Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Screening Livsmedel för klass 1 integroner och genkassetterna

Published: June 19, 2015 doi: 10.3791/52889
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Macquarie University

Introduction

Upptäckten av antibiotika var en av de största vetenskapliga resultaten av 20-talet. Emellertid har bruk och missbruk av antibiotika har lett till den snabba utvecklingen av antibiotikaresistenta bakterier, och dessa nu utgör ett allvarligt hot mot folkhälsan i det 21: a århundradet. Ökningen av bakteriestammar som är resistenta mot de flesta behandlingsalternativ ökar möjligheten vi går in i en era där antimikrobiella läkemedel inte längre är effektiva 1,2.

Den genetiska maskiner som ger antibiotikaresistens är ett gammalt system, predating människor och antibiotikaselektionstryck av miljontals år 3. Mobila genetiska element, såsom plasmider, transposoner, iska öarna, integrativa konjugering element och integroner kan sprida antibiotikaresistensgener (ARG) både inom och mellan bakteriearter 4. Av dessa har integroner spelat en central roll i spridningen av ARG, trots denfaktum att de förlitar sig på plasmider och transposoner för mobilisering och införande i bakteriegenom 5. Integroner fånga genkassetterna använder en integron-integras, och sedan uttrycka kassetter med hjälp av en integron kodad promotor 6,7 (Figur 1). Integron genkassetterna är små rörliga element som består av enskilda öppna läsramar (ORF) vars produkter kan ge resistens mot antibiotika eller desinfektionsmedel 8. Klass 1 integroner är integroner oftast återhämtat sig från kliniska isolat 5, där de tillsammans har förvärvat över 130 olika antibiotikaresistens genkassetterna 9.

Spridningen av klass 1 integroner i humana associerade commensal och patogena bakterier genererar avfallsströmmar mänskliga som innehåller ett stort antal av dessa genetiska element 10. Uppskattningsvis 10 19 bakterier som innehåller klass 1 integroner släpps via avloppsslam varje år in Förenade kungariket 11. Det är därför inte förvånande att klass 1 integroner som ger antibiotika motstånd nu detekteras i mikrobiota av vilda fåglar, fiskar och andra inhemska vilda djur 12-14. Släpper integroner tillbaka till miljön utgör ett allvarligt hot mot folkhälsan, eftersom förvärv av nya genkassetterna och komplexa omlagringar med andra rörliga element kvarstår, särskilt i vattenreningsverk och andra vattendrag 15-18. Den naturliga miljön blir då en grund bördig rekrytera nya resistensbestämningsfaktorer och opportunistiska patogener 19,20. Nya integron innehåller bakterier och nya ARGumenten kan ringa tillbaka till den mänskliga gemenskapen genom förorenat vatten och mat 21,22. Övervakning av miljö ARGumenten är en viktig strategi för att förstå och hantera antibiotikaresistens i framtiden 23. Framför allt bör uppmärksamhet ägnas åt livsmedel som äts råa ellerlätt kokta, eftersom dessa presenterar det största hotet för överföring av nya mobila element och patogener.

I detta protokoll, en rationell metod för att upptäcka, identifiera och karakterisera klass 1 integroner och tillhörande genkassetterna i livsmedel beskrivs (Figur 2). Med en kombination av odling och polymerase chain reaction (PCR), kan integroner snabbt upptäcks i komplexa bakteriesamhällen och enskilda isolat. Metoder för identifiering av arter av bakterier och konformationen och identiteten hos integron associerade genkassetterna ges. Metoden är lämplig för ett brett spektrum av växt- och djurmatar, och exempel på typiska arbetsflöden ges för var och en av dessa typer av livsmedel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Livsmedel som äts råa eller lätt kokta är av störst risk för människors hälsa. Som exempel kan nämnas sallad grönsaker, frukt, skaldjur och kräftdjur.

1. Provtagning

  1. Samla in prov under förhållanden som minimerar kontaminering, och lagras i separata, rena påsar under transporten. När samlas in, ska proverna förvaras vid 4 ° C och behandlas inom 24 timmar.

2. Anrikat Kultur Framställning

  1. Frukt och grönsaker:
    1. Placera ca 10 g material i en tålig plastväska. Om bearbetning större material, koncentrera sig på huden av frukten eller grönsaken. Lägg 90 ml 0,1 M natriumfosfatbuffert, pH 7,0 och process i en paddel-blandare under 30 sek. Alternativt kan materialet manuellt rörs om en paddel mixer är inte tillgänglig.
    2. Samla upp vätskan i två 50 ml Falcon-rör. Centrifugera rören vid 4000 xg under 7 minuter för att pelletera bakterierna. Ta försiktigt bort supernatanten och suspendera de pelleterade bakterier i 30 ml steril Luria Bertani (LB) buljong.
    3. Inkubera på en shaker O / N, som innehar ett rör vid 25 ° C och den andra vid 37 ° C. Kulturer ska skakas vid 200 svängningar per minut (OPM). Förvara kulturer vid 4 ° C tills de behövdes.
  2. Seafood:
    1. Dissekera ut magen (ostron) eller mag-tarmkanalen (räkor) med hjälp av steril pincett och pincett och placera i ett sterilt 1,5 ml rör innehållande 200 | il 0,1 M natriumfosfatbuffert, pH 7,0. Blöta provet för att skapa en homogenat.
    2. Fördela 5 ml LB-buljong i två sterila 5 ml rör och ympa var och en med skaldjur homogenatet.
    3. Inkubera på en shaker O / N, som innehar ett rör vid 25 ° C och den andra 37 ° C. Kulturer ska skakas vid 200 opm. Förvara kulturer vid 4 ° C tills de behövdes.

3. Screening kulturer för integroner

MgCl2 koncentration av 2,5 mM. Om det behövs, har Lorenz (2011) 24 skiss PCR optimering och felsökningsmetoder i ett tidigare nummer av denna tidskrift.

  1. Kokt DNA-beredning:
    1. Fördela 100 l anrikat kultur i en steril 0,5 ml PCR-rör. Upphetta provet till 99 ° C under 10 minuter, med användning av ett vattenbad eller värmeblock. Snäpp kyla på is under 2 minuter.
    2. Mikrocentrifug vid 14.000 xg under 5 minuter för att pelletera cellrester. Återgå till is. DNA-prover kan frysas vid -20 ° C fram till användning, men måste tinas på is.
  2. Screening för klass 1 integroner använder PCR:
    OBS: Blandade kulturer från O / N inkubation screenas för klass 1 integroner använder HS463a / HS464 PCR-protokoll (tabell 1).
    1. Tina alla PCR-reagens på is, bort från eventuella sources av kontaminerande DNA. Make up 48 pl PCR mastermix per prov, inklusive negativa kontroller (tabell 2). Fördela 48 pl PCR Master Mix till varje rör, med hjälp av barriär tips.
    2. Tillsätt 2 pl tinade DNA till individuella PCR-rör med hjälp av barriär tips. Kör motsvarande program i PCR termo.
    3. För att bedöma resultaten av förstärkningen, elektrofores 7 il PCR-produkt på en 2% agarosgel hälls och köra i TBE-buffert (90 mM TRIS-borat, 2 mM EDTA). Inkludera en molekylviktsmarkör, såsom en 100 bp stege.
    4. Post färga gelen med en DNA-fläck, och visualisera med hjälp av en UV-transilluminator. Kontrollera att det inte skett någon förstärkning i den negativa kontrollen. Ett starkt band vid omkring 470 bp för någon särskild prov visar att den blandade kulturen innehåller bakterier som bär en klass 1 integron. Rena kolonier kommer nu att isoleras från vilken blandad kultur som return positiv PCR.

  1. Serieutspädningar och spridningsplattor:
    NOTERA: För att isolera enstaka kolonier från PCR-positiva blandade kulturer, är den blandade kulturen serieutspäddes 10-faldigt i natriumfosfatbuffert, och sedan pläterad för att återvinna enstaka kolonier.
    1. Tillsätt 1 ml blandad kultur till 9 ml 0,1 M natriumfosfatbuffert, pH 7,0 och blanda genom inversion. Tillsätt 1 ml av spädning till en ytterligare 9 ml fosfatbuffert, och upprepa till dess att en serieutspädning av 10 -8 nås.
    2. Sprid 100 pl av de 10 -4 till 10 -8 spädningar på LB-agar, i duplikat. Inkubera plattorna O / N vid samma temperatur som användes för den initiala blandade kulturen. Plattorna kan därefter förvaras vid 4 ° C fram till användning, men det är bäst att bearbeta de enskilda kolonier ganska omgående.
  2. Enda urvals koloni och kokades DNA-beredning:
    1. Välj enstaka kolonier från serieutspädningsplattorna, SElecting så många olika kolonityper som möjligt, med hjälp av kriterier såsom koloni storlek, form och färg. Använd sterila tandpetare för att välja enstaka kolonier från spridningen plattan.
    2. Tryck på tandpetare till kolonin, och sedan överföra till en PCR-rör innehållande 100 pl sterilt vatten. Om ett stort antal kolonier som skall screenas, då kolonier kan framställas i en mikrotiter-fack. Snurra tandpetare mellan fingrarna för att driva bort en del av cellerna i vattnet.
    3. Med samma tandpetare, ympa en LB-platta med en strimma av kolonin. Ett stort antal kolonier kan lagras på märkta plattor om varje strimma är ca 1 cm lång. Upprepa steg 1 till 3 tills du har valt ett lämpligt antal isolat.
    4. Inkubera LB-plattorna O / N, vid samma temperatur som den som användes för den initiala anrikade kultur. Kulturer kan sedan lagras vid 4 ° C tills de behövdes.
    5. För att framställa DNA från bakteriesuspensioner Följ stegen som outlined i avsnitt 3.1. För screening av rena kultur lysat, utför HS463a / HS464-PCR som beskrivs i avsnitt 3.2. Isolerar att returnera en positiv PCR kommer att användas för framställning av genomiskt DNA (avsnitt 5), och för ytterligare analyser.

5. Genomiskt DNA Extraktion av Integron-positiva enstaka kolonier Använda Bead Seger 25

  1. Inokulera 5 ml LB-buljong med ett prov av den rena kulturen isoleras i avsnitt 4.2. Inkubera O / N, skakning vid samma temperatur som användes för den initiala anrikade kultur.
  2. Pellets celler vid 4000 xg under 7 minuter, avlägsna supernatanten. Resuspendera pelleterat celler i 1 ml CLS-TC lösning i en lyserings Matrix E snabb prep röret. Med hjälp av en vulst malningsmaskin, behandla provet vid 5,5 m / sek i 30 sek.
  3. Centrifugrör vid 14.000 xg under 5 min och återvinna 700 | il av supernatanten i ett sterilt 1,5 ml rör.
  4. Lägg 700 pl bindande matris utspädd 1: 5 med 6 M guanidinium tiocyanat och blanda vid rumstemperatur under 5 minuter. Centrifugera vid 14.000 xg under 1 minut, kassera supernatanten.
  5. Lägg 800 pl saltetanoltvätt (70% etanol, 0,1 M natriumacetat) och skaka tills pelleten är helt återsuspenderas. Tvätta under 5 min vid RT, centrifugera vid 14.000 xg under 1 min och kassera supernatanten. Se alla vätskan har tagits bort, med hjälp av en mikropipett vid behov, låt sedan lufttorka under 5 minuter.
  6. Återsuspendera pelleten matrisen i 200 fil TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,6) genom att pipettera upp och ned. Inkubera vid rumstemperatur under 3 minuter. Centrifugera vid 14.000 xg under 3 min och överföring 160 pl av det eluerade DNA i ett sterilt rör. Kör en alikvot av det genomiska DNA-extraktion på en 2% vikt / volym agarosgel för att kontrollera utbytet och integriteten för DNA-extraktion. Det renade genomiska DNA lagras vid -20 ° C och tinas på is när det krävs för PCR-testning.

6. Diagnostiska PCR och DNA-sekvensering

OBS!genomisk DNA framställt i avsnitt 5 kommer att användas för alla diagnostiska PCR, och för att bekräfta det positiva testet för klass 1 integroner.

  1. Tina iskt DNA på is, kort virvel DNA-provet och puls snurra på 14.000 xg under 20 sekunder. Upprepa PCR för klassen 1 integron-integras genen med hjälp HS463a / HS464 (tabell 1), vilket bekräftar att isolat är positivt för 471 bp amplikon (avsnitt 3.2).
  2. Identifiering av positiva kulturer till artnivå åstadkommes genom analys av den lilla subenheten rRNA-genen (16S rDNA). Förstärka 16S-genen med användning av primers F27 / r1492 (tabell 1). Kontrollera PCR-produkterna med hjälp av elektrofores. Alla bakteriella mål ska generera en 16S amplikon av ca 1450 bp.
  3. Sekvens 16S rRNA-genen amplikon för artbestämning identitet, men eftersom det sannolikt kommer att finnas flera positiva PCR från steg 6,2, och många av dessa positiva kommer att vara samma bakterieart, kommer vi först skilja olika arter using-restriktionsdigerering av 16S PCR-produkten.
    1. Smälta en alikvot av 16S PCR med restriktionsenzymet Hinf 1. Alla enzym som känner igen 4 bp klyvningsställen kommer att göra, men Hinf 1 genererar bra mångfald från 16S mål, och är en pålitlig, billig enzym.
  4. Inrätta en 30 ul restriktions smälta mastermix (tabell 2) i ett sterilt rör och tillsätt 20 pl un-purfied 16S PCR-produkten. Inkubera i en 37 ° C vattenbad O / N. Kontrollera digere på en 2% agarosgel.
  5. Betyg nedbrytnings mönster som Hinf 1. Isolat med samma 16S restriktions profil kommer sannolikt att vara samma art. I stället för att sekvensera varje 16S PCR-produkt, sekvens högst tre representanter för varje Hinf 1 restriktionsmönster.
  6. Rena 16S PCR-produkter med användning av ett kommersiellt kit. En enkelsträngad exonukleas kit kan användas, men kolumnen baserade eller utfällningsmetoder fungerar också bra att ta bort unincorporated primrar och enkelsträngade DNA: n. Sekvens 16S amplikonema använder primer R910 (tabell 1), inrättande reaktionerna som anges av sekvense anläggningen.
  7. Använd den resulterande DNA-sekvensen för att förhöra NCBI DNA-databas med BLASTN funktion ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ). Mer än 97% nukleotididentitet tas vanligen som arter identitet.

7. Kartläggning och karakterisering av integroner och kassetter matriser

OBS: Klass 1 integroner som härrör från mänskliga dominerade ekosystem kommer sannolikt att vara de vanligaste integroner i alla prover. Dessa integroner alla har en ny enda ursprung, och har därför en mycket konserverad DNA-sekvens 5.

  1. Skilja mellan en klass 1 integroner som härrör från mänskliga källor och de som förekommer naturligt i miljöprover genom att utföra enPCR med primer set intI1F165 / intI1R476 10 (tabell 1).
    OBS: Klass 1 integroner från kliniska eller bakteriefloran kommer att generera en ~ 300 bp produkt, medan miljöklass 1 integroner inte kommer att generera någon produkt.
  2. Karakterisera kliniska integroner genom att förstärka kassett array med primer set HS458 / HS459. Denna PCR kommer att förstärka området mellan intI1 och 3 "konserverade segment vid terminalen av de flesta kassett matriser. Eftersom antalet och identiteten av kassetter är variabel, kommer storleken av PCR-produkten också variera.
  3. Rena amplikoner och sekvensera DNA med vart och ett av amplifieringsprimers. Använd sekvenser för att förhöra DNA-databaser med hjälp av BLASTN funktion ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ).
  4. Se namngivning av kassetter följer standardiserat system 9, eftersom många data nedfall för integron genkassettens använder inkonsekventa eller tvetydiga namn. Ägna särskild uppmärksamhet åt nya genkassetterna, eftersom dessa kan koda nya fenotyper, inklusive gener som ger ökad överföring, patogenicitet eller virulens 8,21.
    OBS: Prekliniska former av klass 1 integron fortfarande cirkulerar i naturliga miljöer. I synnerhet de som är kopplade till aktiva Tn 402 transposoner är av störst intresse 26. Kassett arrayer av dessa integroner kommer inte amplifierar med primeruppsättning HS458 / HS459, men kan amplifieras med MRG284 / MRG285 primeruppsättningen (tabell 1), genererande amplikoner av varierande storlek beroende på kassett innehåll. PCR-produkter ska renas och DNA sekvenserades som beskrivs i 7.2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Screening av blandade kulturer och bakterieisolat för intI1

Primeruppsättning HS463a / HS464 PCR kan användas för att detektera närvaron av klassen 1 integron-integras-genen, intI1 (figur 1). Denna primeruppsättning fungerar bra för detektering intI1 i blandade kulturer, och används också för att screena bakteriekolonier skördas från spridningsplattor (Figur 2). Positiva isolat bör generera en enda starkt band vid 471 bp med användning av denna primer set (figur 3A). Majoriteten av positiva isolat bär intI1 som har sitt ursprung från människor eller deras jordbruks- och tamdjur. Dessa isolat kommer också att vara positiv i en PCR med hjälp av primers F165 / R476, som ska generera en 311 bp amplikon (Figur 1). Miljökällor intI1 kommer i allmänhet inte att vara positiva i denna andra analys.

Karakterisering av integron kassett arrayer

402 -associated klass 1 integroner kan förstärkas med hjälp av primers HS458 / HS459. Dessa primrar respektive rikta integron rekombinationsställe, och 3'-änden av kassetten arrayen, som normalt slutar i qacEΔ sul1 genfusion (fig 1). Storleken av PCR-produkter som genereras i denna analys varierar beroende på antalet och identiteten av kassetter i arrayen (figur 3B). Miljöklass 1 integroner ofta inbäddade i bakterie kromosomer, och deras kassett arrayer kan förstärkas av primers som riktar sig mot proximala och mest distala rekombinationsställen (Figur 1). Primrar MRG284 / 285 är utformade för att amplifiera denna region, och igen, eftersom kassettinnehållet varierar, storleken på amplikonema varierar också (figur 3C). Sekvensering av HS458 / 459 PCRprodukter kommer normalt åter kända antibiotikaresistens bestämningsfaktorer, medan sekvense MRG284 / 285 PCR-produkter i allmänhet åter genkassetterna som kodar för polypeptider med okänd funktion.

Identifiera bakteriearter

Bakterier identifieras med hjälp av 16S rDNA sekvense och databasjämförelser. Genomiskt DNA användes som en mall för amplifiering av 16S lilla subenheten rRNA-genen. Med användning av de primrar som föreslagits, bör detta generera en amplikon på ca 1450 bp. Eftersom ett stort antal kolonier kan screenas vid ett och samma tillfälle, är en hierarkisk screeningmetod som används. Amplifierade 16S PCR-produktema digererades med restriktionsenzymet Hinf 1, och dessa digereringar separeras på agarosgeler. Enskilda arter kommer att generera tydliga mönster efter sammandrag, så att isolat av samma art kan lätt identifieras (Figur 3D). Sekvensering av 16S rRNA-genen PCR-produkter från ett maximum av treisolat representerar något restriktionsmönster möjliggör effektiv identifiering av alla sannolika arter i en samling av integron positiva isolat.

Figur 1
Figur 1. Struktur av klass 1 integroner. Schematiska diagram av klinisk och miljöklass 1 integroner, visar PCR-primer bindningsställen som avses i manuskriptet. Klass 1 integroner består av en integron-integras-genen (intI1) som katalyserar avskiljning och uttryck för genkassetterna att bilda en kassett array. Före tillkomsten av antibiotikaanvändning, majoriteten av klass 1 integroner var kromosomala och förde genkassetterna vars funktioner ännu inte fastställts. Stark val via antibiotikaanvändning har kraftigt ökat överflöd av en sekvens variant av klass 1 integron i samband med Tn 402 transposon.Dessa "kliniska" integroner har förvärvat uppsättningar av kassetter som kodar antibiotikaresistens. Det är dessa integroner som för närvarande förorenande naturmiljöer och produktionskedjan för livsmedel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Schematisk flödesschema för detektering av klass 1 integroner i livsmedel. Prover av livsmedel används för att ympa media och generera en blandad bakteriekultur. Dessa blandade kulturer screenas för närvaron av klass 1 integroner och positiva kulturer används för att framställa spridda plattorna. Individuella kolonier från spridningsplattorna återscreenades för integroner. Positiva kulturer är renade, DNA extraherat och karaktäriserades för kassettinnehållet genom DNA och för sigquencing. Sekvensering av 16S rRNA genen används för artbestämning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Representant elektro analyser från urvalsförfarandet. (A) Screening enstaka kolonier med hjälp intI1 primers HS463a / 464. Positiva kolonier generera en stark enda band vid 471 bp. (B) Förstärkning av kassett arrayer från Tn 402 integroner använder primers HS458 / 459. Denna PCR genererar variabel produkt ger beroende på identitet och storlek av komponentkassetter i uppsättningen. Identifiering av dessa kassetter kräver DNA-sekvensering. (C) Förstärkning av kassett arrayer från miljöklass 1 integrons med användning av primrarna MRG284 / 285. Denna PCR genererar också variabel produkt ger beroende på identitet och storlek av komponentkassetter i gruppen, men kassetter i är osannolikt att koda antibiotikaresistens miljö matriser. (D) Screening av 16S PCR-produkter genom uppslutning med Hinf 1. Isolat med identiska restriktionsmönster kommer sannolikt att vara samma art. Om ett stort antal en enda begränsning typ återvinns, endast ett fåtal av dessa behöver sekvens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

PCR Gene målet Primer namn Riktning Sekvens 5 '- 3' Cykelbetingelser REFERENCE
HS463a / HS464 Klass 1 Integron HS464 Framåt ACATGCGTGTAAATCATCGTCG 94 ° C 3 min; 35 cykler 94 ° C 30 sek, 60 ° C 30 sek, 72 ° C 1 min 30 sek; 72 ° C 5 min Stokes et al., 2006 28
HS463a Omvänd CTGGATTTCGATCACGGCACG
F27 / r1492 16S rRNA F27 Framåt AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 94 ° C 3 min; 35 cykler 94 ° C 30 sek, 60 ° C 30 sek, 72 ° C 1 min 30 sek; 72 ° C 5 min Lane, 1991 29
r1492 Omvänd TACGGYTACCTTGTTACGACTT
intI1F165 / IntI1R476 Klinisk klass 1 integron inti1F165 Framåt CGAACGAGTGGCGGAGGGTG 94 ° C 3 min; 35 cykler 94 ° C 30 sek, 55 ° C 30 sek, 72 ° C 1 min 30 sek; 72 ° C 5 min Gill 2014 10
intI1R476 Omvänd TACCCGAGAGCTTGGCACCCA
HS549 / HS550 3'CS Klinisk Integron HS549 Framåt ACTAAGCTTGCCCCTTCCGC 94 ° C 3 min; 35 cykler 94 ° C 30 sek, 65 ° C 30 sek, 72 ° C 1 min 30 sek; 72 ° C 5 min Stokes et al., 2006 28
HS550 Omvänd CTAGGCATGATCTAACCCTCGG
HS458 / HS459 Klinisk kassett matris HS458 Framåt GCAAAAAGGCAGCAATTATGAGCC 946; C 3 min; 35 cykler 94 ° C 30 sek, 55 ° C 30 sek, 72 ° C 1 min 30 sek; 72 ° C 5 min Holmes et al., 2003 30
HS459 Omvänd GTTTGATGTTATGGAGCAGCAACG
MRG284 / MRG285 Miljö kassett MRG284 Framåt GTTACGCCGTGGGTCGATG 94 ° C 3 min; 35 cykler 94 ° C 30 sek, 55 ° C 30 sek, 72 ° C 1 min 30 sek; 72 ° C 5 min Gill et al., 2009 21
MRG285 Omvänd CCAGAGCAGCCGTAGAGC

Tabell 1. Primersekvenser och PCR-betingelser som används för att identifiera klass 1 integroner och tillhörande genkassetterna.

Tabell 2. PCR och restriktionsklyvning mastermix beståndsdelar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Identifieringen av integroner och tillhörande genkassetterna är potentiellt ett viktigt steg i att förutsäga uppkomsten av nya opportunistiska patogener, spåra vägar för patogener i livsmedelskedjan, och identifiera nya motstånd och virulensdeterminanter 8,21,26. Syftet med denna uppsats var att beskriva en rationell metod för screening av prover för klass 1 integroner, karakterisera deras kassett matriser och identifiera bakteriearter där de är bosatta. Kritiska steg i protokollet innebär god mikrobiologisk praxis, och förhindra PCR kontaminering som skulle generera falsklarm.

Protokollet som beskrivs här kan lätt ändras för att upptäcka andra kliniskt relevanta integroner, inklusive klass 2 och klass 3 integroner som också återfinns i humana patogener. Det kan också ändras för att upptäcka integroner i mikrobiella samhällen från vatten, biofilmer, jord eller sediment. Det finns några limitatioNS till denna teknik, som härrör från ett beroende av odling av bakterieceller. Många miljö bakterier är inte lätt odlingsbara, och det protokoll som beskrivs här skulle inte upptäcka dessa arter. Utbudet av arter som återvinns kan utökas med hjälp av olika bakterie medier formuleringar och längre inkubationstider. Ändå de flesta arter av intresse för människors hälsa kommer sannolikt att växa under de förhållanden som beskrivs här.

Detta protokoll har vissa fördelar jämfört med tekniker som använder utstrykning på selektiva medier. Inga antaganden behöver göras om identiteten på resistensbestämningsfaktorer som bärs av enskilda isolat, och nya resistensgener kan återvinnas och karakteriseras. I mer allmänna termer, kan arbetsflödet också anpassas för att upptäcka någon del av resistome 27 eller mobilome som kan vara av intresse 4. Sådana analyser är viktiga för att förstå dynamiken hos de olika DNA-element som är inblandade i entibiotic motstånd, och avgörande för att bevara den minskande arsenal av antimikrobiella föreningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget relevant att lämna ut.

Acknowledgments

Tack vare Michaela Hall, Larissa Bispo och Gustavo Tavares för tekniskt bistånd.

Materials

PCR-reagens Volym (^ il) Restriktionsdigere reagens Volym (^ il)
Sterilt vatten 21,5 Sterilt vatten 23
10x GoTaq Vit 25 Buffert B 5
RNasA [1 mg / ml] 0,5 Bovint serumalbumin [1 mg / ml] 1
Framåt primer [50 uM] 0,5 Hinfl [10 enheter / pl] 1
Omvänd primer [50 uM] 0,5
Mastermix volym 48 Mastermix volym 30
DNA-mall 2 PCR-mall 20
Slutliga PCR volym 50 Slutrestriktionsklyvning volym 50
Name Company Catalog Number Comments
GoTaq Colourless Mastermix Promega M7132 Used in all PCRs
RNAse (Ribonuclease A from bovine pancreas) Sigma R6513-10MG Used in all PCRs
HinFI restriction enzyme Promega R6201 Used to digest 16S rDNA PCR poducts. Enzyme comes with optimal buffer and BSA
100 bp ladder GE Healthcare 27400701 Used as a size standard on all agarose gels
GelRed DNA stain Biotium 41003 CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material
Guanidinium thiocyanate Life Technologies AM9422 CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material
CLS-TC Solution MP Biomedicals 6540409 Resuspension solution used at the begining of the genomic DNA extraction
Lysing Matrix E FastPrep tubes MP Biomedicals 116914500 Tube required for mechanical disruption of bacterial cell walls. This code is used for packs of 500 tubes, smaller quantities are available.
Binding matrix MP Biomedicals 116540408 Diluted 1:5 with 6 M guanidinium thiocyanate and used in the genomic DNA extraction method.
Fast Prep machine MP Biomedicals Number of options available MP Biomedicals has a number of FastPrep machines available to purchase. Visit http://www.mpbio.com for more information

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, K., et al. Tackling antibiotic resistance. Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).
  2. Davies, J., Davies, D. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).
  3. Costa, V. M., et al. Antibiotic resistance is ancient. Nature. 477 (7365), 457-461 (2011).
  4. Gillings, M. R. Evolutionary consequences of antibiotic use for the resistome, mobilome and microbial pangenome. Front. Microbiol. 4, 4 (2013).
  5. Gillings, M., et al. The evolution of class 1 integrons and the rise of antibiotic resistance. J. Bacteriol. 190 (14), 5095-5100 (2008).
  6. Brassard, S., Lapointe, J., Roy, P. H. Diversity and relative strength of tandem promoters for the antibiotic-resistance genes of several integrons. Gene. 142 (1), 49-54 (1994).
  7. Partridge, S. R., et al. Definition of the attI1 site of class 1 integrons. Microbiol. 146 (11), 2855-2864 (2000).
  8. Gillings, M. R. Integrons: Past, Present, and Future. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 78 (2), 257-277 (2014).
  9. Partridge, S. R., Tsafnat, G., Coiera, E., Iredell, J. R. Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons. FEMS Microbiol. Rev. 33 (4), 757-784 (2009).
  10. Gillings, M. R., et al. Using the class 1 integron-integrase gene as a proxy for anthropogenic pollution. ISME J. In press, (2014).
  11. Gaze, W. H., et al. Impacts of anthropogenic activity on the ecology of class 1 integrons and integron-associated genes in the environment. ISME J. 5, 1253-1261 (2011).
  12. Gerzova, L., et al. Characterization of microbiota composition and presence of selected antibiotic resistance genes in carriage water of ornamental fish. PLoS ONE. 9, e103865 (2014).
  13. Power, M., Emery, S., Gillings, M. Into the wild: dissemination of antibiotic resistance determinants via a species recovery program. PLoS ONE. 8, e63017 (2013).
  14. Stokes, H. W., Gillings, M. R. Gene flow, mobile genetic elements and the recruitment of antibiotic resistance genes into Gram-negative pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 35 (5), 790-819 (2011).
  15. Moura, A., Oliveira, C., Henriques, I., Smalla, K., Correia, A. Broad diversity of conjugative plasmids in integron-carrying bacteria from wastewater environments. FEMS Microbiol. Lett. 330 (2), 157-164 (2012).
  16. Schlüter, A., Krause, L., Szczepanowski, R., Goesmann, A., Pühler, A. Genetic diversity and composition of a plasmid metagenome from a wastewater treatment plant. J. Biotech. 136 (1-2), 65-76 (2008).
  17. Taylor, N. G. H., Verner-Jeffreys, D. W., Baker-Austin, C. Aquatic systems: maintaining, mixing and mobilising antimicrobial resistance. TREE. 26 (6), 278-284 (2011).
  18. Stalder, T., et al. Quantitative and qualitative impact of hospital effluent on dissemination of the integron pool. ISME J. 8, 768-777 (2014).
  19. Allen, H. K., et al. Call of the wild: antibiotic resistance genes in natural environments. Nature Rev. Microbiol. 8, 251-259 (2010).
  20. Wellington, E. M., et al. The role of the natural environment in the emergence of antibiotic resistance in Gram-negative bacteria. Lancet Infect. Dis. 13 (2), 155-165 (2013).
  21. Gillings, M. R., et al. Mobilization of a Tn402-like class 1 integron with a novel cassette array via flanking miniature inverted-repeat transposable element-like structures. Appl. Env. Microbiol. 75 (18), 6002-6004 (2009).
  22. Graham, D. W., Collignon, P., Davies, J., Larsson, D. J., Snape, J. Underappreciated role of regionally poor water quality on globally increasing antibiotic resistance. Env. Sci. Technol. 48 (20), 11746-11747 (2014).
  23. Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. The antibiotic resistome: what's new. Curr. Opinion Microbiol. 21, 45-50 (2014).
  24. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. 63, e3998-e3998 (2011).
  25. Gillings, M. R. Rapid Extraction of PCR-Competent DNA from Recalcitrant Environmental Samples. Env. Microbiol. 1096, 17-23 (2014).
  26. Sajjad, A., Holley, M. P., Labbate, M., Stokes, H., Gillings, M. R. Preclinical class 1 integron with a complete Tn402-like transposition module. Appl. Env. Microbiol. 77 (1), 335-337 (2011).
  27. Wright, G. D. Antibiotic resistance in the environment: A link to the clinic. Curr. Opinion Microbiol. 13 (5), 589-594 (2010).
  28. Stokes, H., Nesbo, C., Holley, M., Bahl, M., Gillings, M., Boucher, Y. Class 1 integrons predating the association with Tn402.-like transposition genes are present in a sediment microbial community. Journal of Bacteriology. 188, 5722-5730 (2006).
  29. Lane, D. J. Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. , John Wiley &Sons, Inc. 115-175 (1991).
  30. Holmes, A. J., et al. Recombination activity of a distinctive integron-gene cassette system associated with stutzeri. populations in soil. Journal of Bacteriology. 185, 918-928 (2003).

Tags

Miljövetenskap integron överföring lateral gen epidemiologi resistome antibiotikaresistens föroreningar xenogenetic
Screening Livsmedel för klass 1 integroner och genkassetterna
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Waldron, L. S., Gillings, M. R.… More

Waldron, L. S., Gillings, M. R. Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes. J. Vis. Exp. (100), e52889, doi:10.3791/52889 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter