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Dépistage denrées alimentaires pour les intégrons de classe 1 et Gene Cassettes

Published: June 19, 2015 doi: 10.3791/52889
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Macquarie University

Introduction

La découverte des antibiotiques a été l'une des plus grandes réalisations scientifiques du 20 ème siècle. Cependant, l'utilisation et l'abus des antibiotiques a conduit à l'évolution rapide des bactéries résistantes aux antibiotiques, et ceux-ci pose maintenant une menace sérieuse pour la santé publique dans le 21 e siècle. La hausse de souches bactériennes résistantes à la plupart des options de traitement soulève la possibilité que nous entrons dans une ère où les médicaments antimicrobiens ne sont plus efficaces 1,2.

Le mécanisme génétique qui confère une résistance aux antibiotiques est un ancien système, précédant les humains et les pressions de sélection antibiotiques par des millions d'années 3. Éléments génétiques mobiles, tels que les plasmides, les transposons, îlots génomiques, les éléments et les intégrons conjugatifs intégratives peuvent diffuser des gènes de résistance aux antibiotiques (ARG) à l'intérieur et entre les espèces bactériennes 4. Parmi ceux-ci, intégrons ont joué un rôle central dans la propagation de l'ARG, malgré lafait qu'ils reposent sur ​​des plasmides et des transposons pour la mobilisation et l'insertion dans les génomes bactériens 5. Les intégrons capturer cassettes de gènes en utilisant une intégron-intégrase, puis expriment cassettes en utilisant un promoteur intégron codé 6,7 (Figure 1). Integron gène cassettes sont de petits éléments mobiles constitués de simples cadres de lecture ouverts (ORF) dont les produits peuvent conférer une résistance aux antibiotiques ou de désinfectants 8. Intégrons de classe 1 sont les intégrons le plus souvent récupérées à partir d'isolats cliniques 5, où ils ont acquis collectivement plus de 130 différentes cassettes de gènes de résistance aux antibiotiques 9.

La propagation de la classe 1 intégrons dans commensales et bactéries pathogènes humains associés génère des flux de déchets humains qui contiennent un grand nombre de ces éléments génétiques 10. On estime à 10 19 bactéries qui contiennent intégrons de classe 1 sont libérés par les boues chaque année in le Royaume-Uni 11. Il est donc pas surprenant que les intégrons de classe 1 conférant des résistances aux antibiotiques sont maintenant détectés dans le microbiote des oiseaux sauvages, de poissons et d'autres animaux sauvages indigènes de 12-14. Libérer intégrons dans l'environnement constitue une menace importante pour la santé publique, depuis l'acquisition de nouvelles cassettes de gènes et des réarrangements complexes avec d'autres éléments mobiles continue à se produire, en particulier dans les stations d'épuration et d'autres plans d'eau 15-18. L'environnement naturel devient alors un terrain fertile pour le recrutement de nouveaux déterminants de la résistance et des pathogènes opportunistes 19,20. Bactéries contenant de intégron-nouveaux et de nouvelles ARG peuvent encercler retour dans la communauté humaine à travers l'eau et les aliments contaminés 21,22. Surveillance de l'environnement ARG est une stratégie clé pour la compréhension et la gestion de la résistance aux antibiotiques dans l'avenir 23. En particulier, l'attention devrait être accordée aux denrées alimentaires qui sont consommés crus oulégèrement cuits, puisque ceux-ci présentent la plus grande menace pour la transmission de nouveaux éléments mobiles et des agents pathogènes.

Dans ce protocole, une approche simplifiée pour détecter, identifier et caractériser les intégrons de classe 1 et leurs cassettes de gènes associés dans les denrées alimentaires sont décrits (Figure 2). En utilisant une combinaison de la réaction et de la culture en chaîne par polymérase (PCR), intégrons peuvent être détectés rapidement dans les communautés bactériennes complexes et les isolats individuels. Des procédés pour l'identification des espèces de bactéries et de la conformation et de l'identité des cassettes de gènes associés à intégron sont donnés. La méthode est adaptée pour une large gamme d'aliments végétaux et animaux, et des exemples de workflows typiques sont donnés pour chacun de ces types d'aliments.

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Protocol

Les denrées alimentaires qui sont consommés crus ou légèrement cuits sont des plus préoccupantes pour la santé humaine. Les exemples incluent la salade de légumes, les fruits, les coquillages et les crustacés.

Collection 1. Echantillon

  1. Prélever des échantillons dans des conditions qui minimisent la contamination, et stockées dans des sacs propres, séparés pendant le transport. Une fois collectés, les échantillons doivent être conservés à 4 ° C et traitées dans les 24 heures.

2. Culture préparation enrichie

  1. Fruits et légumes:
    1. Placer environ 10 g de matière dans un sac en plastique durable. Si le traitement des matériaux plus volumineux, se concentrer sur la peau du fruit ou du légume. Ajouter 90 ml 0,1 M tampon phosphate de sodium, pH 7,0 et processus dans un malaxeur à pales pendant 30 sec. Alternativement, le matériau peut être agité manuellement si un mélangeur à aubes ne sont pas disponibles.
    2. Recueillir le liquide en deux 50 ml tubes Falcon. Tubes à centrifuger à 4000 g pendant 7 min pour bactéries de pellets. Retirer délicatement le surnageant et suspendre les bactéries en culot dans 30 ml de bouillon Luria Bertani stérile (LB).
    3. Incuber sur un agitateur O / N, tenant un tube à 25 ° C et l'autre à 37 ° C. Les cultures doivent être secoués à 200 oscillations par minute (OPM). cultures de conserver à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
  2. Fruits de mer:
    1. Disséquer l'estomac (huîtres) ou le tube digestif (de crevettes) à l'aide de pinces et pinces stériles et la placer dans un tube de 1,5 ml stérile contenant 200 ul de 0,1 M tampon phosphate de sodium, pH 7,0. Laisser macérer l'échantillon pour créer un homogénat.
    2. Distribuer 5 ml de bouillon LB en deux stériles tubes de 5 ml, et ensemencer chacun avec le broyat de fruits de mer.
    3. Incuber sur un agitateur O / N, tenant un tube à 25 ° C et l'autre 37 ° C. Les cultures doivent être secoués à 200 cpm. cultures de conserver à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire.

3. Cultures de dépistage pour intégrons

MgCl2 2,5 mM. Si nécessaire, Lorenz (2011) 24 a indiqué PCR optimisation et de dépannage méthodes dans un numéro précédent de cette revue.

  1. Boiled préparation de l'ADN:
    1. Distribuer 100 ul de culture enrichi en 0,5 ml tube stérile PCR. Chauffer l'échantillon à 99 ° C pendant 10 min, en utilisant un bain-marie ou un bloc chauffant. Enclenchez froid sur la glace pendant 2 min.
    2. Microcentrifugeuse à 14 000 g pendant 5 min pour sédimenter les débris cellulaires. Retour à la glace. Des échantillons d'ADN peuvent être congelés à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire, mais doivent être décongelés sur de la glace.
  2. Le dépistage de la classe 1 intégrons par PCR:
    NOTE: cultures mixtes de la O / N incubation sont criblés pour intégrons de classe 1 utilisant le protocole HS463a / HS464 PCR (Tableau 1).
    1. Décongeler tous les réactifs PCR sur la glace, loin de toute sou potentielrces de l'ADN contaminant. Maquillage 48 pi mastermix PCR par échantillon, y compris les contrôles négatifs (tableau 2). Distribuer 48 pi de mélange maître PCR dans chaque tube, à l'aide des conseils de barrière.
    2. Ajouter 2 ul d'ADN décongelés dans des tubes de PCR individuels à l'aide des conseils de barrière. Exécutez programme approprié dans le thermocycleur.
    3. Pour évaluer les résultats de l'amplification, l'électrophorèse 7 pi de produit de PCR sur un gel d'agarose à 2% coulé et fonctionner dans un tampon TBE (90 mM Tris-borate, 2 mM EDTA). Inclure un marqueur de poids moléculaire, comme une échelle de 100 pb.
    4. Poster tacher le gel avec une tache d'ADN, et de visualiser l'aide d'un transilluminateur UV. Vérifiez qu'il n'y a pas eu d'amplification dans le contrôle négatif. Une forte bande à environ 470 pb pour tout échantillon particulier indique que la culture mixte contient des bactéries qui portent un intégron de classe 1. Colonies pures vont maintenant être isolés de toute culture mixte qui a retourné une PCR positive.

  1. Des dilutions en série et des plaques de propagation:
    Remarque: pour isoler des colonies uniques à partir des cultures mixtes PCR-positifs, la culture mixte est dilué en série 10 fois dans un tampon de phosphate de sodium, et ensuite plaquées à récupérer des colonies uniques.
    1. Ajouter 1 ml de la culture mixte à 9 ml de tampon de phosphate de sodium 0,1 M, pH 7,0 et mélanger par retournement. Ajouter 1 ml de la dilution à une plus 9 ml de tampon phosphate, et répéter jusqu'à ce qu'une dilution en série de 10 -8 soit atteinte.
    2. Étaler 100 pi des 10 -4 et 10 -8 dilutions sur une gélose LB, en double exemplaire. Incuber les plaques O / N à la même température utilisée pour la culture mixte initial. Les plaques peuvent ensuite être stockés à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire, mais il est préférable de traiter les colonies isolées assez rapidement.
  2. Sélection de colonie unique et préparation d'ADN bouillie:
    1. Choisissez des colonies isolées à partir des plaques de dilution de série, soilecte autant de types de colonies différentes que possible, en utilisant des critères tels que la taille de la colonie, la forme et la couleur. Utiliser des cure-dents stériles pour sélectionner des colonies isolées de la plaque de diffusion.
    2. Touchez le cure-dent à la colonie, puis transférer dans un tube PCR contenant 100 pi d'eau stérile. Si un grand nombre de colonies doivent être examiné, puis les colonies peuvent être préparés dans une plaque de microtitrage. Faites tourner le cure-dent entre les doigts pour déloger certaines des cellules dans l'eau.
    3. En utilisant la même cure-dent, inoculer une plaque LB avec une strie de la colonie. Un grand nombre de colonies peuvent être stockés sur des plaques marquées si chaque série est d'environ 1 cm de long. Répétez les étapes 1 à 3 jusqu'à ce que vous avez sélectionné un nombre approprié d'isolats.
    4. Incuber les plaques LB O / N, à la même température que celle utilisée pour la culture d'enrichi initial. Les cultures peuvent ensuite être conservés à 4 ° C jusqu'à utilisation.
    5. Pour la préparation de l'ADN à partir des suspensions bactériennes, suivez les étapes que oustlined dans la section 3.1. Pour le dépistage de lysats de culture pure, effectuer le / HS464 PCR HS463a comme indiqué à la section 3.2. Isolats qui renvoient une PCR positive sera utilisé pour la préparation de l'ADN génomique (section 5), et pour d'autres analyses.

5. Colonies simples ADN génomique Extraction de Integron-positifs Utilisation Perle Battre 25

  1. Inoculer 5 ml de bouillon LB avec un échantillon de la culture pure isolée dans la section 4.2. Incuber O / N, en agitant à la même température que celle utilisée pour la culture enrichi initial.
  2. Pellet cellules à 4000 g pendant 7 min, puis retirez le surnageant. Reprendre le culot cellulaire dans 1 ml de solution CLS-TC dans un tube de préparation rapide Lysing Matrice E. En utilisant une machine de battage bourrelet, traiter l'échantillon à 5,5 m / s pendant 30 s.
  3. tube de centrifugeuse à 14 000 xg pendant 5 min et récupérer 700 pl de surnageant dans un tube stérile de 1,5 ml.
  4. Ajouter 700 pi de matrice de liaison dilué 1: 5 à 6 M guanidinium THIOCYANATE et mélanger à température ambiante pendant 5 min. Centrifugeuse à 14.000 g pendant 1 min, surnageant défausse.
  5. Ajouter 800 ul de lavage à l'éthanol de sel (70% d'éthanol, 0,1 M d'acétate de sodium) et le vortex jusqu'à ce que le culot est remis en suspension entièrement. Laver pendant 5 min à température ambiante, centrifugeuse à 14.000 g pendant 1 min et éliminer le surnageant. Assurez-vous tout surnageant a été retiré, en utilisant une micropipette si nécessaire, puis laisser sécher à l'air pendant 5 min.
  6. Remettre en suspension le culot de matrice dans 200 ul de TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,6) par pipetage de haut en bas. Incuber à température ambiante pendant 3 min. Centrifuger à 14 000 g pendant 3 min et le transfert de 160 ul de l'ADN élue dans un tube stérile. Exécuter une aliquote de l'extraction de l'ADN génomique sur un gel d'agarose à 2% p / v de vérifier le rendement et l'intégrité de l'extraction de l'ADN. L'ADN génomique purifié est stocké à -20 ° C et décongelés sur de la glace lorsque cela est nécessaire pour les tests de PCR.

6. PCR de diagnostic et séquençage de l'ADN

NOTE: Lel'ADN génomique préparé à l'article 5 sera utilisé pour toutes les PCR de diagnostic, et pour confirmer le test positif pour intégrons de classe 1.

  1. Décongeler l'ADN génomique sur la glace, Vortex brièvement l'échantillon d'ADN et l'impulsion de spin à 14.000 g pendant 20 sec. Répétez le PCR pour le gène de classe 1 de intégron-intégrase utilisant HS463a / HS464 (tableau 1), ce qui confirme que l'isolat est positif pour l'amplicon de 471 pb (section 3.2).
  2. Identification des cultures positives à niveau de l'espèce est obtenue par l'analyse de la petite sous-unité de gène ARNr (ADNr 16S). Amplifier le gène 16S utilisant les amorces F27 / r1492 (tableau 1). Vérifiez les produits de PCR par électrophorèse. Toutes les cibles bactériennes devraient générer un amplicon 16S d'environ 1450 pb.
  3. Séquence du gène amplicon ARNr 16S pour déterminer l'identité de l'espèce, mais comme il ya probablement plusieurs PCR positifs de l'étape 6.2, et beaucoup de ces points positifs seront les mêmes espèces bactériennes, nous allons d'abord distinguer les différentes espèces using digestion de restriction du produit PCR 16S.
    1. Digérer un aliquote de la PCR 16S avec l'enzyme de restriction Hinf 1. Toute enzyme qui reconnaît les sites de clivage de 4 pb feront, mais Hinf 1 génère une bonne diversité d'objectifs de 16S, et est, une enzyme fiable et économique.
  4. Mettre en place une restriction de 30 ul digérer mastermix (tableau 2) dans un tube stérile et ajouter 20 ul de produit PCR 16S non purfied. Incuber dans un bain à 37 ° C de l'eau O / N. Vérifiez la digestion sur un gel agarose à 2%.
  5. Note les profils de digestion produites par Hinf 1. Les isolats avec le même profil de restriction 16S sont susceptibles d'être la même espèce. Plutôt que de séquençage de chaque produit PCR 16S, séquence au plus trois représentants de chaque motif de restriction Hinf 1.
  6. Purifier les produits PCR 16S en utilisant un kit commercial. Un kit d'exonucléase simple brin peut être utilisé, mais basée colonne ou des procédés de précipitation fonctionne aussi bien pour enlever Unincamorces orporated et des ADN simple brin. Séquence amplicons 16S en utilisant l'amorce r910 (tableau 1), mise en place des réactions comme spécifié par l'installation de séquençage.
  7. Utilisation de la séquence d'ADN résultant d'interroger la base de données NCBI d'ADN avec la fonction de BLASTN ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ). D'identité en nucléotides supérieur à 97% est généralement considéré comme l'identité de l'espèce.

7. Cartographie et caractérisation des intégrons et cassettes Arrays

NOTE: Classe 1 intégrons émanant écosystèmes dominés par les humains sont susceptibles d'être intégrons les plus communs dans tous les échantillons. Ces intégrons tous avoir une origine unique récente, et donc avoir une séquence d'ADN hautement conservée 5.

  1. La différence entre un intégrons de classe 1 émanant de sources humaines et ceux qui se produisent naturellement dans des échantillons environnementaux en effectuant unePCR avec l'amorce fixée intI1F165 / intI1R476 10 (tableau 1).
    NOTE: intégrons de classe 1 de bactéries commensales ou cliniques vont générer un produit ~ 300 pb, tandis que la classe environnementale 1 intégrons ne génèreront pas de produit.
  2. Caractériser les intégrons cliniques en amplifiant le tableau de cassette avec ensemble d'amorces HS458 / HS459. Cette PCR amplifier la région entre intI1 segment conservé et l'extrémité 3 'à l'extrémité de la plupart des ensembles de cassettes. Parce que le nombre et l'identité des cassettes est variable, la taille du produit de PCR varie également.
  3. Purifier amplicons et séquencer l'ADN en utilisant chacune des amorces d'amplification. Utiliser des séquences d'interroger les bases de données d'ADN en utilisant la fonction de blastn ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ).
  4. Veiller à nommer des cassettes suivre la nomenclature normalisée 9, puisque de nombreux dépôts de données pour cassette du gène intégrons utiliser des noms incohérentes ou ambiguës. Accorder une attention particulière à de nouvelles cassettes de gènes, puisque ceux-ci peuvent encoder de nouveaux phénotypes, y compris les gènes qui confèrent une transmissibilité interhumaine accrue, la pathogénicité ou la virulence 8,21.
    NOTE: préclinique formes de la classe 1 intégron circulent encore dans les milieux naturels. En particulier, ceux qui sont liés aux actifs Tn 402 transposons sont plus d'intérêt 26. Les tableaux de ces intégrons de cassettes ne seront pas amplifier en présence des amorces HS458 / HS459, mais peuvent être amplifié avec l'MRG284 / MRG285 ensemble d'amorces (tableau 1), générant amplicons de taille variable dépendante sur le contenu de la cassette. Les produits de PCR doivent être purifiés et l'ADN séquencé tel que décrit dans 7.2.

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Representative Results

Projection de cultures mixtes et isolats bactériens pour intI1

Amorce HS463a / HS464 PCR peut être utilisée pour détecter la présence du gène de classe 1 de intégron-intégrase, intI1 (Figure 1). Ce jeu d'amorces fonctionne bien pour détecter intI1 dans les cultures mixtes, et est également utilisé pour cribler des colonies bactériennes récoltées à partir de plaques de propagation (Figure 2). Isolats positifs devraient générer une seule bande forte à 471 pb en utilisant cet ensemble d'amorce (figure 3A). La majorité des isolats positifs portera intI1 qui vient des humains ou leurs animaux agricoles et domestiques. Ces isolats seront également positive dans une PCR en utilisant des amorces F165 / R476, qui devrait générer un amplicon de 311 pb (figure 1). Les sources environnementales de intI1 ne seront généralement pas positif dans ce second test.

Caractérisation des ensembles de cassettes intégron

402 classe -associated de cassettes 1 intégrons peuvent être amplifiés en utilisant des amorces HS458 / HS459. Ces amorces ciblent respectivement le site de recombinaison d'intégron, et l'extrémité 3 'de la matrice de cassette, qui se termine normalement dans le gène qacEΔ de la fusion (figure 1). La taille des produits de PCR générés dans ce dosage varie en fonction du nombre et de l'identité des cassettes dans le tableau (figure 3B). Classe environnementale 1 intégrons sont souvent intégrés dans les chromosomes bactériens, et de leurs réseaux de cassettes peuvent être amplifiés par les amorces qui ciblent proximale et la plupart des sites de recombinaison distales (Figure 1). Les amorces MRG284 / 285 sont conçues pour amplifier cette région, et de plus, parce que le contenu de la cassette est variable, la taille des amplicons varie également (figure 3C). Le séquençage de HS458 / PCR 459produits seront normalement récupérer les déterminants de la résistance aux antibiotiques connus, tandis que le séquençage MRG284 / 285 produits de PCR seront généralement récupérer les cassettes de gènes qui codent pour des polypeptides de fonction inconnue.

L'identification des espèces bactériennes

Les bactéries sont identifiés à l'aide d'ADNr 16S séquençage et de la base de données des comparaisons. L'ADN génomique est utilisé comme matrice pour l'amplification de la petite sous-unité 16S des gènes d'ARNr. En utilisant les amorces ont suggéré, ce qui devrait générer un amplicon de 1450 pb. Étant donné que de grands nombres de colonies peuvent être criblées à la fois, un procédé de criblage hiérarchique est utilisé. 16S produits PCR amplifiés sont digérés avec l'enzyme de restriction Hinf 1, et ces produits de digestion sont séparés sur des gels d'agarose. Les espèces individuelles vont générer des motifs distinctifs après digestion, tels que les isolats de la même espèce peuvent être facilement identifiés (Figure 3D). Le séquençage des produits de PCR du gène de l'ARNr 16S d'un maximum de troisisole représentant tout motif d'une restriction permet l'identification efficace de toutes les espèces susceptibles dans une collection de intégron isolats positifs.

Figure 1
Figure 1. Structure de intégrons de classe 1. Diagrammes schématiques de classe clinique et de l'environnement 1 intégrons, montrant amorce PCR sites de liaison mentionné dans le manuscrit. Classe 1 intégrons consistent en un gène intégron-intégrase (intI1) qui catalyse la capture et l'expression de cassettes de gène pour former un réseau de cassette. Avant l'avènement de l'utilisation des antibiotiques, la majorité des intégrons de classe 1 étaient chromosomique, et réalisée cassettes de gènes dont les fonctions sont encore à déterminer. Forte sélection via l'utilisation d'antibiotiques a considérablement augmenté l'abondance d'une variante de la séquence de la classe 1 intégron associé à la transposon Tn 402.Ces intégrons «clinique» ont acquis des tableaux de cassettes qui codent pour la résistance aux antibiotiques. Ce sont ces intégrons qui sont actuellement polluent les milieux naturels et de la chaîne de production alimentaire. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Schéma organigramme pour détecter intégrons de classe 1 dans les denrées alimentaires. Les échantillons de denrées alimentaires sont utilisés pour inoculer des médias et de générer une culture bactérienne mixte. Ces cultures mixtes sont criblés pour la présence des intégrons de classe 1, et de cultures positives utilisés pour préparer des plaques propagation. Des colonies individuelles des plaques étalées sont recriblées pour intégrons. Les cultures positives sont purifiés, l'ADN extrait et caractérisé pour le contenu de la cassette par l'ADN soiéchelonnement. Le séquençage du gène ARNr 16S est utilisé pour l'identification des espèces. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. électrophorétique Représentant analyse du processus de sélection. (A) Dépistage des colonies isolées en utilisant intI1 amorces HS463a / 464. Les colonies positives génèrent une forte bande unique à 471 pb. (B) Amplification de réseaux de cassettes de Tn 402 intégrons en utilisant des amorces HS458 / 459. Cette PCR génère produit tailles variables dépendant de l'identité et de la taille des cassettes de composants dans le réseau. L'identification de ces cassettes nécessite un séquençage d'ADN. (C) Amplification de réseaux de cassettes de la classe environnementale 1 integrons en utilisant des amorces MRG284 / 285. Cette PCR génère également des produits de tailles variables dépendant de l'identité et de la taille des cassettes de composants de la matrice, cependant cassettes dans les tableaux environnementales sont peu susceptibles de coder pour la résistance aux antibiotiques. (D) Le dépistage de produits PCR 16S par digestion avec Hinf 1. Les isolats avec des motifs de restriction identiques sont susceptibles d'être la même espèce. Si un grand nombre d'un seul type de restriction sont récupérés, seulement quelques-uns d'entre eux ont besoin d'être séquencé. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

PCR cible génique Nom Primer Direction Séquence 5 '- 3' Les conditions de cyclage Reference
HS463a / HS464 Classe 1 Integron HS464 Vers L'Avant ACATGCGTGTAAATCATCGTCG 94 ° C 3 min; 35 cycles de 94 ° C 30 sec, 60 ° C 30 sec, 72 ° C 1 min 30 sec; 72 ° C 5 min Stokes et al., 2006 28
HS463a Inverse CTGGATTTCGATCACGGCACG
f27 / r1492 16S rRNA f27 Vers L'Avant AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 94 ° C 3 min; 35 cycles de 94 ° C 30 sec, 60 ° C 30 sec, 72 ° C 1 min 30 sec; 72 ° C 5 min Lane, 1991 29
r1492 Inverse TACGGYTACCTTGTTACGACTT
intI1F165 / IntI1R476 Classe clinique 1 de intégron intI1F165 Vers L'Avant CGAACGAGTGGCGGAGGGTG 94 ° C 3 min; 35 cycles de 94 ° C 30 sec, 55 ° C 30 sec, 72 ° C 1 min 30 sec; 72 ° C 5 min Gillings 2014 10
intI1R476 Inverse TACCCGAGAGCTTGGCACCCA
HS549 / HS550 3'CS clinique Integron HS549 Vers L'Avant ACTAAGCTTGCCCCTTCCGC 94 ° C 3 min; 35 cycles de 94 ° C 30 sec, 65 ° C 30 sec, 72 ° C 1 min 30 sec; 72 ° C 5 min Stokes et al., 2006 28
HS550 Inverse CTAGGCATGATCTAACCCTCGG
HS458 / HS459 Tableau clinique de la cassette HS458 Vers L'Avant GCAAAAAGGCAGCAATTATGAGCC 946; C 3 min; 35 cycles de 94 ° C 30 sec, 55 ° C 30 sec, 72 ° C 1 min 30 sec; 72 ° C 5 min Holmes et al., 2003 30
HS459 Inverse GTTTGATGTTATGGAGCAGCAACG
MRG284 / MRG285 La cassette de l'environnement MRG284 Vers L'Avant GTTACGCCGTGGGTCGATG 94 ° C 3 min; 35 cycles de 94 ° C 30 sec, 55 ° C 30 sec, 72 ° C 1 min 30 sec; 72 ° C 5 min Gillings et al., 2009 21
MRG285 Inverse CCAGAGCAGCCGTAGAGC

Tableau 1. séquences des amorces et des conditions de PCR utilisées pour identifier les intégrons de classe 1 et leurs cassettes de gènes associés.

Tableau 2. PCR et digestion de restriction mastermix électeurs.

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Discussion

L'identification des intégrons et leurs cassettes de gènes associés est potentiellement une étape clé dans la prédiction de l'émergence de nouveaux pathogènes opportunistes, suivi des voies pour les agents pathogènes dans la chaîne alimentaire humaine, et l'identification de nouvelles résistances et de la virulence déterminants 8,21,26. Le but de cet article était de décrire une approche rationalisée pour le dépistage des échantillons pour intégrons de classe 1, caractérisant leurs tableaux de cassettes et d'identifier les espèces bactériennes dans lequel ils résident. Les étapes critiques dans le protocole impliquent bonne pratique microbiologique et prévenir la contamination PCR qui seraient générer de faux positifs.

Le protocole décrit ici peut être facilement modifié pour détecter d'autres intégrons cliniquement pertinents, y compris la classe 2 et classe 3 intégrons que l'on retrouve dans les pathogènes humains. Il peut également être modifié pour détecter les intégrons dans les communautés microbiennes de l'eau, les biofilms, le sol ou les sédiments. Il ya quelques limitations à cette technique qui se pose à partir d'une dépendance à l'égard de la culture de cellules bactériennes. Beaucoup de bactéries de l'environnement ne sont pas facilement cultivable et le protocole décrit ici ne seraient pas détecter ces espèces. La gamme des espèces qui sont récupérés pourrait être étendue en utilisant différentes formulations de milieux bactérienne et des temps d'incubation. Néanmoins, la majorité des espèces d'intérêt pour la santé humaine sont susceptibles de se développer dans les conditions décrites ici.

Ce protocole a quelques avantages sur les techniques qui utilisent de placage sur des milieux sélectifs. Pas hypothèses doivent être prises au sujet de l'identité des déterminants de la résistance menées par des isolats individuels, et de nouveaux gènes de résistance peut être récupéré et caractérisé. En termes plus généraux, le flux de travail peut également être adapté pour détecter tout élément de la mobilome résistome 27 ou qui pourraient être d'intérêt 4. De tels dosages sont importants pour la compréhension de la dynamique des différents éléments d'ADN impliquées dans unetibiotic résistance, et critique pour la conservation de l'arsenal diminution des composés antimicrobiens.

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Disclosures

Les auteurs ont rien de pertinent de divulguer.

Acknowledgments

Merci à Michaela Hall, Larissa Bispo et Gustavo Tavares pour l'assistance technique.

Materials

Réactifs de PCR Volume (pi) Restriction réactifs digest Volume (pi)
Eau stérile 21,5 Eau stérile 23
10x GoTaq Blanc 25 Tampon B 5
RNase A [1 mg / ml] 0,5 Albumine de sérum bovin [1 mg / ml] 1
Forward Primer [50 uM] 0,5 HinfI [10 unités / ul] 1
Amorce inverse [50 uM] 0,5
Le volume Mastermix 48 Le volume Mastermix 30
matrice d'ADN 2 Template PCR 20
Le volume final de PCR 50 Restriction dernier volume digest 50
Name Company Catalog Number Comments
GoTaq Colourless Mastermix Promega M7132 Used in all PCRs
RNAse (Ribonuclease A from bovine pancreas) Sigma R6513-10MG Used in all PCRs
HinFI restriction enzyme Promega R6201 Used to digest 16S rDNA PCR poducts. Enzyme comes with optimal buffer and BSA
100 bp ladder GE Healthcare 27400701 Used as a size standard on all agarose gels
GelRed DNA stain Biotium 41003 CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material
Guanidinium thiocyanate Life Technologies AM9422 CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material
CLS-TC Solution MP Biomedicals 6540409 Resuspension solution used at the begining of the genomic DNA extraction
Lysing Matrix E FastPrep tubes MP Biomedicals 116914500 Tube required for mechanical disruption of bacterial cell walls. This code is used for packs of 500 tubes, smaller quantities are available.
Binding matrix MP Biomedicals 116540408 Diluted 1:5 with 6 M guanidinium thiocyanate and used in the genomic DNA extraction method.
Fast Prep machine MP Biomedicals Number of options available MP Biomedicals has a number of FastPrep machines available to purchase. Visit http://www.mpbio.com for more information

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Dépistage denrées alimentaires pour les intégrons de classe 1 et Gene Cassettes
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Waldron, L. S., Gillings, M. R.… More

Waldron, L. S., Gillings, M. R. Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes. J. Vis. Exp. (100), e52889, doi:10.3791/52889 (2015).

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