Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Скрининг продуктов питания для 1 класса Интегроны и Джин кассет

Published: June 19, 2015 doi: 10.3791/52889
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Macquarie University

Introduction

Открытие антибиотиков был одним из величайших научных достижений 20-го века. Тем не менее, использование и злоупотребление антибиотиками привело к быстрой эволюции, устойчивых к антибиотикам бактерий, и они в настоящее время представляют собой серьезную угрозу для общественного здоровья в 21-м веке. Рост бактериальных штаммов, устойчивых к большинству вариантов лечения повышает возможность мы вступаем в эпоху, когда противомикробные препараты уже не эффективны 1,2.

Генетический механизм, который придает устойчивость к антибиотику является древняя система, предшествовавшие людей и антибиотиков давление отбора миллионы лет 3. Мобильные генетические элементы, такие как плазмиды, транспозонов, геномных островов, интегративных конъюгативных элементов и интегронов может распространять гены устойчивости к антибиотикам (ARG) как внутри, так и между видами бактерий 4. Из них интегронами сыграли центральную роль в распространении ARG, несмотря наТо, что они полагаются на плазмид и транспозонов для мобилизации и введении в бактериальных геномов 5. Интегроны захватить генные кассеты, используя интегрон-интегразу, а затем выразить кассеты, используя интегрон закодированный промоутер 6,7 (рисунок 1). Интегрон гена кассеты небольшие подвижные элементы, состоящие из отдельных открытых рамок считывания (ORF), чьи продукты могут придают устойчивость к антибиотикам или дезинфицирующих средств 8. Класс 1 интегронами являются интегронами наиболее часто оправился от клинических изолятов 5, где они все вместе, приобретенных более 130 различных генов кассет устойчивость к антибиотикам 9.

Распространение класса 1 интегронов в синантропных и патогенных бактерий человека связанный генерирует потоки отходов человека, которые содержат большое количество этих генетических элементов 10. По оценкам 10 19 бактерий, которые содержат класс 1 Интегроны освобождены с помощью сточных вод каждый годп Великобритания 11. Поэтому не удивительно, что класс 1 интегронами придающие антибиотиков сопротивления в настоящее время обнаружены в микробиоты диких птиц, рыб и других 12-14 родной природы. Освобождение Интегроны обратно в окружающую среду представляет собой серьезную угрозу для общественного здоровья, так как приобретение новых кассет генов и сложных перестроек с другими мобильными элементами продолжает возникать, в частности, в очистных сооружениях и других водных 15-18. Природная среда становится плодородной вербовки новых детерминант резистентности и условно-патогенных микроорганизмов 19,20. Новые интегрон содержащих бактерии и новые АРГУМЕНТЫ можете круг обратно в человеческом сообществе через зараженную воду и пищу 21,22. Наблюдение окружающей среды аргументов является ключевой стратегией для понимания и управления устойчивостью к антибиотикам в будущем 23. В частности, внимание должно быть уделено пищевых продуктов, которые едят сырыми илислегка приготовленные, так как они представляют собой наибольшую угрозу для передачи новых мобильных элементов и патогенных микроорганизмов.

В этом протоколе, в упрощенном подходе для обнаружения, идентификации и характеризации класса 1 Интегроны и связанные с ними генетические кассеты в пищевых продуктах, изложены (рисунок 2). Использование комбинации культивирование и полимеразной цепной реакции (ПЦР), интегронами можно быстро обнаружить в сложных бактериальных сообществ и отдельных штаммов. Методы определения видов бактерий и конформации и идентичности интегрон связанный генных кассет даны. Этот метод пригоден для широкого круга растений и животных продуктов, и примеры типичных рабочих процессов приведены для каждого из этих типов пищевых продуктов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Продукты питания, которые едят сырыми или слегка приготовленные имеют наибольшую озабоченность для здоровья человека. Примеры включают в себя салат овощи, фрукты, моллюсков и ракообразных.

1. Сбор образцов

  1. Собирают образцы в условиях, которые сводят к минимуму загрязнения и храниться в отдельных, чистых мешках во время транспортировки. После сбора пробы должны храниться при температуре 4 ° С и обработан в течение 24 часов.

2. Обогащенный Культура Подготовка

  1. Фрукты и овощи:
    1. Поместите приблизительно 10 г материала в прочный пластиковый пакет. Если обработка больший материал, сосредоточиться на коже фрукта или овоща. Добавить 90 мл 0,1 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,0 и процесс в лопастной смеситель в течение 30 сек. Альтернативно, материал может быть вручную перемешивали при ГОМОГЕНИЗАТОР не доступен.
    2. Сбор жидкости в двух 50 мл пробирки Falcon. Центрифуга трубки на 4000 мкг в течение 7 мин для осаждения бактерий. Осторожно удалите супернатант и приостановить осаждали бактерии в 30 мл стерильной Лурия Bertani (LB) бульона.
    3. Инкубировать на шейкере O / N, держа одну трубку при 25 ° С, а другой при 37 ° С. Культуры должны быть встряхивают при 200 колебаний в минуту (OPM). Хранить культуры при 4 ° С до использования.
  2. Морепродукты:
    1. Рассеките из желудка (устрицы) или пищеварительный тракт (креветки) с помощью стерильного пинцета и пинцет и поместить в стерильную пробирку, содержащую 1,5 мл 200 мкл 0,1 М буфера фосфата натрия, рН 7,0. Размочите образец для создания гомогената.
    2. Разлить по 5 мл LB бульоне в двух стерильных 5 мл пробирки, и прививку каждый с гомогената морепродуктов.
    3. Инкубировать на шейкере O / N, держа одну трубку при 25 ° С, а другой 37 ° С. Культуры должны быть встряхивают при 200 OPM. Хранить культуры при 4 ° С до использования.

3. Скрининг Культуры для Интегроны

2 концентрация 2,5 мм. При необходимости, Лоренц (2011) 24 наметил ПЦР оптимизации и устранения неполадок методы в ранней выпуске журнала.

  1. Вареные препарата ДНК:
    1. Распределить 100 мкл обогащенной культуры в стерильную 0,5 мл ПЦР-пробирку. Нагреть образец до 99 ° С в течение 10 мин, с использованием водяной бани или нагревательный блок. Привязать холод на льду в течение 2 мин.
    2. Микроцентрифуга при 14000 мкг в течение 5 мин для осаждения остатков клеток. Вернуться в лед. Образцы ДНК могут быть заморожены при температуре -20 ° С до тех пор, пока требуется, но должны быть оттаивали на льду.
  2. Скрининг 1 класса интегронов с помощью ПЦР:
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смешанные культуры от O / N инкубации скрининг на 1 класса интегронов с использованием протокола HS463a / HS464 ПЦР (Таблица 1).
    1. Оттепель все реагенты ПЦР на льду, от любого потенциального суРЭЦ загрязняющих ДНК. Макияж 48 мкл ПЦР Mastermix за образец, в том числе отрицательных контролей (таблица 2). Разлить 48 мкл ПЦР мастер смеси в каждую пробирку, с помощью барьерных советы.
    2. Добавьте 2 мкл талой ДНК в отдельных ПЦР пробирок с использованием барьерных советы. Запустите соответствующую программу в амплификаторе ПЦР.
    3. Для оценки результатов амплификации, electrophorese 7 мкл продукта ПЦР на 2% агарозном геле налил и запустить в КЭ буфера (90 мМ Трис-борат, 2 мМ ЭДТА). Включите маркер молекулярного веса, например, 100 п.н. лестницы.
    4. Сообщение окрасить гель с пятном ДНК, и визуализировать с помощью УФ-просвечивания. Убедитесь, что не было усиления в отрицательном контроле. Сильная полоса около 470 б.п. для любого конкретного образца показывает, что смешанная культура содержит бактерии, которые несут класс 1 интегрон. Чистые колонии теперь будут изолированы от любой смешанной культуре, вернулся положительный ПЦР.

  1. Серийные разведения и распространения пластин:
    Примечание: Чтобы изолировать отдельных колоний из ПЦР-положительных смешанных культур, смешанную культуру серийно разводили в 10 раз в натрий-фосфатном буфере, а затем высевали восстановить отдельных колоний.
    1. Добавить 1 мл смешанной культуры с 9 мл фосфатного буфера 0,1 М натрия, рН 7,0 и смешивают с инверсией. Добавить 1 мл в разведении с другим 9 мл фосфатного буфера, и повторить, пока серийного разведения 10 -8 достигается.
    2. Распространение 100 мкл 10 -4 до 10 -8 разведения на LB-агар, в двух экземплярах. Инкубируйте пластин O / N при той же температуре, используемой для начальной смешанной культуры. Плиты затем можно хранить при 4 ° С до необходимости, однако лучше всего, чтобы обработать отдельных колоний довольно быстро.
  2. Одиночный выбор колонией и вареные препарата ДНК:
    1. Выберите отдельные колонии от серийных разбавления пластин, SEсборном, как много различных типов колоний как можно, используя такие критерии, как размер колоний, формы и цвета. Используйте стерильные зубочистки, чтобы выбрать отдельные колонии от распространения пластины.
    2. Нажмите зубочистку в колонию, а затем передать в ПЦР пробирку, содержащую 100 мкл стерильной воды. Если большое количество колоний должны быть экранированы, то колонии могут быть приготовлены в лоток для микротитрования. Спин зубочистку между пальцами, чтобы сместить некоторые из клеток в воду.
    3. Используя ту же зубочистку, прививку в LB пластины с полосой колонии. Большое число колоний могут быть сохранены на меченых пластин, если каждая полоса имеет длину около 1 см. Повторите шаги с 1 по 3 до тех пор, пока не будут выбраны соответствующее количество изолятов.
    4. Инкубируйте пластины LB O / N, при той же температуре, что и для начального обогащенного культуры. Культуры затем можно хранить при температуре 4 ° С до использования.
    5. Для получения ДНК из бактериальных суспензий, выполните следующие действия, как НУtlined в разделе 3.1. Для скрининга чистой культуры лизатов, выполните HS463a / HS464 ПЦР, как описано в разделе 3.2. Изоляты, которые возвращают положительный ПЦР будет использоваться для подготовки геномной ДНК (раздел 5), а для дальнейших анализов.

5. Геномная ДНК Добыча интегрон-положительные Моноколонии Использование бисера Избиение 25

  1. Привить 5 мл LB бульона с образцом чистого культуры изолированных в разделе 4.2. Инкубируйте O / N, встряхивая при той же температуре, которая была использована для первоначального обогащенного культуры.
  2. Пелле клеток при 4000 мкг в течение 7 минут, затем удалите супернатант. Ресуспендируют гранулированных клеток в 1 мл CLS-TC раствора в Лизирующий Матрица E быстро подготовительной трубы. Использование шарик избиение машины, обрабатывать образца при 5,5 м / сек в течение 30 сек.
  3. Центрифуга трубки при 14000 х г в течение 5 мин и восстановление 700 мкл супернатанта в стерильную пробирку 1,5 мл.
  4. Добавить 700 мкл связывания матрицы разбавленного 1: 5 6 M Гуанidinium тиоцианат, и смешивают при комнатной температуре в течение 5 мин. Центрифуга при 14000 мкг в течение 1 мин, отбросить супернатант.
  5. Добавить 800 мкл этанола соли промывка (70% этанола, 0,1 М ацетата натрия) и вихрь, пока осадок не будет полностью ресуспендировали. Промыть в течение 5 мин при комнатной температуре, центрифуге при 14000 х г в течение 1 мин и отбросить супернатант. Убедитесь, что все супернатант был удален с помощью микропипетки, если это необходимо, а затем позволить высохнуть на воздухе в течение 5 мин.
  6. Ресуспендируют гранул матрицы в 200 мкл ТЕ (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,6) с помощью пипетки вверх и вниз. Инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин. Центрифуга при 14000 х г в течение 3 мин и передачи 160 мкл элюированной ДНК в стерильную пробирку. Запуск аликвоту геномной ДНК добычи на 2% вес / об агарозном геле, чтобы проверить выход и целостность экстракции ДНК. Очищенный геномную ДНК хранили при -20 ° С и размораживают на льду, когда требуется для тестирования ПЦР.

6. Диагностические ПЦР и секвенирования ДНК

Обратите вниманиегеномной ДНК, полученной в разделе 5 будет использоваться для всех диагностических ПЦР, и, чтобы подтвердить положительный тест для класса 1 интегронов.

  1. Оттепель геномной ДНК на льду, кратко вихрь образец ДНК и пульс спина при 14000 мкг в течение 20 сек. Повторите ПЦР для интегрон-интегразы гена класса 1 с использованием HS463a / HS464 (таблица 1), подтверждая, что изолят является положительным для 471 б.п. ампликона (раздел 3.2).
  2. Идентификация положительных культур в видовом уровне достигается путем анализа гена малой субъединицы рРНК (16S рДНК). Амплификации гена 16S с использованием праймеров F27 / r1492 (Таблица 1). Проверка продуктов ПЦР с помощью электрофореза. Все бактериальные показатели должны генерировать 16S ампликон около 1450 пар оснований.
  3. Последовательность гена рРНК 16S ампликон для определения идентичности видовой, но так как, скорее всего, будет несколько положительных МКП с шага 6.2, и многие из этих положительных будут те же виды бактерий, мы сначала выделить различные виды Усинг ограничение переваривание продукта ПЦР 16S.
    1. Дайджест аликвоту ПЦР 16S рестриктазой Hinf 1. Любой фермент, который распознает сайты 4 п.о. расщепления будет делать, но Hinf 1 генерирует хороший разнообразие от 16S целей, и надежным, недорогим фермент.
  4. Установите ограничение 30 мкл переварить Mastermix (таблица 2) в стерильную пробирку и добавить 20 мкл ООН-purfied 16S ПЦР продукта. Выдержите в 37 ° С водяной бане O / N. Проверьте дайджест на 2% агарозном геле.
  5. Оценка пищеварение структуры, созданные Hinf 1. Изоляты с той же 16S профиль рестрикции, вероятно, будут того же вида. Вместо секвенирования каждый продукт 16S ПЦР, последовательность в большинстве трех представителей от каждой Hinf 1 рестрикционной.
  6. Очищают продукты 16S ПЦР с использованием коммерческого набора. Одноцепочечной комплект экзонуклеазная может быть использован, но колонна основе или методы осаждения также работать хорошо, чтобы удалить unincorporated грунтовки и Однонитевые ДНК. Последовательность ампликоны 16S с использованием праймера R910 (таблица 1), настройка реакции, как указано секвенирования объекта.
  7. Используйте полученную последовательность ДНК, чтобы допросить базы данных ДНК NCBI с функцией BLASTN ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ). Более 97% идентичность нуклеотидов, как правило, принимаются в качестве идентичности видов.

7. Отображение и характеристика Интегроны и кассетные массивов

ПРИМЕЧАНИЕ: Класс 1 интегронами исходящие от экосистем человека преобладают, скорее всего, наиболее распространенными интегронами во всех ваших образцов. Все эти интегронами есть недавний сингл происхождение, и, следовательно, имеют весьма консервативную последовательность ДНК 5.

  1. Различать класса 1 Интегроны исходящие от человека и те, которые встречаются в природе в пробах окружающей среды, выполняяПЦР с набором праймеров intI1F165 / intI1R476 10 (таблица 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Класс 1 интегронами клинических или синантропных бактерий будет генерировать б.п. продукт ~ 300, в то время как экологический класс 1 интегронами не будет генерировать любой продукт.
  2. Охарактеризовать клинические Интегроны путем усиления массив кассеты с набором праймеров HS458 / HS459. Это ПЦР усилится область между intI1 и консервативной сегменте 3 'в конце большинства массивов кассету. Поскольку число и идентичность кассет является переменной, размер ПЦР-продукта будет также изменяться.
  3. Очищают ампликоны и секвенирования ДНК с использованием каждого из праймеров для амплификации. Используйте последовательности допросить базы данных ДНК, используя функцию BLASTN ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ).
  4. Убедитесь, называя кассет следовать стандартной номенклатуры 9, так как многие отложений данных генной кассеты интегрон• Используйте противоречивые или неоднозначные имена. Уделять особое внимание к новым генных кассет, так как они могут кодировать новые фенотипы, в том числе генов, которые придают увеличилось передаче, патогенность или вирулентность 8,21.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Доклинические формы класса 1 интегрона еще циркулируют в природных средах. В частности, те, которые связаны с активными Тп 402 транспозонов наибольший интерес 26. В кассетные массивы этих интегронов не будет усиливать с набором праймеров HS458 / HS459, но может быть усилен с набором праймеров MRG284 / MRG285 (таблица 1), генерации ампликонов переменного размера в зависимости от содержания кассеты. ПЦР-продукты должны быть очищены и ДНК последовательность, как указано в 7.2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Скрининг смешанных культур и бактериальных изолятов intI1

Набор праймеров HS463a / HS464 ПЦР может быть использован для обнаружения присутствия интегрон-интегразы гена класса 1, intI1 (рис 1). Это набор праймеров хорошо работает для обнаружения intI1 в смешанных культурах, а также используется для скрининга бактериальных колоний найденным распространенных пластин (рис 2). Положительные изоляты должны генерировать одну сильную полосу на 471 п.о. с помощью этого набора праймеров (фиг.3А). Большинство положительных изолятов будет нести intI1, что происходит от человека или их сельскохозяйственных и домашних животных. Эти изоляты также будет положительным в ПЦР с использованием праймеров, F165 / R476, который должен генерировать 311 б.п. ампликона (рисунок 1). Экологические источники intI1 как правило, будут положительными в этом втором анализе.

Характеристика интегрон массивов кассетных

402 -associated класса 1 интегронами может быть усилен с помощью праймеров HS458 / HS459. Эти праймеры соответственно целевой рекомбинации сайт интегрон, и конец 3 'массива кассеты, которые, как правило заканчивается в qacEΔ sul1 слияния генов (рис 1). Размер продуктов ПЦР в этом анализе изменяется в соответствии с количеством и идентичности кассет в массиве (фиг.3В). Экологический класс 1 интегронами часто вкладывается в бактериальных хромосом и их массивов кассетные может быть усилен праймерами, которые нацелены на проксимальный и дистальный участки большинство рекомбинации (рисунок 1). Праймеры MRG284 / 285 предназначены для усиления этого региона, и снова, потому что содержание кассеты изменяется, размер ампликонов также изменяется (3С). Секвенирование HS458 / 459 ПЦРпродукты, как правило, восстановить известные антибиотики детерминанты сопротивления, в то время как последовательность MRG284 / 285 ПЦР-продукты, как правило, восстановить ген кассеты, которые кодируют полипептиды с неизвестной функцией.

Определение видов бактерий

Бактерии идентифицированы с помощью секвенирования 16S рДНК и баз данных сопоставлений. Геномную ДНК используют в качестве матрицы для амплификации спейсерной области 16S гена малой субъединицы рРНК. С использованием праймеров предложил, это должно генерировать ампликона приблизительно 1450 п.н.. Из-за большого числа колоний может быть экранирован в любой момент времени, используется иерархический метод скрининга. Амплифицированные продукты 16S ПЦР расщепляли рестриктазой Hinf 1, и эти дайджесты разделены на агарозном геле. Отдельные виды будет генерировать отличительные узоры после дайджеста, например, что изоляты тех же видов могут быть легко идентифицированы (рис 3D). Секвенирование ПЦР гена 16S рРНК продуктов из более трехизолирует, представляющий любой узор одно ограничение позволяет эффективно выявлять все вероятные видов в коллекции интегрон положительных изолятов.

Фигура 1
Рисунок 1. Структура класса 1 интегронов. Принципиальные схемы клиническая и экологическая класса 1 интегронов, показывая ПЦР сайты связывания праймеров, указанных в рукописи. Класс 1 интегронами состоят из гена интегрон-интегразы (intI1), который катализирует захват и выражение генных кассет, чтобы сформировать массив кассеты. Перед появлением применения антибиотиков, большинство класса 1 интегронов были хромосомные, генные и осуществляется кассеты, чьи функции еще не определены. Сильный выбор с помощью применения антибиотиков значительно расширило обилие одной последовательности варианта класса 1 интегрона, связанного с Тп 402 транспозонов.Эти «клинические» интегронами приобрели массивы кассет, которые кодируют устойчивость к антибиотикам. Именно эти интегронами, что в настоящее время загрязняющие природную среду и цепи производства продуктов питания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. схема последовательности операций для определения класса 1 Интегроны в пищевых продуктах. Образцы продуктов питания используют для инокуляции СМИ и генерировать смешанный бактериальной культуры. Эти смешанные культуры подвергают скринингу на присутствие класса 1 интегронов, и положительные культуры использовали для получения расширенных пластин. Отдельные колонии от распространения пластин повторный скрининг для интегронов. Положительные культуры очищены, ДНК извлекается и характеризуется на содержание кассеты ДНК себеquencing. Секвенирование гена 16S рРНК используется для идентификации видов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Представитель электрофоретической анализ в процессе скрининга. (A) Скрининг отдельных колоний, используя праймеры intI1 HS463a / 464. Положительные колонии генерировать сильный одну полосу на 471 б. (Б) Усиление кассетных массивов из Tn 402 интегронов с использованием праймеров HS458 / 459. Это порождает ПЦР переменная продукт размеры зависят от личности и размер компонента кассет в массиве. Идентификация этих кассет требуется секвенирования ДНК. (С) Усиление кассетных массивов от окружающей среды 1-го класса Integrons использованием праймеров MRG284 / 285. Это также создает ПЦР продукт переменного размеры в зависимости от идентичности и размер компонента кассет в массиве, однако кассеты в окружающей среде массивы вряд ли кодировать устойчивость к антибиотику. (D) Скрининг продуктов ПЦР 16S расщеплением Hinf 1. Изолирует с идентичные картины рестрикции, вероятно, будет тот же вид. Если большое количество одного типа ограничения будут восстановлены, только немногие из них должны быть упорядочены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

ПЦР Джин цель Грунтовка имя Направление Последовательность 5 '- 3' Условия Велоспорт Refereсть
HS463a / HS464 Класс 1 интегрон HS464 Вперед ACATGCGTGTAAATCATCGTCG 94 ° C 3 мин; 35 циклов 94 ° С 30 сек, 60 ° С 30 сек, 72 ° С 1 мин 30 сек; 72 ° С 5 мин Стокса и др., 2006 28
HS463a Обратный CTGGATTTCGATCACGGCACG
F27 / r1492 16S рРНК F27 Вперед AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 94 ° C 3 мин; 35 циклов 94 ° С 30 сек, 60 ° С 30 сек, 72 ° С 1 мин 30 сек; 72 ° С 5 мин Лейн, 1991 29
r1492 Обратный TACGGYTACCTTGTTACGACTT
intI1F165 / IntI1R476 Клиническая класс 1 интегрон Инти1F165 Вперед CGAACGAGTGGCGGAGGGTG 94 ° C 3 мин; 35 циклов 94 ° С 30 сек, 55 ° С 30 сек, 72 ° С 1 мин 30 сек; 72 ° С 5 мин Гиллингс, 2014 10
intI1R476 Обратный TACCCGAGAGCTTGGCACCCA
HS549 / HS550 3'CS Клиническая интегрон HS549 Вперед ACTAAGCTTGCCCCTTCCGC 94 ° C 3 мин; 35 циклов 94 ° С 30 сек, 65 ° С 30 сек, 72 ° С 1 мин 30 сек; 72 ° С 5 мин Стокса и др., 2006 28
HS550 Обратный CTAGGCATGATCTAACCCTCGG
HS458 / HS459 Клиническая массив кассеты HS458 Вперед GCAAAAAGGCAGCAATTATGAGCC 946; С 3 мин; 35 циклов 94 ° С 30 сек, 55 ° С 30 сек, 72 ° С 1 мин 30 сек; 72 ° С 5 мин Holmes и др., 2003 30
HS459 Обратный GTTTGATGTTATGGAGCAGCAACG
MRG284 / MRG285 Экологическая кассеты MRG284 Вперед GTTACGCCGTGGGTCGATG 94 ° C 3 мин; 35 циклов 94 ° С 30 сек, 55 ° С 30 сек, 72 ° С 1 мин 30 сек; 72 ° С 5 мин Гиллингс др., 2009 21
MRG285 Обратный CCAGAGCAGCCGTAGAGC

Таблица 1. Последовательности праймеров и условия ПЦР, используемые для идентификации класса 1 Интегроны и связанные с ними генетические кассеты.

Таблица 2. ПЦР и ограничение переварить Mastermix компоненты.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Выявление интегронов и связанных с ними генов кассет потенциально важным шагом в прогнозировании возникновения новых патогенных возбудителей, отслеживание пути для патогенов в пищевой цепи человека, а также выявление новых сопротивление и вирулентности детерминанты 8,21,26. Целью данной работы было описать рациональный подход для скрининга образцов для 1 класса интегронов, характеризующие их массивы кассетные и идентификации видов бактерий, в которых они проживают. Критические шаги в протоколе привлекать хорошую микробиологическую практику, и предотвращения загрязнения ПЦР, что будет генерировать ложных срабатываний.

Протокол, описанный здесь, может быть легко изменена, чтобы обнаружить другие клинически значимые Интегроны, в том числе класса 2 и класса 3 интегронов, которые также найдены в человеческих патогенов. Она также может быть модифицирована для обнаружения Интегроны в микробных сообществ из воды, биопленок, почвы или осадка. Есть некоторые limitatioнс до этого метода, которые возникают из опоры на культивирования бактериальные клетки. Многие экологические бактерии не легко культивируемых, и протокол, описанный здесь не обнаружить эти виды. Диапазон видов, которые восстановленных может быть расширена с помощью различных формулировок бактериальная массовой информации и более длительное время инкубации. Тем не менее, большинство видов, представляющих интерес для здоровья человека, скорее всего, растут в условиях, описанных здесь.

Этот протокол имеет некоторые преимущества по сравнению с методами, которые используют покрытие на селективных средах. Нет предположения не должны быть сделаны о личности детерминант резистентности, проведенных отдельными изолятов и новых генов устойчивости могут быть восстановлены и характеризуют. В более общем плане, рабочий процесс также может быть выполнен с возможностью обнаружения любого элемента resistome 27 или mobilome, которые могут представлять интерес 4. Такие анализы важны для понимания динамики различных элементов ДНК, участвующих вtibiotic сопротивление, и решающее значение для сохранения сокращающийся арсенал антимикробных соединений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего разглашать соответствующую.

Acknowledgments

Благодаря Микаэла зале, Лариса Bispo и Густаво Таварес для технической помощи.

Materials

ПЦР реактивы Объем (мкл) Ограничение дайджест реагенты Объем (мкл)
Стерильная вода 21,5 Стерильная вода 23
10x GoTaq Белый 25 Буфер B 5
РНКазы [1 мг / мл] 0,5 Бычий сывороточный альбумин [1 мг / мл] 1
Прямой праймер [50 мкМ] 0,5 HinfI [10 единиц / мкл] 1
Обратный праймер [50 мкМ] 0,5
Объем Mastermix 48 Объем Mastermix 30
ДНК-матрицы 2 ПЦР шаблона 20
Конечный объем ПЦР 50 Окончательный ограничение дайджест объем 50
Name Company Catalog Number Comments
GoTaq Colourless Mastermix Promega M7132 Used in all PCRs
RNAse (Ribonuclease A from bovine pancreas) Sigma R6513-10MG Used in all PCRs
HinFI restriction enzyme Promega R6201 Used to digest 16S rDNA PCR poducts. Enzyme comes with optimal buffer and BSA
100 bp ladder GE Healthcare 27400701 Used as a size standard on all agarose gels
GelRed DNA stain Biotium 41003 CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material
Guanidinium thiocyanate Life Technologies AM9422 CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material
CLS-TC Solution MP Biomedicals 6540409 Resuspension solution used at the begining of the genomic DNA extraction
Lysing Matrix E FastPrep tubes MP Biomedicals 116914500 Tube required for mechanical disruption of bacterial cell walls. This code is used for packs of 500 tubes, smaller quantities are available.
Binding matrix MP Biomedicals 116540408 Diluted 1:5 with 6 M guanidinium thiocyanate and used in the genomic DNA extraction method.
Fast Prep machine MP Biomedicals Number of options available MP Biomedicals has a number of FastPrep machines available to purchase. Visit http://www.mpbio.com for more information

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, K., et al. Tackling antibiotic resistance. Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).
  2. Davies, J., Davies, D. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).
  3. Costa, V. M., et al. Antibiotic resistance is ancient. Nature. 477 (7365), 457-461 (2011).
  4. Gillings, M. R. Evolutionary consequences of antibiotic use for the resistome, mobilome and microbial pangenome. Front. Microbiol. 4, 4 (2013).
  5. Gillings, M., et al. The evolution of class 1 integrons and the rise of antibiotic resistance. J. Bacteriol. 190 (14), 5095-5100 (2008).
  6. Brassard, S., Lapointe, J., Roy, P. H. Diversity and relative strength of tandem promoters for the antibiotic-resistance genes of several integrons. Gene. 142 (1), 49-54 (1994).
  7. Partridge, S. R., et al. Definition of the attI1 site of class 1 integrons. Microbiol. 146 (11), 2855-2864 (2000).
  8. Gillings, M. R. Integrons: Past, Present, and Future. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 78 (2), 257-277 (2014).
  9. Partridge, S. R., Tsafnat, G., Coiera, E., Iredell, J. R. Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons. FEMS Microbiol. Rev. 33 (4), 757-784 (2009).
  10. Gillings, M. R., et al. Using the class 1 integron-integrase gene as a proxy for anthropogenic pollution. ISME J. In press, (2014).
  11. Gaze, W. H., et al. Impacts of anthropogenic activity on the ecology of class 1 integrons and integron-associated genes in the environment. ISME J. 5, 1253-1261 (2011).
  12. Gerzova, L., et al. Characterization of microbiota composition and presence of selected antibiotic resistance genes in carriage water of ornamental fish. PLoS ONE. 9, e103865 (2014).
  13. Power, M., Emery, S., Gillings, M. Into the wild: dissemination of antibiotic resistance determinants via a species recovery program. PLoS ONE. 8, e63017 (2013).
  14. Stokes, H. W., Gillings, M. R. Gene flow, mobile genetic elements and the recruitment of antibiotic resistance genes into Gram-negative pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 35 (5), 790-819 (2011).
  15. Moura, A., Oliveira, C., Henriques, I., Smalla, K., Correia, A. Broad diversity of conjugative plasmids in integron-carrying bacteria from wastewater environments. FEMS Microbiol. Lett. 330 (2), 157-164 (2012).
  16. Schlüter, A., Krause, L., Szczepanowski, R., Goesmann, A., Pühler, A. Genetic diversity and composition of a plasmid metagenome from a wastewater treatment plant. J. Biotech. 136 (1-2), 65-76 (2008).
  17. Taylor, N. G. H., Verner-Jeffreys, D. W., Baker-Austin, C. Aquatic systems: maintaining, mixing and mobilising antimicrobial resistance. TREE. 26 (6), 278-284 (2011).
  18. Stalder, T., et al. Quantitative and qualitative impact of hospital effluent on dissemination of the integron pool. ISME J. 8, 768-777 (2014).
  19. Allen, H. K., et al. Call of the wild: antibiotic resistance genes in natural environments. Nature Rev. Microbiol. 8, 251-259 (2010).
  20. Wellington, E. M., et al. The role of the natural environment in the emergence of antibiotic resistance in Gram-negative bacteria. Lancet Infect. Dis. 13 (2), 155-165 (2013).
  21. Gillings, M. R., et al. Mobilization of a Tn402-like class 1 integron with a novel cassette array via flanking miniature inverted-repeat transposable element-like structures. Appl. Env. Microbiol. 75 (18), 6002-6004 (2009).
  22. Graham, D. W., Collignon, P., Davies, J., Larsson, D. J., Snape, J. Underappreciated role of regionally poor water quality on globally increasing antibiotic resistance. Env. Sci. Technol. 48 (20), 11746-11747 (2014).
  23. Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. The antibiotic resistome: what's new. Curr. Opinion Microbiol. 21, 45-50 (2014).
  24. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. 63, e3998-e3998 (2011).
  25. Gillings, M. R. Rapid Extraction of PCR-Competent DNA from Recalcitrant Environmental Samples. Env. Microbiol. 1096, 17-23 (2014).
  26. Sajjad, A., Holley, M. P., Labbate, M., Stokes, H., Gillings, M. R. Preclinical class 1 integron with a complete Tn402-like transposition module. Appl. Env. Microbiol. 77 (1), 335-337 (2011).
  27. Wright, G. D. Antibiotic resistance in the environment: A link to the clinic. Curr. Opinion Microbiol. 13 (5), 589-594 (2010).
  28. Stokes, H., Nesbo, C., Holley, M., Bahl, M., Gillings, M., Boucher, Y. Class 1 integrons predating the association with Tn402.-like transposition genes are present in a sediment microbial community. Journal of Bacteriology. 188, 5722-5730 (2006).
  29. Lane, D. J. Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. , John Wiley &Sons, Inc. 115-175 (1991).
  30. Holmes, A. J., et al. Recombination activity of a distinctive integron-gene cassette system associated with stutzeri. populations in soil. Journal of Bacteriology. 185, 918-928 (2003).

Tags

Наук об окружающей среде выпуск 100 интегрон боковая перенос генов эпидемиология resistome устойчивость к антибиотикам загрязнение окружающей среды xenogenetic
Скрининг продуктов питания для 1 класса Интегроны и Джин кассет
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Waldron, L. S., Gillings, M. R.… More

Waldron, L. S., Gillings, M. R. Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes. J. Vis. Exp. (100), e52889, doi:10.3791/52889 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter