Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Screening næringsmidler for klasse 1 integroner og Gene Kassetter

Published: June 19, 2015 doi: 10.3791/52889
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Macquarie University

Introduction

Oppdagelsen av antibiotika var en av de største vitenskapelige prestasjoner av det 20. århundre. Imidlertid har bruk og misbruk av antibiotika har ført til den raske utviklingen av antibiotikaresistente bakterier, og disse nå utgjør en alvorlig trussel mot folkehelsen i det 21. århundre. Framveksten av bakteriestammer resistente mot de fleste behandlingstilbud øker muligheten vi går inn i en tid der antimikrobielle stoffer er ikke lenger effektive 1,2.

Den genetiske maskiner som overfører antibiotikaresistens er et gammelt system, predating mennesker og antibiotika seleksjonstrykk av millioner av år 3. Mobile genetiske elementer, som plasmider, transposoner, genomiske øyer, integrerende konjugativt elementer og integroner kan spre antibiotikaresistensgener (ARG) både innenfor og mellom bakteriearter 4. Av disse har integroner spilt en sentral rolle i spredningen av ARG, til tross fordet faktum at de er avhengige av plasmider og transposoner mobiliserings- og innsetting inn i bakterielle genomer 5. Integroner fange genkassetter ved hjelp av en integron-integrase, og deretter uttrykke kassetter ved hjelp av en integron kodet promoter 6,7 (figur 1). Integron genet kassetter er små mobile elementer som består av enkelt åpne leserammer (ORF) hvis produkter kan gi resistens mot antibiotika eller desinfeksjonsmidler 8. Klasse 1 integroner er integroner oftest utvinnes fra kliniske isolater 5, hvor de har samlet ervervet over 130 forskjellige antibiotikaresistens genkassetter 9.

Spredningen av klasse 1 integroner inn i menneskelige-forbundet commensal og patogene bakterier genererer menneskelige avfallsstrømmer som inneholder store mengder av disse genetiske elementer 10. Anslagsvis 10 19 bakterier som inneholder klasse 1 integroner frigis via kloakkslam hvert år jegn Storbritannia 11. Det er derfor ikke overraskende at klasse 1 integroner overdragelse antibiotika motstander blir nå påvist i bakterieflora av ville fugler, fisk og andre lokale dyrelivet 12-14. Releasing integroner tilbake i miljøet utgjør en betydelig helsetrusselen, siden kjøpet av nye genet kassetter og komplekse rearrangements med andre mobile elementer vedvarer, særlig i kloakkrenseanlegg og andre vassdrag 15-18. Naturmiljøet blir da en fruktbar for rekruttering til nye resistens og opportunistiske patogener 19,20. Nye integron inneholder bakterier og nye args kan sirkel tilbake til det menneskelige fellesskap gjennom forurenset vann og mat 21,22. Overvåking av miljø args er en viktig strategi for å forstå og håndtere antibiotikaresistens i fremtiden 23. Særlig oppmerksomhet bør rettes mot matvarer som spises rå ellerlett tilberedes, fordi disse frem den største trusselen for overføring av nye mobile elementer og patogener.

I denne protokollen, en strømlinjeformet tilnærming for å påvise, identifisere og karakterisere klasse 1 integroner og deres tilknyttede genet kassetter i næringsmidler er skissert (figur 2). Ved hjelp av en kombinasjon av dyrking og polymerase chain reaction (PCR), kan integroner bli raskt oppdaget i komplekse bakteriesamfunn og enkelte isolater. Fremgangsmåter for identifisering av arter av bakterier og konformasjon og identiteten til de integron-assosierte genkassetter er gitt. Fremgangsmåten er egnet for et bredt spekter av plante- og animalske matvarer, og eksempler på typiske arbeidsflyter er gitt for hver av disse typer mat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Matvarer som spises rå eller lett kokte er av mest interesse for menneskers helse. Eksempler inkluderer salat grønnsaker, frukt, skalldyr og krepsdyr.

1. Prøvetaking

  1. Samle inn prøver under betingelser som minimerer kontaminering og lagres i separate, rene poser under transport. Når oppsamlet, må prøvene lagret ved 4 ° C og behandles i løpet av 24 timer.

2. Beriket Kultur Forberedelse

  1. Frukt og grønnsaker:
    1. Plasser tilnærmet 10 g materiale i et slitesterkt plastposen. Ved behandling av større materiale, konsentrere seg på huden av frukt eller grønnsak. Legg 90 ml 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH 7,0 og prosess i en åre blander i 30 sek. Alternativt kan materialet manuelt opphisset hvis en åre blender er ikke tilgjengelig.
    2. Samle opp væsken inn i to 50 ml Falcon-rør. Sentrifugerør ved 4000 xg i 7 minutter for å klumpe bakteriene. Fjern forsiktig supernatanten og suspendere de pelleterte bakterier i 30 ml sterilt Luria Bertani (LB) kjøttkraft.
    3. Inkuber på en riste O / N, holder ett rør ved 25 ° C og den andre ved 37 ° C. Kulturer skal ristes på 200 svingninger per minutt (OPM). Oppbevar kulturer ved 4 ° C inntil anvendelse.
  2. Seafood:
    1. Dissekere ut av magesekken (østers) eller fordøyelseskanalen (reker) ved hjelp av sterile pinsetter og pinsett og plasseres i et sterilt 1,5 ml rør inneholdende 200 ul 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH 7,0. Oppbløtes prøven for å skape et homogenat.
    2. Tilsett 5 ml LB buljong i to sterile 5 ml rør, og vaksinere hver med sjømat homogenate.
    3. Inkuber på en riste O / N, holder ett rør ved 25 ° C og den andre 37 ° C. Kulturer skal ristes ved 200 opm. Oppbevar kulturer ved 4 ° C inntil anvendelse.

3. Screening kulturer for integroner

MgCI2 konsentrasjon på 2,5 mm. Hvis det er nødvendig, har Lorenz (2011) 24 skissert PCR optimalisering og feilsøking metoder i en tidligere utgave av dette tidsskriftet.

  1. Kokt DNA forberedelse:
    1. Fordeles 100 mL av anriket kultur i et sterilt 0,5 ml PCR-rør. Varm prøven til 99 ° C i 10 min, ved hjelp av et vannbad eller i varme blokken. Snap kulden på is i 2 min.
    2. Mikrosentrifuge ved 14 000 xg i 5 min for å pelletere celleavfallet. Tilbake til is. DNA-prøver kan fryses ved -20 ° C inntil anvendelse, men må tines på is.
  2. Screening for klasse 1 integroner bruker PCR:
    MERK: Blandede kulturer fra O / N inkubasjon blir screenet for klasse 1 integroner bruker HS463a / HS464 PCR-protokollen (tabell 1).
    1. Tine alle PCR reagenser på is, bort fra eventuelle sources av forurensende DNA. Utgjør 48 mL PCR Mastermix per prøve, inkludert negative kontroller (tabell 2). Tilsett 48 mL av PCR Master Mix til hvert rør, ved hjelp av barriere tips.
    2. Tilsett 2 mL av tint DNA til individuelle PCR rør ved hjelp av barriere tips. Kjør riktig program i PCR thermocycler.
    3. For å vurdere resultatene av forsterkning, electrophorese 7 pl av PCR-produktet på en 2% agarosegel og kjørt helt over i TBE-buffer (90 mM Tris-borat, 2 mM EDTA). Omfatte en molekylvektmarkør, slik som et 100 bp stige.
    4. Post beis gel med en DNA flekken, og visualisere ved hjelp av en UV transilluminator. Kontroller at det ikke har vært noen forsterkning i den negative kontroll. En sterk bånd på rundt 470 bp for noen bestemt prøve indikerer at den blandede kultur inneholder bakterier som bærer en klasse 1 integron. Rene kolonier vil nå bli isolert fra en hvilken som helst blandet kultur som var positivt PCR.

  1. Seriefortynninger og spredt plater:
    NB: For å isolere enkeltkolonier fra de PCR-positive blandingskulturer, blir den blandede kultur serielt fortynnet 10 ganger i natriumfosfatbuffer, og deretter belagt for å gjenopprette enkeltkolonier.
    1. Tilsett 1 ml blandet kultur til 9 ml av 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH 7,0 og blandes ved inversjon. Legg 1 ml av fortynning til en ytterligere 9 ml av fosfatbufferen, og gjenta til en seriell fortynning av 10 -8 er nådd.
    2. Spre 100 ul av den 10 -4 til 10 -8 fortynninger på LB-agar, i duplikat. Inkuber platene O / N ved den samme temperatur som brukes for den første blandede kultur. Plater kan deretter bli lagret ved 4 ° C inntil anvendelse, men det er best å behandle enkle kolonier ganske raskt.
  2. Enkelt koloni utvalg og kokt DNA forberedelse:
    1. Plukk enkeltkolonier fra serieutvannings plater, SEoppsamling så mange forskjellige kolonityper som mulig, ved hjelp av kriterier som kolonistørrelse, form og farge. Bruk sterile tannpirkere for å velge enkeltkolonier fra spredning plate.
    2. Trykk på tannpirker til kolonien, og deretter overføre til en PCR rør som inneholder 100 mL sterilt vann. Dersom et stort antall kolonier skal siles, så kolonier kan fremstilles i en mikrotiter skuffen. Spinn tannpirker mellom fingrene for å løsne noen av cellene i vannet.
    3. Ved å bruke den samme tannpirker, inokulere en LB-plate med en stripe av kolonien. Et stort antall kolonier kan lagres på merkede plater hvis hver strek er ca 1 cm lang. Gjenta trinn 1 til 3 til du har valgt et passende antall isolater.
    4. Inkuber LB plater O / N, ved den samme temperatur som det som anvendes for den første anrikede kultur. Kulturer kan deretter bli lagret ved 4 ° C inntil anvendelse.
    5. For å forberede DNA fra bakteriesuspensjoner, følg stegene som outlined i avsnitt 3.1. For screening av renkultur lysatene, utføre HS463a / HS464 PCR som beskrevet i kapittel 3.2. Isolater som returnerer en positiv PCR vil bli brukt for utarbeidelse av genomisk DNA (kapittel 5), og for videre analyser.

5. Genomisk DNA Utvinning av Integron-positive enkeltkolonier Bruke Perlene Slo 25

  1. Vaksinere 5 ml LB buljong med en prøve av ren kultur isolert i punkt 4.2. Inkuber O / N, rist ved den samme temperatur som ble brukt for den første anrikede kultur.
  2. Pellet cellene ved 4000 xg for 7 min, så fjern supernatanten. Resuspender de pelleterte celler i 1 ml TC CLS-løsning i en lyserings matrise E rask prep tube. Ved hjelp av en vulst vibrerende maskin, behandle prøven ved 5,5 m / sek i 30 sek.
  3. Sentrifugerør ved 14 000 xg i 5 minutter og utvinne 700 ul av supernatanten til et sterilt 1,5 ml rør.
  4. Legg 700 ul bindings matrise fortynnet 1: 5 med 6 M guanidinium tiocyanat og blandes ved RT i 5 min. Sentrifuger ved 14.000 xg i 1 min, kast supernatanten.
  5. Legg 800 mL salt etanol vaske (70% etanol, 0,1 M natriumacetat) og vortex inntil pelleten er fullstendig resuspendert. Vask 5 min ved RT, sentrifuger ved 14 000 xg i 1 min og kast supernatant. Sørg for at alle overstående er fjernet, ved hjelp av en mikropipette om nødvendig, så la det lufttørke i 5 min.
  6. Resuspender pelleten matrisen i 200 ul TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,6) ved å pipettere opp og ned. Inkuber ved RT i 3 min. Sentrifuger ved 14.000 xg i 3 min og overfør 160 pl av den eluerte DNA inn i et sterilt rør. Kjøre en alikvot av det genomiske DNA-ekstraksjon på en 2% vekt / volum agarosegel for å kontrollere utbyttet og integriteten av DNA-ekstraksjon. Det rensede genomisk DNA blir lagret ved -20 ° C og tint på is når det er nødvendig for PCR-testing.

6. Diagnostiske PCRs og DNA-sekvensering

MERK:genomisk DNA forberedt i § 5 skal brukes til alle diagnostiske PCRs, og for å bekrefte den positive testen for klasse 1 integroner.

  1. Tine genomisk DNA på is, kort vortex DNA-prøven og puls spinn på 14.000 xg i 20 sek. Gjenta PCR for klasse 1 integron-integrase genet hjelp HS463a / HS464 (tabell 1), som bekrefter at isolatet er positivt for 471 bp amplicon (punkt 3.2).
  2. Identifisering av positive kulturer til artsnivå er oppnådd ved analyse av den lille subenheten rRNA-gen (16S rDNA). Forsterke 16S genet bruk av prim F27 / r1492 (tabell 1). Sjekk PCR produkter ved hjelp av elektroforese. Alle bakterie målene skal generere en 16S amplicon på ca 1450 bp.
  3. Sekvens 16S rRNA-genet amplikon til bestemmelse identitet, men siden det ikke er sannsynlig å være flere positive PCR fra trinn 6.2, og mange av disse positive vil være den samme bakteriearter, vil vi først skille mellom forskjellige arter using restriksjonsspalting av 16S PCR-produktet.
    1. Fordøye en delmengde av 16S PCR med restriksjonsenzymet Hinf 1. Enhver enzym som gjenkjenner fire bp spaltningsseter vil gjøre, men Hinf en genererer god spredning fra 16S mål, og er en pålitelig, rimelig enzym.
  4. Sett opp en 30 mL begrensning fordøye Mastermix (tabell 2) i et sterilt rør og tilsett 20 mL av un-purfied 16S PCR produktet. Inkuber i et 37 ° C vannbad O / N. Sjekk fordøye på en 2% agarosegel.
  5. Resultat fordøyelsen mønstre produsert av Hinf 1. Isolater med det samme restriksjons 16S profil sannsynligvis vil være den samme art. Snarere enn å sekvensere hver 16S PCR produkt, sekvens på de fleste tre representanter fra hver Hinf en begrensning mønster.
  6. Rense 16S PCR produkter ved hjelp av et kommersielt kit. En enkelt-trådet eksonuklease Settet kan brukes, men kolonnen basert eller utfellingsmetoder også fungere godt for å fjerne unincorporated primere og enkelkjedede DNA. Sekvens 16S amplikonene bruker primer R910 (tabell 1), sette opp reaksjonene som angitt av sekvense anlegget.
  7. Bruk den resulterende DNA sekvens for å avhøre NCBI DNA-databasen med blastn funksjon ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ). Mer enn 97% nucleotide identitet blir vanligvis oppfattet som arter identitet.

7. Kartlegging og karakterisering av integroner og Cassette Arrays

MERK: Klasse 1 integroner kommer fra menneskedominerte økosystemer vil trolig være de vanligste integroner i alle prøvene. Disse integroner alle har en nylig singel opprinnelse, og har derfor et høyt konservert DNA sekvens 5.

  1. Skille mellom en klasse 1 integroner kommer fra menneskelige kilder og de som forekommer naturlig i miljøprøver ved å utføre enPCR med primer satt intI1F165 / intI1R476 10 (tabell 1).
    MERK: Klasse 1 integroner fra kliniske eller commensal bakterier vil generere et ~ 300 bp produkt, mens miljøklasse 1 integroner ikke vil generere noe produkt.
  2. Karakteriserer de kliniske integroner ved å forsterke kassetten array med primer sett HS458 / HS459. Dette PCR vil forsterke området mellom intI1 og 3'-konserverte segment ved enden av de fleste kassett matriser. På grunn av at antallet og identiteten av kassetter er variabel, vil størrelsen av PCR-produktet også variere.
  3. Rens amplikonene og sekvensere DNA ved hjelp av hver av amplifiseringsprimerne. Bruk sekvenser å avhøre DNA-databaser med blastn funksjon ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ).
  4. Sørg for navnsetting av kassetter følge standardisert nomenklatur 9, siden mange data avsetninger for integron genet kassetts bruke inkonsekvent eller tvetydige navn. Gi særlig oppmerksomhet til nye gen kassetter, siden disse kan kode nye fenotyper, inkludert gener som konferere økt smitte, patogenitet eller virulens 8,21.
    MERK: Preklinisk former av klasse 1 integron fortsatt sirkulere i naturlige omgivelser. Spesielt de som er knyttet til aktive Tn 402 transposoner er av mest interesse 26. Kassett matriser av disse integroner vil ikke forsterke med primer sett HS458 / HS459, men kan forsterkes med MRG284 / MRG285 primer sett (tabell 1), genererer amplikonene av variabel størrelse avhengig av kassett innhold. PCR-produkter blir renset og DNA sekvensert som beskrevet i 7.2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Screening av blandede kulturer og bakterieisolater for intI1

Primersett HS463a / HS464 PCR kan brukes for å påvise tilstedeværelse av klasse 1 integron-integrase gen, intI1 (figur 1). Denne primer settet fungerer godt for å detektere intI1 i blandede kulturer, og blir også brukt til å screene bakteriekolonier som er høstet fra spredningsplater (figur 2). Positive isolater skal generere en enkelt sterkt band på 471 bp bruke denne primer sett (figur 3A). Flertallet av positive isolater vil bære intI1 som stammer fra mennesker eller deres landbruksprodukter og husdyr. Disse isolatene vil også være positive i en PCR ved bruk av primere F165 / R476, som skal generere et 311 bp fragment (figur 1). Miljøkilder intI1 vil generelt ikke være positive i denne andre analyse.

Karakterisering av integron kassett arrays

402 -associated klasse 1 integroner kan forsterkes ved hjelp av primere HS458 / HS459. Disse primerene henholdsvis mål på integron rekombinasjon området, og 3'-enden av kassetten matrisen, som normalt avsluttes i qacEΔ sul1 genfusjon (figur 1). Størrelsen på PCR-produktene genereres i denne analysen varierer i henhold til antallet og identiteten av kassetter i matrisen (figur 3B). Miljøklasse 1 integroner er ofte innebygd i bakterielle kromosomene, og deres kassett arrays kan bli forsterket av primere som er rettet mot den proksimale og de ​​fleste distal rekombinasjonsseter (figur 1). Primere MRG284 / 285 er utformet for å forsterke denne regionen, og igjen, fordi kassetten innholdet varierer størrelsen av amplikonene varierer også (figur 3C). Sekvensering av HS458 / 459 PCRprodukter vil normalt gjenopprette kjente antibiotika resistens, mens sekvense MRG284 / 285 PCR produktene vil vanligvis gjenopprette genet kassetter som koder polypeptider med ukjent funksjon.

Identifisere bakteriearter

Bakterier blir identifisert ved hjelp av 16S rDNA-sekvensering og database sammenligninger. Genomisk DNA blir brukt som et templat for amplifikasjon av 16S subenheten liten rRNA-genet. Ved å bruke primere foreslått, bør dette generere et fragment på omtrent 1450 bp. Fordi et stort antall kolonier kan bli vist til enhver tid, er en hierarkisk screening-metode som anvendes. Amplifiserte 16S PCR-produktene blir spaltet med restriksjonsenzym Hinf 1, og disse fordøyer separeres på agarosegeler. Enkelte arter vil generere karakteristiske mønstre etter fordøye, slik at isolater av samme art kan lett identifiseres (Figur 3D). Sekvense 16S rRNA-genet PCR-produkter fra maksimalt treisolerer representerer noen begrensning mønster tillater effektiv identifikasjon av alle sannsynlige arter i en samling av integron positive isolater.

Figur 1
Figur 1. Struktur av klasse 1 integroner. Skjematisk diagrammer av klinisk og miljø klasse 1 integroner viser PCR primer bindingsseter nevnt i manuskriptet. Klasse 1 integroner består av en integron-integrase genet (intI1) som katalyserer fangst og uttrykk av gene kassetter for å danne en kassett array. Før advent av antibiotika bruk, de fleste av klasse en integroner var kromosom, og båret genkassetter hvis funksjoner er ennå ikke bestemt. Sterk utvalg via bruk av antibiotika er kraftig økt overflod av en sekvens variant av klasse 1 integron forbundet med Tn 402 transposonet.Disse 'kliniske' integroner har kjøpt matriser av kassetter som koder for antibiotikaresistens. Det er disse integroner som i dag forurensende naturmiljøer og matproduksjonskjeden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Skjematisk flytskjema for deteksjon av klasse 1 integroner i næringsmidler. Prøver av næringsmidler blir anvendt for å inokulere mediet og generere en blandet bakteriekultur. Disse blandede kulturer blir screenet for tilstedeværelse av klasse 1 integroner, og positive kulturer anvendes til fremstilling av spredt platene. Individuelle kolonier fra spredt platene er screenet på nytt for integroner. Positive kulturer er renset, DNA ekstraheres og karakterisert for kassett-innhold av DNA SEquencing. Sekvensering av 16S rRNA-genet brukes til identifisering arter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Representant elektro analyser fra screening prosessen. (A) Screening enkeltkolonier ved hjelp intI1 primere HS463a / 464. Positive kolonier generere en sterk enkelt bånd på 471 bp. (B) Forsterkning av kassett arrays fra Th 402 integroner bruker primere HS458 / 459. Dette PCR-produkt genererer variable størrelser avhengig av identiteten og størrelsen av komponent kassettene i matrisen. Identifisering av disse kassetter krever DNA-sekvensering. (C) Forsterkning av kassett arrays fra miljøklasse 1 integrons bruker primere MRG284 / 285. Dette PCR produktet genererer også variable størrelser avhengig av identiteten og størrelsen av komponent kassettene i matrisen, men kassetter i miljø matriser er usannsynlig å kode antibiotikaresistens. (D) Undersøkelse av 16S PCR-produkter ved spaltning med Hinf 1. Isolater med identiske restriksjons mønstre er sannsynlig å være samme art. Hvis store mengder én begrensning typen blir gjenvunnet, bare et fåtall av disse må bli sekvensert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

PCR Gene target Primer navn Retning Sekvens 5 '- 3' Sykkelforhold RefereNCE
HS463a / HS464 Klasse 1 Integron HS464 Forward ACATGCGTGTAAATCATCGTCG 94 ° C 3 min; 35 cykler 94 ° C 30 sek, 60 ° C 30 sek, 72 ° C 1 min 30 sek; 72 ° C 5 min Stokes et al., 2006 28
HS463a Omvendt CTGGATTTCGATCACGGCACG
F27 / r1492 16S rRNA F27 Forward AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 94 ° C 3 min; 35 cykler 94 ° C 30 sek, 60 ° C 30 sek, 72 ° C 1 min 30 sek; 72 ° C 5 min Lane, 1991 29
r1492 Omvendt TACGGYTACCTTGTTACGACTT
intI1F165 / IntI1R476 Klinisk klasse 1 integron Inti1F165 Forward CGAACGAGTGGCGGAGGGTG 94 ° C 3 min; 35 cykler 94 ° C 30 sek, 55 ° C 30 sek, 72 ° C 1 min 30 sek; 72 ° C 5 min Gillings, 2014 10
intI1R476 Omvendt TACCCGAGAGCTTGGCACCCA
HS549 / HS550 3'CS Klinisk Integron HS549 Forward ACTAAGCTTGCCCCTTCCGC 94 ° C 3 min; 35 cykler 94 ° C 30 sek, 65 ° C 30 sek, 72 ° C 1 min 30 sek; 72 ° C 5 min Stokes et al., 2006 28
HS550 Omvendt CTAGGCATGATCTAACCCTCGG
HS458 / HS459 Klinisk kassett matrise HS458 Forward GCAAAAAGGCAGCAATTATGAGCC 946, C 3 min; 35 cykler 94 ° C 30 sek, 55 ° C 30 sek, 72 ° C 1 min 30 sek; 72 ° C 5 min Holmes et al., 2003 30
HS459 Omvendt GTTTGATGTTATGGAGCAGCAACG
MRG284 / MRG285 Miljø kassett MRG284 Forward GTTACGCCGTGGGTCGATG 94 ° C 3 min; 35 cykler 94 ° C 30 sek, 55 ° C 30 sek, 72 ° C 1 min 30 sek; 72 ° C 5 min Gillings et al., 2009 21
MRG285 Omvendt CCAGAGCAGCCGTAGAGC

Tabell 1. Primer sekvenser og PCR-forhold som brukes for å identifisere Class 1 integroner og deres tilknyttede genet kassetter.

Tabell 2. PCR og begrensning fordøye MASTERMIX bestanddeler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Identifiseringen av integroner og deres tilknyttede genet kassetter er potensielt et viktig steg i å forutsi fremveksten av nye opportunistiske patogener, sporing trasé for patogener i den menneskelige næringskjeden, og identifisere nye motstand og virulens determinanter 8,21,26. Målet med denne artikkelen var å beskrive en strømlinjeformet tilnærming for screening prøver for klasse 1 integroner, karakteriserer sine kassett arrays og identifisere bakteriearter der de bor. Kritiske trinn i protokollen innebærer god mikrobiologisk praksis, og forebygge PCR forurensning som ville generere falske positiver.

Protokollen er beskrevet her kan enkelt endres til å oppdage andre klinisk relevante integroner, inkludert klasse 2 og klasse 3 integroner som også finnes i menneskelige patogener. Det kan også bli endret for å oppdage integroner i mikrobielle samfunn fra vann, biofilm, jord eller sediment. Det er noen limitations til denne teknikken, som oppstår fra en avhengighet av dyrking av bakterieceller. Mange miljø bakterier er ikke lett dyrkbare, og protokollen beskrevet her vil ikke oppdage disse artene. Utvalget av arter som er gjenvunnet kan utvides ved hjelp av ulike bakteriemedie formuleringer og lengre inkubasjonstider. Likevel er de fleste arter av interesse for menneskers helse er sannsynlig å vokse under de forhold som er beskrevet her.

Denne protokollen har noen fordeler over teknikker som bruker platekledning på selektive medier. Det er ingen antagelser må bli gjort om identiteten til resistens båret av individuelle isolater, og nye resistensgener kan gjenvinnes og karakterisert. Mer generelt kan arbeidsflyten også tilpasses til å oppdage noe element i resistome 27 eller mobilome som kan være av interesse fire. Slike analyser er viktig for å forstå dynamikken i de forskjellige DNA-elementer involvert i entibiotic motstand, og avgjørende for å bevare den minskende arsenalet av antimikrobielle forbindelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe relevant å avsløre.

Acknowledgments

Takk til Michaela Hall, Larissa Bispo og Gustavo Tavares for teknisk assistanse.

Materials

PCR reagenser Volum (mL) Restriksjonskutting reagenser Volum (mL)
Sterilt vann 21.5 Sterilt vann 23
10x GoTaq Hvit 25 Buffer B 5
RNAseA [1 mg / ml] 0.5 Bovine Serum Albumin [1 mg / ml] 1
Forward Primer [50 M] 0.5 Hinfl [10 enheter / ul] 1
Omvendt Primer [50 M] 0.5
Mastermix volum 48 Mastermix volum 30
DNA-templat 2 PCR mal 20
Endelig PCR volum 50 Endelig restriksjonskutting volum 50
Name Company Catalog Number Comments
GoTaq Colourless Mastermix Promega M7132 Used in all PCRs
RNAse (Ribonuclease A from bovine pancreas) Sigma R6513-10MG Used in all PCRs
HinFI restriction enzyme Promega R6201 Used to digest 16S rDNA PCR poducts. Enzyme comes with optimal buffer and BSA
100 bp ladder GE Healthcare 27400701 Used as a size standard on all agarose gels
GelRed DNA stain Biotium 41003 CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material
Guanidinium thiocyanate Life Technologies AM9422 CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material
CLS-TC Solution MP Biomedicals 6540409 Resuspension solution used at the begining of the genomic DNA extraction
Lysing Matrix E FastPrep tubes MP Biomedicals 116914500 Tube required for mechanical disruption of bacterial cell walls. This code is used for packs of 500 tubes, smaller quantities are available.
Binding matrix MP Biomedicals 116540408 Diluted 1:5 with 6 M guanidinium thiocyanate and used in the genomic DNA extraction method.
Fast Prep machine MP Biomedicals Number of options available MP Biomedicals has a number of FastPrep machines available to purchase. Visit http://www.mpbio.com for more information

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, K., et al. Tackling antibiotic resistance. Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).
  2. Davies, J., Davies, D. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).
  3. Costa, V. M., et al. Antibiotic resistance is ancient. Nature. 477 (7365), 457-461 (2011).
  4. Gillings, M. R. Evolutionary consequences of antibiotic use for the resistome, mobilome and microbial pangenome. Front. Microbiol. 4, 4 (2013).
  5. Gillings, M., et al. The evolution of class 1 integrons and the rise of antibiotic resistance. J. Bacteriol. 190 (14), 5095-5100 (2008).
  6. Brassard, S., Lapointe, J., Roy, P. H. Diversity and relative strength of tandem promoters for the antibiotic-resistance genes of several integrons. Gene. 142 (1), 49-54 (1994).
  7. Partridge, S. R., et al. Definition of the attI1 site of class 1 integrons. Microbiol. 146 (11), 2855-2864 (2000).
  8. Gillings, M. R. Integrons: Past, Present, and Future. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 78 (2), 257-277 (2014).
  9. Partridge, S. R., Tsafnat, G., Coiera, E., Iredell, J. R. Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons. FEMS Microbiol. Rev. 33 (4), 757-784 (2009).
  10. Gillings, M. R., et al. Using the class 1 integron-integrase gene as a proxy for anthropogenic pollution. ISME J. In press, (2014).
  11. Gaze, W. H., et al. Impacts of anthropogenic activity on the ecology of class 1 integrons and integron-associated genes in the environment. ISME J. 5, 1253-1261 (2011).
  12. Gerzova, L., et al. Characterization of microbiota composition and presence of selected antibiotic resistance genes in carriage water of ornamental fish. PLoS ONE. 9, e103865 (2014).
  13. Power, M., Emery, S., Gillings, M. Into the wild: dissemination of antibiotic resistance determinants via a species recovery program. PLoS ONE. 8, e63017 (2013).
  14. Stokes, H. W., Gillings, M. R. Gene flow, mobile genetic elements and the recruitment of antibiotic resistance genes into Gram-negative pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 35 (5), 790-819 (2011).
  15. Moura, A., Oliveira, C., Henriques, I., Smalla, K., Correia, A. Broad diversity of conjugative plasmids in integron-carrying bacteria from wastewater environments. FEMS Microbiol. Lett. 330 (2), 157-164 (2012).
  16. Schlüter, A., Krause, L., Szczepanowski, R., Goesmann, A., Pühler, A. Genetic diversity and composition of a plasmid metagenome from a wastewater treatment plant. J. Biotech. 136 (1-2), 65-76 (2008).
  17. Taylor, N. G. H., Verner-Jeffreys, D. W., Baker-Austin, C. Aquatic systems: maintaining, mixing and mobilising antimicrobial resistance. TREE. 26 (6), 278-284 (2011).
  18. Stalder, T., et al. Quantitative and qualitative impact of hospital effluent on dissemination of the integron pool. ISME J. 8, 768-777 (2014).
  19. Allen, H. K., et al. Call of the wild: antibiotic resistance genes in natural environments. Nature Rev. Microbiol. 8, 251-259 (2010).
  20. Wellington, E. M., et al. The role of the natural environment in the emergence of antibiotic resistance in Gram-negative bacteria. Lancet Infect. Dis. 13 (2), 155-165 (2013).
  21. Gillings, M. R., et al. Mobilization of a Tn402-like class 1 integron with a novel cassette array via flanking miniature inverted-repeat transposable element-like structures. Appl. Env. Microbiol. 75 (18), 6002-6004 (2009).
  22. Graham, D. W., Collignon, P., Davies, J., Larsson, D. J., Snape, J. Underappreciated role of regionally poor water quality on globally increasing antibiotic resistance. Env. Sci. Technol. 48 (20), 11746-11747 (2014).
  23. Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. The antibiotic resistome: what's new. Curr. Opinion Microbiol. 21, 45-50 (2014).
  24. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. 63, e3998-e3998 (2011).
  25. Gillings, M. R. Rapid Extraction of PCR-Competent DNA from Recalcitrant Environmental Samples. Env. Microbiol. 1096, 17-23 (2014).
  26. Sajjad, A., Holley, M. P., Labbate, M., Stokes, H., Gillings, M. R. Preclinical class 1 integron with a complete Tn402-like transposition module. Appl. Env. Microbiol. 77 (1), 335-337 (2011).
  27. Wright, G. D. Antibiotic resistance in the environment: A link to the clinic. Curr. Opinion Microbiol. 13 (5), 589-594 (2010).
  28. Stokes, H., Nesbo, C., Holley, M., Bahl, M., Gillings, M., Boucher, Y. Class 1 integrons predating the association with Tn402.-like transposition genes are present in a sediment microbial community. Journal of Bacteriology. 188, 5722-5730 (2006).
  29. Lane, D. J. Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. , John Wiley &Sons, Inc. 115-175 (1991).
  30. Holmes, A. J., et al. Recombination activity of a distinctive integron-gene cassette system associated with stutzeri. populations in soil. Journal of Bacteriology. 185, 918-928 (2003).

Tags

Miljøfag integron lateral genoverføring epidemiologi resistome antibiotikaresistens forurensning xenogenetic
Screening næringsmidler for klasse 1 integroner og Gene Kassetter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Waldron, L. S., Gillings, M. R.… More

Waldron, L. S., Gillings, M. R. Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes. J. Vis. Exp. (100), e52889, doi:10.3791/52889 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter