Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Sınıf 1 integronlar ve Gen Kasetleri için gıda maddelerinin taranması

Published: June 19, 2015 doi: 10.3791/52889
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Macquarie University

Introduction

Antibiyotiklerin keşfi 20. yüzyılın en büyük bilimsel başarılarından biri oldu. Ancak, antibiyotik kullanımı ve kötüye antibiyotiğe dirençli bakterilerin hızlı evrim yol açmıştır ve bu artık 21. yüzyılda halk sağlığı için ciddi bir tehdit oluşturmaktadır. En tedavi seçenekleri dirençli bakteri suşlarının yükselişi biz antimikrobiyal ilaçlar artık 1,2 etkili bir döneme giriyoruz olasılığını yükseltir.

Antibiyotik direnci kazandıran genetik makine yıl 3 milyonlarca insanları ve antibiyotik seçimi baskıları predating, antik bir sistemdir. Örneğin plazmidler, transpozonlar, genomik adaları, bütünleştirici konjugatif elemanlar ve İntegronların gibi mobil genetik elementler içinde ve bakteri türlerinin 4 ile, her iki antibiyotik direnç genlerini (ARG) yayabilirler. Bunlardan, integronlar rağmen, ARG yayılmasında önemli bir rol oynamıştırOnlar bakteri genomları 5 içine plazmidler ve seferberlik ve ekleme için transposonların güvenmeye gerçeği. Integron bir integron-integraz kullanılarak gen kasetleri yakalama ve daha sonra kodlanmış bir integron promotör 6,7 (Şekil 1) kullanılarak kasetleri ifade eder. Gen integron kasetleri, ürünleri antibiyotik veya dezenfektanların 8 direnç kazandırabildiği tek bir açık okuma çerçeveleri (ORF) 'den oluşan küçük mobil elemanlardır. Sınıf 1 integronlar en yaygın toplu olarak 130 farklı antibiyotik direnç geni kasetleri üzerinden 9 edindikleri klinik izolat 5, kurtarıldı integronlar vardır.

İnsan ilişkili ortakçı ve patojenik bakterilerin içine Sınıf 1 İntegronların yayılması bu genetik elementlerin 10 büyük sayı içeren insan atık akımlarını oluşturur. Sınıf 1 integronlar içerirler tahmini 10 19 bakteri kanalizasyon çamuru her yıl i yoluyla yayımlanann Birleşik Krallık 11. Bu antibiyotik dirençleri veren 1. sınıf integronlar artık yabani kuşlar, balıklar ve diğer yerli yaban hayatı 12-14 Mikrobiyota tespit ediliyor, bu nedenle şaşırtıcı değildir. Yeni gen kasetleri ve diğer mobil unsurları ile karmaşık düzenlenmeleri kazanılması, özellikle kanalizasyon arıtma tesisleri ve diğer su kütleleri 15-18 yılında, oluşmaya devam beri geri çevreye integronlar Salıcı, önemli bir halk sağlığı tehdit oluşturuyor. doğal çevre ardından yeni direniş belirleyicileri ve fırsatçı patojenler 19,20 için verimli bir işe zemin haline gelir. Roman integron içeren bakteri ve yeni argüman kontamine su ve gıdalarla 21,22 yoluyla insan toplum içine geri daire. Çevre args gözetim anlayışı ve gelecek 23 yılında antibiyotik direnci yönetmek için temel bir stratejidir. Özellikle dikkat çiğ yenen veya olduğu gıda maddelerine dikkat edilmelidirBu yeni mobil elemanlar ve patojenlerin bulaşma için en büyük tehdit teşkil beri hafifçe pişirilir.

Bu protokol, 1 integron ve gıda maddelerinde, ilişkili gen kasetleri, saptanması, tanımlanması ve sınıfı karakterize etmek için düzenlenmiş bir yaklaşımda, (Şekil 2) tarif edilmektedir. Kültürleme ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) bir arada kullanarak, integronlar hızla karmaşık bakteri toplulukları ve bireysel izolatların tespit edilebilir. Bakteri ve integron-ilişkili gen kasetlerinin uyum ve kimlik türlerin belirlenmesi için yöntemler verilmiştir. yöntem, bitki ve hayvan gıdaların geniş bir aralığı için uygundur, ve tipik iş akışları örnekleri bu gıda türlerinin her biri için verilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Çiğ veya hafifçe pişirilir Gıda insan sağlığı için en endişe vardır. Örnekler salata sebze, meyve, kabuklu deniz ürünleri ve kabuklular yer alıyor.

1. Örnek Toplama

  1. Kontaminasyonu en aza indirmek koşullarda örnekleri toplamak ve taşıma sırasında ayrı, temiz torbalar içinde saklanan. Toplanan sonra, numuneler 4 ° C'de saklandı ve 24 saat içinde işleme tabi tutulmalıdır.

2. Zenginleştirilmiş Kültür Hazırlık

  1. Meyve ve sebzeler:
    1. Dayanıklı bir plastik torba içinde malzemenin, yaklaşık 10 g yerleştirin. Daha büyük malzeme işleme durumunda, meyve veya sebze cilt üzerinde yoğunlaşırlar. 30 sn için bir kanatlı karıştırıcı içinde 90 ml 0.1 M sodyum fosfat tamponu, pH 7.0 ve işlem ekleyin. Bir kanatlı karıştırıcı mevcut değildir Alternatif olarak, malzemenin elle çalkalanır edilebilir.
    2. Iki adet 50 ml Falcon tüpler içine sıvı toplayın. Pelet bakteri 7 dakika boyunca 4.000 xg'de santrifüj tüplerine. Dikkatle steril Luria Bertani (LB) suyu 30 ml pelet bakteri süpernatant kaldırmak ve askıya.
    3. 37 ° C sıcaklıkta başka 25 ° C de bir tüp tutarak ve bir çalkalayıcı O / N üzerinde inkübe edin. Kültürler dakikada 200 salınım (OPM) de çalkalanmalıdır. 4 ° C'de saklayın kültürleri kadar gerekli.
  2. Deniz ürünleri:
    1. Steril forseps ve cımbız kullanarak mide (istiridye) ya da sindirim sistemi (karides) inceleyin ve 0.1 M sodyum fosfat tamponu, pH 7.0 200 ul içeren steril 1.5 ml tüp içine yerleştirin. Bir Homojenat oluşturmak için örnek ıslatarak yumuşatmak.
    2. Iki steril 5 ml tüpler içine LB suyu 5 ml koyun ve deniz homojenatı ile zerk.
    3. 25 ° C'de ve diğer 37 ° C'de bir tüp tutarak, bir çalkalayıcı, O / N üzerinde inkübe edin. Kültürler 200 orijinale de çalkalanmalıdır. 4 ° C'de saklayın kültürleri kadar gerekli.

Integron 3. Tarama Kültürleri

MgCI2 konsantrasyonu. Gerekirse, Lorenz (2011) 24, bu derginin bir önceki sayısında PCR optimizasyon ve sorun giderme yöntemleri sıraladı.

  1. Haşlanmış DNA hazırlığı:
    1. Steril 0.5ml PCR tüpüne zenginleştirilmiş kültür, 100 ul koyun. Bir su banyosu ya da ısıtma bloğu kullanılarak, 10 dakika boyunca 99 ° C'ye kadar örnek ısıtın. 2 dakika boyunca buzda çekin.
    2. 5 dakika için 14,000 x g'de Mikrosantrifüj hücre yıkıntıları pelet haline getirildi. Buz dönün. DNA örnekleri gerekene kadar -20 ° C'de dondurulur, ancak buz üzerinde eritildi olmalıdır.
  2. PCR kullanılarak 1. sınıf İntegronların için tarama:
    Not: O / N inkübasyon Karışık kültürler HS463a / HS464 PCR protokolü (Tablo 1) kullanarak Sınıf 1 İntegronların için taranır.
    1. Olası sou uzakta, buz üzerinde tüm PCR reaktifler çözülmeDNA kontamine rces. Negatif kontrol (Tablo 2) de dahil olmak üzere, örnek başına 48 | il PCR MasterMix hazırlayın. Bariyer ipuçlarını kullanarak, her tüpe PCR master karışımı 48 ul koyun.
    2. Bariyer ipuçlarını kullanarak bireysel PCR tüplerine çözülmüş DNA 2 ul ekleyin. PCR PCR uygun programını çalıştırın.
    3. Amplifikasyon sonuçlarını değerlendirmek için, dökülmüş ve TBE tamponu (90 mM tris-borat, 2 mM EDTA) içinde işletilen bir% 2 agaroz jeli üzerinde PCR ürünün 7 ul Electrophorese. Bir 100 bp merdiven gibi bir molekül ağırlığı işaretleyici, içerir.
    4. Mesaj DNA leke jel leke ve UV transilluminator kullanarak görselleştirmek. Negatif kontrolde hiçbir amplifikasyon olmamıştır olmadığını kontrol edin. Herhangi bir numune için yaklaşık 470 bp de güçlü bir bant karışık kültür sınıf 1 integron taşıyan bakteri içerdiğini gösterir. Saf koloniler artık pozitif PCR iade edilen karma kültüründen izole edilecektir.

  1. Seri dilüsyonları ve yayılma plakaları:
    Not: PCR-Pozitif karışık kültürlerden tek koloniler izole etmek için, karışık kültür seri sodyum fosfat tamponu içinde 10-kat seyreltilmiştir, ve daha sonra tek koloniler kurtarmak için kaplanır.
    1. 0.1 M sodyum fosfat tampon maddesi, pH 7.0, 9 ml karışık kültür 1 ml ilave edilir ve ters çevirme ile karıştırın. 10 -8 bir seri dilüsyona kadar fosfat tampon maddesi bir başka 9 ml seyreltme 1 ml ilave edilir ve tekrar ulaşılır.
    2. Nüsha halinde, LB agara 10 -4 -8 10 dilüsyonlarının 100 ul yayıldı. Ilk karma kültürü için kullanılan aynı sıcaklıkta plakaları O / N inkübe edin. Plakalar daha sonra bununla birlikte oldukça derhal tek koloniler işlemek için en iyi, gerekli olana değin 4 ° C'de saklanabilir.
  2. Tek bir koloni seçimi ve kaynatıldı DNA hazırlığı:
    1. Se seri seyreltme plakaları, gelen tek koloniler seçinBöyle bir koloni, boyut, şekil ve renk gibi kriterler kullanılarak, mümkün olduğunca çok sayıda farklı koloni türleri çildiğinde. Yayılmış plaka tek koloniler seçmek için steril kürdan kullanın.
    2. Koloni kürdan dokunun ve sonra steril su 100 ul içeren bir PCR tüpüne aktarın. Kolonilerin çok sayıda taranması için ise, daha sonra koloniler, bir mikrotitre tepsi hazırlanabilir. Suya bazı hücreler çıkarmak için parmaklar arasında kürdan Spin.
    3. Aynı kürdan kullanarak, koloninin bir çizgi ile bir LB plaka aşılamak. Her bir çizgi yaklaşık 1 cm uzunluğunda olduğunda koloniler çok sayıda etiketli plakaları üzerinde saklanabilir. Eğer izolatların uygun sayıda seçilmiş kadar 1 3 arası adımları tekrarlayın.
    4. Başlangıç ​​zenginleştirilmiş kültür için kullanılan ile aynı sıcaklıkta, LB plakaları O / N inkübe edin. Gerekene kadar Kültürler daha sonra 4 ° C de muhafaza edilebilir.
    5. Bakteriyel süspansiyonlar DNA hazırlamak için, ou adımları izleyinBölüm 3.1'de tlined. Bölüm 3.2 de tarif edilen saf kültür lizatlarının tarama için, HS463a / HS464 PCR işlemi gerçekleştirmek. Bu olumlu bir PCR genomik DNA (bölüm 5) bileşiğinin hazırlanması için kullanılan ve ayrıca analiz için olan geri izole eder.

Boncuk 25 Dayak Kullanılması 5. Genomik DNA Ekstraksiyon integron pozitif Tek Kolonileri

  1. Bölüm 4.2'de izole saf kültürünün bir numunesi ile LB suyu 5 ml inoküle. Başlangıç ​​zenginleştirilmiş kültür için kullanılan aynı sıcaklıkta çalkalanarak, O / N inkübe edin.
  2. Pelet hücreleri 7 dakika boyunca 4.000 xg'de sonra süpernatant kaldırmak. Bir Parçalama Matrix E hızlı hazırlık tüp içinde 1 ml CLS-TC çözeltisi içinde pelet hücreleri tekrar süspansiyon. Bir kordon çırpma makinesi kullanılarak, 30 saniye süre ile 5.5 m / sn örnek işlem.
  3. Santrifüj 5 dakika için 14,000 x g'de boru ve steril bir 1.5 ml tüp içine süpernatant 700 ul iyileşir.
  4. 6 M Guan ile 5: 1 oranında sulandırılmış bağlayıcı matrisin 700 ul ekleidinium tiyosiyanat ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırılır. 1 dakika, ıskarta süpernatant 14,000 xg'de Santrifüj.
  5. Topak yeniden süspansiyon haline getirildi, tam kadar 800 ul bir tuzu etanol yıkaması (% 70 etanol, 0.1 M sodyum asetat) ve vorteks ekleyin. 1 dakika için 14,000 x g'de oda sıcaklığında 5 dakika santrifüj için yıkayın ve süpernatant atılır. Ve daha sonra 5 dakika boyunca kurumaya bırakın gerektiğinde bir mikropipet kullanılarak, üstte kalan maddenin hepsi kaldırıldı emin olun.
  6. Yukarı ve aşağı pipetleme 200 ul TE (10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH 7.6) 'de pelet matrisi süspanse edin. 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. 3 dakika ve steril bir tüpe transferi elüt DNA 160 ul 14,000 x g'de santrifüjleyin. DNA ekstraksiyonu verimini ve bütünlüğünü kontrol etmek için bir% 2 w / v agaroz jeli üzerinde genomik DNA izolasyonu bir kısım çalıştırın. Saflaştırılmış genomik DNA, -20 ° C'de saklandı ve PCR testleri için gerekli olduğunda buz üzerinde buzu çözülür.

6. Tanı PCR'ler ve DNA Dizi

NOT:5. bölümünde hazırlanan genomik DNA, tüm tanı PCR'ler için kullanılacak, ve sınıf 1 İntegronların için pozitif test teyit etmek için.

  1. Kısaca 20 saniye boyunca 14.000 xg'de DNA örneği ve nabız sıkma vorteks, buz üzerinde genomik DNA çözülme. Izolat 471 bp amplikon (Kısım 3.2) için olumlu olduğunu teyit HS463a / HS464 (Tablo 1) kullanarak sınıf 1 integron-entegraz geni için PCR tekrarlayın.
  2. Tür düzeyinde pozitif kültür tanımlanması küçük alt-ünite rRNA geninin (16S rDNA) analizi ile elde edilmektedir. Primerleri F27 'yi / r1492 (Tablo 1) kullanarak 16S geni yükseltin. Elektroforezi kullanılarak PCR ürünleri kontrol edin. Tüm bakteriyel hedef yaklaşık 1450 bp'lik bir 16S amplikon oluştursun.
  3. Sıra 16S rRNA gen amplikon tür kimliğini belirlemek için, aynı bakteri türü olacak adım 6.2 birden fazla pozitif PCRlar olması muhtemeldir ve bu pozitiflerin çoktur çünkü, biz ilk istimal farklı türler ayırt edecek16S PCR ürününün g restriksiyon sindirimi.
    1. Restriksiyon enzimi Hinf 1 ile 16S PCR bir kısım Digest. Herhangi bir 4 bp bölünme siteleri yapacak tanır enzim, ancak Hinf 1 16S hedeflerden iyi çeşitliliği oluşturur ve güvenilir, ucuz bir enzimdir.
  4. 30 ul bir kısıtlama steril bir tüpe, master (Tablo 2) sindirimi ve BM-purfied 16S PCR ürününün 20 ul ekle ayarlayın. 37 ° C su banyosu O / N inkübe edin. % 2 agaroz jeli üzerinde özet edin.
  5. Hinf 1 tarafından üretilen sindirim desenleri Puan. Aynı 16S kısıtlama profili ile İzolatlarının aynı tür olması muhtemeldir. Aksine, her Hinf 1 sınırlandırma modeli çoğu üç temsilci her 16S PCR ürünü, diziyi sıralanmasıyla daha.
  6. Bir ticari kit kullanılarak 16S PCR ürünleri arındırın. Tek şeritli ekzonükleaz kiti kullanılabilir, ancak sütun bazlı veya çöktürme yöntemleri de uninc kaldırmak için iyi işorporated primerleri ve tek şeritli DNAlar. Dizi, astar R910 (Tablo 1) kullanarak sıralama tesisi tarafından belirtilen reaksiyonlar kurma 16S amplikonlarının.
  7. Blastn fonksiyonu ile (NCBI DNA veritabanı sorgulamak için elde edilen DNA dizisini kullanın http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ). Büyüktür% 97 nükleotid kimliği genellikle türler kimlik olarak alınır.

7. Haritalama ve integronlar ve Kaset Diziler Karakterizasyonu

NOT: İnsan-egemen ekosistemlerin kaynaklanan Sınıf 1 integronlar tüm örneklerinde en sık integronlar olması muhtemeldir. Bu integron Tüm yapılan tek bir kökene sahip ve bu nedenle yüksek oranda korunmuş bir DNA sekansı 5 sahiptir.

  1. Bir sınıf olarak 1, insan kaynaklarından yayılan integron ve performans ile çevre numuneleri içinde doğal olarak o ayırtAstar ile PCR intI1F165 / intI1R476 10 (Tablo 1) ayarlayın.
    NOT: Çevresel sınıfı 1 integronlar herhangi bir ürün üretmek olmaz ise klinik veya ortakçı bakterilerden Sınıf 1 integronlar bir ~ 300 bp ürünü üretecektir.
  2. Primer seti HS458 / HS459 ile kaset dizisi yükselterek klinik integronlar karakterize. Bu PCR çoğu kaset dizilerin ucundaki intI1 ve 3 'korunmuş segmentinde arasındaki bölgeyi yükseltmek olacaktır. Kasetlerin numarası ve kimlik değişken olduğu için, PCR ürününün boyutu da değişir.
  3. Amplikonları arındırmak ve amplifikasyon primerlerinin her biri kullanılarak DNA sekansı. Blastn işlevini (kullanılarak DNA veritabanlarını sorgulamak için dizileri kullanın http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ).
  4. Integron gen kasetinin için birçok veri yeminli beri, standart isimlendirme 9 izleyin kaset adlandırma oluns tutarsız veya belirsiz adları kullanabilirsiniz. Bu geçirgenlik, patojenitesini veya virülans 8,21 artış kazandıran genler de dahil olmak üzere, yeni fenotipleri kodlayabilmektedir beri yeni gen kasetleri özellikle dikkat verin.
    NOT: Sınıf 1 integron preklinik formları hala doğal ortamlarında dolaşır. Özel olarak, aktif Tn 402 transpozonlar bağlantılı olanlar en çok ilgi 26 arasında bulunmaktadır. Bu İntegronların kaseti dizileri primer seti HS458 / HS459 ile amplifiye değil, ancak kaset içeriğine bağlı olarak farklı boyutlarda amplıkonları üreten MRG284 / MRG285 primer kümesi (Tablo 1) ile amplifiye edilebilir. PCR ürünleri saflaştınldı ve 7.2 de tarif edilen bir DNA dizisi gerekmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Karışık kültürler ve intI1 bakteriyel izolatlar taranması

Primer seti HS463a / HS464 PCR sınıfı 1 integron-integraz geninin intI1 (Şekil 1) varlığını tespit etmek için kullanılabilir. Bu primer kümesi karışık kültürlerinde intI1 saptanması için çalışır, ve ayrıca dağılma plakalarından (Şekil 2) hasat bakteri kolonileri taranması için kullanılır. Pozitif izolatlar bu primer seti (Şekil 3A) kullanılarak 471 bp tek bir güçlü bant oluşturmanız gerekir. pozitif izolatların çoğunluğu insan veya tarımsal ve evcil hayvanların kaynaklanan etti intI1 taşıyacak. Bu izolatlar da 311 bp amplikon (Şekil 1) oluşturması gerektiğini PCR kullanarak primerleri F165 / R476, olumlu olacaktır. IntI1 çevresel kaynakları, genellikle bu ikinci deneyde pozitif olmayacaktır.

Integron kaseti dizileri karakterizasyonu

402 enzimi yüksek yoğunluklu lipoproteinlerde sınıfının kaseti dizileri, 1 integron primerleri HS458 / HS459 kullanılarak amplifiye edilebilir. Bu primerler, sırasıyla, integron rekombinasyon sitesi, hedef ve normal qacEΔ sul1 gen füzyonu (Şekil 1) 'de sona erer kaseti dizinin 3' ucu. Bu tahlilde elde edilen PCR ürünlerinin boyutunu dizisi (Şekil 3B) sayısı ve kasetler kimliğine göre değişir. Çevre sınıfı 1 integronlar genellikle bakteriyel kromozom gömülür ve onların kaset diziler proksimal ve en distal rekombinasyon siteleri (Şekil 1) hedefleyen primerler ile amplifiye edilebilir. Astarlar MRG284 / 285 kaset içeriği değişir, çünkü amplikonların boyutu da değişir, yine bu bölgeyi yükseltmek için tasarlanmıştır ve (Şekil 3C). HS458 / 459 PCR sekanslanmasısıralama MRG284 / 285 PCR ürünleri genellikle bilinmeyen fonksiyonu polipeptidleri kodlayan gen kasetleri geri olurken ürünler normalde bilinen antibiyotik direnç belirleyicilerini kurtaracaktır.

Bakteriyel türler belirlenmesi

Bakteriler 16S rDNA sekanslama ve veritabanı karşılaştırmaları kullanılarak tanımlanır. Genomik DNA, 16S küçük alt rRNA gen amplifikasyonu için bir şablon olarak kullanılır. Primerler önerilen kullanarak, bu yaklaşık 1450 bp bir amplikon oluşturmak gerekir. Kolonilerin çok sayıda herhangi bir anda taranabilir olabileceğinden, hiyerarşik bir tarama metodu kullanılır. Amplifiye 16S PCR ürünleri kısıtlama enzimi Hinf 1 ile sindirilir ve bu sindirimleri agaroz jelleri üzerinde ayrılırlar. Tek tek türlerin aynı türün izolatı kolayca tespit edilebilir şekilde dijest sonra belirgin desenler, (Şekil 3D) oluşturur. En fazla üç 16S rRNA gen PCR ürünleri sequencingherhangi biri kısıtlama deseni temsil integron pozitif izolatların koleksiyonu tüm olası türlerin etkin belirlenmesini sağlar ayırır.

Şekil 1
Şekil sınıfı 1 İntegronların 1. Yapı. Bağlanma yerleri PCR primer gösteren klinik ve çevresel sınıfı 1 İntegronların şematik diyagramlar, el yazması anılacaktır. Sınıf 1 integron kaset dizisi oluşturmak için yakalama ve gen kasetleri ekspresyonunu katalize eden bir integron-integraz geni (intI1) oluşur. Antibiyotik kullanımı gelişiyle önce, sınıf 1 İntegronların çoğunluğu kromozomal vardı ve kimin fonksiyonları henüz tespit edilecek gen kasetlerini taşıdı. Antibiyotik kullanımı ile güçlü bir seçim büyük ölçüde Tn 402 transposon ile ilişkili sınıf 1 integron bir dizi varyantının bereket artmıştır.Bunlar 'klinik' integronlar antibiyotik direncini kodlayan Kasetlerin dizileri edindik. Şu anda doğal ortamları ve gıda üretim zinciri kirleten olan bu integronlar olduğunu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Gıda maddelerinde Sınıf 1 integronlar tespiti için 2. şematik akış şeması Şekil. Gıda maddelerinin numuneleri medyayı aşılamak ve karışık bakteri kültürü oluşturmak için kullanılır. Bu karışık kültürler 1. sınıf İntegronların varlığı için taranır ve pozitif kültürler yayılmış plakaları hazırlamak için kullanılan. Yayılmış plakalardan Bireysel koloniler İntegronların için tekrar elenebilir edilir. Pozitif kültürleri ekstre edilmiş ve DNA se kaset içeriğinden, özelliği, saflaştırılmış DNA'yıquencing. 16S rRNA geninin Sıralama türü tespiti için kullanılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. Temsilcisi elektroforetik tarama sürecinin analizleri. (A) intI1 HS463a / 464 primerleri kullanılarak tek koloniler tarama. Pozitif koloniler 471 bp güçlü bir tek bant oluşturur. Primerler HS458 / 459 kullanarak Tn 402 İntegronların gelen kaset dizileri (B) Amplifikasyon. Bu PCR değişken ürün dizisindeki bileşen kaset kimlik ve büyüklüğüne bağlıdır boyutları üretir. Bu kaset Kimlik DNA dizi gerektirir. (C) sınıfı çevre 1 i gelen kaset dizilerin amplifikasyonuprimerler MRG284 / 285 kullanarak ntegrons. Bu PCR, aynı zamanda, değişken ürünün kimliği ve bir dizi bileşen kasetleri büyüklüğüne bağlıdır boyutları oluşturur çevre diziler antibiyotik direnci kodlayan olası değildir Bununla birlikte kasetleri. (D) Hinf 1 ile sindirilerek 16S PCR ürünlerinin taranması. Aynı kısıtlama desenleri aynı tür olması muhtemeldir ile ayırır. Tek kısıtlama Çeşidi çok sayıda kurtarıldı ise, bunlardan sadece birkaç dizilenebilmektedir gerekir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

PCR Gen hedef Astar isim Yön Sıra 5 '- 3' Döngü koşulları Reference
HS463a / HS464 Sınıf 1 integron HS464 Ileri ACATGCGTGTAAATCATCGTCG 94 ° C 3 dk; 35 döngü 94 ° C 30 sn, 60 ° C 30 sn, 72 ° C 1 dk 30 sn; 72 ° C'de 5 dakika Stokes ve diğ., 2006 28
HS463a Ters CTGGATTTCGATCACGGCACG
F27 / r1492 16S rRNA F27 Ileri AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 94 ° C 3 dk; 35 döngü 94 ° C 30 sn, 60 ° C 30 sn, 72 ° C 1 dk 30 sn; 72 ° C'de 5 dakika Lane, 1991 29
r1492 Ters TACGGYTACCTTGTTACGACTT
intI1F165 / IntI1R476 Klinik sınıfı 1 integron Inti1F165 Ileri CGAACGAGTGGCGGAGGGTG 94 ° C 3 dk; 35 döngü 94 ° C 30 sn, 55 ° C 30 sn, 72 ° C 1 dk 30 sn; 72 ° C'de 5 dakika Gillings 2014 10
intI1R476 Ters TACCCGAGAGCTTGGCACCCA
HS549 / HS550 3'CS Klinik integron HS549 Ileri ACTAAGCTTGCCCCTTCCGC 94 ° C 3 dk; 35 döngü 94 ° C 30 sn, 65 ° C 30 sn, 72 ° C 1 dk 30 sn; 72 ° C'de 5 dakika Stokes ve diğ., 2006 28
HS550 Ters CTAGGCATGATCTAACCCTCGG
HS458 / HS459 Klinik kaset dizisi HS458 Ileri GCAAAAAGGCAGCAATTATGAGCC 946 C 3 dakika; 35 döngü 94 ° C 30 sn, 55 ° C 30 sn, 72 ° C 1 dk 30 sn; 72 ° C'de 5 dakika Holmes et al., 2003 30
HS459 Ters GTTTGATGTTATGGAGCAGCAACG
MRG284 / MRG285 Çevre kaset MRG284 Ileri GTTACGCCGTGGGTCGATG 94 ° C 3 dk; 35 döngü 94 ° C 30 sn, 55 ° C 30 sn, 72 ° C 1 dk 30 sn; 72 ° C'de 5 dakika Gillings ve diğ., 2009 21
MRG285 Ters CCAGAGCAGCCGTAGAGC

Sınıf 1 integron ve bunların ilişkili gen kasetleri belirlenmesi için kullanılan Tablo 1. Primer dizileri ve PCR koşulları.

Tablo 2. PCR ve sınırlama MASTERMIX bileşenlerini sindirmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

İntegronların ve bunların ilişkili gen kasetlerinin tanımlanması potansiyel, yeni fırsatçı patojenlerin ortaya çıkması tahmin insan besin zincirine patojenler için yollar izleme ve yeni direnç belirlenmesinde önemli bir adımdır ve virülans 8,21,26 determinantlar. Bu yazının amacı, sınıf 1 İntegronların için örnek tarama onların kaset dizileri karakterize ve ikamet ettikleri bakteri türlerinin belirlenmesi için bir aerodinamik yaklaşım tanımlamak için oldu. Protokolde Kritik adımlar iyi mikrobiyolojik uygulama içeren ve PCR kontaminasyonu engelleyerek yanlış pozitif üretmek söyledi.

Burada açıklanan protokol da kolayca insan patojenleri bulunan sınıf 2 ve sınıf 3 İntegronların de dahil olmak üzere, diğer klinik olarak integron tespit etmek için modifiye edilebilir. Ayrıca, su, biyofilm, toprak ya da tortu mikrobiyal topluluklarda integron tespit etmek için modifiye edilebilir. Bazı limitatio varBakteriyel hücrelerin kültürlenmesi bir dayanarak meydana bu teknik, NS. Birçok çevresel bakteriler kolayca kültürlenebilir değildir ve burada açıklanan protokol bu türlerin tespit olmaz. geri kazanılan türlerin alanı, farklı bakteriyel ortam formülasyonları ve uzun inkübasyon süreleri kullanılarak genişletilebilir. Bununla birlikte, insan sağlığı için ilgi türlerinin çoğunluğu burada tarif edilen koşullar altında büyümek için olasıdır.

Bu protokol seçici ortama kaplama kullanır teknikleri üzerinde bazı avantajlara sahiptir. Resim varsayımlar geri kazanıldı ve özelliği, tek tek izolattan ve yeni direnç genleri tarafından taşınan direnç belirleyici kimliği hakkında yapılan gerekir. Daha genel olarak, iş akışı, aynı zamanda ilgi 4 olabilir resistome 27 veya mobilome herhangi bir unsur tespit etmek için adapte edilebilir. Bu gibi deneyler, bir yer alan çeşitli DNA elemanlarının dinamiklerini anlamak için önemlidirtibiotic direnci ve antimikrobiyal bileşiklerin azalan cephanelik korunması için kritik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa ilgili hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Michaela Hall, Larissa Bispo ve Teknik Yardım Gustavo Tavares teşekkürler.

Materials

PCR reaktifleri Hacim (ul) Kısıtlama özet reaktifleri Hacim (ul)
Steril su 21.5 Steril su 23
10x GoTaq Beyaz 25 Tampon B 5
RnazA [1 mg / ml] 0.5 Sığır Serumu Albümini [1 mg / ml] 1
İleri Astar [50 uM] 0.5 HinfI [10 birim / ul] 1
Astar Ters [50 uM] 0.5
Mastermix hacmi 48 Mastermix hacmi 30
DNA şablonu 2 PCR şablonu 20
Final PCR hacmi 50 Final kısıtlama sindirmek hacmi 50
Name Company Catalog Number Comments
GoTaq Colourless Mastermix Promega M7132 Used in all PCRs
RNAse (Ribonuclease A from bovine pancreas) Sigma R6513-10MG Used in all PCRs
HinFI restriction enzyme Promega R6201 Used to digest 16S rDNA PCR poducts. Enzyme comes with optimal buffer and BSA
100 bp ladder GE Healthcare 27400701 Used as a size standard on all agarose gels
GelRed DNA stain Biotium 41003 CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material
Guanidinium thiocyanate Life Technologies AM9422 CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material
CLS-TC Solution MP Biomedicals 6540409 Resuspension solution used at the begining of the genomic DNA extraction
Lysing Matrix E FastPrep tubes MP Biomedicals 116914500 Tube required for mechanical disruption of bacterial cell walls. This code is used for packs of 500 tubes, smaller quantities are available.
Binding matrix MP Biomedicals 116540408 Diluted 1:5 with 6 M guanidinium thiocyanate and used in the genomic DNA extraction method.
Fast Prep machine MP Biomedicals Number of options available MP Biomedicals has a number of FastPrep machines available to purchase. Visit http://www.mpbio.com for more information

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, K., et al. Tackling antibiotic resistance. Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).
  2. Davies, J., Davies, D. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).
  3. Costa, V. M., et al. Antibiotic resistance is ancient. Nature. 477 (7365), 457-461 (2011).
  4. Gillings, M. R. Evolutionary consequences of antibiotic use for the resistome, mobilome and microbial pangenome. Front. Microbiol. 4, 4 (2013).
  5. Gillings, M., et al. The evolution of class 1 integrons and the rise of antibiotic resistance. J. Bacteriol. 190 (14), 5095-5100 (2008).
  6. Brassard, S., Lapointe, J., Roy, P. H. Diversity and relative strength of tandem promoters for the antibiotic-resistance genes of several integrons. Gene. 142 (1), 49-54 (1994).
  7. Partridge, S. R., et al. Definition of the attI1 site of class 1 integrons. Microbiol. 146 (11), 2855-2864 (2000).
  8. Gillings, M. R. Integrons: Past, Present, and Future. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 78 (2), 257-277 (2014).
  9. Partridge, S. R., Tsafnat, G., Coiera, E., Iredell, J. R. Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons. FEMS Microbiol. Rev. 33 (4), 757-784 (2009).
  10. Gillings, M. R., et al. Using the class 1 integron-integrase gene as a proxy for anthropogenic pollution. ISME J. In press, (2014).
  11. Gaze, W. H., et al. Impacts of anthropogenic activity on the ecology of class 1 integrons and integron-associated genes in the environment. ISME J. 5, 1253-1261 (2011).
  12. Gerzova, L., et al. Characterization of microbiota composition and presence of selected antibiotic resistance genes in carriage water of ornamental fish. PLoS ONE. 9, e103865 (2014).
  13. Power, M., Emery, S., Gillings, M. Into the wild: dissemination of antibiotic resistance determinants via a species recovery program. PLoS ONE. 8, e63017 (2013).
  14. Stokes, H. W., Gillings, M. R. Gene flow, mobile genetic elements and the recruitment of antibiotic resistance genes into Gram-negative pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 35 (5), 790-819 (2011).
  15. Moura, A., Oliveira, C., Henriques, I., Smalla, K., Correia, A. Broad diversity of conjugative plasmids in integron-carrying bacteria from wastewater environments. FEMS Microbiol. Lett. 330 (2), 157-164 (2012).
  16. Schlüter, A., Krause, L., Szczepanowski, R., Goesmann, A., Pühler, A. Genetic diversity and composition of a plasmid metagenome from a wastewater treatment plant. J. Biotech. 136 (1-2), 65-76 (2008).
  17. Taylor, N. G. H., Verner-Jeffreys, D. W., Baker-Austin, C. Aquatic systems: maintaining, mixing and mobilising antimicrobial resistance. TREE. 26 (6), 278-284 (2011).
  18. Stalder, T., et al. Quantitative and qualitative impact of hospital effluent on dissemination of the integron pool. ISME J. 8, 768-777 (2014).
  19. Allen, H. K., et al. Call of the wild: antibiotic resistance genes in natural environments. Nature Rev. Microbiol. 8, 251-259 (2010).
  20. Wellington, E. M., et al. The role of the natural environment in the emergence of antibiotic resistance in Gram-negative bacteria. Lancet Infect. Dis. 13 (2), 155-165 (2013).
  21. Gillings, M. R., et al. Mobilization of a Tn402-like class 1 integron with a novel cassette array via flanking miniature inverted-repeat transposable element-like structures. Appl. Env. Microbiol. 75 (18), 6002-6004 (2009).
  22. Graham, D. W., Collignon, P., Davies, J., Larsson, D. J., Snape, J. Underappreciated role of regionally poor water quality on globally increasing antibiotic resistance. Env. Sci. Technol. 48 (20), 11746-11747 (2014).
  23. Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. The antibiotic resistome: what's new. Curr. Opinion Microbiol. 21, 45-50 (2014).
  24. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. 63, e3998-e3998 (2011).
  25. Gillings, M. R. Rapid Extraction of PCR-Competent DNA from Recalcitrant Environmental Samples. Env. Microbiol. 1096, 17-23 (2014).
  26. Sajjad, A., Holley, M. P., Labbate, M., Stokes, H., Gillings, M. R. Preclinical class 1 integron with a complete Tn402-like transposition module. Appl. Env. Microbiol. 77 (1), 335-337 (2011).
  27. Wright, G. D. Antibiotic resistance in the environment: A link to the clinic. Curr. Opinion Microbiol. 13 (5), 589-594 (2010).
  28. Stokes, H., Nesbo, C., Holley, M., Bahl, M., Gillings, M., Boucher, Y. Class 1 integrons predating the association with Tn402.-like transposition genes are present in a sediment microbial community. Journal of Bacteriology. 188, 5722-5730 (2006).
  29. Lane, D. J. Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. , John Wiley &Sons, Inc. 115-175 (1991).
  30. Holmes, A. J., et al. Recombination activity of a distinctive integron-gene cassette system associated with stutzeri. populations in soil. Journal of Bacteriology. 185, 918-928 (2003).

Tags

Çevre Bilimleri xenogenetic Sayı 100 integron yanal gen transferi epidemiyoloji resistome antibiyotik direnci kirlilik,
Sınıf 1 integronlar ve Gen Kasetleri için gıda maddelerinin taranması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Waldron, L. S., Gillings, M. R.… More

Waldron, L. S., Gillings, M. R. Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes. J. Vis. Exp. (100), e52889, doi:10.3791/52889 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter