Этот протокол описывает обнаружение интегронов класса 1 и связанных с ними генных кассет в пищевых продуктах.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Скрининг продуктов питания для 1 класса Интегроны и Джин кассет
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Устойчивость к антибиотикам является одной из самых больших угроз для здоровья в 21веке. Приобретение генов резистентности путем латерального переноса генов является основным фактором в распространении различных механизмов резистентности. Среди элементов ДНК, способствующих латеральному переносу, интегоны класса 1 в значительной степени ответственны за распространение детерминант устойчивости к антибиотикам среди грамотрицательных патогенов. В общей сложности эти интегроны приобрели и распространили более 130 различных генов устойчивости к антибиотикам. В связи с продолжающимся использованием антибиотиков, интегроны класса 1 стали повсеместно использоваться в комменсалах и патогенах человека и его домашних животных. Как следствие, теперь их можно найти во всех потоках жизнедеятельности человека, где они продолжают приобретать новые гены и имеют потенциал возвращаться к человеку через пищевую цепь. В этом протоколе подробно описывается оптимизированный подход к обнаружению интегронов класса 1 и связанных с ними кассет с генами устойчивости в пищевых продуктах с использованием культивирования и ПЦР. Используя этот протокол, исследователи должны иметь возможность: собирать и подготавливать образцы для получения обогащенных культур и проводить скрининг на наличие ингронов класса 1; изолировать одиночные колонии бактерий для идентификации интегрон-положительных изолятов; выявить виды бактерий, которые содержат ингроны класса 1; и охарактеризовать эти интегроны и связанные с ними генные кассеты.
Введение
Открытие антибиотиков был одним из величайших научных достижений 20-го века. Тем не менее, использование и злоупотребление антибиотиками привело к быстрой эволюции, устойчивых к антибиотикам бактерий, и они в настоящее время представляют собой серьезную угрозу для общественного здоровья в 21-м веке. Рост бактериальных штаммов, устойчивых к большинству вариантов лечения повышает возможность мы вступаем в эпоху, когда противомикробные препараты уже не эффективны 1,2.
Генетический механизм, который придает устойчивость к антибиотику является древняя система, предшествовавшие людей и антибиотиков давление отбо....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Продукты питания, которые едят сырыми или слегка приготовленные имеют наибольшую озабоченность для здоровья человека. Примеры включают в себя салат овощи, фрукты, моллюсков и ракообразных.
1. Сбор образцов
- Собирают образцы в условиях, которые сводят к минимуму загрязнения и храниться в отдельных, чистых мешках во время транспортировки. После сбора пробы должны храниться при температуре 4 ° С и обработан в течение 24 часов.
2. Обогащенный Культура Подготовка
- Фрукты и овощи:
- Поместите приблизительно 10 г материала в прочный пластиковый пакет. Если обработка больший материал, ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Скрининг смешанных культур и бактериальных изолятов intI1
Набор праймеров HS463a / HS464 ПЦР может быть использован для обнаружения присутствия интегрон-интегразы гена класса 1, intI1 (рис 1). Это набор праймеров хорошо работает для обнаружения intI1 в смешанных культурах, а также используется для скрининга бактериальных колоний найденным распространенных пластин (рис 2). Положительные изоляты должны генерировать одну сильную полосу на 471 п.о.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Выявление интегронов и связанных с ними генов кассет потенциально важным шагом в прогнозировании возникновения новых патогенных возбудителей, отслеживание пути для патогенов в пищевой цепи человека, а также выявление новых сопротивление и вирулентности детерминанты 8,21,26. Целью данной работы было описать рациональный подход для скрининга образцов для 1 класса интегронов, характеризующие их массивы кассетные и идентификации видов бактерий, в которых они проживают. Критические шаги в протоколе привлекать хоро.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего разглашать соответствующую.
Благодарности
Благодаря Микаэла зале, Лариса Bispo и Густаво Таварес для технической помощи.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| GoTaq Colourless Mastermix | Promega | M7132 | Используется во всех ПЦР |
| РНКаза (рибонуклеаза А из поджелудочной железы крупного рогатого скота) | Sigma | R6513-10MG | Используется во всех ПЦР |
| Фермент рестрикции HinFI | Promega | R6201 | Используется для расщепления 16S рДНК ПЦР-продуктов. Фермент поставляется с оптимальным буфером и лестницей BSA |
| 100 bp GE | Healthcare | 27400701 | Используется в качестве стандартного размера на всех агарозных гелях |
| GelRed DNA краситель | Biotium | 41003 | ВНИМАНИЕ: При работе с этим материалом необходимо носить средства индивидуальной защиты |
| Guanidinium thiocyanate | Life Technologies | AM9422 | ВНИМАНИЕ: При работе с этим материалом необходимо носить средства индивидуальной защиты |
| CLS-TC Раствор | MP Biomedicals | 6540409 | Ресуспензионный раствор, используемый в начале геномной экстракции ДНК |
| Lysing Matrix E FastPrep Tubes | MP Biomedicals | 116914500 | Tube, необходимый для механического разрушения клеточных стенок бактерий. Этот код используется для упаковок по 500 туб, доступны меньшие количества. |
| Связывающая матрица | MP Biomedicals | 116540408 | разведена в соотношении 1:5 с 6 М тиоцианатом гуанидиния и использована в методе экстракции геномной ДНК. |
| Машина Fast Prep | MP Biomedicals | Количество доступных опций | MP Biomedicals имеет ряд машин FastPrep, доступных для покупки. Посетите http://www.mpbio.com для получения дополнительной информации |
Ссылки
- Bush, K., et al. Tackling antibiotic resistance. Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).
- Davies, J., Davies, D. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).
- Costa, V. M., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
