Este protocolo describe la detección de integrones de clase 1 y sus casetes de genes asociados en productos alimenticios.
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Artículo de método
Screening productos alimenticios para la Clase 1 integrones y Gene Cassettes
En este artículo
Resumen
Resumen
La resistencia a los antibióticos es una de las mayores amenazas para la salud enel siglo XXI. La adquisición de genes de resistencia a través de la transferencia lateral de genes es un factor importante en la propagación de diversos mecanismos de resistencia. Entre los elementos del ADN que facilitan la transferencia lateral, los integrones de clase 1 han sido en gran medida responsables de la propagación de los determinantes de la resistencia a los antibióticos entre los patógenos Gram negativos. En total, estos integrones han adquirido y diseminado más de 130 genes diferentes de resistencia a los antibióticos. Con el uso continuo de antibióticos, los integrones de clase 1 se han vuelto omnipresentes en comensales y patógenos de los seres humanos y sus animales domésticos. Como consecuencia, ahora se pueden encontrar en todos los flujos de desechos humanos, donde continúan adquiriendo nuevos genes y tienen el potencial de regresar a los humanos a través de la cadena alimentaria. Este protocolo detalla un enfoque simplificado para la detección de integrones de clase 1 y sus casetes de genes de resistencia asociados en productos alimenticios, mediante cultivo y PCR. Con este protocolo, los investigadores deberían ser capaces de: recolectar y preparar muestras para hacer cultivos enriquecidos y detectar integrones de clase 1; aislar colonias bacterianas individuales para identificar aislados positivos para integrones; identificar las especies bacterianas que contienen integrones de clase 1; y caracterizar estos integrones y sus casetes de genes asociados.
Introducción
El descubrimiento de los antibióticos fue uno de los mayores logros científicos del siglo 20. Sin embargo, el uso y abuso de antibióticos ha llevado a la rápida evolución de las bacterias resistentes a los antibióticos, y estos ahora representan una seria amenaza para la salud pública en el siglo 21. El surgimiento de cepas bacterianas resistentes a la mayoría de las opciones de tratamiento plantea la posibilidad de que estamos entrando en una era en que los medicamentos antimicrobianos ya no son eficaces 1,2.
La maquinaria genética que confiere resistencia a los antibióticos es un sistema antiguo, anterio....
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Protocolo
Los productos alimenticios que se consumen crudos o ligeramente cocidos son de mayor preocupación para la salud humana. Los ejemplos incluyen ensalada de verduras, frutas, mariscos y crustáceos.
1. Recogida de muestras
- Recoger las muestras en condiciones que reduzcan al mínimo la contaminación, y se almacena en sacos limpios, separados durante el transporte. Una vez recogidos, las muestras deben almacenarse a 4 ° C y procesadas dentro de 24 horas.
2. Preparación Enriquecido Cultura
- Frutas y vegetales:
- Poner unos 10 g de material en una bolsa de plástico resistente. Si el pr....
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Resultados
Proyección de cultivos mixtos y aislamientos bacterianos para intI1
Conjunto de cebadores HS463a / HS464 PCR se puede utilizar para detectar la presencia del gen de la integrasa integrón de clase 1, intI1 (Figura 1). Este conjunto de cebadores funciona bien para detectar intI1 en cultivos mixtos, y también se utiliza para detectar colonias de bacterias recogidas de placas separadas (Figura 2). Aislamientos positivos deberían generar una sola b.......
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Discusión
La identificación de los integrones y sus cassettes genéticos asociados es potencialmente un paso clave en la predicción de la aparición de nuevos agentes patógenos oportunistas, el seguimiento de las vías para los patógenos en la cadena alimentaria humana, y la identificación de una nueva resistencia y virulencia determinantes 8,21,26. El objetivo de este trabajo fue describir un enfoque simplificado para el cribado de muestras para la clase 1 integrones, caracterizando sus matrices de cassette y la identifi.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada relevante a revelar.
Agradecimientos
Gracias a Michaela Hall, Larissa Bispo y Gustavo Tavares para la asistencia técnica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| GoTaq Mastermix Incoloro | Promega | M7132 | Utilizado en todas las PCR |
| ARNasa (Ribonucleasa A del páncreas bovino) | Sigma | R6513-10MG | Utilizado en todas las PCR |
| Enzima de restricción HinFI | Promega | R6201 | Se utiliza para digerir productos de PCR de ADNr 16S. La enzima viene con un tampón óptimo y una escalera BSA |
| de 100 bp | GE Healthcare | 27400701 | Se utiliza como estándar de tamaño en todos los geles de agarosa |
| Tinción de ADN GelRed | Biotium | 41003 | PRECAUCIÓN: Se debe usar protección personal al manipular este material |
| Tiocianato de guanidinio | Life Technologies | AM9422 | PRECAUCIÓN: Se debe usar protección personal al manipular este material |
| CLS-TC Solución | MP Biomedicals | 6540409 | Solución de resuspensión utilizada al comienzo de la extracción de ADN genómico |
| Lysing Matrix E Tubos FastPrep | MP Biomedicals | 116914500 Tubo necesario para la disrupción mecánica de las paredes celulares bacterianas. Este código se utiliza para paquetes de 500 tubos, hay cantidades más pequeñas disponibles. | |
| Matriz de unión | MP Biomedicals | 116540408 | diluida 1:5 con tiocianato de guanidinio 6 M y utilizada en el método de extracción de ADN genómico. |
| Máquina de preparación rápida | MP Biomedicals | Número de opciones disponibles | MP Biomedicals tiene una serie de máquinas FastPrep disponibles para comprar. Para más información, visita http://www.mpbio.com |
Referencias
- Bush, K., et al. Tackling antibiotic resistance. Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).
- Davies, J., Davies, D. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).
- Costa, V. M., et al.
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Reimpresiones y permisos
