Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Screening Levensmiddelen voor klasse 1 integrons en Gene Cassettes

Published: June 19, 2015 doi: 10.3791/52889
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Macquarie University

Introduction

De ontdekking van antibiotica was een van de grootste wetenschappelijke prestaties van de 20 ste eeuw. Echter, het gebruik en misbruik van antibiotica heeft geleid tot de snelle evolutie van antibiotica resistente bacteriën, en die nu een ernstige bedreiging voor de volksgezondheid in de 21e eeuw poseren. De opkomst van bacteriestammen resistent tegen de meeste behandelingen verhoogt de mogelijkheid we betreden een tijdperk waarin antimicrobiële geneesmiddelen zijn niet langer effectief 1,2.

De genetische machines die antibiotica-resistentie is een oud systeem, die dateren van vóór de mens en antibiotische selectie druk door miljoenen jaren 3. Mobiele genetische elementen, zoals plasmiden, transposons, genomische eilanden, integratieve conjugatieve elementen en integronen kan verspreiden antibiotica resistentiegenen (ARG), zowel binnen als tussen bacteriesoorten 4. Hiervan hebben integrons een centrale rol in de verspreiding van ARG gespeeld, ondanksfeit dat ze vertrouwen op plasmiden en transposons voor de mobilisatie en het inbrengen in bacteriële genomen 5. Integronen vastleggen gencassettes via een integron-integrase, en vervolgens tot expressie cassettes middels een integron gecodeerd promoter 6,7 (figuur 1). Integron gen cassettes zijn kleine mobiele elementen bestaande uit enkele open reading frames (ORF), waarvan de producten kan resistentie tegen antibiotica of ontsmettingsmiddelen 8. Klasse 1 integronen zijn de integronen meest hersteld van klinische isolaten 5, waar ze gezamenlijk hebben verworven meer dan 130 verschillende antibioticumresistentiegen cassettes 9.

De verspreiding van klasse 1 integronen in-menselijke geassocieerd commensale en pathogene bacteriën genereert afvalstromen mens dat een groot aantal van deze genetische elementen 10 bevatten. Naar schatting 10 19 bacteriën die klasse 1 integronen bevatten, worden vrijgegeven via zuiveringsslib elk jaar in het Verenigd Koninkrijk 11. Het is daarom niet verwonderlijk dat klasse 1 integronen verlenen antibioticaresistenties worden nu gedetecteerd in microbiota van wilde vogels, vissen en andere inheemse dieren 12-14. Vrijgeven integronen terug in het milieu vormt een belangrijke bedreiging voor de volksgezondheid, omdat de verwerving van nieuw gen cassettes en complexe herschikkingen met andere mobiele elementen blijft optreden, met name in zuiveringsinstallaties en andere waterlichamen 15-18. De natuurlijke omgeving wordt dan een vruchtbare werven voor nieuwe weerstand determinanten en opportunistische pathogenen 19,20. Novel-Integron met bacteriën en nieuwe gegeven argumenten terug omcirkelen in de menselijke gemeenschap via besmet water en voedsel 21,22. Bewaking van het milieu ARGs is een belangrijke strategie voor het begrijpen en beheren van resistentie tegen antibiotica in de toekomst 23. In het bijzonder moet aandacht worden besteed aan levensmiddelen die rauw worden gegeten oflichtvaardig gekookt, omdat deze presenteren de grootste bedreiging voor de overdracht van nieuwe mobiele elementen en ziekteverwekkers.

In dit protocol, een gestroomlijnde benadering voor het detecteren, identificeren en karakteriseren van klasse 1 integronen en bijbehorende gencassettes in levensmiddelen worden beschreven (Figuur 2). Met een combinatie van kweken en polymerase kettingreactie (PCR), kan integrons snel worden gedetecteerd in complexe bacteriële en individuele isolaten. Werkwijzen voor het identificeren van de soorten bacteriën en de conformatie en identiteit van het Integron geassocieerde gencassettes gegeven. De werkwijze is geschikt voor een breed scala van plantaardige en dierlijke voedingsmiddelen en voorbeelden zijn werkstromen voor elk van deze soorten voedsel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Levensmiddelen die rauw worden gegeten of licht gekookt zijn van de meeste zorg voor de gezondheid van de mens. Voorbeelden zijn salade groenten, fruit, schaal- en schelpdieren.

1. Sample Collection

  1. Verzamel monsters onder omstandigheden die verontreiniging te minimaliseren, en in afzonderlijke, schone zakken tijdens het transport. Eenmaal verzameld moeten de monsters worden bewaard bij 4 ° C en binnen 24 uur.

2. Verrijkte Cultuur Voorbereiding

  1. Fruit en groenten:
    1. Leg ongeveer 10 g materiaal in een duurzame plastic zak. Indien voor grotere materiaal, concentreren op de schil van het gewas. Voeg 90 ml 0,1 M natriumfosfaatbuffer, pH 7,0 en werkwijze een paddle mixer gedurende 30 sec. Als alternatief, kan het materiaal met de hand worden geschud als een peddel blender is niet beschikbaar.
    2. Verzamel de vloeistof in twee 50 ml Falcon buizen. Centrifugebuizen bij 4000 xg gedurende 7 min om pellet bacteriën. Verwijder voorzichtig het supernatant en schorten de gepelleteerde bacteriën in 30 ml steriele Luria Bertani (LB) bouillon.
    3. Incubeer op een schudinrichting O / N, die één buis bij 25 ° C en de andere bij 37 ° C. Culturen moeten 200 trillingen per minuut (opm) worden geschud. WINKEL kweken bij 4 ° C totdat ze nodig waren.
  2. Seafood:
    1. Ontleden de maag (oesters) spijsverteringskanaal (garnalen) met steriele pincet en pincet en plaats in een steriele 1,5 ml buis met 200 ui 0,1 M natriumfosfaatbuffer, pH 7,0. Maceraat het monster een homogenaat te creëren.
    2. Doseer 5 ml LB-bouillon in twee steriele 5 ml buizen en enten elk met de zeevruchten homogenaat.
    3. Incubeer op een schudinrichting O / N, die één buis bij 25 ° C en de overige 37 ° C. Culturen moet op 200 opm worden geschud. WINKEL kweken bij 4 ° C totdat ze nodig waren.

3. Screening Cultures for integrons

MgCl2 concentratie van 2,5 mM. Indien nodig, heeft Lorenz (2011) 24 PCR-optimalisatie en het oplossen van problemen methoden geschetst in een eerdere uitgave van dit tijdschrift.

  1. Gekookte DNA voorbereiding:
    1. Verdeel 100 ul van verrijkte cultuur in een steriele 0,5 ml PCR-buis. Verwarm het monster tot 99 ° C gedurende 10 min onder toepassing van een waterbad of verwarmingsblok. Snap chill op ijs gedurende 2 minuten.
    2. Microcentrifuge bij 14.000 xg gedurende 5 min celresten te pelleteren. Keer terug naar het ijs. DNA monsters kunnen bij -20 ° C worden ingevroren totdat ze nodig, maar moet worden ontdooid op ijs.
  2. Screening voor klasse 1 integronen met behulp van PCR:
    OPMERKING: Gemengde culturen uit de O / N incubatie worden gescreend voor klasse 1 integronen met de HS463a / HS464 PCR-protocol (tabel 1).
    1. Ontdooi alle PCR-reagentia op het ijs, weg van alle mogelijke souRCE verontreinigend DNA. Make up 48 pi PCR mastermix per monster, waaronder negatieve controles (tabel 2). Doseer 48 pi PCR master mix aan elke buis, met behulp van barrière tips.
    2. Voeg 2 pl ontdooide DNA individuele PCR-buizen met behulp van barrière tips. Run juiste programma in de PCR thermocycler.
    3. Om de resultaten van de amplificatie beoordelen Electrophorese 7 pi PCR product op een 2% agarosegel gegoten en gerund in TBE buffer (90 mM TRIS-boraat, 2 mM EDTA). Neem een ​​molecuulgewicht merker, zoals een 100 bp ladder.
    4. Voeg vlek de gel met DNA kleuring en visualiseren met een UV transilluminator. Controleer dat er geen versterking in de negatieve controle is geweest. Een sterke band bij ongeveer 470 bp voor een bepaald monster geeft aan dat de gemengde cultuur bevat bacteriën die een klasse 1 Integron dragen. Pure kolonies zal nu worden geïsoleerd van elke gemengde cultuur die een positieve PCR teruggekeerd.

  1. Seriële verdunningen en de verspreiding platen:
    Opmerking: Om enkele kolonies te isoleren van het PCR-positieve gemengde kweken, wordt de gemengde kweek serieel verdund 10-voudig in natriumfosfaatbuffer, en vervolgens uitgeplaat op enkele kolonies te herstellen.
    1. Voeg 1 ml kweek gemengd met 9 ml van 0,1 M natriumfosfaatbuffer, pH 7,0 en mengen door omkeren. Voeg 1 ml van de verdunning tot een verdere 9 ml fosfaatbuffer en herhaal tot een seriële verdunning van 10 -8 bereikt.
    2. Verdeel 100 ul van de 10 -4 tot 10 -8 verdunningen op LB agar, in tweevoud. Incubeer de platen O / N bij dezelfde temperatuur gebruikt voor de eerste gemengde kweek. De platen kunnen vervolgens worden opgeslagen bij 4 ° C totdat ze nodig waren, maar het beste de enkele kolonies vrij snel verwerken.
  2. Enkele kolonie selectie en gekookte DNA voorbereiding:
    1. Pick enkele kolonies van de seriële verdunning platen, seaanvinken van vele verschillende types kolonie zijn, volgens de criteria zoals kolonie grootte, vorm en kleur. Gebruik steriele tandenstokers om enkele kolonies van de verspreiding plaat kiezen.
    2. Raak de tandenstoker naar de kolonie, en vervolgens over in een PCR-buis met 100 ul steriel water. Bij grote aantallen kolonies te screenen, dan kolonies kunnen worden bereid in een microtiterplaat. Draai de tandenstoker tussen de vingers om een ​​aantal van de cellen los in het water.
    3. Met dezelfde tandenstoker, enten een LB plaat met een streep van de kolonie. Grote aantallen kolonies kunnen worden opgeslagen geëtiketteerd platen als elke strook ongeveer 1 cm lang. Herhaal de stappen 1 tot 3 tot u een geschikt aantal isolaten hebt geselecteerd.
    4. Incubeer de platen LB O / N, bij dezelfde temperatuur als die toegepast voor de eerste verrijkte cultuur. Kweken kunnen vervolgens worden opgeslagen bij 4 ° C totdat ze nodig waren.
    5. Voor het bereiden van DNA van de bacteriële suspensies, volg de stappen zoals outlined in paragraaf 3.1. Voor de screening van zuivere cultuur lysaten, voeren de HS463a / HS464 PCR zoals beschreven in paragraaf 3.2. Isolaten die terug positief PCR wordt gebruikt voor de bereiding van genomisch DNA (punt 5), en voor verdere analyse.

5. Genomic DNA Winning van Integron-positieve Single Colonies behulp Bead Beating 25

  1. Inoculeer 5 ml LB-bouillon met een monster van het zuivere kweek die in paragraaf 4.2. Incubeer O / N, schudden bij dezelfde temperatuur die werd gebruikt voor de eerste verrijkte cultuur.
  2. Pellet cellen bij 4.000 xg gedurende 7 minuten, verwijder het supernatant. Resuspendeer de gepelleteerde cellen in 1 ml CLS-TC oplossing in een Lysing Matrix E snel prep buis. Met een kraal kloppend machine verwerkt de monster bij 5,5 m / sec voor 30 sec.
  3. Centrifugebuis bij 14.000 xg gedurende 5 min en herstellen 700 pl supernatant in een steriele buis van 1,5 ml.
  4. Voeg 700 ul van binding matrix verdund 1: 5 met 6 M Guanidinium thiocyanaat en meng bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 1 min, verwijder het supernatant.
  5. Voeg 800 ul zout ethanol wassen (70% ethanol, 0,1 M natriumacetaat) en vortex totdat de pellet volledig geresuspendeerd. Was gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur gecentrifugeerd bij 14.000 xg gedurende 1 min en gooi supernatant. Zorg ervoor dat alle supernatant werd verwijderd met behulp van een micropipet eventueel vervolgens aan de lucht drogen gedurende 5 minuten.
  6. Resuspendeer de pellet matrix in 200 gl TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,6) door en neer te pipetteren. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 min. Centrifugeer bij 14.000 xg gedurende 3 min en overdracht 160 ul van het geëlueerde DNA in een steriele buis. Run een aliquot van het genomische DNA-extractie op een 2% w / v agarose gel om de opbrengst en de integriteit van de DNA-extractie controleren. De gezuiverde genomisch-DNA wordt opgeslagen bij -20 ° C en ontdooid op ijs indien nodig PCR-test.

6. Diagnostische PCR en DNA sequentiebepaling

OPMERKING: Degenomisch DNA bereid in deel 5 zal worden gebruikt voor diagnostische PCR, en de positieve test voor klasse 1 integronen bevestigen.

  1. Dooi genomische DNA op ijs, kort vortex het DNA-monster en pols draaien op 14.000 xg gedurende 20 sec. Herhaal de PCR voor de klasse 1 integron-integrase-gen middels HS463a / HS464 (Tabel 1), hetgeen bevestigt dat het isolaat positief voor het 471 bp amplicon (paragraaf 3.2).
  2. Identificatie van positieve kweken van soorten wordt bereikt door analyse van de kleine subeenheid rRNA-gen (16S rDNA). Versterken de 16S-gen met behulp van primers F27 / r1492 (Tabel 1). Controleer de PCR producten met behulp van elektroforese. Alle bacteriële doelstellingen moeten een 16S amplicon van ongeveer 1450 bp te genereren.
  3. Sequentie het 16S rRNA-gen amplicon species te bepalen van identiteit, maar aangezien er waarschijnlijk meerdere positieve PCR vanaf stap 6,2, en veel van deze positieve zullen dezelfde bacteriesoort, zullen we eerst onderscheiden verschillende species using restrictiedigestie van het 16S PCR product.
    1. Digest een hoeveelheid van de 16S PCR met het restrictie-enzym Hinf 1. Elk enzym dat herkent 4 bp splitsingsplaatsen zal doen, maar Hinf 1 genereert good diversiteit afkomstig van 16S doelen en is een betrouwbare, goedkope enzym.
  4. Het opzetten van een 30 pl restrictiedigestie mastermix (tabel 2) in een steriele buis en voeg 20 ul-un purfied 16S PCR product. Incubeer in een 37 ° C waterbad O / N. Controleer het digest op een 2% agarosegel.
  5. Ril de ontsluitingspatronen door Hinf 1. Isolaten met hetzelfde restrictie-16S profiel waarschijnlijk dezelfde soort zijn. Eerder dan sequencing elke 16S PCR-product, volgorde ten hoogste drie vertegenwoordigers van elke Hinf 1 restrictie patroon.
  6. Zuiver het 16S PCR producten met behulp van een commerciële kit. Een enkelstrengs exonuclease kit kan worden gebruikt, maar kolommen gebaseerde of precipitatie methodes werken ook uninc verwijderenorporated primers en enkelstrengs DNA. Sequence de 16S amplicons met primer R910 (tabel 1), het opzetten van de reacties, zoals gespecificeerd door de sequencing faciliteit.
  7. Gebruik de resulterende DNA-sequentie te ondervragen de NCBI DNA-databank met de BLASTN functie ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ). Meer dan 97% nucleotide-identiteit wordt meestal als soorten identiteit.

7. Mapping en karakterisering van integronen en Cassette Arrays

OPMERKING: Klasse 1 integronen afkomstig uit menselijke gedomineerde ecosystemen zijn waarschijnlijk de meest voorkomende integronen in al uw monsters. Deze integronen allemaal een recente single origin, en daarom een sterk geconserveerde DNA-sequentie 5.

  1. Onderscheid tussen een klasse 1 integronen afkomstig van menselijke bronnen en die welke van nature in milieumonsters door het uitvoeren van eenPCR met primer set intI1F165 / intI1R476 10 (tabel 1).
    OPMERKING: Klasse 1 integronen van klinische of commensale bacteriën zal een ~ 300 bp product te genereren, terwijl de milieuklasse 1 integronen een product niet zal genereren.
  2. Karakteriseren het klinische integronen door het versterken van de cassette array met primer set HS458 / HS459. Dit PCR zal het gebied tussen intI1 en geconserveerde segment van de 3 'te versterken bij het ​​eindpunt van de meeste cassette arrays. Omdat het aantal en de identiteit van cassettes is variabel, zal de grootte van het PCR-product eveneens variëren.
  3. Zuiver amplicons en de DNA sequentie met behulp van elk van de amplificatieprimers. Gebruik sequenties DNA-databanken met de BLASTN functie (ondervragen http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ).
  4. Zorg voor het benoemen van de cassettes te volgen gestandaardiseerde nomenclatuur 9, omdat veel gegevens deposities voor Integron gencassettes gebruiken inconsistente of onduidelijke namen. Bijzondere aandacht schenken aan nieuw gen cassettes, omdat deze nieuwe fenotypes kunnen coderen, waaronder genen die verlenen verhoogde overdraagbaarheid, pathogeniteit en virulentie 8,21.
    OPMERKING: Preklinische vormen van de klasse 1 Integron steeds circuleren in natuurlijke omgevingen. Met name die welke verband houden met actieve Tn 402 transposons zijn het meest interessant 26. De cassette arrays van deze integronen niet zal versterken met primer set HS458 / HS459, maar kan worden versterkt met de MRG284 / MRG285 primer set (tabel 1), het genereren van amplicons van variabele grootte afhankelijk van de cassette-inhoud. PCR producten worden gezuiverd en DNA-sequentiebepaling zoals beschreven in 7.2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Screening van gemengde culturen en bacteriële isolaten van intI1

Primerpaar HS463a / HS464 PCR kan worden gebruikt om de aanwezigheid van de klasse 1 integron-integrase gen, intI1 (figuur 1) te detecteren. Deze primer set werkt goed voor het detecteren intI1 in gemengde culturen, en wordt ook gebruikt om bacteriële kolonies geoogst uit platen uitgespreid (figuur 2) te screenen. Positieve isolaten moet een sterke band te genereren bij 471 bp met deze primer set (figuur 3A). De meerderheid van de positieve isolaten zal uitvoeren intI1 die is voortgekomen uit mensen of hun landbouw- en huisdieren. Deze isolaten zullen ook positief in een PCR met gebruik van primers F165 / R476, die een 311 bp amplicon (figuur 1) te genereren. Omgevingsbronnen van intI1 algemeen niet positief in deze tweede assay.

Karakterisering van Integron cassette arrays

402 geassocieerde klasse 1 integronen kan worden versterkt met behulp van primers HS458 / HS459. Deze primers respectievelijk gericht de integron recombinatie locatie, en het 3 'uiteinde van de cassette array, die normaliter eindigt in de qacEΔ sul1 genfusie (figuur 1). De grootte van PCR-producten gegenereerd in dit assay is afhankelijk van het aantal en de identiteit van cassettes in de matrix (Figuur 3B). Milieuklasse 1 integronen vaak deel uitmaken van bacteriële chromosomen, en de cassette arrays kunnen worden geamplificeerd door primers die de proximale en meest distale recombinatie locaties (Fig 1) te verkrijgen. Primers MRG284 / 285 zijn ontworpen om dit amplificeren en opnieuw, omdat de cassette gehalte varieert de grootte van de amplicons varieert (figuur 3C). Sequencing van HS458 / 459 PCRproducten zal normaal herstellen bekend antibioticaresistentie determinanten, terwijl sequencing MRG284 / 285 PCR-producten in het algemeen zal herstellen gen cassettes die polypeptiden van onbekende functie coderen.

Het identificeren van bacteriële soorten

Bacteriën worden geïdentificeerd door 16S rDNA sequentie en database vergelijkingen. Genomisch DNA wordt gebruikt als een matrijs voor amplificatie van het 16S kleine subeenheid rRNA gen. De primers voorgesteld, zou deze een amplicon van ongeveer 1450 bp te genereren. Door grote aantallen kolonies kunnen worden onderzocht op elk moment, is een hiërarchische screeningsmethode toegepast. 16S geamplificeerde PCR-producten worden gedigereerd met het restrictie-enzym Hinf 1 en deze digesties worden gescheiden op agarose gels. Individuele soorten zal opvallende patronen na digest, zodanig dat isolaten van dezelfde soort gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd (Figuur 3D) te genereren. Sequencing het 16S rRNA-gen PCR producten van ten hoogste drieisolaten die elk restrictiepatroon maakt een efficiënte identificatie van alle waarschijnlijke species in een verzameling integron positieve isolaten.

Figuur 1
Figuur 1. Structuur van klasse 1 integronen. Schema's van de klinische en milieuklasse 1 integronen, toont PCR-primer bindingsplaatsen in het manuscript wordt verwezen. Klasse 1 integronen bestaan ​​uit een Integron-integrase-gen (intI1) dat het vangen en de expressie van genen cassettes katalyseert om een cassette-array te vormen. Voor de komst van antibiotica, de meeste klasse 1 integronen waren chromosomaal en gedragen gencassettes waarvan de functies nog worden bepaald. Sterke selectie via het gebruik van antibiotica is enorm toegenomen de overvloed van een reeks variant van klasse 1 Integron in verband met de Tn 402 transposon.Deze 'klinisch' integronen hebben arrays van cassettes die antibioticaresistentie coderen verworven. Het zijn deze integronen die momenteel worden vervuilende natuurlijke omgevingen en de voedselproductieketen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Schematische stroomschema voor het opsporen van klasse 1 integronen in levensmiddelen. Monsters van levensmiddelen worden gebruikt om media te enten en het genereren van een gemengde bacteriecultuur. Deze gemengde kweken werden gescreend op de aanwezigheid van klasse 1 integronen en positieve kweken gebruikt voor het verspreiden petrischaal. Afzonderlijke kolonies van de spread platen worden opnieuw onderzocht voor integronen. Positieve kweken worden gezuiverd, DNA geëxtraheerd en gekarakteriseerd cassette gehalte DNA SEquencing. Sequencing van de 16S rRNA-gen wordt gebruikt voor de identificatie van soorten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Representatieve elektroforetische analyse van de screening. (A) Screening enkele kolonies met intI1 primers HS463a / 464. Positieve kolonies genereren van een sterke single band op 471 bp. (B) Versterking van de cassette arrays uit Tn 402 integronen met primers HS458 / 459. Deze PCR genereert variabele product valt afhankelijk van de identiteit en de grootte van de component cassettes in de array. Identificatie van deze cassettes nodig DNA- sequencing. (C) Versterking van de cassette arrays van milieuklasse 1 integrons behulp primers MRG284 / 285. Deze PCR genereert ook variable product valt afhankelijk van de identiteit en de grootte van de component cassettes in de matrix, maar cassettes in milieu arrays waarschijnlijk antibioticaresistentie coderen. (D) Screening van 16S PCR producten door digestie met Hinf 1. Isolaten met identieke restrictiepatronen waarschijnlijk dezelfde soort zijn. Als grote aantallen van één soort beperking worden hersteld, slechts een paar van deze moeten worden gesequenced. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

PCR Gene doel Primer naam Richting Sequentie 5 '- 3' Fietsen voorwaarden ReferentieNVU
HS463a / HS464 Klasse 1 Integron HS464 Vooruit ACATGCGTGTAAATCATCGTCG 94 ° C 3 min; 35 cycli van 94 ° C 30 sec, 60 ° C 30 sec, 72 ° C 1 min 30 sec; 72 ° C 5 min Stokes et al., 2006 28
HS463a Reverse CTGGATTTCGATCACGGCACG
F27 / r1492 16S rRNA F27 Vooruit AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 94 ° C 3 min; 35 cycli van 94 ° C 30 sec, 60 ° C 30 sec, 72 ° C 1 min 30 sec; 72 ° C 5 min Lane, 1991 29
r1492 Reverse TACGGYTACCTTGTTACGACTT
intI1F165 / IntI1R476 Klinische klasse 1 Integron INTI1F165 Vooruit CGAACGAGTGGCGGAGGGTG 94 ° C 3 min; 35 cycli van 94 ° C 30 sec, 55 ° C 30 sec, 72 ° C 1 min 30 sec; 72 ° C 5 min Gillings, 2014 10
intI1R476 Reverse TACCCGAGAGCTTGGCACCCA
HS549 / HS550 3'CS Klinische Integron HS549 Vooruit ACTAAGCTTGCCCCTTCCGC 94 ° C 3 min; 35 cycli van 94 ° C 30 sec, 65 ° C 30 sec, 72 ° C 1 min 30 sec; 72 ° C 5 min Stokes et al., 2006 28
HS550 Reverse CTAGGCATGATCTAACCCTCGG
HS458 / HS459 Klinische cassette serie HS458 Vooruit GCAAAAAGGCAGCAATTATGAGCC 946; C 3 min; 35 cycli van 94 ° C 30 sec, 55 ° C 30 sec, 72 ° C 1 min 30 sec; 72 ° C 5 min Holmes et al., 2003 30
HS459 Reverse GTTTGATGTTATGGAGCAGCAACG
MRG284 / MRG285 Milieu-cassette MRG284 Vooruit GTTACGCCGTGGGTCGATG 94 ° C 3 min; 35 cycli van 94 ° C 30 sec, 55 ° C 30 sec, 72 ° C 1 min 30 sec; 72 ° C 5 min Gillings et al., 2009 21
MRG285 Reverse CCAGAGCAGCCGTAGAGC

Tabel 1. Primer sequenties en PCR-omstandigheden voor het identificeren van klasse 1 integrons en bijbehorende gencassettes.

Tabel 2. PCR en restrictiedigest mastermix kiezers.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De identificatie van integronen en de bijbehorende gen cassettes is potentieel een belangrijke stap in het voorspellen van de opkomst van nieuwe opportunistische pathogenen, tracking paden voor ziekteverwekkers in de menselijke voedselketen, en het identificeren van nieuwe weerstand en virulentiedeterminanten 8,21,26. Het doel van dit artikel was om een ​​gestroomlijnde aanpak voor het screenen van monsters voor klasse 1 integronen, het karakteriseren van de cassette arrays en het identificeren van de soorten bacteriën waar zij wonen te beschrijven. Kritische stappen in het protocol te betrekken goede microbiologische praktijk, en het voorkomen van PCR contaminatie die valse positieven zou genereren.

De hier beschreven protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan andere klinisch relevante integronen detecteren, waaronder de klasse 2 en klasse 3 integronen die ook in humane pathogenen. Het kan ook worden gemodificeerd om integronen in microbiële gemeenschappen water, biofilms, bodem of sediment te detecteren. Er zijn een aantal BEPERKIns deze techniek, die vrijkomt afhankelijkheid kweken van bacteriële cellen. Veel milieu-bacteriën zijn niet gemakkelijk kweekbare, en de hier beschreven protocol zou niet deze soorten te detecteren. De lijst van soorten die teruggewonnen kan worden uitgebreid door verschillende bacteriële mediumformuleringen en langere incubatietijden. Niettemin, de meeste van belang zijnde species voor de menselijke gezondheid waarschijnlijk groeien onder de hier beschreven omstandigheden.

Dit protocol heeft een aantal voordelen ten opzichte van technieken die gebruik maken van plating op selectieve media. Geen veronderstellingen moeten worden gemaakt over de identiteit van resistentie determinanten individuele isolaten en nieuwe resistentiegenen uitgevoerd kunnen worden gewonnen en gekarakteriseerd. Meer algemeen kan de workflow worden aangepast aan elk element van de resistoom 27 of mobilome die interessant 4 kunnen zijn te detecteren. Dergelijke assays zijn belangrijk voor het begrijpen van de dynamica van de verschillende DNA elementen die bij eentibiotic weerstand, en van cruciaal belang voor het behoud van de slinkende arsenaal van antimicrobiële stoffen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets relevant te onthullen.

Acknowledgments

Dankzij Michaela Hall, Larissa Bispo en Gustavo Tavares voor technische bijstand.

Materials

PCR reagentia Volume (pl) Restrictiedigest reagentia Volume (pl)
Steriel water 21.5 Steriel water 23
10x GoTaq White 25 Buffer B 5
RNAse [1 mg / ml] 0.5 Bovine Serum Albumin [1 mg / ml] 1
Forward Primer [50 pm] 0.5 HinfI [10 eenheden / gl] 1
Reverse Primer [50 uM] 0.5
Mastermix volume 48 Mastermix volume 30
DNA template 2 PCR Template 20
Final volume PCR 50 Final restrictiedigest volume 50
Name Company Catalog Number Comments
GoTaq Colourless Mastermix Promega M7132 Used in all PCRs
RNAse (Ribonuclease A from bovine pancreas) Sigma R6513-10MG Used in all PCRs
HinFI restriction enzyme Promega R6201 Used to digest 16S rDNA PCR poducts. Enzyme comes with optimal buffer and BSA
100 bp ladder GE Healthcare 27400701 Used as a size standard on all agarose gels
GelRed DNA stain Biotium 41003 CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material
Guanidinium thiocyanate Life Technologies AM9422 CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material
CLS-TC Solution MP Biomedicals 6540409 Resuspension solution used at the begining of the genomic DNA extraction
Lysing Matrix E FastPrep tubes MP Biomedicals 116914500 Tube required for mechanical disruption of bacterial cell walls. This code is used for packs of 500 tubes, smaller quantities are available.
Binding matrix MP Biomedicals 116540408 Diluted 1:5 with 6 M guanidinium thiocyanate and used in the genomic DNA extraction method.
Fast Prep machine MP Biomedicals Number of options available MP Biomedicals has a number of FastPrep machines available to purchase. Visit http://www.mpbio.com for more information

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, K., et al. Tackling antibiotic resistance. Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).
  2. Davies, J., Davies, D. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).
  3. Costa, V. M., et al. Antibiotic resistance is ancient. Nature. 477 (7365), 457-461 (2011).
  4. Gillings, M. R. Evolutionary consequences of antibiotic use for the resistome, mobilome and microbial pangenome. Front. Microbiol. 4, 4 (2013).
  5. Gillings, M., et al. The evolution of class 1 integrons and the rise of antibiotic resistance. J. Bacteriol. 190 (14), 5095-5100 (2008).
  6. Brassard, S., Lapointe, J., Roy, P. H. Diversity and relative strength of tandem promoters for the antibiotic-resistance genes of several integrons. Gene. 142 (1), 49-54 (1994).
  7. Partridge, S. R., et al. Definition of the attI1 site of class 1 integrons. Microbiol. 146 (11), 2855-2864 (2000).
  8. Gillings, M. R. Integrons: Past, Present, and Future. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 78 (2), 257-277 (2014).
  9. Partridge, S. R., Tsafnat, G., Coiera, E., Iredell, J. R. Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons. FEMS Microbiol. Rev. 33 (4), 757-784 (2009).
  10. Gillings, M. R., et al. Using the class 1 integron-integrase gene as a proxy for anthropogenic pollution. ISME J. In press, (2014).
  11. Gaze, W. H., et al. Impacts of anthropogenic activity on the ecology of class 1 integrons and integron-associated genes in the environment. ISME J. 5, 1253-1261 (2011).
  12. Gerzova, L., et al. Characterization of microbiota composition and presence of selected antibiotic resistance genes in carriage water of ornamental fish. PLoS ONE. 9, e103865 (2014).
  13. Power, M., Emery, S., Gillings, M. Into the wild: dissemination of antibiotic resistance determinants via a species recovery program. PLoS ONE. 8, e63017 (2013).
  14. Stokes, H. W., Gillings, M. R. Gene flow, mobile genetic elements and the recruitment of antibiotic resistance genes into Gram-negative pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 35 (5), 790-819 (2011).
  15. Moura, A., Oliveira, C., Henriques, I., Smalla, K., Correia, A. Broad diversity of conjugative plasmids in integron-carrying bacteria from wastewater environments. FEMS Microbiol. Lett. 330 (2), 157-164 (2012).
  16. Schlüter, A., Krause, L., Szczepanowski, R., Goesmann, A., Pühler, A. Genetic diversity and composition of a plasmid metagenome from a wastewater treatment plant. J. Biotech. 136 (1-2), 65-76 (2008).
  17. Taylor, N. G. H., Verner-Jeffreys, D. W., Baker-Austin, C. Aquatic systems: maintaining, mixing and mobilising antimicrobial resistance. TREE. 26 (6), 278-284 (2011).
  18. Stalder, T., et al. Quantitative and qualitative impact of hospital effluent on dissemination of the integron pool. ISME J. 8, 768-777 (2014).
  19. Allen, H. K., et al. Call of the wild: antibiotic resistance genes in natural environments. Nature Rev. Microbiol. 8, 251-259 (2010).
  20. Wellington, E. M., et al. The role of the natural environment in the emergence of antibiotic resistance in Gram-negative bacteria. Lancet Infect. Dis. 13 (2), 155-165 (2013).
  21. Gillings, M. R., et al. Mobilization of a Tn402-like class 1 integron with a novel cassette array via flanking miniature inverted-repeat transposable element-like structures. Appl. Env. Microbiol. 75 (18), 6002-6004 (2009).
  22. Graham, D. W., Collignon, P., Davies, J., Larsson, D. J., Snape, J. Underappreciated role of regionally poor water quality on globally increasing antibiotic resistance. Env. Sci. Technol. 48 (20), 11746-11747 (2014).
  23. Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. The antibiotic resistome: what's new. Curr. Opinion Microbiol. 21, 45-50 (2014).
  24. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. 63, e3998-e3998 (2011).
  25. Gillings, M. R. Rapid Extraction of PCR-Competent DNA from Recalcitrant Environmental Samples. Env. Microbiol. 1096, 17-23 (2014).
  26. Sajjad, A., Holley, M. P., Labbate, M., Stokes, H., Gillings, M. R. Preclinical class 1 integron with a complete Tn402-like transposition module. Appl. Env. Microbiol. 77 (1), 335-337 (2011).
  27. Wright, G. D. Antibiotic resistance in the environment: A link to the clinic. Curr. Opinion Microbiol. 13 (5), 589-594 (2010).
  28. Stokes, H., Nesbo, C., Holley, M., Bahl, M., Gillings, M., Boucher, Y. Class 1 integrons predating the association with Tn402.-like transposition genes are present in a sediment microbial community. Journal of Bacteriology. 188, 5722-5730 (2006).
  29. Lane, D. J. Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. , John Wiley &Sons, Inc. 115-175 (1991).
  30. Holmes, A. J., et al. Recombination activity of a distinctive integron-gene cassette system associated with stutzeri. populations in soil. Journal of Bacteriology. 185, 918-928 (2003).

Tags

Environmental Sciences Integron laterale genoverdracht epidemiologie resistoom resistentie tegen antibiotica de vervuiling xenogenetic
Screening Levensmiddelen voor klasse 1 integrons en Gene Cassettes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Waldron, L. S., Gillings, M. R.… More

Waldron, L. S., Gillings, M. R. Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes. J. Vis. Exp. (100), e52889, doi:10.3791/52889 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter