Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

הקרנת מזון לכיתה Integrons 1 וג'ין קלטות

Published: June 19, 2015 doi: 10.3791/52889
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Macquarie University

Introduction

גילוי האנטיביוטיקה היה אחד ההישגים המדעיים הגדולים ביותר של המאה ה -20. עם זאת, השימוש וניצול לרעה של אנטיביוטיקה הוביל להתפתחות המהירה של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה, ואלה עכשיו מהווים איום רציני לבריאות ציבור במאה ה -21. העלייה של זני חיידקים עמידים למרבית אפשרויות הטיפול מעלה את האפשרות שאנו נכנסים לעידן שבו תרופות נגד חיידקים כבר לא יעילות 1,2.

המכונות הגנטיות שמקנות עמידות לאנטיביוטיקה היא מערכת עתיקה, מקדימים בני אדם ולחצי בחירה אנטיביוטיים על ידי מיליוני שנות 3. אלמנטים גנטיים ניידים, כגון פלסמידים, transposons, איים הגנומי, אלמנטי conjugative אינטגרטיבית וintegrons יכולים להפיץ את הגנים אנטיביוטיקה התנגדות (ARG) הן בתוך ובין מיני חיידקים 4. מבין אלה, integrons שיחק תפקיד מרכזי בהתפשטות ARG, למרותעובדה שהם מסתמכים על פלסמידים וtransposons לגיוס והכנסה לתוך הגנום של חיידקי 5. Integrons ללכוד קלטות גן באמצעות integron-אינטגראז, ולאחר מכן להביע קלטות באמצעות integron מקודד אמרגן 6,7 (איור 1). Integron גן קלטות אלמנטים ניידים קטנים בהיקף של מסגרות יחידה פתוחה קריאה (ORF) שמוצרים יכולים להעניק עמידות לאנטיביוטיקה או חומרי חיטוי 8. integrons Class 1 הוא integrons התאושש הנפוץ ביותר מבידודים קליניים 5, שבו הם רכשו ביחד יותר מ -130 קלטות גן עמידות לאנטיביוטיקה שונות 9.

התפשטות integrons 1 הכיתה לחיידקים פתוגניים commensal וקשורים אנושיים מייצרת זרמי פסולת אנושיים המכילים מספר גדול של אלמנטים הגנטיים אלה 10. 10 19 חיידקים מוערכים המכילים כיתת 1 integrons משתחררים דרך ביוב בוצה כל i שנהn בריטניה 11. לכן זה לא מפתיע שintegrons כיתת 1 המקנות התנגדויות אנטיביוטיקה עכשיו שיראו בחיידקים של ציפור בר, דגים, וחיות ברות האחר 12-14 ילידים. שחרור integrons בחזרה לסביבה מהווה איום משמעותי על בריאות הציבור, מאז רכישת קלטות גן חדשות וארגון מחדש מורכב עם אלמנטים ניידים אחרים ממשיכה להתרחש, במיוחד בצמחים לטיפול בשפכים ובגופי מים אחרים 15-18. הסביבה הטבעית ואז הופכת קרקע פורה לגיוס גורמי התנגדות חדשים ופתוגנים אופורטוניסטיים 19,20. חיידקים המכיל integron רומן וargs החדש יכולים מעגל בחזרה לקהילה האנושית דרך מים ומזון מזוהמים 21,22. מעקב של args הסביבתי הוא אסטרטגיה מפתח להבנה ולניהול עמידות לאנטיביוטיקה בעתיד 23. בפרט, יש לשים לב למזון שאכלו גלם אוקל מבושל, שכן אלה להציג את האיום הגדול ביותר להעברה של אלמנטים ניידים חדשים ופתוגנים.

בפרוטוקול זה, גישה יעילה לאיתור, זיהוי ואפיון כיתת 1 integrons וקלטות הגן הקשור במוצרי מזון מתוארים (איור 2). באמצעות שילוב של תגובת שרשרת culturing ופולימראז (PCR), integrons ניתן לאתר במהירות בקהילות חיידקים מורכבות ומבודדות בודדים. שיטות לזיהוי המינים של חיידקים וקונפורמציה והזהות של קלטות הגן-קשור integron מקבלות. השיטה מתאימה למגוון רחב של מזונות צמחיים ובעלי חיים, ודוגמאות של תהליכי עבודה טיפוסיים ניתנות לכל אחד מסוגי המזון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מוצרי מזון שנאכלים טרי או מבושל קל הם של רוב הדאגה לבריאות אדם. דוגמאות כוללות ירקות סלט, פירות, צדפות וסרטנים.

אוסף 1. לדוגמא

  1. לאסוף דגימות בתנאים שלמזער זיהום, ומאוחסן בשקיות נפרדות, נקיות במהלך הובלה. לאחר שנאסף, יש לאחסן דגימות ב 4 מעלות צלזיוס ומעובדות בתוך 24 שעות.

2. מועשרת תרבות הכנה

  1. פירות וירקות:
    1. מניחים כ -10 גרם של חומר בשקית ניילון עמידה. אם עיבוד חומר גדול יותר, להתרכז בעור של הפרי או ירק. להוסיף 90 מיליליטר 0.1 M חיץ נתרן פוספט, pH 7.0 ותהליך בבלנדר ההנעה למשך 30 שניות. לחלופין, החומר יכול להיות נסער באופן ידני אם בלנדר ההנעה אינו זמין.
    2. לאסוף את הנוזל לתוך שני צינורות 50 מיליליטר פלקון. צנטריפוגה צינורות ב 4000 XG במשך 7 דקות לחיידקים גלולה. i>
    3. מוציא בזהירות את supernatant ולהשעות את חיידקי pelleted ב 30 מיליליטר של מרק סטרילי וריא Bertani (LB).
    4. דגירה על O ייקר / N, מחזיק צינור אחד של 25 מעלות צלזיוס ואחרת על 37 מעלות צלזיוס. צריכה להיות מזועזעות תרבויות ב 200 תנודות לדקה (OPM). תרבויות חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד נדרשות.
  2. פירות ים:
    1. לנתח את הבטן (צדפות) או מערכת עיכול (סרטנים) באמצעות מלקחיים ופינצטה סטרילי ומקום לתוך צינור 1.5 מיליליטר סטרילי המכיל 200 μl של 0.1 חיץ פוספט M נתרן, pH 7.0. מרוך המדגם ליצור homogenate.
    2. לוותר 5 מיליליטר של מרק LB לשני 5 מיליליטר צינורות סטרילי, ולחסן כל עם homogenate פירות הים.
    3. דגירה על O ייקר / N, מחזיקה צינור אחד של 25 מעלות צלזיוס ומעלות צלזיוס 37 אחרים. צריכה להיות מזועזעות תרבויות ב 200 OPM. תרבויות חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד נדרשות.

3. תרבויות הקרנה לIntegrons

= "Jove_content"> הערה: פרוטוקולי PCR רגילים נמצאים בשימוש במתודולוגיה זו, באמצעות מאגרים מסופקים עם האנזים, וMgCl 2 ריכוז סופי של 2.5 מ"מ. במידת הצורך, לורנץ (2011) 24 התוו שיטות אופטימיזציה ופתרון בעיות PCR בנושא קודם של כתב עת זה.

  1. הכנת DNA מבושל:
    1. לוותר תרבות המועשרת 100 μl לתוך צינור PCR 0.5 מיליליטר סטרילי. מחממים את המדגם 99 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, שימוש באמבט מים או גוש חום. הצמד מקרר על קרח למשך 2 דקות.
    2. Microcentrifuge 14,000 XG במשך 5 דקות עד גלולה פסולת תא. חזור לקרח. אפשר להקפיא דגימות DNA ב -20 ° C עד נדרשות, אבל חייב להיות מופשרים על קרח.
  2. הקרנה לintegrons הכיתה 1 באמצעות PCR:
    הערה: תרבויות מעורבות מO הדגירה / N מוקרנות על integrons הכיתה 1 באמצעות פרוטוקול HS463a / HS464 PCR (טבלת 1).
    1. להפשיר את כל חומרים כימיים PCR על קרח, הרחק מכל סו פוטנציאל rces של זיהום DNA. איפור mastermix PCR 48 μl לדגימה, לרבות בקרות שליליות (טבלה 2). לוותר 48 μl של תמהיל אב PCR לכל צינור, באמצעות טיפים מחסום.
    2. הוסף 2 μl של DNA המופשר לצינורות PCR בודדים באמצעות טיפים מחסום. הפעל תכנית מתאימה בthermocycler PCR.
    3. כדי להעריך את התוצאות של ההגברה, electrophorese 7 μl של מוצר ה- PCR על ג'ל agarose 2% שפך ולהפעיל במאגר TBE (90 מ"מ טריס-borate, 2 מ"מ EDTA). כולל סמן משקל מולקולרי, כגון סולם 100 נ"ב.
    4. ההודעה כתם ג'ל עם כתם DNA, ולדמיין באמצעות transilluminator UV. בדוק שלא חלה הגברה בבקרה השלילית. להקה חזקה בסביבות 470 נ"ב לכל מדגם מסוים מצביעה על כך שהתרבות המעורבת מכילה חיידקים הנושאים integron כיתת 1. מושבות טהורות עכשיו תהיינה מבודדות מכל תרבות מעורבת שחזרה PCR חיובי.

> 4. הקרנת יחידה המושבות לIntegrons Class 1

  1. דילולים סידוריים וצלחות התפשטות:
    הערה: כדי לבודד מושבות אחת מהתרבויות המעורבות PCR החיובי, התרבות המעורבת היא בדילול סדרתי של פי 10 בחיץ פוספט נתרן, ולאחר מכן מצופה להתאושש מושבות אחת.
    1. הוסף 1 מיליליטר של תרבות המעורבת עד 9 מיליליטר של חיץ פוספט 0.1 M נתרן, pH 7.0 ומערבבים על ידי היפוך. הוסף 1 מיליליטר של הדילול ל9 מיליליטר נוסף של חיץ פוספט, וחזור עד דילול סדרתי של 10 -8 הוא הגיע.
    2. התפשטות 10 -4 עד 10 -8 דילולים על אגר LB 100 μl, בשני עותקים. דגירה הצלחות O / N באותה הטמפרטורה המשמשת לתרבות המעורבת הראשונית. אז יכולות להיות מאוחסנות צלחות על 4 מעלות צלזיוס עד נדרשים, אולם עדיף לעבד את המושבות אחת למדי מייד.
  2. בחירה יחידה מושבה והכנת DNA מבושלת:
    1. פיק מושבות אחת מהצלחות דילול סדרתי, selecting סוגי מושבה שונים רבים ככל האפשר, תוך שימוש בקריטריונים כגון גודל מושבה, צורה וצבע. השתמש קיסמי סטרילי כדי לבחור מושבות אחת מצלחת ההתפשטות.
    2. לגעת בקיסם למושבה, ולאחר מכן להעביר לתוך צינור PCR המכיל מים סטריליים 100 μl. אם מספר גדול של מושבות הם שיוקרנו, אז יכולות להיות מוכנות מושבות במגש microtiter. ספין הקיסם בין האצבעות כדי לסלק חלק מהתאים אל תוך המים.
    3. שימוש באותו הקיסם, לחסן צלחת LB עם פס של המושבה. מספר גדול של מושבות ניתן לאחסן על צלחות שכותרתו אם כל פס ארוך על 1 סנטימטר. חזור על שלבי 1 עד 3 עד שבחרת מספר מתאים של מבודדים.
    4. דגירה O צלחות LB / N, באותה הטמפרטורה כמו שמשמש לתרבות המועשרת הראשונית. אז יכולות להיות מאוחסנות תרבויות על 4 מעלות צלזיוס עד נדרשת.
    5. להכנת דנ"א מהשעיות חיידקים, בצע את השלבים כמו outlined בסעיף 3.1. להקרנה של lysates התרבות הטהור, לבצע HS463a / HS464 PCR כפי שתואר בסעיף 3.2. מבודד שתחזור PCR חיובי ישמש להכנת דנ"א גנומי (סעיף 5), ולניתוחים נוספים.

5. מושבות האחת הגנום הפקת DNA של Integron חיובי שימוש ביד הכאת 25

  1. לחסן 5 מיליליטר של מרק LB עם מדגם של התרבות הטהורה מבודדת בסעיף 4.2. דגירה O / N, רועדת באותה הטמפרטורה ששימשה לתרבות המועשרת הראשונית.
  2. תאים גלולה ב 4000 XG במשך 7 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant. Resuspend תאי pelleted ב 1 מיליליטר פתרון CLS-TC בצינור הכנה מהירה lysing מטריקס E. שימוש במכונת מכות חרוז, לעבד את המדגם על 5.5 מ '/ שנייה למשך 30 שניות.
  3. צינור צנטריפוגה ב 14,000 XG במשך 5 דקות ולהתאושש 700 μl של supernatant לתוך צינור 1.5 מיליליטר סטרילי.
  4. להוסיף 700 μl של מטריצה ​​מחייבת דילול 1: 5 עם 6 גואן Midinium thiocyanate ומערבבים על RT במשך 5 דקות. צנטריפוגה ב 14,000 XG דקות 1, supernatant פסולת.
  5. להוסיף 800 לשטוף μl אתנול מלח (70% אתנול, 0.1 נתרן אצטט M) ומערבולת עד גלולה היא resuspended באופן מלא. שטוף במשך 5 דקות ב RT, צנטריפוגות ב 14,000 XG דקות 1 ולהשליך supernatant. להבטיח את כל supernatant הוסר, באמצעות micropipette במידת צורך, ולאחר מכן לאפשר לאוויר יבש במשך 5 דקות.
  6. Resuspend מטריצת גלולה ב200 μl TE (10 מ"מ טריס HCl, 1 המ"מ EDTA, pH 7.6) על ידי pipetting למעלה ולמטה. לדגור על RT במשך 3 דקות. צנטריפוגה ב 14,000 XG במשך 3 דקות והעברה 160 μl של ה- DNA eluted לתוך צינור סטרילי. הפעל aliquot של מיצוי DNA הגנומי על 2% w / ג'ל agarose נ 'כדי לבדוק את התשואה ויושרה של מיצוי DNA. הדנ"א הגנומי המטוהר מאוחסן ב -20 ° C והפשרה על קרח בעת צורך לבדיקת PCR.

6. PCRs אבחון ורצפי DNA

הערה:הדנ"א הגנומי מוכן בסעיף 5 ישמש לכל PCRs האבחון, וכדי לאשר את הבדיקה החיובית לintegrons 1 הכיתה.

  1. להפשיר הדנ"א הגנומי על קרח, בקצרה מערבולת דגימת DNA וספין דופק ב14,000 XG במשך 20 שניות. חזור על PCR לגן integron-אינטגראז כיתת 1 באמצעות HS463a / HS464 (טבלה 1), המאשר כי לבודד הוא חיובי עבור amplicon 471 נ"ב (סעיף 3.2).
  2. זיהוי של תרבויות חיוביות לרמת מין מושגת על ידי ניתוח של גן rRNA המקטע הקטן (16S rDNA). להגביר את גן 16S באמצעות f27 פריימרים / r1492 (טבלת 1). בדקו את מוצרי ה- PCR באמצעות אלקטרופורזה. כל היעדים בקטריאלי צריכים ליצור amplicon 16S של כ 1,450 נקודות בסיס.
  3. רצף amplicon גן 16S rRNA כדי לקבוע את זהות מינים, אבל כן יש סיכוי להיות PCRs החיובי מרובה מצעד 6.2, ורבים מאלה תוצאות חיוביות יהיו זהים מיני חיידקים, אנו להבחין מינים שונים ראשון usinעיכול הגבלת גרם של מוצר 16S PCR.
    1. לעכל aliquot של 16S PCR עם אנזים ההגבלה 1 Hinf. כל אנזים שמכיר אתרי מחשוף 4 נ"ב יעשו, אבל 1 Hinf מייצר מגוון טוב ממטרות 16S, והוא אנזים אמין, זול.
  4. הגדרת הגבלת 30 μl לעכל mastermix (טבלה 2) בצינור סטרילי ולהוסיף 20 μl של מוצר 16S PCR-purfied האו"ם. דגירה בO אמבט המים 37 מעלות צלזיוס / N. בדוק את התקציר על 2% agarose ג'ל.
  5. ציון דפוסי העיכול מיוצרים על ידי 1 Hinf. מבודד עם אותו פרופיל הגבלת 16S עשויים להיות אותו המין. במקום רצף כל מוצר 16S PCR, רצף לכל היותר שלושה נציגים של כל דפוס הגבלה Hinf 1.
  6. לטהר את מוצרי 16S PCR באמצעות ערכה מסחרית. ניתן להשתמש בערכת exonuclease חד גדילים, אך מבוססת עמודה או שיטות ממטרים גם לעבוד היטב כדי להסיר unincפריימרים orporated וDNAs חד גדילים. רצף amplicons 16S באמצעות R910 פריימר (טבלת 1), הגדרת התגובות כמו שצוינה על ידי מתקן הרצף.
  7. השתמש ברצף ה- DNA וכתוצאה מכך לחקור את בסיס הנתונים DNA צמח השדה עם פונקצית blastn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). זהות נוקלאוטיד יותר מ 97% נלקחת בדרך כלל כזהות מינים.

7. מיפוי ואפיון של מערכי Integrons והקלטת

הערה: Class integrons 1 נובע ממערכות אקולוגיות הנשלט אדם צפוי להיות integrons הנפוץ ביותר בכל דוגמאות שלך. יש כל integrons אלה מקור יחיד אחרונים, ויש לי רצף ה- DNA השמור ביותר 5 לכן.

  1. להבחין בין מעמד integrons 1 נובע ממקורות אנושיים ואלה המתרחשים באופן טבעי בדגימות סביבתיות על ידי ביצועPCR עם פריימר להגדיר intI1F165 / intI1R476 10 (טבלה 1).
    הערה: Class integrons 1 מחיידקים קליניים או commensal יפיק מוצר נ"ב ~ 300, ואילו ברמה סביבתית 1 integrons לא יניב כל מוצר.
  2. לאפיין את integrons הקליני על ידי הגברת מערך הקלטת עם סט פריימר HS458 / HS459. זה PCR יהיה להגביר את האזור בין intI1 וקטע המשומר '3 בתחנה הסופית של רוב מערכי קלטת. מכיוון שהמספר והזהות של קלטות הוא משתנה, בגודל של מוצר ה- PCR גם להשתנות.
  3. לטהר amplicons ורצף ה- DNA באמצעות כל אחד מצבעי יסוד ההגברה. השתמש רצפים לחקור מאגרי DNA באמצעות פונקצית blastn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
  4. ודא שיום של קלטות מעקב מינוח תקני 9, מאז תצהירי נתונים רבים לקלטת גן integronים להשתמש בשמות עולים בקנה אחד או דו-משמעיים. תן תשומת לב מיוחדת לקלטות גן רומן, שכן אלה עלולים לקודד פנוטיפים חדשים, כוללים גנים המעניקים יכולת העברה מוגברת, פתוגניות או אלימות 8,21.
    הערה: פרה-קלינית צורות של integron כיתת 1 עדיין להסתובב בסביבה טבעית. בפרט, אלה שצמודים לTn 402 transposons הפעיל הם המעניין ביותר 26. מערכי הקלטת של integrons אלה לא להגביר עם סט פריימר HS458 / HS459, אבל יכולים להיות מוגבר עם סט פריימר MRG284 / MRG285 (טבלת 1), שהניבו amplicons של גודל המשתנה תלוי על תוכן קלטת. צריכים להיות מטוהרים מוצרי ה- PCR ו- DNA רצף כפי שמתואר ב7.2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הקרנה של תרבויות מעורבות ומבודדים חיידקים לintI1

סט פריימר HS463a / HS464 PCR יכול לשמש כדי לזהות את נוכחותו של הגן ברמת 1 integron-אינטגראז, intI1 (איור 1). סט פריימר זה עובד היטב עבור איתור intI1 בתרבויות מעורבות, וגם משמש כדי מושבות חיידקים שנקטפו מצלחות התפשטות (איור 2). מבודדים חיובי צריכים ליצור להקה חזקה יחידה ב471 נ"ב באמצעות קבוצה זו פריימר (איור 3 א). רוב מקרי חיובים ישאו intI1 שמקורו מבני אדם או בעלי החיים החקלאיים והביתיים שלהם. מבודדים אלה גם יהיה חיוביים בF165 PCR פריימרים באמצעות / R476, שאמורה ליצור amplicon 311 נ"ב (איור 1). מקורות סביבתיים של intI1 בדרך כלל לא יהיו חיוביים בassay השני.

אפיון של מערכי קלטת integron

= "Jove_content" ילדה> הדנ"א הגנומי ממבודד טהורה משמש לאפיון של מערכי קלטת integron. מערכי הקלטת של TN 402 כיתת -associated 1 integrons יכול להיות מוגבר באמצעות פריימרים HS458 / HS459. פריימרים אלו בהתאמה למקד את אתר רקומבינציה integron, וסוף '3 ​​של מערך הקלטת, אשר בדרך כלל מסתיים בהיתוך גן sul1 qacEΔ (איור 1). הגודל של מוצרי ה- PCR שנוצר בassay זה משתנה בהתאם למספר והזהות של קלטות במערך (איור 3). integrons 1 הכיתה סביבתית לעתים קרובות הם משובצים בכרומוזומים חיידקים, ויכולים להיות מוגברים מערכי הקלטת שלהם על ידי פריימרים המתמקדים בהפרוקסימלי ורוב אתרי דיסטלי רקומבינציה (איור 1). Primers MRG284 / 285 נועד להגביר אזור זה, ושוב, כי תוכן הקלטת משתנה, בגודל של amplicons גם משתנה (איור 3 ג). רצף של HS458 / 459 PCRמוצרים בדרך כלל יתאוששו גורמי עמידות לאנטיביוטיקה ידועות, ואילו רצף MRG284 / 285 מוצרי ה- PCR בדרך כלל לשחזר קלטות גן שמקודדות פוליפפטידים של פונקציה לא ידועה.

זיהוי מיני חיידקים

חיידקים מזוהים באמצעות השוואות רצף ומסד נתוני 16S rDNA. הדנ"א הגנומי משמש כתבנית להגברה של 16S rRNA גן מקטע קטן. שימוש בפריימרים הציעו, זה צריך ליצור amplicon של כ 1,450 נקודות בסיס. בגלל מספר גדול של מושבות עשוי להיות מוקרן בכל זמן, שיטת הקרנה היררכית מועסקת. מוצרי 16S PCR מוגברים מתעכלים עם אנזים ההגבלה 1 Hinf, ומעכלים אלה מופרדים על agarose ג'לי. מינים בודדים יפיקו דפוסים ייחודיים לאחר לעכל, כגון שמבודד מאותו המין יכול להיות מזוהה בקלות (איור 3D). רצף מוצרי ה- PCR גן 16S rRNA ממקסימום של שלושמבודד מייצג כל דפוס הגבלה אחת מאפשר זיהוי יעיל של כל המינים הסביר באוסף של בידודים חיוביים integron.

איור 1
איור 1. מבנה integrons 1 הכיתה. דיאגרמות סכמטי של integrons 1 הכיתה קלינית וסביבתית, מראים פריימר PCR מחייב אתרים הנזכרים בכתב היד. integrons 1 הכיתה מורכבת מגן integron-אינטגראז (intI1) שמזרז את הלכידה וביטוי של קלטות גן כדי ליצור מערך קלטת. לפני הופעתו של שימוש באנטיביוטיקה, רוב integrons 1 הכיתה היו כרומוזומליות, ונשא קלטות גן הפונקציות שהם עדיין לא נקבעו. בחירה חזקה באמצעות שימוש באנטיביוטיקה בהרבה גדלה השפע של גרסת רצף אחד של integron כיתת 1 קשורים לtransposon Tn 402.integrons 'הקליני' אלה רכש מערכים של קלטות שלקודד עמידות לאנטיביוטיקה. זה integrons אלה שכרגע מזהמים סביבות טבעיות ושרשרת ייצור מזון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. תרשים זרימה סכמטי לאיתור integrons 1 הכיתה במוצרי מזון. דוגמאות של מוצרי מזון המשמשות לתקשורת לחסן וליצור תרבות חיידקים מעורבת. תרבויות המעורבות אלה מוקרנות על הנוכחות של integrons 1 הכיתה, ותרבויות חיוביות המשמשות להכנת לוחות התפשטות. מושבות בודדות מהצלחות התפשטותם rescreened לintegrons. תרבויות חיוביות הן מטוהר, ה- DNA שחולץ ומאופיין לתוכן קלטת על ידי ה- DNA sequencing. רצף של גן 16S rRNA משמש לזיהוי מינים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. electrophoretic נציג ניתוחים מתהליך המיון. () הקרנת מושבות בודדות באמצעות intI1 פריימרים HS463a / 464. מושבות חיוביות ליצור להקה אחת חזקה ב471 נ"ב. הגברה (B) של מערכי קלטת מintegrons 402 Tn באמצעות פריימרים HS458 / 459. PCR זה מייצר מוצר משתנה בגדלים תלוי בזהות ובגודל של קלטות רכיב במערך. זיהוי של קלטות אלה דורש רצפי DNA. הגברה של מערכי קלטת מאני כיתה סביבתית 1 (ג)ntegrons באמצעות פריימרים MRG284 / 285. זה PCR גם מייצר מוצר משתנה בגדלים תלוי בזהות ובגודל של קלטות רכיב במערך, לעומת זאת קלטות במערכים סביבתיים צפויים לקודד עמידות לאנטיביוטיקה. הקרנה של מוצרי 16S PCR על ידי עיכול עם 1 Hinf (ד '). מבודד עם דפוסי הגבלה זהים עשויים להיות אותו המין. אם מספר גדול של סוג הגבלה יחיד שנמצאו, רק כמה מאלה צריכים להיות רצף. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

PCR יעד גן שם פריימר כיוון רצף 5 '- 3' תנאי רכיבה על אופניים RefereNCE
HS463a / HS464 Class 1 Integron HS464 קדימה ACATGCGTGTAAATCATCGTCG 94 ° C 3 דקות; 35 מחזורים 94 ° C 30 שניות, 60 מעלות צלזיוס 30 שניות, 72 ° C 1 דקות 30 שניות; 72 מעלות צלזיוס 5 דקות סטוקס et al., 2006 28
HS463a הפוך CTGGATTTCGATCACGGCACG
f27 / r1492 16S rRNA f27 קדימה AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 94 ° C 3 דקות; 35 מחזורים 94 ° C 30 שניות, 60 מעלות צלזיוס 30 שניות, 72 ° C 1 דקות 30 שניות; 72 מעלות צלזיוס 5 דקות ליין, 1991 29
r1492 הפוך TACGGYTACCTTGTTACGACTT
intI1F165 / IntI1R476 integron 1 כיתה קלינית אינטי1F165 קדימה CGAACGAGTGGCGGAGGGTG 94 ° C 3 דקות; 35 מחזורים 94 ° C 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס 30 שניות, 72 ° C 1 דקות 30 שניות; 72 מעלות צלזיוס 5 דקות Gillings 2014 10
intI1R476 הפוך TACCCGAGAGCTTGGCACCCA
HS549 / HS550 Integron הקליני 3'CS HS549 קדימה ACTAAGCTTGCCCCTTCCGC 94 ° C 3 דקות; 35 מחזורים 94 ° C 30 שניות, 65 מעלות צלזיוס 30 שניות, 72 ° C 1 דקות 30 שניות; 72 מעלות צלזיוס 5 דקות סטוקס et al., 2006 28
HS550 הפוך CTAGGCATGATCTAACCCTCGG
HS458 / HS459 מערך קלטת קליני HS458 קדימה GCAAAAAGGCAGCAATTATGAGCC 946; C 3 דקות; 35 מחזורים 94 ° C 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס 30 שניות, 72 ° C 1 דקות 30 שניות; 72 מעלות צלזיוס 5 דקות הולמס et al., 30 2,003
HS459 הפוך GTTTGATGTTATGGAGCAGCAACG
MRG284 / MRG285 קלטת סביבה MRG284 קדימה GTTACGCCGTGGGTCGATG 94 ° C 3 דקות; 35 מחזורים 94 ° C 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס 30 שניות, 72 ° C 1 דקות 30 שניות; 72 מעלות צלזיוס 5 דקות Gillings et al., 2009 21
MRG285 הפוך CCAGAGCAGCCGTAGAGC

1. רצפי שולחן פריימר ותנאי PCR משמשים לזיהוי Class 1 integrons וקלטות הגן הקשור.

הטבלה 2. PCR והגבלה לעכל מרכיבי mastermix.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

זיהוי של integrons וקלטות הגן הקשור הוא פוטנציאל צעד מפתח בניבוי הופעתה של פתוגנים אופורטוניסטיים חדשים, מעקב מסלולים לפתוגנים לשרשרת מזון האנושי, וזיהוי התנגדות חדשה וארסי גורמים מכתיבים 8,21,26. מטרת מאמר זה הייתה לתאר גישה יעילה לסינון דגימות לintegrons 1 הכיתה, אפיון מערכי הקלטת שלהם וזיהוי מיני חיידקים שבו הם מתגוררים. צעדים קריטיים בפרוטוקול כרוך בפועל מיקרוביולוגית טובה, ומניעת זיהום PCR שתעוררנה חיוביות שגוי.

הפרוטוקול המתואר כאן ניתן לשנות בקלות לזהות integrons הרלוונטי קליני אחר, כולל ברמה 2 ומעמד 3 integrons שנמצאים גם בפתוגנים אנושיים. זה גם יכול להיות שונה כדי לזהות integrons בקהילות חיידקים ממים, biofilms, אדמה או משקעים. יש כמה limitatioNS לטכניקה זו, הנובעת מהסתמכות על culturing של תאי חיידקים. חיידקים סביבתיים רבים אינם קלות culturable, והפרוטוקול המתואר כאן לא לזהות מינים אלה. מגוון מינים שהם התאוששו יכול להיות מורחב באמצעות ניסוחים תקשורת חיידקים שונים ובזמני דגירה ארוכים יותר. עם זאת, רוב המינים של ריבית לבריאות אדם צפויים לגדול בתנאים שתוארו כאן.

יש פרוטוקול זה יש כמה יתרונות על פני שיטות שמשתמשים בציפוי על תקשורת סלקטיבית. אין הנחות צריכה להתבצע על הזהות של גורמי התנגדות בוצעו על ידי מבודד בודד, וגני התנגדות חדשים ניתן לשחזר ומאופיין. באופן כללי יותר, זרימת העבודה יכולה גם להיות מותאמת כדי לזהות כל אלמנט של mobilome resistome 27 או שעשוי לעניין 4. מבחני כאלה הם חשובים להבנת הדינמיקה של רצפי דנ"א השונים המעורבים בהתנגדות tibiotic, וקריטי לשימור הנשקייה המידלדלת של תרכובות אנטי-מיקרוביאלי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין רלוונטי לגילוי.

Acknowledgments

תודה למיכאלה אולם, לריסה Bispo וגוסטבו Tavares לקבלת סיוע טכני.

Materials

ריאגנטים PCR נפח (μl) ריאגנטים לעכל הגבלה נפח (μl)
מים סטריליים 21.5 מים סטריליים 23
10x GoTaq לבן 25 המאגר B 5
RNAseA [1 מ"ג / מיליליטר] 0.5 סרום השור אלבומין [1 מ"ג / מיליליטר] 1
קדימה פריימר [50 מיקרומטר] 0.5 HinfI [10 יחידות / μl] 1
הפוך פריימר [50 מיקרומטר] 0.5
Mastermix נפח 48 Mastermix נפח 30
תבנית ה- DNA 2 PCR תבנית 20
סופי PCR נפח 50 הגבלה סופית לעכל נפח 50
Name Company Catalog Number Comments
GoTaq Colourless Mastermix Promega M7132 Used in all PCRs
RNAse (Ribonuclease A from bovine pancreas) Sigma R6513-10MG Used in all PCRs
HinFI restriction enzyme Promega R6201 Used to digest 16S rDNA PCR poducts. Enzyme comes with optimal buffer and BSA
100 bp ladder GE Healthcare 27400701 Used as a size standard on all agarose gels
GelRed DNA stain Biotium 41003 CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material
Guanidinium thiocyanate Life Technologies AM9422 CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material
CLS-TC Solution MP Biomedicals 6540409 Resuspension solution used at the begining of the genomic DNA extraction
Lysing Matrix E FastPrep tubes MP Biomedicals 116914500 Tube required for mechanical disruption of bacterial cell walls. This code is used for packs of 500 tubes, smaller quantities are available.
Binding matrix MP Biomedicals 116540408 Diluted 1:5 with 6 M guanidinium thiocyanate and used in the genomic DNA extraction method.
Fast Prep machine MP Biomedicals Number of options available MP Biomedicals has a number of FastPrep machines available to purchase. Visit http://www.mpbio.com for more information

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, K., et al. Tackling antibiotic resistance. Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).
  2. Davies, J., Davies, D. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).
  3. Costa, V. M., et al. Antibiotic resistance is ancient. Nature. 477 (7365), 457-461 (2011).
  4. Gillings, M. R. Evolutionary consequences of antibiotic use for the resistome, mobilome and microbial pangenome. Front. Microbiol. 4, 4 (2013).
  5. Gillings, M., et al. The evolution of class 1 integrons and the rise of antibiotic resistance. J. Bacteriol. 190 (14), 5095-5100 (2008).
  6. Brassard, S., Lapointe, J., Roy, P. H. Diversity and relative strength of tandem promoters for the antibiotic-resistance genes of several integrons. Gene. 142 (1), 49-54 (1994).
  7. Partridge, S. R., et al. Definition of the attI1 site of class 1 integrons. Microbiol. 146 (11), 2855-2864 (2000).
  8. Gillings, M. R. Integrons: Past, Present, and Future. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 78 (2), 257-277 (2014).
  9. Partridge, S. R., Tsafnat, G., Coiera, E., Iredell, J. R. Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons. FEMS Microbiol. Rev. 33 (4), 757-784 (2009).
  10. Gillings, M. R., et al. Using the class 1 integron-integrase gene as a proxy for anthropogenic pollution. ISME J. In press, (2014).
  11. Gaze, W. H., et al. Impacts of anthropogenic activity on the ecology of class 1 integrons and integron-associated genes in the environment. ISME J. 5, 1253-1261 (2011).
  12. Gerzova, L., et al. Characterization of microbiota composition and presence of selected antibiotic resistance genes in carriage water of ornamental fish. PLoS ONE. 9, e103865 (2014).
  13. Power, M., Emery, S., Gillings, M. Into the wild: dissemination of antibiotic resistance determinants via a species recovery program. PLoS ONE. 8, e63017 (2013).
  14. Stokes, H. W., Gillings, M. R. Gene flow, mobile genetic elements and the recruitment of antibiotic resistance genes into Gram-negative pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 35 (5), 790-819 (2011).
  15. Moura, A., Oliveira, C., Henriques, I., Smalla, K., Correia, A. Broad diversity of conjugative plasmids in integron-carrying bacteria from wastewater environments. FEMS Microbiol. Lett. 330 (2), 157-164 (2012).
  16. Schlüter, A., Krause, L., Szczepanowski, R., Goesmann, A., Pühler, A. Genetic diversity and composition of a plasmid metagenome from a wastewater treatment plant. J. Biotech. 136 (1-2), 65-76 (2008).
  17. Taylor, N. G. H., Verner-Jeffreys, D. W., Baker-Austin, C. Aquatic systems: maintaining, mixing and mobilising antimicrobial resistance. TREE. 26 (6), 278-284 (2011).
  18. Stalder, T., et al. Quantitative and qualitative impact of hospital effluent on dissemination of the integron pool. ISME J. 8, 768-777 (2014).
  19. Allen, H. K., et al. Call of the wild: antibiotic resistance genes in natural environments. Nature Rev. Microbiol. 8, 251-259 (2010).
  20. Wellington, E. M., et al. The role of the natural environment in the emergence of antibiotic resistance in Gram-negative bacteria. Lancet Infect. Dis. 13 (2), 155-165 (2013).
  21. Gillings, M. R., et al. Mobilization of a Tn402-like class 1 integron with a novel cassette array via flanking miniature inverted-repeat transposable element-like structures. Appl. Env. Microbiol. 75 (18), 6002-6004 (2009).
  22. Graham, D. W., Collignon, P., Davies, J., Larsson, D. J., Snape, J. Underappreciated role of regionally poor water quality on globally increasing antibiotic resistance. Env. Sci. Technol. 48 (20), 11746-11747 (2014).
  23. Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. The antibiotic resistome: what's new. Curr. Opinion Microbiol. 21, 45-50 (2014).
  24. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. 63, e3998-e3998 (2011).
  25. Gillings, M. R. Rapid Extraction of PCR-Competent DNA from Recalcitrant Environmental Samples. Env. Microbiol. 1096, 17-23 (2014).
  26. Sajjad, A., Holley, M. P., Labbate, M., Stokes, H., Gillings, M. R. Preclinical class 1 integron with a complete Tn402-like transposition module. Appl. Env. Microbiol. 77 (1), 335-337 (2011).
  27. Wright, G. D. Antibiotic resistance in the environment: A link to the clinic. Curr. Opinion Microbiol. 13 (5), 589-594 (2010).
  28. Stokes, H., Nesbo, C., Holley, M., Bahl, M., Gillings, M., Boucher, Y. Class 1 integrons predating the association with Tn402.-like transposition genes are present in a sediment microbial community. Journal of Bacteriology. 188, 5722-5730 (2006).
  29. Lane, D. J. Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. , John Wiley &Sons, Inc. 115-175 (1991).
  30. Holmes, A. J., et al. Recombination activity of a distinctive integron-gene cassette system associated with stutzeri. populations in soil. Journal of Bacteriology. 185, 918-928 (2003).

Tags

מדעי הסביבה גיליון 100 integron העברת גנים רוחבית אפידמיולוגיה resistome עמידות לאנטיביוטיקה זיהום xenogenetic
הקרנת מזון לכיתה Integrons 1 וג'ין קלטות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Waldron, L. S., Gillings, M. R.… More

Waldron, L. S., Gillings, M. R. Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes. J. Vis. Exp. (100), e52889, doi:10.3791/52889 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter