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कक्षा 1 Integrons और जीन कैसेट के लिए खाद्य पदार्थों स्क्रीनिंग

Published: June 19, 2015 doi: 10.3791/52889
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Macquarie University

Introduction

एंटीबायोटिक दवाओं की खोज 20 वीं सदी की सबसे बड़ी वैज्ञानिक उपलब्धियों में से एक था। हालांकि, एंटीबायोटिक दवाओं के उपयोग और दुरुपयोग एंटीबायोटिक प्रतिरोधी बैक्टीरिया के तेजी से विकास के लिए नेतृत्व किया गया है, और अब ये 21 वीं सदी में सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए एक गंभीर खतरा है। सबसे उपचार के विकल्प के लिए प्रतिरोधी जीवाणु उपभेदों के उदय हम रोगाणुरोधी दवाओं नहीं रह 1,2 प्रभावी रहे हैं, जहां एक युग में प्रवेश कर रहे संभावना को जन्म देती है।

एंटीबायोटिक प्रतिरोध प्रदान कि आनुवंशिक मशीनरी साल 3 के लाखों लोगों द्वारा मनुष्यों और एंटीबायोटिक चयन के दबाव predating, एक प्राचीन पद्धति है। ऐसे प्लास्मिड, transposons, जीनोमिक द्वीप समूह, एकीकृत conjugative तत्वों और integrons के रूप में मोबाइल आनुवंशिक तत्वों, के भीतर और बैक्टीरियल प्रजातियों के बीच 4 दोनों एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीनों (ARG) का प्रसार कर सकते हैं। इनमें से integrons के बावजूद, ARG के प्रसार में एक केंद्रीय भूमिका निभाई हैवे बैक्टीरियल जीनोम 5 में प्लास्मिड और जुटाना और प्रविष्टि के लिए transposons पर भरोसा तथ्य यह है कि। Integrons एक integron-इंटिग्रेस का उपयोग कर जीन कैसेट पर कब्जा है, और फिर इनकोडिंग एक integron प्रमोटर 6,7 (चित्रा 1) का उपयोग कैसेट व्यक्त करते हैं। जीन Integron कैसेट जिनके उत्पादों एंटीबायोटिक दवाओं या कीटाणुनाशक से 8 प्रतिरोध प्रदान कर सकते हैं एक खुला पढ़ने फ्रेम (ओआरएफ) से मिलकर छोटे से मोबाइल तत्व हैं। कक्षा 1 integrons सबसे अधिक वे सामूहिक रूप से 130 विभिन्न एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन कैसेट 9 से अधिक प्राप्त कर लिया है, जहां नैदानिक ​​वियोजन 5, से बरामद integrons हैं।

मानव जुड़े खानेवाला और रोगजनक बैक्टीरिया में कक्षा 1 integrons के प्रसार इन आनुवंशिक तत्वों 10 की संख्या में होते हैं कि मानव अपशिष्ट धाराओं उत्पन्न करता है। कक्षा 1 integrons होते हैं कि एक अनुमान के अनुसार 10 से 19 बैक्टीरिया मल मल हर साल मैं के माध्यम से जारी किया जाता हैएन यूनाइटेड किंगडम 11। यह एंटीबायोटिक प्रतिरोध प्रदान कक्षा 1 integrons अब जंगली पक्षियों, मछलियों, और अन्य देशी वन्य जीवन के 12-14 की microbiota में पता लगाया जा रहा है कि इसलिए आश्चर्य की बात नहीं है। नए जीन कैसेट और अन्य मोबाइल तत्वों के साथ जटिल rearrangements की अधिग्रहण विशेष रूप से मलजल उपचार संयंत्र और अन्य जल निकायों 15-18 में, फिर भी रहती है, क्योंकि वातावरण में वापस integrons जारी करते हुए एक महत्वपूर्ण सार्वजनिक स्वास्थ्य खतरा बना हुआ है। प्राकृतिक वातावरण फिर नए प्रतिरोध निर्धारकों और अवसरवादी रोगज़नक़ों 19,20 के लिए एक उपजाऊ जमीन भर्ती हो जाता है। उपन्यास integron युक्त बैक्टीरिया और नए args दूषित पानी और भोजन 21,22 के माध्यम से मानव समुदाय में वापस चक्र कर सकते हैं। पर्यावरण args की निगरानी समझ और भविष्य 23 में एंटीबायोटिक प्रतिरोध के प्रबंधन के लिए एक महत्वपूर्ण रणनीति है। विशेष रूप से, ध्यान कच्चा खाया या कर रहे हैं कि खाद्य पदार्थों के लिए भुगतान किया जाना चाहिएइन नए मोबाइल तत्वों और रोगज़नक़ों के प्रसारण के लिए सबसे बड़ा खतरा मौजूद है के बाद से हल्के से, पकाया जाता है।

इस प्रोटोकॉल, 1 integrons और खाद्य पदार्थों में उनके जुड़े जीन कैसेट, का पता लगाने की पहचान करने और वर्ग निस्र्पक के लिए एक सुव्यवस्थित दृष्टिकोण में (चित्रा 2) रेखांकित कर रहे हैं। संवर्धन और पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) का एक संयोजन का उपयोग करना, integrons तेजी से जटिल बैक्टीरियल समुदायों और व्यक्तिगत वियोजन में पता लगाया जा सकता है। बैक्टीरिया और integron जुड़े जीन कैसेट की रचना और पहचान की प्रजातियों की पहचान करने के लिए तरीके दिए गए हैं। विधि पौधे और पशु खाद्य पदार्थों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त है, और ठेठ वर्कफ़्लोज़ के उदाहरण इन खाद्य प्रकार से प्रत्येक के लिए दिया जाता है।

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Protocol

कच्चा खाया या हल्के से पका रहे हैं कि खाद्य पदार्थों के मानव स्वास्थ्य के लिए सबसे चिंता का विषय हैं। उदाहरण सलाद सब्जियों, फलों, शंख और क्रसटेशियन शामिल हैं।

1. नमूना संग्रह

  1. संदूषण कि कम से कम शर्तों के तहत नमूने एकत्र, और परिवहन के दौरान अलग, साफ बैग में संग्रहीत। एकत्र करने के बाद, नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत है और 24 घंटे के भीतर कार्रवाई की जानी चाहिए।

2. समृद्ध संस्कृति की तैयारी

  1. फल और सब्जियां:
    1. एक टिकाऊ प्लास्टिक की थैली में सामग्री का लगभग 10 ग्राम रखें। बड़े माल प्रसंस्करण, तो फल या सब्जी की त्वचा पर ध्यान केंद्रित। 30 सेकंड के लिए एक चप्पू ब्लेंडर में 90 मिलीलीटर 0.1 एम सोडियम फॉस्फेट बफर, पीएच 7.0 और प्रक्रिया जोड़ें। एक चप्पू ब्लेंडर उपलब्ध नहीं है, तो वैकल्पिक रूप से, सामग्री मैन्युअल रूप से उत्तेजित किया जा सकता है।
    2. दो 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूबों में तरल लीजिए। गोली बैक्टीरिया को 7 मिनट के लिए 4000 XG पर अपकेंद्रित्र ट्यूब। ध्यान से बाँझ Luria Bertani (पौंड) शोरबा के 30 मिलीलीटर में pelleted बैक्टीरिया सतह पर तैरनेवाला हटाने और निलंबित।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर अन्य 25 डिग्री सेल्सियस पर एक ट्यूब पकड़ रहा है और एक प्रकार के बरतन हे / एन पर सेते हैं। संस्कृति प्रति मिनट 200 दोलनों (ओपीएम) में हिल जाना चाहिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर संस्कृतियों जब तक की आवश्यकता है।
  2. समुद्री भोजन:
    1. बाँझ संदंश और चिमटी का उपयोग कर पेट (कस्तूरी) या पाचन तंत्र (झींगे) काटना और 0.1 एम सोडियम फॉस्फेट बफर, पीएच 7.0 के 200 μl युक्त एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में जगह है। एक homogenate बनाने के लिए नमूना तर।
    2. दो बाँझ 5 एमएल ट्यूबों में लेग शोरबा के 5 एमएल बांटना, और समुद्री भोजन homogenate के साथ प्रत्येक टीका लगाना।
    3. 25 डिग्री सेल्सियस और अन्य 37 डिग्री सेल्सियस से कम एक ट्यूब पकड़े, एक प्रकार के बरतन हे / एन पर सेते हैं। संस्कृति 200 ओपीएम पर हिलाकर रख दिया जाना चाहिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर संस्कृतियों जब तक की आवश्यकता है।

Integrons के लिए 3. स्क्रीनिंग संस्कृति

2 MgCl एकाग्रता। यदि आवश्यक हो, लोरेन्ज (2011) 24 इस पत्रिका के पहले के एक अंक में पीसीआर अनुकूलन और समस्या निवारण विधियों का ब्यौरा दिया है।

  1. उबला हुआ डीएनए की तैयारी:
    1. एक बाँझ 0.5 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब में समृद्ध संस्कृति की 100 μl बांटना। एक पानी के स्नान या गर्मी ब्लॉक का उपयोग करते हुए 10 मिनट के लिए 99 डिग्री सेल्सियस के लिए नमूना गरम करें। 2 मिनट के लिए बर्फ पर सर्द निकलो।
    2. 5 मिनट के लिए 14,000 XG पर microcentrifuge सेल मलबे गोली। बर्फ पर लौटें। डीएनए के नमूने की आवश्यकता है जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए किया जा सकता है, लेकिन बर्फ पर thawed किया जाना चाहिए।
  2. पीसीआर का उपयोग कक्षा 1 integrons के लिए स्क्रीनिंग:
    नोट: हे / एन ऊष्मायन से मिश्रित संस्कृतियों HS463a / HS464 पीसीआर प्रोटोकॉल (तालिका 1) का उपयोग करते हुए कक्षा 1 integrons के लिए जांच कर रहे हैं।
    1. किसी भी संभावित Sou से दूर, बर्फ पर सभी पीसीआर अभिकर्मकों पिघलनाडीएनए contaminating की rces। नकारात्मक नियंत्रण (तालिका 2) सहित नमूना प्रति 48 μl पीसीआर mastermix अप करें। बाधा युक्तियों का उपयोग, प्रत्येक ट्यूब पीसीआर मास्टर मिश्रण के 48 μl बांटना।
    2. बाधा युक्तियों का उपयोग व्यक्तिगत पीसीआर ट्यूबों के लिए thawed डीएनए के 2 μl जोड़ें। पीसीआर thermocycler में उपयुक्त प्रोग्राम चलाएँ।
    3. प्रवर्धन के परिणामों का आकलन करने के लिए, डाला और TBE बफर (90 मिमी Tris-borate, 2 मिमी EDTA) में चलाने के लिए एक 2% agarose जेल पर पीसीआर उत्पाद के 7 μl Electrophorese। एक 100 बीपी सीढ़ी के रूप में इस तरह के एक आणविक वजन मार्कर, को शामिल करें।
    4. पोस्ट एक डीएनए दाग के साथ जेल दाग, और एक यूवी transilluminator का उपयोग करते हुए कल्पना। नकारात्मक नियंत्रण में कोई प्रवर्धन कर दिया गया है कि जाँच करें। किसी विशेष नमूना के लिए चारों ओर 470 बीपी पर एक मजबूत बैंड मिश्रित संस्कृति एक कक्षा 1 integron ले कि बैक्टीरिया होते हैं कि इंगित करता है। शुद्ध कालोनियों अब एक सकारात्मक पीसीआर लौटे कि किसी भी मिश्रित संस्कृति से अलग हो जाएगा।

  1. धारावाहिक dilutions और प्रसार प्लेट्स:
    नोट: पीसीआर पॉजिटिव मिश्रित संस्कृतियों से एकल कालोनियों को अलग-थलग करने के लिए, मिश्रित संस्कृति क्रमानुसार सोडियम फॉस्फेट बफर में 10 गुना पतला, और उसके बाद एकल कालोनियों को ठीक करने में चढ़ाया जाता है।
    1. 0.1 एम सोडियम फॉस्फेट बफर, पीएच 7.0 से 9 मिलीलीटर मिश्रित संस्कृति के 1 मिलीलीटर जोड़ें और उलटा द्वारा मिश्रण। 10 -8 के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने तक फॉस्फेट बफर का एक और 9 मिलीलीटर कमजोर पड़ने के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और दोहराने पर पहुंच गया है।
    2. दो प्रतियों में, लेग अगर पर 10 -4 -8 से 10 dilutions की 100 μl बिखरा हुआ है। प्रारंभिक मिश्रित संस्कृति के लिए प्रयोग किया जाता है उसी के तापमान पर प्लेटें हे / एन सेते हैं। प्लेट्स तो फिर भी यह काफी तुरंत एकल कालोनियों संसाधित करने के लिए सबसे अच्छा है, जब तक आवश्यक है 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है।
  2. एकल कॉलोनी चयन और उबला हुआ डीएनए की तैयारी:
    1. एसई धारावाहिक कमजोर पड़ने प्लेटें, से एकल कालोनियों उठाओऐसे कॉलोनी आकार, आकार और रंग के रूप में मानदंड का उपयोग संभव के रूप में कई अलग अलग कॉलोनी प्रकार lecting। प्रसार थाली से एकल कालोनियों का चयन करने के लिए बाँझ toothpicks का प्रयोग करें।
    2. कॉलोनी के लिए दन्तखुदनी स्पर्श करें, और उसके बाद बाँझ पानी के 100 μl युक्त एक पीसीआर ट्यूब में हस्तांतरण। कालोनियों की बड़ी संख्या की जांच की जा करने के लिए कर रहे हैं, तो कालोनियों एक microtiter ट्रे में तैयार किया जा सकता है। पानी में कोशिकाओं में से कुछ को बेदखल करने के लिए उंगलियों के बीच दन्तखुदनी स्पिन।
    3. एक ही दन्तखुदनी का उपयोग करना, कॉलोनी की एक लकीर के साथ एक लेग थाली टीका लगाना। प्रत्येक लकीर के बारे में 1 सेमी लंबा है अगर कालोनियों के बड़ी संख्या में लेबल प्लेटों पर संग्रहित किया जा सकता है। आप वियोजन का एक उपयुक्त संख्या का चयन किया है, जब तक 3 करने के लिए कदम 1 दोहराएँ।
    4. प्रारंभिक समृद्ध संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया है कि के रूप में ही तापमान पर, लेग प्लेटों हे / एन सेते हैं। जब तक आवश्यक संस्कृति तो 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    5. बैक्टीरियल निलंबन से डीएनए तैयार करने के लिए, कहां के रूप में चरणों का पालन करेंधारा 3.1 में tlined। खंड 3.2 में उल्लिखित के रूप में शुद्ध संस्कृति lysates के स्क्रीनिंग के लिए, HS463a / HS464 पीसीआर प्रदर्शन करते हैं। कि एक सकारात्मक पीसीआर जीनोमिक डीएनए (धारा 5) की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया, और आगे के विश्लेषण के लिए किया जाएगा लौटने आइसोलेट्स।

मनका 25 बैरंग का प्रयोग 5. के जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण Integron पॉजिटिव एकल कालोनियों

  1. खंड 4.2 में पृथक शुद्ध संस्कृति का एक नमूना के साथ लेग शोरबा के 5 मिलीलीटर टीका लगाना। प्रारंभिक समृद्ध संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया गया था कि एक ही तापमान में मिलाते हुए, ओ / एन सेते हैं।
  2. गोली कोशिकाओं 7 मिनट के लिए 4000 XG पर, फिर सतह पर तैरनेवाला हटा दें। एक lysing मैट्रिक्स ई तेजी से प्रस्तुत करने का ट्यूब में 1 मिलीलीटर सीएलएस-टीसी समाधान में pelleted कोशिकाओं Resuspend। एक मनका पिटाई मशीन का प्रयोग, 30 सेकंड के लिए 5.5 मीटर / सेकंड पर नमूना प्रक्रिया।
  3. अपकेंद्रित्र 5 मिनट के लिए 14,000 XG पर ट्यूब और एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला के 700 μl ठीक हो।
  4. 6 एम गुआन के साथ 5: 1 पतला बाध्यकारी मैट्रिक्स के 700 μl जोड़ेंidinium thiocyanate और 5 मिनट के लिए आरटी पर मिश्रण। 1 मिनट, सतह पर तैरनेवाला त्यागें के लिए 14,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
  5. गोली पूरी तरह से resuspended है जब तक 800 μl नमक इथेनॉल धोने (70% इथेनॉल, 0.1 एम सोडियम एसीटेट) और भंवर जोड़ें। 1 मिनट के लिए 14,000 XG पर आरटी पर 5 मिनट, सेंट्रीफ्यूज के लिए धो और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। , फिर 5 मिनट के लिए हवा शुष्क करने की अनुमति आवश्यक हो तो एक micropipette का उपयोग, सभी सतह पर तैरनेवाला हटा दिया गया है सुनिश्चित करें।
  6. ऊपर और नीचे pipetting द्वारा 200 μl ते (10 मिमी Tris-एचसीएल, 1mm EDTA, पीएच 7.6) में गोली मैट्रिक्स Resuspend। 3 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। 3 मिनट और एक बाँझ ट्यूब में स्थानांतरण eluted डीएनए के 160 μl के लिए 14,000 XG पर अपकेंद्रित्र। डीएनए निष्कर्षण की उपज और अखंडता की जाँच करने के लिए एक 2% W / वी agarose जेल पर जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण के एक विभाज्य चलाएँ। शुद्ध जीनोमिक डीएनए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और पीसीआर परीक्षण के लिए आवश्यक है जब बर्फ पर defrosted है।

6. डायग्नोस्टिक PCRs और डीएनए अनुक्रमण

ध्यान दें:खंड 5 में तैयार जीनोमिक डीएनए सभी नैदानिक ​​PCRs के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, और कक्षा 1 integrons के लिए सकारात्मक परीक्षण की पुष्टि के लिए।

  1. संक्षेप में 20 सेकंड के लिए 14,000 XG पर डीएनए नमूने और नाड़ी स्पिन भंवर, बर्फ पर जीनोमिक डीएनए गला लें। अलग 471 बीपी amplicon (धारा 3.2) के लिए सकारात्मक है कि इस बात की पुष्टि HS463a / HS464 (तालिका 1) का उपयोग करते हुए कक्षा 1 integron-इंटिग्रेस जीन के लिए पीसीआर को दोहराएँ।
  2. प्रजातियों के स्तर तक सकारात्मक संस्कृतियों की पहचान छोटे सबयूनिट rRNA जीन (-16 rDNA) के विश्लेषण के द्वारा हासिल की है। प्राइमरों f27 / r1492 (तालिका 1) का उपयोग -16 जीन बढ़ाना। वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करते हुए पीसीआर उत्पादों की जाँच करें। सभी जीवाणु लक्ष्य 1450 के बारे में बीपी के एक -16 amplicon उत्पन्न करनी चाहिए।
  3. अनुक्रम -16 RRNA जीन amplicon प्रजातियों पहचान निर्धारित करने के लिए, लेकिन एक ही बैक्टीरियल प्रजातियों हो जाएगा कदम 6.2 से कई सकारात्मक PCRs होने की संभावना है, और इन सकारात्मक काफी भिन्न होते हैं के बाद से, हम पहले usin विभिन्न प्रजातियों अलग होगा-16 पीसीआर उत्पाद के छ प्रतिबंध पाचन।
    1. प्रतिबंध एंजाइम Hinf 1 के साथ -16 पीसीआर के एक विभाज्य डाइजेस्ट। किसी भी 4 बीपी दरार साइटों करना होगा पहचानता है कि एंजाइम, लेकिन Hinf 1 -16 लक्ष्य से अच्छी विविधता उत्पन्न करता है, और एक विश्वसनीय, सस्ती एंजाइम है।
  4. एक 30 μl प्रतिबंध एक बाँझ ट्यूब में mastermix (तालिका 2) को पचाने और संयुक्त राष्ट्र के purfied -16 पीसीआर उत्पाद के 20 μl जोड़ने के सेट करें। एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान हे / एन में सेते हैं। एक 2% agarose जेल पर डाइजेस्ट की जाँच करें।
  5. Hinf 1 द्वारा उत्पादित पाचन पैटर्न स्कोर। एक ही -16 प्रतिबंध प्रोफाइल के साथ आइसोलेट्स एक ही प्रजाति होने की संभावना है। बल्कि प्रत्येक Hinf 1 प्रतिबंध पैटर्न के सबसे तीन प्रतिनिधियों में हर -16 पीसीआर उत्पाद, अनुक्रम अनुक्रमण से अधिक है।
  6. एक वाणिज्यिक किट का उपयोग -16 पीसीआर उत्पादों शुद्ध। एक एकल असहाय exonuclease किट इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन स्तंभ आधारित या वर्षा तरीकों में भी uninc दूर करने के लिए अच्छी तरह से कामorporated प्राइमरों और एकल असहाय DNAs। अनुक्रम, प्राइमर R910 (तालिका 1) का उपयोग अनुक्रमण सुविधा द्वारा निर्दिष्ट के रूप में प्रतिक्रियाओं की स्थापना -16 amplicons।
  7. Blastn समारोह के साथ (एन सी बी आई डीएनए डेटाबेस से पूछताछ के लिए जिसके परिणामस्वरूप डीएनए अनुक्रम का उपयोग http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi )। ग्रेटर की तुलना में 97% न्यूक्लियोटाइड पहचान आमतौर पर प्रजातियों की पहचान के रूप में लिया जाता है।

7. मैपिंग और Integrons और कैसेट्स सारणियों की विशेषता

नोट: मानव बहुल पारिस्थितिकी प्रणालियों से चलाई कक्षा 1 integrons आपके सभी नमूनों में सबसे आम integrons होने की संभावना है। ये integrons सभी हाल ही में एक ही मूल है, और इसलिए एक अत्यधिक संरक्षित डीएनए अनुक्रम 5 है।

  1. एक वर्ग के बीच 1 मानव स्रोतों से निकलती integrons और एक प्रदर्शन से पर्यावरणीय नमूनों में प्राकृतिक रूप से पाए जाते हैं कि उन अंतरप्राइमर के साथ पीसीआर intI1F165 / intI1R476 10 (1 टेबल) की स्थापना की।
    नोट: पर्यावरण कक्षा 1 integrons किसी भी उत्पाद उत्पन्न नहीं होगा, जबकि नैदानिक ​​या खानेवाला बैक्टीरिया से कक्षा 1 integrons, एक ~ 300 बीपी उत्पाद उत्पन्न होगा।
  2. प्राइमर सेट HS458 / HS459 साथ कैसेट सरणी amplifying द्वारा नैदानिक ​​integrons की विशेषताएँ। इस पीसीआर सबसे कैसेट सरणियों की टर्मिनस पर intI1 और 3 'संरक्षित खंड के बीच इस क्षेत्र बढ़ाना होगा। कैसेट की संख्या और पहचान चर रहा है, क्योंकि पीसीआर उत्पाद का आकार भी अलग-अलग होगा।
  3. Amplicons के शुद्ध और प्रवर्धन प्राइमरों में से प्रत्येक का उपयोग करते हुए डीएनए अनुक्रम। Blastn समारोह (का उपयोग डीएनए डेटाबेस से पूछताछ करने के लिए दृश्यों का उपयोग http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi )।
  4. Integron जीन कैसेट के लिए कई डेटा बयानों के बाद से, मानकीकृत नामकरण 9 पालन कैसेट का नामकरण सुनिश्चित करेंएस असंगत या अस्पष्ट नामों का उपयोग करें। इन transmissibility, pathogenicity या डाह 8,21 वृद्धि हुई प्रदान जीन है कि सहित, नए phenotypes के सांकेतिक शब्दों में बदलना कर सकते हैं के बाद से, उपन्यास जीन कैसेट के लिए विशेष ध्यान दे।
    नोट: कक्षा 1 integron के पूर्व नैदानिक ​​रूपों अभी भी प्राकृतिक वातावरण में प्रसारित। विशेष रूप से, सक्रिय तमिलनाडु 402 transposons से जुड़े होते हैं, उन है कि सबसे अधिक ब्याज 26 के हैं। इन integrons की कैसेट सरणियों प्राइमर सेट HS458 / HS459 साथ बढ़ाना नहीं होगा, लेकिन कैसेट सामग्री पर निर्भर चर आकार की amplicons के सृजन MRG284 / MRG285 प्राइमर सेट (तालिका 1) के साथ परिलक्षित किया जा सकता है। पीसीआर उत्पादों शुद्ध और 7.2 में उल्लिखित के रूप में डीएनए अनुक्रम किया जाना चाहिए।

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Representative Results

मिश्रित संस्कृतियों और intI1 के लिए बैक्टीरियल आइसोलेट्स की स्क्रीनिंग

प्राइमर सेट HS463a / HS464 पीसीआर कक्षा 1 integron-इंटिग्रेस जीन, intI1 (चित्रा 1) की उपस्थिति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस किताब सेट मिश्रित संस्कृतियों में intI1 का पता लगाने के लिए अच्छी तरह से काम करता है, और यह भी फैल प्लेट (चित्रा 2) से काटा जीवाणु कॉलोनियों स्क्रीन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। सकारात्मक वियोजन इस प्राइमर सेट (चित्रा 3 ए) का उपयोग कर 471 बीपी पर एक भी मजबूत बैंड उत्पन्न करनी चाहिए। सकारात्मक वियोजन के बहुमत मनुष्य या अपने कृषि और घरेलू पशुओं से उत्पन्न है कि intI1 ले जाएगा। ये वियोजन भी एक 311 बीपी amplicon (चित्रा 1) उत्पन्न करनी चाहिए जो एक पीसीआर का उपयोग प्राइमरों F165 / R476 में सकारात्मक हो जाएगा। IntI1 के पर्यावरण के सूत्रों आम तौर पर यह दूसरा परख में सकारात्मक नहीं होगा।

Integron कैसेट सरणियों की विशेषता

में 402 -associated वर्ग की कैसेट सरणियों 1 integrons प्राइमरों HS458 / HS459 का उपयोग कर परिलक्षित किया जा सकता। इन प्राइमरों क्रमशः integron पुनर्संयोजन साइट को लक्षित है, और सामान्य रूप से qacEΔ sul1 जीन संलयन (चित्रा 1) में समाप्त हो जाता है, जो कैसेट सरणी, के 3 'अंत। इस परख में उत्पन्न पीसीआर उत्पादों के आकार सरणी (3B चित्रा) में संख्या और कैसेट की पहचान के अनुसार बदलता रहता है। पर्यावरण कक्षा 1 integrons अक्सर बैक्टीरियल गुणसूत्रों में एम्बेडेड रहे हैं, और उनके कैसेट सरणियों समीपस्थ और सबसे बाहर का पुनर्संयोजन साइटों (चित्रा 1) लक्ष्य है कि प्राइमरों से परिलक्षित किया जा सकता है। प्राइमर MRG284 / 285 कैसेट सामग्री से भिन्न होता है, क्योंकि amplicons का आकार भी बदलता रहता है, फिर इस क्षेत्र बढ़ाना करने के लिए तैयार है, और कर रहे हैं (चित्रा -3 सी)। HS458 / 459 पीसीआर की अनुक्रमणअनुक्रमण MRG284 / 285 पीसीआर उत्पादों को आम तौर पर अज्ञात समारोह के polypeptides सांकेतिक शब्दों में बदलना है कि जीन कैसेट ठीक हो जाएगी, जबकि उत्पादों को आम तौर पर जाना जाता है, एंटीबायोटिक प्रतिरोध निर्धारकों ठीक हो जाएगी।

बैक्टीरियल प्रजातियों की पहचान

जीवाणु -16 rDNA अनुक्रमण और डेटाबेस तुलना का उपयोग कर पहचाना जाता है। जीनोमिक डीएनए -16 छोटे सबयूनिट rRNA जीन का प्रवर्धन के लिए एक टेम्पलेट के रूप में प्रयोग किया जाता है। प्राइमरों सुझाव का उपयोग करना, इस 1450 के बारे में बीपी के एक amplicon उत्पन्न करनी चाहिए। कालोनियों की बड़ी संख्या किसी भी एक समय पर जांच की जा सकती है, क्योंकि एक श्रेणीबद्ध स्क्रीनिंग विधि कार्यरत है। प्रवर्धित -16 पीसीआर उत्पादों प्रतिबंध एंजाइम Hinf 1 के साथ पचा रहे हैं, और इन हज़म agarose जैल पर अलग हो रहे हैं। व्यक्तिगत प्रजातियों एक ही प्रजाति के वियोजन आसानी से पहचाना जा सकता है कि इस तरह डाइजेस्ट के बाद विशिष्ट पैटर्न, (चित्रा 3 डी) उत्पन्न करेगा। तीन में से एक अधिकतम से -16 RRNA जीन पीसीआर उत्पादों अनुक्रमणकिसी भी एक प्रतिबंध पैटर्न का प्रतिनिधित्व integron सकारात्मक वियोजन का एक संग्रह में सभी की संभावना प्रजातियों के कुशल पहचान की अनुमति देता आइसोलेट्स।

चित्र 1
चित्रा कक्षा 1 integrons 1. संरचना। बाध्यकारी साइटों पीसीआर प्राइमर दिखा नैदानिक ​​और पर्यावरण कक्षा 1 integrons के योजनाबद्ध आरेख, पांडुलिपि में करने के लिए भेजा। कक्षा 1 integrons एक कैसेट सरणी बनाने के लिए कब्जा है और जीन कैसेट की अभिव्यक्ति उत्प्रेरित करता है कि एक integron-इंटिग्रेस जीन (intI1) से मिलकर बनता है। एंटीबायोटिक उपयोग के आगमन से पहले, कक्षा 1 integrons के बहुमत गुणसूत्र थे, और जिसका कार्य अभी तक कर रहे हैं निर्धारित किया जा करने के लिए जीन कैसेट ले गए। एंटीबायोटिक का उपयोग के माध्यम से सशक्त चयन बेहद तमिलनाडु 402 transposon के साथ जुड़े कक्षा 1 integron के एक दृश्य संस्करण की बहुतायत बढ़ गया है।ये 'नैदानिक' integrons एंटीबायोटिक प्रतिरोध सांकेतिक शब्दों में बदलना है कि कैसेट की सरणियों हासिल कर ली है। यह वर्तमान में प्राकृतिक वातावरण और खाद्य उत्पादन श्रृंखला प्रदूषण कर रहे हैं कि इन integrons है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
खाद्य पदार्थों में कक्षा 1 integrons का पता लगाने के लिए 2. योजनाबद्ध फ़्लोचार्ट चित्रा। खाद्य पदार्थों के नमूने मीडिया टीका लगाना और एक मिश्रित जीवाणु संस्कृति उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इन मिश्रित संस्कृतियों कक्षा 1 integrons की उपस्थिति के लिए जांच कर रहे हैं, और सकारात्मक संस्कृतियों फैल प्लेटें तैयार करने के लिए प्रयोग किया जाता है। प्रसार प्लेटों से अलग-अलग कालोनियों integrons के लिए rescreened कर रहे हैं। सकारात्मक संस्कृतियों निकाले और डीएनए एसई द्वारा कैसेट सामग्री के लिए विशेषता शुद्ध, डीएनए कर रहे हैंquencing। -16 RRNA जीन का अनुक्रमण प्रजातियों की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. प्रतिनिधि electrophoretic जांच प्रक्रिया से विश्लेषण करती है। (ए) intI1 HS463a / 464 प्राइमरों का उपयोग एकल कालोनियों स्क्रीनिंग। सकारात्मक कालोनियों 471 बीपी पर एक मजबूत एकल बैंड उत्पन्न करते हैं। प्राइमरों HS458 / 459 का उपयोग करते हुए तमिलनाडु 402 integrons से कैसेट सरणियों (बी) प्रवर्धन। इस पीसीआर चर उत्पाद सरणी में घटक कैसेट की पहचान और आकार पर निर्भर आकार उत्पन्न करता है। इन कैसेटों की पहचान डीएनए अनुक्रमण की आवश्यकता है। (सी) पर्यावरण कक्षा 1 मैं से कैसेट सरणियों के प्रवर्धनप्राइमरों MRG284 / 285 का उपयोग कर ntegrons। इस पीसीआर भी, चर उत्पाद पहचान और सरणी में घटक कैसेट के आकार पर निर्भर आकार उत्पन्न पर्यावरण सरणियों एंटीबायोटिक प्रतिरोध सांकेतिक शब्दों में बदलना करने की संभावना नहीं कर रहे हैं में हालांकि कैसेट। (डी) Hinf 1 के साथ पाचन द्वारा -16 पीसीआर उत्पादों की स्क्रीनिंग। समान प्रतिबंध पैटर्न एक ही प्रजाति होने की संभावना के साथ आइसोलेट्स। एक भी प्रतिबंध प्रकार की बड़ी संख्या को बरामद कर रहे हैं, इनमें से केवल कुछ अनुक्रम किया जा जरूरत है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पीसीआर जीन लक्ष्य प्राइमर नाम दिशा अनुक्रम 5 '- 3' साइकिल चालन की स्थिति Reference
HS463a / HS464 कक्षा 1 Integron HS464 आगे ACATGCGTGTAAATCATCGTCG 94 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट; 35 चक्र 94 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड, 60 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड, 72 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 30 सेकंड; 72 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट स्टोक्स एट अल।, 2006 28
HS463a रिवर्स CTGGATTTCGATCACGGCACG
f27 / r1492 -16 RRNA f27 आगे AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 94 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट; 35 चक्र 94 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड, 60 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड, 72 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 30 सेकंड; 72 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट लेन, 1991 29
r1492 रिवर्स TACGGYTACCTTGTTACGACTT
intI1F165 / IntI1R476 क्लीनिकल कक्षा 1 integron Inti1F165 आगे CGAACGAGTGGCGGAGGGTG 94 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट; 35 चक्र 94 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड, 55 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड, 72 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 30 सेकंड; 72 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट Gillings, 2014 10
intI1R476 रिवर्स TACCCGAGAGCTTGGCACCCA
HS549 / HS550 3'CS क्लीनिकल Integron HS549 आगे ACTAAGCTTGCCCCTTCCGC 94 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट; 35 चक्र 94 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड, 65 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड, 72 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 30 सेकंड; 72 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट स्टोक्स एट अल।, 2006 28
HS550 रिवर्स CTAGGCATGATCTAACCCTCGG
HS458 / HS459 क्लीनिकल कैसेट सरणी HS458 आगे GCAAAAAGGCAGCAATTATGAGCC 946, सी 3 मिनट; 35 चक्र 94 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड, 55 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड, 72 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 30 सेकंड; 72 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट होम्स एट अल।, 2003 30
HS459 रिवर्स GTTTGATGTTATGGAGCAGCAACG
MRG284 / MRG285 पर्यावरण कैसेट MRG284 आगे GTTACGCCGTGGGTCGATG 94 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट; 35 चक्र 94 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड, 55 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड, 72 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 30 सेकंड; 72 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट Gillings एट अल।, 2009 21
MRG285 रिवर्स CCAGAGCAGCCGTAGAGC

कक्षा 1 integrons और उनके संबद्ध जीन कैसेट की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया तालिका 1. प्राइमर दृश्यों और पीसीआर स्थितियों।

तालिका 2 पीसीआर और प्रतिबंध mastermix घटक को पचाने।

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Discussion

integrons और उनके संबद्ध जीन कैसेट की पहचान के संभावित नए अवसरवादी रोगजनकों के उद्भव की भविष्यवाणी मानव खाद्य श्रृंखला में रोगजनकों के लिए रास्ते पर नज़र रखने, और नए प्रतिरोध की पहचान करने में एक महत्वपूर्ण कदम है और डाह 8,21,26 निर्धारकों। इस पेपर का उद्देश्य, कक्षा 1 integrons के लिए नमूने स्क्रीनिंग उनके कैसेट सरणियों निस्र्पक और जिसमें वे रहते हैं बैक्टीरियल प्रजातियों की पहचान करने के लिए एक सुव्यवस्थित दृष्टिकोण का वर्णन करने के लिए किया गया था। प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम अच्छा सूक्ष्मजीवविज्ञानी अभ्यास शामिल है, और पीसीआर संदूषण को रोकने झूठी सकारात्मक उत्पन्न होता है।

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल आसानी से भी मानव रोगज़नक़ों में पाए जाते हैं कि वर्ग 2 और 3 कक्षा integrons सहित अन्य नैदानिक ​​प्रासंगिक integrons पता लगाने के लिए संशोधित किया जा सकता है। यह भी पानी, biofilms, मिट्टी या तलछट से माइक्रोबियल समुदायों में integrons पता लगाने के लिए संशोधित किया जा सकता है। कुछ limitatio कर रहे हैंबैक्टीरियल कोशिकाओं के संवर्धन पर निर्भरता से उत्पन्न होती हैं, जो इस तकनीक को एनएस। कई पर्यावरण बैक्टीरिया आसानी से कृषि योग्य नहीं हैं, और यहां वर्णित प्रोटोकॉल इन प्रजातियों का पता लगाने के लिए नहीं होता। बरामद कर रहे हैं कि प्रजातियों की सीमा अलग बैक्टीरियल मीडिया योगों और अब ऊष्मायन बार का उपयोग करके विस्तारित किया जा सकता है। फिर भी, मानव स्वास्थ्य के लिए ब्याज की प्रजातियों में से बहुमत यहाँ वर्णित शर्तों के तहत बढ़ने की संभावना है।

इस प्रोटोकॉल चयनात्मक मीडिया पर चढ़ाना है कि प्रयोग की तकनीक पर कुछ फायदे हैं। कोई मान्यताओं और बरामद होती जा सकता है व्यक्ति वियोजन, और नए प्रतिरोध जीन द्वारा किए गए प्रतिरोध निर्धारकों की पहचान के बारे में बनाया जा जरूरत है। अधिक सामान्य शब्दों में, कार्यप्रवाह भी ब्याज 4 की हो सकती है कि resistome 27 या mobilome के किसी भी तत्व का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। ऐसे assays एक में शामिल विभिन्न डीएनए तत्वों की गतिशीलता को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैंtibiotic प्रतिरोध, और रोगाणुरोधी यौगिकों की घटती शस्त्रागार के संरक्षण के लिए महत्वपूर्ण है।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए प्रासंगिक नहीं है।

Acknowledgments

मिशेल हॉल, लारिसा बिस्पो और तकनीकी सहायता के लिए गुस्तावो टेवारेस करने के लिए धन्यवाद।

Materials

पीसीआर अभिकर्मकों वॉल्यूम (μl) प्रतिबंध डाइजेस्ट अभिकर्मकों वॉल्यूम (μl)
जीवाणुरहित जल 21.5 जीवाणुरहित जल 23
10x GoTaq व्हाइट 25 बफर बी 5
RNAseA [1 मिलीग्राम / एमएल] 0.5 गोजातीय सीरम albumin [1 मिलीग्राम / एमएल] 1
आगे प्राइमर [50 माइक्रोन] 0.5 HinfI [10 इकाइयों / μl] 1
प्राइमर उल्टा [50 माइक्रोन] 0.5
Mastermix मात्रा 48 Mastermix मात्रा 30
डीएनए टेम्पलेट 2 पीसीआर खाका 20
अंतिम पीसीआर मात्रा 50 अंतिम प्रतिबंध डाइजेस्ट मात्रा 50
Name Company Catalog Number Comments
GoTaq Colourless Mastermix Promega M7132 Used in all PCRs
RNAse (Ribonuclease A from bovine pancreas) Sigma R6513-10MG Used in all PCRs
HinFI restriction enzyme Promega R6201 Used to digest 16S rDNA PCR poducts. Enzyme comes with optimal buffer and BSA
100 bp ladder GE Healthcare 27400701 Used as a size standard on all agarose gels
GelRed DNA stain Biotium 41003 CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material
Guanidinium thiocyanate Life Technologies AM9422 CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material
CLS-TC Solution MP Biomedicals 6540409 Resuspension solution used at the begining of the genomic DNA extraction
Lysing Matrix E FastPrep tubes MP Biomedicals 116914500 Tube required for mechanical disruption of bacterial cell walls. This code is used for packs of 500 tubes, smaller quantities are available.
Binding matrix MP Biomedicals 116540408 Diluted 1:5 with 6 M guanidinium thiocyanate and used in the genomic DNA extraction method.
Fast Prep machine MP Biomedicals Number of options available MP Biomedicals has a number of FastPrep machines available to purchase. Visit http://www.mpbio.com for more information

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References

  1. Bush, K., et al. Tackling antibiotic resistance. Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).
  2. Davies, J., Davies, D. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).
  3. Costa, V. M., et al. Antibiotic resistance is ancient. Nature. 477 (7365), 457-461 (2011).
  4. Gillings, M. R. Evolutionary consequences of antibiotic use for the resistome, mobilome and microbial pangenome. Front. Microbiol. 4, 4 (2013).
  5. Gillings, M., et al. The evolution of class 1 integrons and the rise of antibiotic resistance. J. Bacteriol. 190 (14), 5095-5100 (2008).
  6. Brassard, S., Lapointe, J., Roy, P. H. Diversity and relative strength of tandem promoters for the antibiotic-resistance genes of several integrons. Gene. 142 (1), 49-54 (1994).
  7. Partridge, S. R., et al. Definition of the attI1 site of class 1 integrons. Microbiol. 146 (11), 2855-2864 (2000).
  8. Gillings, M. R. Integrons: Past, Present, and Future. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 78 (2), 257-277 (2014).
  9. Partridge, S. R., Tsafnat, G., Coiera, E., Iredell, J. R. Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons. FEMS Microbiol. Rev. 33 (4), 757-784 (2009).
  10. Gillings, M. R., et al. Using the class 1 integron-integrase gene as a proxy for anthropogenic pollution. ISME J. In press, (2014).
  11. Gaze, W. H., et al. Impacts of anthropogenic activity on the ecology of class 1 integrons and integron-associated genes in the environment. ISME J. 5, 1253-1261 (2011).
  12. Gerzova, L., et al. Characterization of microbiota composition and presence of selected antibiotic resistance genes in carriage water of ornamental fish. PLoS ONE. 9, e103865 (2014).
  13. Power, M., Emery, S., Gillings, M. Into the wild: dissemination of antibiotic resistance determinants via a species recovery program. PLoS ONE. 8, e63017 (2013).
  14. Stokes, H. W., Gillings, M. R. Gene flow, mobile genetic elements and the recruitment of antibiotic resistance genes into Gram-negative pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 35 (5), 790-819 (2011).
  15. Moura, A., Oliveira, C., Henriques, I., Smalla, K., Correia, A. Broad diversity of conjugative plasmids in integron-carrying bacteria from wastewater environments. FEMS Microbiol. Lett. 330 (2), 157-164 (2012).
  16. Schlüter, A., Krause, L., Szczepanowski, R., Goesmann, A., Pühler, A. Genetic diversity and composition of a plasmid metagenome from a wastewater treatment plant. J. Biotech. 136 (1-2), 65-76 (2008).
  17. Taylor, N. G. H., Verner-Jeffreys, D. W., Baker-Austin, C. Aquatic systems: maintaining, mixing and mobilising antimicrobial resistance. TREE. 26 (6), 278-284 (2011).
  18. Stalder, T., et al. Quantitative and qualitative impact of hospital effluent on dissemination of the integron pool. ISME J. 8, 768-777 (2014).
  19. Allen, H. K., et al. Call of the wild: antibiotic resistance genes in natural environments. Nature Rev. Microbiol. 8, 251-259 (2010).
  20. Wellington, E. M., et al. The role of the natural environment in the emergence of antibiotic resistance in Gram-negative bacteria. Lancet Infect. Dis. 13 (2), 155-165 (2013).
  21. Gillings, M. R., et al. Mobilization of a Tn402-like class 1 integron with a novel cassette array via flanking miniature inverted-repeat transposable element-like structures. Appl. Env. Microbiol. 75 (18), 6002-6004 (2009).
  22. Graham, D. W., Collignon, P., Davies, J., Larsson, D. J., Snape, J. Underappreciated role of regionally poor water quality on globally increasing antibiotic resistance. Env. Sci. Technol. 48 (20), 11746-11747 (2014).
  23. Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. The antibiotic resistome: what's new. Curr. Opinion Microbiol. 21, 45-50 (2014).
  24. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. 63, e3998-e3998 (2011).
  25. Gillings, M. R. Rapid Extraction of PCR-Competent DNA from Recalcitrant Environmental Samples. Env. Microbiol. 1096, 17-23 (2014).
  26. Sajjad, A., Holley, M. P., Labbate, M., Stokes, H., Gillings, M. R. Preclinical class 1 integron with a complete Tn402-like transposition module. Appl. Env. Microbiol. 77 (1), 335-337 (2011).
  27. Wright, G. D. Antibiotic resistance in the environment: A link to the clinic. Curr. Opinion Microbiol. 13 (5), 589-594 (2010).
  28. Stokes, H., Nesbo, C., Holley, M., Bahl, M., Gillings, M., Boucher, Y. Class 1 integrons predating the association with Tn402.-like transposition genes are present in a sediment microbial community. Journal of Bacteriology. 188, 5722-5730 (2006).
  29. Lane, D. J. Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. , John Wiley &Sons, Inc. 115-175 (1991).
  30. Holmes, A. J., et al. Recombination activity of a distinctive integron-gene cassette system associated with stutzeri. populations in soil. Journal of Bacteriology. 185, 918-928 (2003).

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Waldron, L. S., Gillings, M. R.… More

Waldron, L. S., Gillings, M. R. Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes. J. Vis. Exp. (100), e52889, doi:10.3791/52889 (2015).

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