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Screening-Lebensmittel, die für Klasse 1 und Integrons Genkassetten

Published: June 19, 2015 doi: 10.3791/52889
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Macquarie University

Introduction

Die Entdeckung der Antibiotika war eine der größten wissenschaftlichen Errungenschaften des 20. Jahrhunderts. Allerdings hat der Gebrauch und Missbrauch von Antibiotika, um der raschen Entwicklung von Antibiotika-resistenten Bakterien geführt, und diese nun eine ernsthafte Bedrohung für die öffentliche Gesundheit in das 21. Jahrhundert. Der Aufstieg der Bakterienstämme resistent gegen die meisten Behandlungsmöglichkeiten eröffnet die Möglichkeit, betreten wir eine Ära, in der antimikrobiellen Arzneimitteln nicht mehr wirksam sind 1,2.

Die genetische Maschinerie, die Antibiotika-Resistenz ist ein altes System, Zeit vor Menschen und antibiotischen Selektionsdruck durch Millionen von Jahren 3. Mobile genetische Elemente, wie Plasmiden, Transposons, genomische Inseln integrative konjugativen Elemente und Integrons kann Antibiotikaresistenzgenen (ARG) innerhalb und zwischen den Bakterienspezies 4 verbreiten. Von diesen wurden Integrons eine zentrale Rolle bei der Verbreitung von ARG trotz der spielte,Tatsache, dass sie verlassen sich auf Plasmide und Transposons für die Mobilisierung und das Einsetzen in bakterielle Genome 5. Integrons erfassen Genkassetten mit einem Integron-Integrase und dann zum Ausdruck Kassetten unter Verwendung eines Promotors codiert Integron 6,7 (Abbildung 1). Integron Genkassetten sind kleine mobile Elemente aus einzelnen offenen Leserahmen (ORF), deren Produkte Resistenz gegenüber Antibiotika oder Desinfektionsmittel 8. Klasse 1 Integrons die Integrons am häufigsten aus klinischen Isolaten 5, wo sie zusammen über 130 verschiedene Antibiotikaresistenzgen Kassetten 9 erfasst gewonnen.

Die Verbreitung der Klasse 1 Integrons in menschliche assoziierten kommen und pathogenen Bakterien erzeugt menschlichen Abfallströme, die eine große Zahl von diesen genetischen Elemente 10 enthalten. Schätzungsweise 10 19 Bakterien, die Klasse 1 Integrons enthalten, werden über Klärschlamm pro Jahr i freigegebenn Großbritannien 11. Es ist daher nicht verwunderlich, dass der Klasse 1 Integrons verleihen Antibiotikaresistenzen werden nun in Mikrobiota von wilden Vögel, Fische und andere einheimische Tierwelt 12-14 erkannt. Loslassen Integrons wieder an die Umgebung stellt eine erhebliche Bedrohung der öffentlichen Gesundheit, da Akquisition neuer Gen-Kassetten und komplexe Umlagerungen mit anderen mobilen Elementen auftritt weiterhin, insbesondere in Kläranlagen und anderen Gewässern 15-18. Die natürliche Umwelt wird dann zu einem fruchtbaren Rekrutierungsfeld für neue Resistenzdeterminanten und opportunistische Infektionen 19,20. Novel Integron haltigen Bakterien und neue ARG zurück in die menschliche Gemeinschaft durch verunreinigtes Wasser und Lebensmittel 21,22 umrunden. Überwachung der Umwelt ARG ist eine Schlüsselstrategie für das Verständnis und die Verwaltung Antibiotikaresistenz in der Zukunft 23. Insbesondere sollten ihr Augenmerk auf Nahrungsmittel zu achten, die roh gegessen werden oderleicht gekocht, denn diese stellen die größte Bedrohung für die Übertragung von neuen mobilen Elementen und Krankheitserreger.

In diesem Protokoll einen optimierten Ansatz zur Erfassung, Identifizierung und Charakterisierung der Klasse 1 Integrons und ihre zugehörigen Genkassetten in Lebensmitteln werden skizziert (Abbildung 2). Verwendung einer Kombination von Kultivierung und Polymerasekettenreaktion (PCR) kann Integrons schnell komplexe Bakteriengemeinschaften und individuellen Isolaten nachgewiesen werden. Verfahren zum Identifizieren der Arten von Bakterien und die Konformation und die Identität der Integron assoziierten Genkassetten werden angegeben. Das Verfahren eignet sich für eine breite Palette von pflanzlichen und tierischen Lebensmitteln, und Beispiele für typische Arbeitsabläufe sind für jede dieser Arten von Lebensmitteln gegeben.

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Protocol

Lebensmittel, die roh gegessen werden oder leicht gekocht sind die größten Bedenken für die menschliche Gesundheit. Beispiele hierfür sind Salat Gemüse, Obst, Schalen- und Krustentieren.

1. Probenentnahme

  1. Die Proben werden unter Bedingungen, die Kontamination zu minimieren, und in getrennte, saubere Säcke beim Transport gespeichert. Sobald sie aufgenommen sind, sind die Proben bei 4 ° C gelagert und innerhalb von 24 Stunden verarbeitet werden.

2. Enriched Kultur Vorbereitung

  1. Obst und Gemüse:
    1. Zeigen ca. 10 g Material in einem haltbaren Kunststoffbeutel. Wenn Verarbeitung größerer Material, konzentrieren sich auf die Haut der Frucht oder Gemüse. 90 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0 und Verfahren in einem Schaufelmischer für 30 Sekunden. Alternativ kann das Material von Hand bewegt werden, wenn eine Blattmischer ist nicht verfügbar.
    2. Sammeln Sie die Flüssigkeit in zwei 50 ml-Falcon-Röhrchen. Zentrifugenröhrchen bei 4000 × g für 7 min zu Pellets Bakterien. In 30 ml sterile Luria Bertani (LB) Brühe Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und suspendieren die pelletierten Bakterien.
    3. Inkubieren auf einem Schüttler O / N, hält eine Röhre bei 25 ° C und die andere bei 37 ° C. Die Kulturen sollten bei 200 Schwingungen pro Minute (OPM) geschüttelt werden. Speicher-Kulturen bei 4ºC bis zur Verwendung.
  2. Meeresfrüchte:
    1. Sezieren den Magen (Austern) oder Verdauungstrakt (Garnelen) mit einer sterilen Pinzette und Pinzette und in einen sterilen 1,5-ml-Röhrchen mit 200 ul 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0. Mazeration der Probe um ein Homogenat zu erstellen.
    2. Verzichtet werden 5 ml LB-Brühe in zwei sterile 5 ml Röhrchen und impfen jeweils mit der Meeresfrüchte Homogenat.
    3. Inkubieren auf einem Schüttler O / N, hält eine Röhre bei 25 ° C und die andere 37 ° C. Die Kulturen sollten bei 200 opm geschüttelt werden. Speicher-Kulturen bei 4ºC bis zur Verwendung.

3. Screening Kulturen für Integrons

2 -Konzentration von 2,5 mM. Falls erforderlich, hat Lorenz (2011) 24 PCR-Optimierung und Methoden zur Problembehandlung in einer früheren Ausgabe dieser Zeitschrift beschrieben.

  1. Gekochte DNA-Präparation:
    1. Dispense 100 ul angereicherten Kultur in ein steriles 0,5 ml PCR-Röhrchen. Erhitzen Sie die Probe auf 99 ° C für 10 Minuten, mit einem Wasserbad oder Wärmeblock. Snap Chill auf Eis für 2 min.
    2. Mikrozentrifuge bei 14.000 × g für 5 min, um die Zelltrümmer zu pelletieren. Zurück zu Eis. DNA-Proben können bei -20 ° C eingefroren werden, bis sie benötigt wurden, sondern muss auf Eis aufgetaut werden.
  2. Screening für Klasse 1 Integrons mittels PCR:
    ANMERKUNG: Mischkulturen aus dem O / N Inkubation für Klasse 1 Integrons Verwendung des HS463a / HS464-PCR-Protokoll (Tabelle 1) untersucht.
    1. Auftauen alle PCR-Reagenzien auf Eis, weg von jeder potenzielle souRCEs kontaminierender DNA. Make-up 48 & mgr; l PCR Mastermix pro Probe, einschließlich Negativkontrollen (Tabelle 2). Verzichtet werden 48 ul der PCR-Master-Mix zu jedem Röhrchen mit Barrierespitzen.
    2. In 2 ul DNA aufgetaut, um einzelne PCR-Gefäße mit Barriere-Tipps. Führen entsprechende Programm in der PCR-Thermocycler.
    3. Um die Ergebnisse der Verstärkung zu bewerten, Elektrophorese 7 ul des PCR-Produkts auf einem 2% Agarosegel gegossen und in TBE-Puffer (90 mM Tris-Borat, 2 mM EDTA) durchgeführt. Gehören ein Molekulargewichtsmarker, wie beispielsweise ein 100 bp Leiter.
    4. Beitrag färben das Gel mit einem DNA-Färbung, und visualisieren mit einem UV-Transilluminator. Überprüfen Sie, hat es keine Verstärkung in der negativen Kontrolle. Eine starke Bande bei etwa 470 bp für eine bestimmte Probe zeigt, dass die Mischkultur enthält Bakterien, die eine Klasse 1 Integron tragen. Reine Kolonien werden nun von einem beliebigen Mischkultur, die einen positiven PCR zurück isoliert werden.

  1. Reihenverdünnungen und Verbreitung Platten:
    ANMERKUNG: Um einzelne Kolonien aus den PCR-positiven Mischkulturen zu isolieren, wird der Mischkultur seriell 10-fach verdünnt in Natriumphosphatpuffer und ausplattiert, um einzelne Kolonien zu gewinnen dann.
    1. 1 ml der Mischkultur zu 9 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0 und Mischen durch Umdrehen. 1 ml der Verdünnung auf eine weitere 9 ml Phosphatpuffer, und wiederholen, bis eine serielle Verdünnung von 10 -8 erreicht ist.
    2. Striches 100 ul der 10 -4 bis 10 -8 Verdünnungen auf LB Agar, doppelt vorhanden. Die Platten O / N Inkubieren bei der gleichen Temperatur für die anfängliche Mischkultur verwendet wird. Die Platten können dann bei 4 ° C bis zur Verwendung gelagert werden, jedoch ist es am besten, um die einzelnen Kolonien ziemlich umgehend bearbeiten.
  2. Einzelkolonie Auswahl und gekochten DNA-Präparation:
    1. Wählen Sie einzelne Kolonien aus den Verdünnungsplatten, selecting so viele verschiedene Kolonietypen wie möglich, anhand von Kriterien wie Koloniegröße, Form und Farbe. Verwenden sterilen Zahnstochern zu Einzelkolonien aus der Verbreitung Platte auswählen.
    2. Tippen Sie auf die Zahnstocher in die Kolonie, und dann in ein PCR-Röhrchen, das 100 & mgr; l sterilem Wasser zu übertragen. Wenn eine große Anzahl von Kolonien zu sehen sein, dann können Kolonien in einer Mikrotiterplatte hergestellt werden. Drehen Sie die Zahnstocher zwischen den Fingern, um einige der Zellen in das Wasser zu entfernen.
    3. Mit der gleichen Zahnstocher, impfen eine LB-Platte mit einem Streifen von der Kolonie. Eine große Zahl von Kolonien auf markierten Platten gespeichert werden, wenn jeder Streifen etwa 1 cm lang. Wiederholen Sie die Schritte 1 bis 3, bis Sie eine geeignete Anzahl von Isolaten ausgewählt haben.
    4. Inkubieren LB Platten O / N, bei der gleichen Temperatur wie bei der anfänglichen Anreicherungskultur verwendet. Kulturen können dann bei 4 ° C gelagert werden.
    5. Zur Herstellung von DNA aus den Bakteriensuspensionen, gehen Sie wie ouin Abschnitt 3.1 tlined. Für das Screening von Reinkultur Lysaten, führen Sie die HS463a / HS464 PCR, wie in Abschnitt 3.2 beschrieben. Isolate, dass eine positive Rück PCR wird zur Herstellung von genomischer DNA (Abschnitt 5) verwendet werden, und für weitere Analysen.

5. Die genomische DNA Extraktion von Integron-positive Einzelkolonien Mit Bead Beating 25

  1. Impfen 5 ml LB-Brühe mit einer Probe der Reinkultur isoliert in Abschnitt 4.2. Inkubieren O / N, bei gleicher Temperatur, die für die anfängliche Anreicherungskultur verwendet wurde Schütteln.
  2. Pellet-Zellen bei 4.000 g für 7 min, dann entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren der pelletierten Zellen in 1 ml CLS-TC-Lösung in einem Lysismatrix E schnell prep Rohr. Mit einer Perlmühle Mahlmaschine, verarbeiten die Probe bei 5,5 m / s für 30 s.
  3. Zentrifugenröhrchen bei 14000 × g für 5 min und Wiederherstellen 700 ul Überstand in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen.
  4. Fügen Sie 700 ul Bindematrix verdünnt 1: 5 mit 6 M guanidinium Thiocyanat und mischen bei RT 5 min. Zentrifuge bei 14.000 × g für 1 min, Überstand verwerfen.
  5. Zugabe von 800 ul Ethanolwaschsalz (70% Ethanol, 0,1 M Natriumacetat), vortexen, bis das Pellet vollständig resuspendiert ist. Waschen für 5 min bei RT, Zentrifuge bei 14.000 · g für 1 min und Überstand verwerfen. Stellen Sie sicher, alle Überstand entfernt worden ist, mit einer Mikropipette bei Bedarf dann an der Luft trocknen lassen für 5 Minuten.
  6. Das Pellet in 200 & mgr; l Matrix TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,6) durch Auf- und Abpipettieren. Inkubieren bei Raumtemperatur für 3 min. Zentrifuge bei 14.000 × g für 3 min und Transfer 160 ul der eluierten DNA in einem sterilen Röhrchen. Führen Sie einen aliquoten Teil der genomischen DNA-Extraktion auf einem 2% w / v Agarosegel, um die Ausbeute und die Integrität der DNA-Extraktion zu überprüfen. Die gereinigte genomische DNA wird bei -20 ° C gelagert und auf Eis aufgetaut, wenn für die PCR-Tests erforderlich.

6. Diagnostische PCR und DNA-Sequenzierung

HINWEIS: Derin Abschnitt 5 hergestellte genomische DNA wird für alle diagnostischen PCR verwendet werden, und um den positiven Test für Klasse 1 Integrons bestätigen.

  1. Auftauen genomischer DNA auf Eis, die DNA-Probe und Impuls Spin Vortexen bei 14.000 · g für 20 sec. Wiederholen Sie die PCR für die Klasse 1 Integron-Integrase-Gens unter Verwendung HS463a / HS464 (Tabelle 1), was bestätigt, dass das Isolat positiv für das 471 bp Amplikon (Abschnitt 3.2).
  2. Identifizierung positiver Kulturen zur Art wird durch Analyse des kleinen rRNA-Untereinheit-Gens (16S rDNA) erreicht. Verstärken die 16S-Gens unter Verwendung von Primern F27 / r1492 (Tabelle 1). Überprüfen Sie die PCR-Produkte mit Hilfe der Elektrophorese. Alle bakterielle Ziele sollten einen 16S Amplikon von etwa 1450 bp zu erzeugen.
  3. Sequenz des 16S-rRNA-Gen-Amplikons zu Spezies Identität zu bestimmen, da es jedoch wahrscheinlich mehrere positive PCRs aus Stufe 6.2 werden, und viele von diesen werden die gleichen positiven bakteriellen Spezies, werden wir zuerst unterscheiden verschiedene Arten using Restriktionsverdau der 16S-PCR-Produkt.
    1. Verdauen ein Aliquot der PCR-16S mit dem Restriktionsenzym Hinf 1. Jedes Enzym, das erkennt 4 bp Spaltstellen werden zu tun, aber Hinf 1 erzeugt gute Vielfalt von 16S-Ziele, und ist eine zuverlässige, kostengünstige Enzym.
  4. Bis 30 & mgr; l Restriktionsmengen verdauen Mastermix (Tabelle 2) in einem sterilen Röhrchen und fügen Sie 20 ul un-purfied 16S-PCR-Produkt. Inkubieren in einem 37 ° C Wasserbad O / N. Überprüfen des Digests auf einem 2% Agarosegel.
  5. Ergebnis der von Hinf 1 hergestellt Verdauung Mustern. Isolate mit derselben 16S Restriktionsprofil sind wahrscheinlich die gleichen Spezies. Anstatt Sequenzierung jedes 16S PCR-Produkt, Sequenz höchstens drei Vertretern jeder Hinf 1 Restriktionsmuster.
  6. Aufreinigung der 16S-PCR-Produkte unter Verwendung eines kommerziellen Kits. Ein Einzelstrang-Exonuklease-Kit kann verwendet werden, aber anhand Spalte oder Fällungsverfahren auch gut zu entfernen unincorporated Primer und Einzelstrang-DNAs. Sequenz, die das 16S Amplicons unter Verwendung von Primer R910 (Tabelle 1), die Einrichtung, die Reaktionen, wie durch die Sequenzierung Anlage festgelegt.
  7. Verwenden Sie das resultierende DNA-Sequenz, die NCBI DNA-Datenbank mit dem blastn Funktion (verhören http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ). Mehr als 97% Nukleotid-Identität wird in der Regel als Arten Identität gemacht.

7. Kartierung und Charakterisierung von Integrons und Kassetten-Arrays

HINWEIS: Klasse 1 Integrons von Menschen dominierten Ökosystemen ausgeh sind wahrscheinlich die häufigsten Integrons in allen Proben sein. Diese Integrons alle einen letzten einzigen Ursprung, und haben daher eine hoch konservierte DNA-Sequenz 5.

  1. Unterscheiden zwischen einer Klasse 1 Integrons aus menschlichen Quellen ausgehen und die, die in Umweltproben natürlich vorkommen, indem einPCR mit Primersatz intI1F165 / intI1R476 10 (Tabelle 1).
    HINWEIS: Klasse 1 Integrons von klinischen oder kommensalen Bakterien ein ~ 300 bp-Produkt zu erzeugen, während der Umweltklasse 1 Integrons wird jedes Produkt erstellen.
  2. Charakterisierung der klinischen Integrons durch Verstärken der Kassette Array mit Primer-Set HS458 / HS459. Dieses PCR wird die Region zwischen intI1 und konservierten Segment der 3'an der Endstation der meisten Kassetten Arrays zu verstärken. Da die Anzahl und die Identität der Kassetten variabel ist, wird die Größe des PCR-Produkts variieren.
  3. Reinige Amplicons und Reihenfolge der DNA unter Verwendung jeder der Amplifikationsprimer. Verwenden Sequenzen DNA-Datenbanken mit dem blastn Funktion (verhören http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ).
  4. Stellen Sie sicher, die Benennung von Kassetten folgen standardisierte Nomenklatur 9, da viele Daten Abscheidungen für Integron Genkassettes verwenden inkonsistent oder nicht eindeutige Namen. Sie besonderes Augenmerk auf neue Gen-Kassetten, da diese neue Phänotypen kodieren, darunter Gene, die erhöhte Durchlässigkeit, Pathogenität oder Virulenz 8,21 verleihen.
    HINWEIS: Präklinische Formen des Klassen 1 Integron zirkulieren immer noch in der natürlichen Umwelt. Insbesondere diejenigen, die aktive Transposons Tn 402 verbunden sind, sind von besonderem Interesse 26. Die Kassette Arrays dieser Integrons nicht mit Primer-Set HS458 / HS459 verstärken, kann aber mit dem MRG284 / MRG285 Primer-Set (Tabelle 1) amplifiziert werden, erzeugen Amplikons variabler Größe abhängig von Kassetteninhalt. PCR-Produkte sollten gereinigt und DNA sequenziert, wie in 7.2 beschrieben.

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Representative Results

Screening von Mischkulturen und bakteriellen Isolate intI1

Primer-Set HS463a / HS464 PCR kann verwendet werden, um das Vorhandensein von der Klasse 1 Integron-Integrase-Gen, intI1 (Abbildung 1) zu erkennen. Diese Primer-Set eignet sich gut zur Erfassung intI1 in Mischkulturen, und wird auch verwendet, um Bakterienkolonien von Verteilerhaube (Abbildung 2) geerntet Bildschirm. Positive Isolate sollte eine einzige starke Bande bei 471 bp mit diesem Primer-Set (3A) zu erzeugen. Der Großteil der positiven Isolaten durchführen wird intI1, die von Menschen oder ihre landwirtschaftlichen und Haustieren entstanden ist. Diese Isolate werden ebenfalls positiv in einer PCR unter Verwendung von Primern F165 / R476, der ein 311 bp Amplikon (Figur 1) erzeugen soll. Umweltquellen intI1 wird in der Regel nicht positiv in diesem zweiten Test sein.

Charakterisierung von Integron Kassette Arrays

402 assoziierte Klasse 1 Integrons kann unter Verwendung von Primern HS458 / HS459 verstärkt werden. Diese Primer jeweils gezielt die Integron Rekombinationsstelle, und das 3'-Ende der Kassette Array, die in der Regel endet in der qacEΔ sul1 Genfusion (Abbildung 1). Die Größe der PCR-Produkte in diesem Test erzeugt je nach der Anzahl und Identität der Kassetten in der Anordnung (3B). Umweltklasse 1 Integrons werden häufig in Bakterienchromosomen eingebettet und ihre Kassetten Arrays von den Primern, die den proximalen und am distalen Rekombinationsstellen (Abbildung 1) gezielt verstärkt werden. Primer MRG284 / 285 sind entworfen, um die Region zu amplifizieren, und wieder, weil die Kassette Gehalt variiert, variiert die Grße der Amplikons auch (3C). Die Sequenzierung der HS458 / 459 PCRArtikel werden in der Regel erholen bekannten Antibiotika-Resistenz-Determinanten, während Sequenzierung MRG284 / 285 PCR-Produkte werden in der Regel erholen Genkassetten, die Polypeptide mit unbekannter Funktion kodieren.

Identifizierung von Bakterienspezies

Bakterien werden mit 16S rDNA-Sequenzierung und Datenbankvergleiche identifiziert. Genomische DNA wird als Matrize für die Amplifikation der 16S rRNA der kleinen Untereinheit-Gens verwendet. Unter Verwendung der Primer vorgeschlagen, sollte dies ein Amplikon von etwa 1450 bp zu erzeugen. Weil eine große Anzahl von Kolonien könnte zu einem Zeitpunkt untersucht werden, ist eine hierarchische Screeningverfahren eingesetzt. Amplifizierte 16S PCR-Produkte werden mit dem Restriktionsenzym Hinf 1 verdaut, und diese Sedimente auf Agarosegelen getrennt. Einzelne Spezies unterschiedliche Muster nach Verdau, daß Isolate der gleichen Spezies können leicht identifiziert werden (3D) zu erzeugen. Sequenzierung der 16S-rRNA-Gen-PCR-Produkte von einem Maximum von dreiIsolate, die eine beliebige Restriktionsmuster ermöglicht eine effiziente Identifizierung aller Arten wahrscheinlich in einer Sammlung von Integron positive Isolate.

Abbildung 1
Abbildung 1. Struktur der Klasse 1 Integrons. Schematische Darstellung der klinischen und Umweltklasse 1 Integrons, zeigt PCR-Primer-Bindungsstellen im Sinne des Manuskripts. Klasse 1 Integrons bestehen aus einem Integron-Integrase-Gen (intI1), die die Erfassung und die Expression von Gen-Kassetten katalysiert, um eine Kassette Array zu bilden. Vor dem Aufkommen der Antibiotika-Einsatz, der Großteil der Klasse 1 Integrons waren chromosomale und durch Gen-Kassetten, deren Funktionen noch nicht bestimmt werden. Strong-Auswahl über den Einsatz von Antibiotika hat in beträchtlichem Ausmaß die Fülle von einer Sequenzvariante der Klasse 1 Integron mit der Tn 402 Transposons assoziiert erhöht.Diese 'klinischen' Integrons haben Arrays von Kassetten, die Antibiotika-Resistenz kodieren erworben. Es sind diese Integrons, die derzeit umwelt natürlichen Umwelt und der Lebensmittelkette sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Schematische Ablaufdiagramm zum Erfassen der Klasse 1 Integrons in Lebensmitteln. Die Proben von Lebensmitteln verwendet werden, um Medien zu impfen und erzeugen eine gemischte Bakterienkultur. Diese Mischkulturen werden auf das Vorhandensein der Klasse 1 Integrons gesiebt und positive Kulturen verwendet, um Ausbreitung Platten vorzubereiten. Einzelne Kolonien aus der Verbreitung Platten werden Integrons erneut gescreent. Positive Kulturen werden extrahiert und zum Kassetteninhalt durch DNA se gereinigte DNAquencing. Die Sequenzierung des 16S-rRNA-Gen für Artbestimmung verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Representative elektrophoretische Analysen aus der Screening-Prozess. (A) Screening Einzelkolonien mit intI1 Primer HS463a / 464. Positive Kolonien erzeugen eine starke einzelne Bande bei 471 bp. (B) Amplifikation der Kassette Arrays von Tn 402 Integrons unter Verwendung von Primern HS458 / 459. Diese PCR erzeugt variable Produkt fällt abhängig von der Identität und der Größe der Komponente Kassetten in der Anordnung. Identifizierung dieser Kassetten erfordert DNA Sequenzierung. (C) Amplifikation der Kassette Arrays von Umweltklasse 1 integrons unter Verwendung von Primern MRG284 / 285. Diese PCR erzeugt auch variable Produkt fällt abhängig von der Identität und der Größe der Komponente Kassetten in der Anordnung jedoch Kassetten Umwelt Arrays unwahrscheinlich Antibiotikaresistenz kodieren. (D) Screening der 16S-PCR-Produkte durch Verdauung mit Hinf 1. Isolate mit identische Restriktionsmuster sind wahrscheinlich die gleichen Spezies. Wenn eine große Zahl von einer einzigen Einschränkung Art gewonnen werden, nur ein paar von ihnen müssen sequenziert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

PCR Gene Ziel Primer Namen Richtung Sequenz 5 '- 3' Radfahren Bedingungen Reference
HS463a / HS464 Klasse 1 Integron HS464 Vorwärts ACATGCGTGTAAATCATCGTCG 94 ° C 3 min; 35 Zyklen 94 ° C 30 sec, 60 ° C 30 sec, 72 ° C 1 min 30 sec; 72 ° C 5 min Stokes et al., 2006, 28
HS463a Rückwärts CTGGATTTCGATCACGGCACG
f27 / r1492 16S rRNA f27 Vorwärts AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 94 ° C 3 min; 35 Zyklen 94 ° C 30 sec, 60 ° C 30 sec, 72 ° C 1 min 30 sec; 72 ° C 5 min Lane 1991 29
r1492 Rückwärts TACGGYTACCTTGTTACGACTT
intI1F165 / IntI1R476 Klinische Klasse 1 Integron intI1F165 Vorwärts CGAACGAGTGGCGGAGGGTG 94 ° C 3 min; 35 Zyklen 94 ° C 30 sec, 55 ° C 30 sec, 72 ° C 1 min 30 sec; 72 ° C 5 min Gillings 2014 10
intI1R476 Rückwärts TACCCGAGAGCTTGGCACCCA
HS549 / HS550 3'CS Clinical Integron HS549 Vorwärts ACTAAGCTTGCCCCTTCCGC 94 ° C 3 min; 35 Zyklen 94 ° C 30 sec, 65 ° C 30 sec, 72 ° C 1 min 30 sec; 72 ° C 5 min Stokes et al., 2006, 28
HS550 Rückwärts CTAGGCATGATCTAACCCTCGG
HS458 / HS459 Klinische Kassette Array HS458 Vorwärts GCAAAAAGGCAGCAATTATGAGCC 946; C 3 min; 35 Zyklen 94 ° C 30 sec, 55 ° C 30 sec, 72 ° C 1 min 30 sec; 72 ° C 5 min Holmes et al. 2003 30
HS459 Rückwärts GTTTGATGTTATGGAGCAGCAACG
MRG284 / MRG285 Umwelt Kassette MRG284 Vorwärts GTTACGCCGTGGGTCGATG 94 ° C 3 min; 35 Zyklen 94 ° C 30 sec, 55 ° C 30 sec, 72 ° C 1 min 30 sec; 72 ° C 5 min Gillings et al., 2009, 21
MRG285 Rückwärts CCAGAGCAGCCGTAGAGC

Tabelle 1 Primersequenzen und PCR-Bedingungen für die Identifizierung von Klasse 1 Integrons und ihre zugeordneten Genkassetten verwendet.

Tabelle 2. PCR und Restriktionsverdau Mastermix Bestandteile.

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Discussion

Die Identifizierung von Integrons und ihre zugehörigen Gen-Kassetten ist potentiell ein Schlüsselschritt bei der Vorhersage der Entstehung von neuen opportunistischen Erregern, Tracking Wege für Krankheitserreger in die menschliche Nahrungskette, und die Identifizierung neuer Widerstand und Virulenzdeterminanten 8,21,26. Das Ziel dieser Arbeit war es, einen optimierten Ansatz für das Screening von Proben für die Klasse 1 Integrons, Charakterisierung ihrer Kassette Arrays und Identifizierung der Bakterien-Spezies in dem sie wohnen zu beschreiben. Wichtige Schritte im Protokoll beinhalten guten mikrobiologischen Praxis und verhindert PCR Kontamination, die False Positives erzeugen würden.

Das hier beschriebene Protokoll kann leicht modifiziert werden, um andere klinisch relevante Integrons erkennen, einschließlich der Klasse 2 und Klasse 3 Integrons, die auch in menschlicher Krankheitserreger festgestellt werden. Es kann auch modifiziert werden, um Integrons in mikrobiellen Gemeinschaften aus Wasser, Biofilme, Boden oder Sediment zu erkennen. Es gibt einige, limitations für diese Technik, die aus einem Rückgriff auf die Kultivierung von bakteriellen Zellen entstehen. Viele Umwelt Bakterien nicht leicht kultivierbaren, und das hier beschriebene Protokoll würde diese Arten nicht erkennen. Die Palette der Arten, die zurückgewonnen werden kann mit verschiedenen Bakterienmedienformulierungen und längere Inkubationszeiten erweitert werden. Dennoch ist die Mehrzahl der Arten von Interesse für die menschliche Gesundheit sind wahrscheinlich unter den hier beschriebenen Bedingungen wachsen.

Dieses Verfahren hat einige Vorteile gegenüber den Techniken, die auf selektiven Medien Plattieren zu verwenden. Keine Annahmen müssen über die Identität des Resistenzdeterminanten durch einzelne Isolate und neue Resistenzgene durchgeführt werden können wiederhergestellt werden und charakterisiert. Ganz allgemein kann der Workflow auch angepasst, um jedes mögliches Element des resistome 27 oder mobilome, die von Interesse sein könnten 4 zu erkennen. Solche Assays sind wichtig für das Verständnis der Dynamik der verschiedenen DNA-Elemente in einer beteiligtenantibiotische Resistenz, und von entscheidender Bedeutung für die Erhaltung der schwindenden Arsenal von antimikrobiellen Verbindungen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren relevant.

Acknowledgments

Dank Michaela Hall, Larissa Bispo und Gustavo Tavares für technische Hilfe.

Materials

PCR-Reagenzien Volumen (ul) Restriktionsverdau Reagenzien Volumen (ul)
Sterilem Wasser 21,5 Sterilem Wasser 23
10x GoTaq Weiß 25 Puffer B 5
RNAseA [1 mg / ml] 0,5 Rinderserumalbumin [1 mg / ml] 1
Forward Primer [50 uM] 0,5 HinfI [10 Einheiten / ul] 1
Reverse-Primer [50 uM] 0,5
Mastermix Volumen 48 Mastermix Volumen 30
DNA-Matrize 2 PCR Template 20
Schluss PCR Volumen 50 Schluss Restriktionsverdau Volumen 50
Name Company Catalog Number Comments
GoTaq Colourless Mastermix Promega M7132 Used in all PCRs
RNAse (Ribonuclease A from bovine pancreas) Sigma R6513-10MG Used in all PCRs
HinFI restriction enzyme Promega R6201 Used to digest 16S rDNA PCR poducts. Enzyme comes with optimal buffer and BSA
100 bp ladder GE Healthcare 27400701 Used as a size standard on all agarose gels
GelRed DNA stain Biotium 41003 CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material
Guanidinium thiocyanate Life Technologies AM9422 CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material
CLS-TC Solution MP Biomedicals 6540409 Resuspension solution used at the begining of the genomic DNA extraction
Lysing Matrix E FastPrep tubes MP Biomedicals 116914500 Tube required for mechanical disruption of bacterial cell walls. This code is used for packs of 500 tubes, smaller quantities are available.
Binding matrix MP Biomedicals 116540408 Diluted 1:5 with 6 M guanidinium thiocyanate and used in the genomic DNA extraction method.
Fast Prep machine MP Biomedicals Number of options available MP Biomedicals has a number of FastPrep machines available to purchase. Visit http://www.mpbio.com for more information

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, K., et al. Tackling antibiotic resistance. Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).
  2. Davies, J., Davies, D. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).
  3. Costa, V. M., et al. Antibiotic resistance is ancient. Nature. 477 (7365), 457-461 (2011).
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Screening-Lebensmittel, die für Klasse 1 und Integrons Genkassetten
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Waldron, L. S., Gillings, M. R.… More

Waldron, L. S., Gillings, M. R. Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes. J. Vis. Exp. (100), e52889, doi:10.3791/52889 (2015).

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