في 14000 x ج لمدة 5 دقائق لتكوير الحطام الخلية. العودة إلى جليد. عينات من الحمض النووي يمكن تجميد في -20 درجة مئوية حتى المطلوبة، ولكن يجب إذابة على الجليد.
  2. الكشف عن فئة 1 integrons باستخدام PCR:
    ملاحظة: يتم فحص الثقافات المختلطة من O / N الحضانة لفئة 1 integrons باستخدام بروتوكول HS463a / HS464 PCR (الجدول 1).
    1. ذوبان الجليد جميع الكواشف PCR على الجليد، بعيدا عن أي سو المحتملين rces تلوث DNA. يشكلون 48 ميكرولتر PCR mastermix لكل عينة، بما في ذلك الضوابط السلبية (الجدول 2). الاستغناء عن 48 ميكرولتر من PCR مزيج الرئيسي لكل أنبوب، وذلك باستخدام نصائح الحاجز.
    2. إضافة 2 ميكرولتر من الحمض النووي لإذابة أنابيب PCR الفردية باستخدام نصائح الحاجز. تشغيل البرنامج المناسب في thermocycler PCR.
    3. لتقييم نتائج التضخيم، electrophorese 7 ميكرولتر من الناتج PCR على 2٪ هلام الاغاروز سكب وتشغيلها في TBE العازلة (90 ملي تريس بورات، 2 مم EDTA). تتضمن علامة الوزن الجزيئي، مثل سلم 100 سنة مضت.
    4. آخر صمة عار الجل مع وصمة عار DNA، وتصور باستخدام الأشعة فوق البنفسجية نقل transilluminator. تأكد من أن لم يكن هناك تضخيم في السيطرة السلبية. فرقة قوية في حوالي 470 سنة مضت لأي عينة معينة تشير إلى أن ثقافة مختلطة تحتوي على البكتيريا التي تحمل فئة 1 integron. سيتم الآن عزل مستعمرات نقية من أي ثقافة المختلطة التي عاد PCR إيجابي.

> 4. فحص واحدة المستعمرات للفئة 1 Integrons

  1. التخفيفات المسلسل وانتشار لوحات:
    ملاحظة: لعزل المستعمرات واحد من الثقافات المختلطة PCR إيجابية، وتضعف ثقافة مختلطة متسلسل 10 أضعاف في المخزن فوسفات الصوديوم، ثم بالذهب لاستعادة المستعمرات واحد.
    1. إضافة 1 مل من ثقافة مختلطة إلى 9 مل من العازلة الفوسفات 0.1 M الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.0 و تخلط بواسطة قلب. إضافة 1 مل من التخفيف إلى 9 مل مزيد من العازلة الفوسفات، وتكرار حتى التخفيف المتسلسل من 10 -8 يتم التوصل إليه.
    2. انتشار 100 ميكرولتر من 10 إلى 10 -4 -8 التخفيفات على LB أجار، في نسختين. احتضان لوحات O / N في نفس درجة الحرارة المستخدمة في ثقافة مختلطة الأولية. ويمكن بعد ذلك أن يتم تخزين لوحات في 4 درجات مئوية حتى المطلوبة، ومع ذلك فمن الأفضل لمعالجة المستعمرات واحد على وجه السرعة إلى حد ما.
  2. اختيار مستعمرة واحدة وإعداد DNA المغلي:
    1. اختيار المستعمرات واحد من لوحات تخفيف المسلسل، وحد ذاتهاlecting العديد من أنواع مختلفة مستعمرة وقت ممكن، وذلك باستخدام معايير مثل حجم مستعمرة والشكل واللون. استخدام المسواك العقيمة لتحديد المستعمرات واحد من لوحة انتشار.
    2. لمس مسواك إلى المستعمرة، ثم نقل في أنبوب PCR تحتوي على 100 ميكرولتر من الماء المعقم. إذا أعداد كبيرة من المستعمرات ليتم عرضه، ثم مستعمرات يمكن تحضير صينية عيار مكروي. تدور مسواك بين الأصابع لطرد بعض الخلايا في الماء.
    3. باستخدام نفس مسواك، تطعيم لوحة LB مع مسحة من المستعمرة. ويمكن تخزين عدد كبير من المستعمرات على لوحات وصفت إذا كان كل خط حوالي 1 سم. كرر الخطوات من 1-3 حتى يتم اختيار عدد مناسب من العزلات.
    4. احتضان LB وحات O / N، في نفس درجة الحرارة التي استخدمت للثقافة غنية الأولية. ومن ثم يمكن تخزينها الثقافات في 4 درجات مئوية حتى المطلوبة.
    5. لإعداد DNA من تعليق البكتيرية، اتبع الخطوات كما أووtlined في القسم 3.1. لفحص لست] ثقافة نقية، أداء HS463a / HS464 PCR على النحو المبين في الفقرة 3.2. يعزل التي ترجع سيتم استخدام PCR إيجابية لإعداد الحمض النووي الجيني (القسم 5)، وللمزيد من التحليلات.

5. المستعمرات واحد الجينوم استخراج الحمض النووي من Integron إيجابية عن طريق الخرزة الضرب 25

  1. تطعيم 5 مل من مرق LB مع عينة من ثقافة نقية معزولة في القسم 4.2. احتضان O / N، والهز في نفس درجة الحرارة التي تم استخدامها للثقافة غنية الأولية.
  2. خلايا بيليه في 4000 x ج لمدة 7 دقائق، ثم إزالة طاف. resuspend الخلايا مكعبات في 1 مل من محلول CLS-TC في الناشر مصفوفة E أنبوب الإعدادية سريع. باستخدام آلة حبة الضرب ومعالجة العينة عند 5.5 متر / ثانية لمدة 30 ثانية.
  3. أنبوب الطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 5 دقائق واسترداد 700 ميكرولتر من طاف في أنبوب معقم 1.5 مل.
  4. إضافة 700 ميكرولتر من المصفوفة ملزمة المخفف 1: 5 مع 6 M قوانidinium ثيوسيانات وتخلط في RT لمدة 5 دقائق. الطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 1 دقيقة، طاف تجاهل.
  5. إضافة 800 ميكرولتر غسل الإيثانول الملح (70٪ من الإيثانول، 0.1 M خلات الصوديوم) ودوامة حتى يتم معلق بيليه بالكامل. يغسل لمدة 5 دقائق على RT، الطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 1 دقيقة وتجاهل طاف. ضمان تمت إزالة جميع طاف، باستخدام micropipette إذا لزم الأمر، ثم السماح للهواء الجاف لمدة 5 دقائق.
  6. Resuspend ومصفوفة بيليه في 200 ميكرولتر TE (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 1MM EDTA، ودرجة الحموضة 7.6) من قبل pipetting صعودا وهبوطا. في احتضان RT لمدة 3 دقائق. الطرد المركزي في 14000 x ج لمدة 3 دقائق ونقل 160 ميكرولتر من الحمض النووي مزال في أنبوب العقيمة. تشغيل قسامة من استخراج الحمض النووي الجيني على 2٪ ث / ت الاغاروز هلام للتحقق من المحصول وسلامة استخراج الحمض النووي. يتم تخزين الحمض النووي الجيني النقي عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، وديفروستيد على الجليد عند الحاجة لاختبار PCR.

6. إتمام المشروعات التشخيص وتسلسل الحمض النووي

ملاحظة:وسيتم استخدام الحمض النووي الجيني أعدت في القسم 5 لجميع تقارير إنجاز المشروعات التشخيص، والتأكد من ثبوت تعاطيه للفئة 1 integrons.

  1. ذوبان الجليد الحمض النووي الجيني على الجليد، دوامة لفترة وجيزة على عينة من الحمض النووي والنبض تدور في 14000 x ج لمدة 20 ثانية. تكرار PCR ل-integron integrase الجينات الدرجة 1 باستخدام HS463a / HS464 (الجدول 1)، مؤكدا أن عزل إيجابية لamplicon 471 سنة مضت (القسم 3.2).
  2. ويتحقق التعرف على الثقافات الإيجابية إلى مستوى الأنواع من خلال تحليل الصغيرة الجينات الوحيدات الريباسي (16S rDNA). تضخيم الجينات 16S باستخدام بادئات F27 / r1492 (الجدول 1). التحقق من المنتجات PCR باستخدام الكهربائي. يجب على جميع الأهداف البكتيرية تولد 16S amplicon حوالي 1450 سنة مضت.
  3. تسلسل الجينات 16S الريباسي amplicon لتحديد هوية الأنواع، ولكن لأن هناك من المحتمل أن تكون تقارير إنجاز المشروعات إيجابية متعددة من الخطوة 6.2، وكثير من هذه ايجابيات سيكون نفس الأنواع البكتيرية، ونحن سوف نميز أولا الأنواع المختلفة النقيبز تقييد هضم المنتج 16S PCR.
    1. هضم قسامة من PCR 16S مع انزيم التقييد Hinf 1. أي الانزيم الذي يعترف وانشقاق المواقع 4 بي بي القيام به، ولكن Hinf 1 يولد تنوع جيد من الأهداف 16S، وغير موثوقة وغير مكلفة الانزيم.
  4. اقامة تقييد 30 ميكرولتر الهضم mastermix (الجدول 2) في أنبوب معقم وإضافة 20 ميكرولتر من-purfied الامم المتحدة 16S PCR المنتج. احتضان في 37 ° C حمام الماء O / N. تحقق الخلاصة على هلام الاغاروز 2٪.
  5. تسجيل أنماط الهضم التي تنتجها Hinf 1. يعزل بنفس 16S الشخصي تقييد من المحتمل أن يكون من نفس النوع. بدلا من التسلسل كل 16S PCR المنتج، وتسلسل في معظم ثلاثة ممثلين من كل نمط تقييد Hinf 1.
  6. تنقية المنتجات 16S PCR باستخدام طقم التجارية. وحيد عدة نوكلياز خارجية تقطعت بهم السبل يمكن استخدامها، ولكن عمود تستند أو أساليب هطول الأمطار أيضا تعمل بشكل جيد لإزالة unincالاشعال orporated والسلطات الوطنية المعينة الذين تقطعت بهم السبل واحدة. تسلسل amplicons 16S باستخدام R910 التمهيدي (الجدول 1)، ووضع ردود الفعل على النحو المحدد من قبل مرفق التسلسل.
  7. استخدام تسلسل الحمض النووي مما أدى لاستجواب قاعدة بيانات الحمض النووي NCBI مع وظيفة blastn ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ). تؤخذ عادة أكبر من 97٪ هوية النوكليوتيدات كما هوية الأنواع.

7. تعيين وتوصيف Integrons وكاسيت صالحة

ملاحظة: الفئة 1 integrons المنبثقة من النظم الإيكولوجية التي يهيمن عليها الإنسان من المحتمل أن يكون integrons الأكثر شيوعا في كل ما تبذلونه من العينات. هذه integrons كل لها أصل واحد مؤخرا، وبالتالي لديها تسلسل الحمض النووي الحفظ جدا 5.

  1. التفريق بين فئة 1 integrons النابعة من مصادر بشرية وتلك التي تحدث بشكل طبيعي في العينات البيئية عن طريق إجراءPCR مع التمهيدي تعيين intI1F165 / intI1R476 10 (الجدول 1).
    ملاحظة: الفئة 1 integrons من البكتيريا المتعايشة السريرية أو توليد منتج BP ~ 300، في حين أن الطبقة البيئية 1 integrons لا تولد أي منتج.
  2. تميز integrons السريرية عن طريق تضخيم مجموعة كاسيت مع مجموعة التمهيدي HS458 / HS459. وهذا PCR تضخيم المنطقة بين intI1 وقطاع الحفظ 3 'في محطة معظم صفائف الكاسيت. لأن عدد وهوية أشرطة متغير، فإن حجم المنتج PCR تختلف أيضا.
  3. تنقية amplicons وتسلسل الحمض النووي باستخدام كل من الاشعال التضخيم. استخدام تسلسل الحمض النووي لاستجواب قواعد البيانات باستخدام وظيفة blastn ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ).
  4. ضمان تسمية من أشرطة اتبع تسمية موحدة 9، لأن العديد من ترسبات بيانات كاسيت integron الجيناتالصورة استخدام أسماء غير متناسقة أو غامضة. إيلاء اهتمام خاص لأشرطة جينة جديدة، لأن هذه قد ترميز الظواهر الجديدة، بما في ذلك الجينات التي تمنح زيادة على الانتقال، المرضية أو الفوعة 8،21.
    ملاحظة: قبل السريرية أشكال integron الدرجة 1 لا يزال يعمم في البيئات الطبيعية. على وجه الخصوص، تلك التي ترتبط النشطة تينيسي 402 الترانسبوزونات هي الأكثر أهمية 26. سوف صفائف كاسيت هذه integrons لا تضخيم مع مجموعة التمهيدي HS458 / HS459، ولكن يمكن أن تتضخم مع التمهيدي مجموعة MRG284 / MRG285 (الجدول 1)، وتوليد amplicons من حجم متغير يعتمد على محتوى الكاسيت. يجب تنقية المنتجات PCR وتسلسل الحمض النووي كما هو موضح في 7.2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

فحص الثقافات المختلطة والعزلات البكتيرية للintI1

مجموعة التمهيدي HS463a / HS464 PCR يمكن استخدامها للكشف عن وجود للintegron integrase الجينات الدرجة 1، intI1 (الشكل 1). هذه المجموعة التمهيدي يعمل بشكل جيد للكشف عن intI1 في الثقافات المختلطة، ويستخدم أيضا لفحص المستعمرات البكتيرية التي تحصد من انتشار لوحات (الشكل 2). يجب أن العزلات الإيجابية تولد فرقة قوية واحدة في 471 سنة مضت باستخدام هذه المجموعة التمهيدي (الشكل 3A). فإن الغالبية العظمى من العزلات إيجابية تحمل intI1 التي نشأت من البشر أو الحيوانات الزراعية والمحلية. وهذه العزلات يكون أيضا إيجابية في PCR باستخدام بادئات F165 / R476، والتي ينبغي أن تولد amplicon 311 سنة مضت (الشكل 1). المصادر البيئية من intI1 عموما لن تكون إيجابية في هذا الاختبار الثاني.

توصيف صفائف كاسيت integron

يستخدم معشوقة = "jove_content"> الحمض النووي الجيني من العزلات النقية لتوصيف صفائف integron الكاسيت. صفائف كاسيت من تينيسي 402 فئة -associated 1 integrons يمكن تضخيم باستخدام بادئات HS458 / HS459. هذه الاشعال تستهدف التوالي الموقع إعادة التركيب integron، ونهاية 3 'من مجموعة الكاسيت، والتي تنتهي عادة في qacEΔ sul1 الانصهار الجين (الشكل 1). حجم المنتجات PCR ولدت في هذا الاختبار يختلف وفقا لعدد وهوية الأشرطة في مجموعة (الشكل 3B). في كثير من الأحيان جزءا لا يتجزأ من الطبقة البيئية 1 integrons في الكروموسومات البكتيرية، والمصفوفات الكاسيت الخاصة بهم يمكن تضخيمها من قبل الاشعال التي تستهدف القريبة والبعيدة معظم المواقع إعادة التركيب (الشكل 1). الاشعال MRG284 / 285 صممت لتضخيم هذه المنطقة، ومرة أخرى، لأن محتوى كاسيت يختلف حجم amplicons يختلف أيضا (الشكل 3C). تسلسل HS458 / 459 PCRسوف المنتجات عادة استرداد محددات المقاومة للمضادات الحيوية المعروفة، في حين أن التسلسل MRG284 / 285 منتجات PCR سوف يتعافى عموما أشرطة الجينات التي تكود البروتينية وظيفة غير معروفة.

تحديد الأنواع البكتيرية

يتم تحديد البكتيريا باستخدام 16S rDNA التسلسل وقاعدة بيانات المقارنة. يستخدم الحمض النووي الجيني كنموذج لالتضخيم من 16S الوحيدات صغيرة الريباسي الجينات. باستخدام بادئات اقترحت، وهذا ينبغي إنشاء amplicon من حوالي 1450 سنة مضت. لأن أعداد كبيرة من المستعمرات قد عرض في وقت واحد، وتستخدم طريقة الفرز الهرمي. يتم هضمها تضخيم المنتجات 16S PCR مع انزيم التقييد Hinf 1، ويتم فصل هذه الملخصات على المواد الهلامية الاغاروز. والأنواع الفردية توليد أنماط مميزة بعد هضم، مثل أن العزلات من نفس النوع يمكن التعرف عليها بسهولة (الشكل 3D). تسلسل 16S الريباسي المنتجات PCR الجينات من مدة أقصاها ثلاثيعزل تمثل أي نمط قيد واحد يسمح بتحديد الفعال لجميع الأنواع المحتملة في مجموعة من العزلات الإيجابية integron.

الشكل 1
الشكل 1. بنية الطبقة 1 integrons. الرسوم التخطيطية الطبقة السريرية والبيئية 1 integrons، والتي تبين PCR التمهيدي مواقع الربط المشار إليها في المخطوطة. تتكون الطبقة 1 integrons من الجينات integron-integrase (intI1) الذي يحفز على التقاط والتعبير عن أشرطة الجينات لتشكيل مجموعة الكاسيت. قبل مجيء استخدام المضادات الحيوية، وكانت غالبية الطبقة 1 integrons الكروموسومات، وقامت أشرطة الجينات التي هي حتى الآن ظائف يحدد لاحقا. اختيار قوية عن طريق استخدام المضادات الحيوية قد زاد بشكل كبير وفرة البديل سلسلة واحدة من الفئة 1 integron المرتبطة ينقول تينيسي 402.وقد اكتسبت هذه integrons "السريرية" صفائف من الأشرطة التي تكود المقاومة للمضادات الحيوية. ومن هذه integrons التي يتم حاليا تلويث البيئة الطبيعية وسلسلة الإنتاج الغذائي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. مخطط بياني للكشف عن الفئة 1 integrons في المواد الغذائية. وتستخدم عينات من المواد الغذائية لتطعيم وسائل الإعلام وتوليد ثقافة البكتيرية المختلطة. يتم فحص هذه الثقافات المختلطة لوجود فئة 1 integrons، والثقافات إيجابية تستخدم لإعداد منتشرة وحات. وrescreened المستعمرات الفردية من انتشار لوحات لintegrons. الثقافات الإيجابية النقى الحمض النووي المستخرج، وتميزت عن محتوى الكاسيت التي كتبها DNA حد ذاتهاquencing. يستخدم تسلسل الجينات 16S الريباسي لتحديد الأنواع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم يحلل 3. الكهربي ممثل من عملية الفرز. (A) فحص المستعمرات واحد باستخدام intI1 الاشعال HS463a / 464. المستعمرات الإيجابية تولد فرقة واحدة قوية في 471 سنة مضت. (B) التضخيم من صفائف كاسيت من تينيسي 402 integrons باستخدام بادئات HS458 / 459. هذا PCR يولد أحجام المنتج متغير يعتمد على الهوية وحجم أشرطة مكون في المصفوفة. تحديد هذه الأشرطة يتطلب تسلسل الحمض النووي. (C) التضخيم من صفائف كاسيت من الدرجة البيئية 1 طntegrons باستخدام بادئات MRG284 / 285. يولد هذا PCR أيضا أحجام المنتج متغير يعتمد على الهوية وحجم أشرطة عنصر في المصفوفة، ولكن أشرطة في غير المرجح أن ترميز مقاومة المضادات الحيوية صفائف البيئية. (D) فحص المنتجات 16S PCR عن طريق الهضم مع Hinf 1. يعزل مع أنماط قيود مماثلة من المرجح أن تكون من نفس النوع. إذا تعافى أعداد كبيرة من نوع تقييد واحد، سوى عدد قليل من هذه تحتاج تكون متسلسلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

PCR الهدف الجين اسم التمهيدي اتجاه تسلسل 5 '- 3 " شروط الدراجات Refereالامتحانات التنافسية الوطنية
HS463a / HS464 الفئة 1 Integron HS464 إلى الأمام ACATGCGTGTAAATCATCGTCG 94 ° C 3 دقائق. 35 دورة 94 ° C 30 ثانية، 60 ° C 30 ثانية، 72 ° C 1 دقيقة و 30 ثانية؛ 72 ° C 5 دقيقة ستوكس وآخرون، 2006 28
HS463a الاتجاه المعاكس CTGGATTTCGATCACGGCACG
F27 / r1492 16S الريباسي F27 إلى الأمام AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 94 ° C 3 دقائق. 35 دورة 94 ° C 30 ثانية، 60 ° C 30 ثانية، 72 ° C 1 دقيقة و 30 ثانية؛ 72 ° C 5 دقيقة حارة، 1991 29
r1492 الاتجاه المعاكس TACGGYTACCTTGTTACGACTT
intI1F165 / IntI1R476 الطبقة السريرية 1 integron إنتي1F165 إلى الأمام CGAACGAGTGGCGGAGGGTG 94 ° C 3 دقائق. 35 دورة 94 ° C 30 ثانية، 55 ° C 30 ثانية، 72 ° C 1 دقيقة و 30 ثانية؛ 72 ° C 5 دقيقة Gillings، 2014 10
intI1R476 الاتجاه المعاكس TACCCGAGAGCTTGGCACCCA
HS549 / HS550 3'CS السريرية Integron HS549 إلى الأمام ACTAAGCTTGCCCCTTCCGC 94 ° C 3 دقائق. 35 دورة 94 ° C 30 ثانية، 65 ° C 30 ثانية، 72 ° C 1 دقيقة و 30 ثانية؛ 72 ° C 5 دقيقة ستوكس وآخرون، 2006 28
HS550 الاتجاه المعاكس CTAGGCATGATCTAACCCTCGG
HS458 / HS459 مجموعة كاسيت السريرية HS458 إلى الأمام GCAAAAAGGCAGCAATTATGAGCC 946؛ C 3 دقائق. 35 دورة 94 ° C 30 ثانية، 55 ° C 30 ثانية، 72 ° C 1 دقيقة و 30 ثانية؛ 72 ° C 5 دقيقة هولمز وآخرون، 2003 30
HS459 الاتجاه المعاكس GTTTGATGTTATGGAGCAGCAACG
MRG284 / MRG285 كاسيت البيئي MRG284 إلى الأمام GTTACGCCGTGGGTCGATG 94 ° C 3 دقائق. 35 دورة 94 ° C 30 ثانية، 55 ° C 30 ثانية، 72 ° C 1 دقيقة و 30 ثانية؛ 72 ° C 5 دقيقة Gillings وآخرون، 2009 21
MRG285 الاتجاه المعاكس CCAGAGCAGCCGTAGAGC

الجدول 1. تسلسل التمهيدي وظروف PCR تستخدم لتحديد الفئة 1 integrons وأشرطة الجينات المرتبطة بها.

الجدول 2. PCR وتقييد هضم مكونات mastermix.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تحديد integrons وأشرطة الجينات المرتبطة بها قد يمثل خطوة رئيسية في توقع ظهور مسببات الأمراض الانتهازية الجديدة، وتتبع مسارات لمسببات الأمراض في السلسلة الغذائية للإنسان، وتحديد مقاومة جديدة والفوعة محددات 8،21،26. وكان الهدف من هذه الورقة لوصف نهج مبسط لفحص عينات لفئة 1 integrons، واصفا صفائف كاسيت والتعرف على الأنواع البكتيرية التي يقيمون فيها. الخطوات الحاسمة في البروتوكول تنطوي على ممارسة الميكروبيولوجية جيدة، ومنع التلوث PCR التي من شأنها أن تولد ايجابيات كاذبة.

بروتوكول الموصوفة هنا يمكن تعديلها بسهولة للكشف عن غيرها من integrons ذات الصلة سريريا، بما في ذلك الطبقة 2 والطبقة 3 integrons التي تم العثور عليها أيضا في مسببات الأمراض البشرية. ويمكن أيضا أن يتم تعديل للكشف عن integrons في المجتمعات الميكروبية من المياه، والأغشية الحيوية والتربة أو الرواسب. هناك بعض limitatioنانوثانية لهذه التقنية، التي تنشأ من الاعتماد على زراعة الخلايا البكتيرية. العديد من أنواع البكتيريا البيئية ليست بسهولة زروع، وسوف بروتوكول صفها هنا لا يكشف هذه الأنواع. مجموعة من الأنواع التي يتم استردادها يمكن توسيع باستخدام مختلف الصيغ وسائل الإعلام البكتيرية ومرات حضانة أطول. ومع ذلك، فإن الغالبية العظمى من الأنواع ذات الأهمية لصحة الإنسان من المرجح أن تنمو في ظل الظروف الموصوفة هنا.

هذا البروتوكول لديه بعض المزايا أكثر من التقنيات التي تستخدم الطلاء على وسائل الإعلام انتقائية. لا تحتاج الى افتراضات يتم عن هوية محددات المقاومة التي يحملها العزلات الفردية، والجينات المقاومة جديدة يمكن استردادها، وتميزت. في مزيد من الشروط العامة، يمكن أن سير العمل أيضا أن تتكيف للكشف عن أي عنصر من عناصر mobilome resistome 27 أو التي قد تكون ذات فائدة 4. هذه المقايسات مهمة لفهم ديناميات مختلف العناصر DNA تشارك فيالمقاومة tibiotic، وحاسمة للحفاظ على ترسانة المتناقصة من المركبات المضادة للميكروبات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما ذات الصلة في الكشف عنها.

Acknowledgments

بفضل قاعة ميكايلا، لاريسا بيسبو وغوستافو تافاريس للمساعدة التقنية.

Materials

الكواشف PCR الحجم (ميكرولتر) تقييد الكواشف هضم الحجم (ميكرولتر)
الماء المعقم 21.5 الماء المعقم 23
10X GoTaq الأبيض 25 عازلة B 5
RNAseA [1 ملغ / مل] 0.5 الأبقار مصل الزلال [1 ملغ / مل] 1
إلى الأمام التمهيدي [50 ميكرومتر] 0.5 HinfI [10 وحدة / ميكرولتر] 1
عكس التمهيدي [50 ميكرومتر] 0.5
حجم Mastermix 48 حجم Mastermix 30
قالب DNA 2 PCR قالب 20
حجم PCR النهائي 50 تقييد النهائي حجم هضم 50
Name Company Catalog Number Comments
GoTaq Colourless Mastermix Promega M7132 Used in all PCRs
RNAse (Ribonuclease A from bovine pancreas) Sigma R6513-10MG Used in all PCRs
HinFI restriction enzyme Promega R6201 Used to digest 16S rDNA PCR poducts. Enzyme comes with optimal buffer and BSA
100 bp ladder GE Healthcare 27400701 Used as a size standard on all agarose gels
GelRed DNA stain Biotium 41003 CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material
Guanidinium thiocyanate Life Technologies AM9422 CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material
CLS-TC Solution MP Biomedicals 6540409 Resuspension solution used at the begining of the genomic DNA extraction
Lysing Matrix E FastPrep tubes MP Biomedicals 116914500 Tube required for mechanical disruption of bacterial cell walls. This code is used for packs of 500 tubes, smaller quantities are available.
Binding matrix MP Biomedicals 116540408 Diluted 1:5 with 6 M guanidinium thiocyanate and used in the genomic DNA extraction method.
Fast Prep machine MP Biomedicals Number of options available MP Biomedicals has a number of FastPrep machines available to purchase. Visit http://www.mpbio.com for more information

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, K., et al. Tackling antibiotic resistance. Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).
  2. Davies, J., Davies, D. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).
  3. Costa, V. M., et al. Antibiotic resistance is ancient. Nature. 477 (7365), 457-461 (2011).
  4. Gillings, M. R. Evolutionary consequences of antibiotic use for the resistome, mobilome and microbial pangenome. Front. Microbiol. 4, 4 (2013).
  5. Gillings, M., et al. The evolution of class 1 integrons and the rise of antibiotic resistance. J. Bacteriol. 190 (14), 5095-5100 (2008).
  6. Brassard, S., Lapointe, J., Roy, P. H. Diversity and relative strength of tandem promoters for the antibiotic-resistance genes of several integrons. Gene. 142 (1), 49-54 (1994).
  7. Partridge, S. R., et al. Definition of the attI1 site of class 1 integrons. Microbiol. 146 (11), 2855-2864 (2000).
  8. Gillings, M. R. Integrons: Past, Present, and Future. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 78 (2), 257-277 (2014).
  9. Partridge, S. R., Tsafnat, G., Coiera, E., Iredell, J. R. Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons. FEMS Microbiol. Rev. 33 (4), 757-784 (2009).
  10. Gillings, M. R., et al. Using the class 1 integron-integrase gene as a proxy for anthropogenic pollution. ISME J. In press, (2014).
  11. Gaze, W. H., et al. Impacts of anthropogenic activity on the ecology of class 1 integrons and integron-associated genes in the environment. ISME J. 5, 1253-1261 (2011).
  12. Gerzova, L., et al. Characterization of microbiota composition and presence of selected antibiotic resistance genes in carriage water of ornamental fish. PLoS ONE. 9, e103865 (2014).
  13. Power, M., Emery, S., Gillings, M. Into the wild: dissemination of antibiotic resistance determinants via a species recovery program. PLoS ONE. 8, e63017 (2013).
  14. Stokes, H. W., Gillings, M. R. Gene flow, mobile genetic elements and the recruitment of antibiotic resistance genes into Gram-negative pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 35 (5), 790-819 (2011).
  15. Moura, A., Oliveira, C., Henriques, I., Smalla, K., Correia, A. Broad diversity of conjugative plasmids in integron-carrying bacteria from wastewater environments. FEMS Microbiol. Lett. 330 (2), 157-164 (2012).
  16. Schlüter, A., Krause, L., Szczepanowski, R., Goesmann, A., Pühler, A. Genetic diversity and composition of a plasmid metagenome from a wastewater treatment plant. J. Biotech. 136 (1-2), 65-76 (2008).
  17. Taylor, N. G. H., Verner-Jeffreys, D. W., Baker-Austin, C. Aquatic systems: maintaining, mixing and mobilising antimicrobial resistance. TREE. 26 (6), 278-284 (2011).
  18. Stalder, T., et al. Quantitative and qualitative impact of hospital effluent on dissemination of the integron pool. ISME J. 8, 768-777 (2014).
  19. Allen, H. K., et al. Call of the wild: antibiotic resistance genes in natural environments. Nature Rev. Microbiol. 8, 251-259 (2010).
  20. Wellington, E. M., et al. The role of the natural environment in the emergence of antibiotic resistance in Gram-negative bacteria. Lancet Infect. Dis. 13 (2), 155-165 (2013).
  21. Gillings, M. R., et al. Mobilization of a Tn402-like class 1 integron with a novel cassette array via flanking miniature inverted-repeat transposable element-like structures. Appl. Env. Microbiol. 75 (18), 6002-6004 (2009).
  22. Graham, D. W., Collignon, P., Davies, J., Larsson, D. J., Snape, J. Underappreciated role of regionally poor water quality on globally increasing antibiotic resistance. Env. Sci. Technol. 48 (20), 11746-11747 (2014).
  23. Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. The antibiotic resistome: what's new. Curr. Opinion Microbiol. 21, 45-50 (2014).
  24. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. 63, e3998-e3998 (2011).
  25. Gillings, M. R. Rapid Extraction of PCR-Competent DNA from Recalcitrant Environmental Samples. Env. Microbiol. 1096, 17-23 (2014).
  26. Sajjad, A., Holley, M. P., Labbate, M., Stokes, H., Gillings, M. R. Preclinical class 1 integron with a complete Tn402-like transposition module. Appl. Env. Microbiol. 77 (1), 335-337 (2011).
  27. Wright, G. D. Antibiotic resistance in the environment: A link to the clinic. Curr. Opinion Microbiol. 13 (5), 589-594 (2010).
  28. Stokes, H., Nesbo, C., Holley, M., Bahl, M., Gillings, M., Boucher, Y. Class 1 integrons predating the association with Tn402.-like transposition genes are present in a sediment microbial community. Journal of Bacteriology. 188, 5722-5730 (2006).
  29. Lane, D. J. Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. , John Wiley &Sons, Inc. 115-175 (1991).
  30. Holmes, A. J., et al. Recombination activity of a distinctive integron-gene cassette system associated with stutzeri. populations in soil. Journal of Bacteriology. 185, 918-928 (2003).

Tags

العلوم البيئية، العدد 100، integron، نقل الجينات الأفقي، وعلم الأوبئة، resistome، المقاومة للمضادات الحيوية، والتلوث، xenogenetic
فحص المواد الغذائية للفئة 1 Integrons وجين كاسيتات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Waldron, L. S., Gillings, M. R.… More

Waldron, L. S., Gillings, M. R. Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes. J. Vis. Exp. (100), e52889, doi:10.3791/52889 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter