Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Screening Levnedsmidler for klasse 1 Integrons og genkassetter

Published: June 19, 2015 doi: 10.3791/52889
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Macquarie University

Introduction

Opdagelsen af antibiotika var en af de største videnskabelige resultater af det 20. århundrede. Imidlertid har brug og misbrug af antibiotika ført til den hurtige udvikling af antibiotikaresistente bakterier, og disse nu udgør en alvorlig trussel mod folkesundheden i det 21. århundrede. Fremkomsten af bakteriestammer er resistente over for de fleste behandlingsmuligheder rejser muligheden vi er på vej ind i en æra, hvor antimikrobielle stoffer ikke længere effektive 1,2.

Den genetiske maskineri, som giver antibiotikaresistens er et gammelt system forud mennesker og antibiotikaselektion pres af millioner af år 3. Mobile genetiske elementer, såsom plasmider, transposoner, genomiske øer, integrativ konjugative elementer og integrons kan formidle antibiotikumresistensgener (Arg), både inden for og mellem bakteriearter 4. Af disse har integrons spillet en central rolle i spredningen af ​​ARG, på trods af denfaktum, at de er afhængige af plasmider og transposoner til mobilisering og indføring i bakterielle genomer 5. Integrons fange genkassetter anvendelse af en integron-integrase, og derefter udtrykke kassetter anvendelse af en integron kodet promotor 6,7 (figur 1). Integron gen-kassetter er små mobile elementer bestående af enkelte åbne læserammer (ORF), hvis produkter kan give resistens over for antibiotika eller desinfektionsmidler 8. Klasse 1 integrons er integrons mest almindeligt inddrives fra kliniske isolater 5, hvor de tilsammen har erhvervet over 130 forskellige antibiotikaresistens genkassetter 9.

Udbredelsen af klasse 1 integrons i humane-associeret kommensale og sygdomsfremkaldende bakterier genererer menneskelige affaldsstrømme, der indeholder et stort antal af disse genetiske elementer 10. Det anslås 10 19 bakterier, der indeholder klasse 1 integrons frigives via spildevandsslam hvert år in Det Forenede Kongerige 11. Det er derfor ikke overraskende, at klasse 1 integrons der giver antibiotika modstande nu er ved at blive opdaget i mikrobiota af vilde fugle, fisk og andre indfødte dyreliv 12-14. Frigivelse integrons tilbage i miljøet udgør en betydelig trussel mod folkesundheden, da køb af nye genkassetter og komplekse rearrangementer med andre mobile elementer fortsætter med at opstå, især i rensningsanlæg og andre vandområder 15-18. Det naturlige miljø bliver så en frugtbar rekrutteringsgrundlag for nye modstand determinanter og opportunistiske patogener 19,20. Nye integron-holdige bakterier og nye args kan cirkel tilbage i det menneskelige fællesskab gennem forurenet vand og mad 21,22. Overvågning af de miljømæssige args er en vigtig strategi for at forstå og administrere antibiotikaresistens i fremtiden 23. Især bør man være opmærksom på fødevarer, der spises rå ellerlet kogte, da disse præsentere den største trussel for overførsel af nye mobile elementer og patogener.

I denne protokol, en strømlinet tilgang til detektering, identificering og karakterisering af klasse 1 integrons og deres tilknyttede genkassetter i levnedsmidler er skitseret (figur 2). Ved hjælp af en kombination af dyrkning og polymerasekædereaktion (PCR), kan integrons hurtigt påvises i komplekse bakterielle samfund og individuelle isolater. Fremgangsmåder til at identificere de arter af bakterier og konformationen og identiteten af ​​de integron-associerede genkassetter er givet. Fremgangsmåden er velegnet til en bred vifte af vegetabilske og animalske fødevarer, og er givet eksempler på typiske arbejdsgange for hver af disse typer fødevarer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Fødevarer, som spises rå eller let kogte, er af de fleste for menneskers sundhed. Eksempler omfatter salat grøntsager, frugt, skaldyr og krebsdyr.

1. Prøvetagning

  1. Indsamle prøver under forhold, der minimerer forurening, og opbevares i særskilte, rene poser under transport. Når samlet, bør prøverne opbevares ved 4 ° C og behandles inden for 24 timer.

2. beriget Culture Forberedelse

  1. Frugt og grøntsager:
    1. Placer ca. 10 g materiale i en slidstærk plasticpose. Hvis behandling større materiale, koncentrere sig om huden af ​​frugt eller grøntsag. Tilføje 90 ml 0,1 M natriumphosphatbuffer, pH 7,0, og processen i en pagaj blender i 30 sek. Alternativt kan materialet manuelt ophidset, hvis en pagaj blender er ikke tilgængelig.
    2. Opsamling af væsken i to 50 ml Falcon-rør. Centrifugerør ved 4.000 xg i 7 min for at pelletere bakterierne. Fjern forsigtigt supernatanten og suspendere de pelleterede bakterier i 30 ml sterilt Luria Bertani (LB) bouillon.
    3. Inkuber på et rysteapparat O / N, holde et rør ved 25 ° C og den anden ved 37 ° C. Kulturer skal rystes ved 200 svingninger pr minut (OPM). Kulturer opbevares ved 4 ° C indtil brug.
  2. Seafood:
    1. Dissekere ud maven (østers) eller fordøjelseskanalen (rejer) under anvendelse af steril pincet og pincetter og anbringes i et sterilt 1,5 ml rør indeholdende 200 pi 0,1 M natriumphosphatbuffer, pH 7,0. Opblødes prøven for at skabe et homogenat.
    2. Dispensere 5 ml LB-bouillon i to sterile 5 ml rør, og pode hver med skaldyr homogenatet.
    3. Inkuber på et rysteapparat O / N, holde et rør ved 25 ° C, og den anden 37 ° C. Kulturer skal rystes ved 200 OPM. Kulturer opbevares ved 4 ° C indtil brug.

3. Screening Kulturer for Integrons

MgCl2-koncentration på 2,5 mM. Hvis det er nødvendigt, Lorenz (2011) 24 har skitseret PCR optimering og fejlfinding metoder i en tidligere udgave af dette tidsskrift.

  1. Kogt DNA forberedelse:
    1. Dispenseres 100 pi beriget kultur i en steril 0,5 ml PCR-rør. Opvarmes prøven til 99 ° C i 10 minutter, under anvendelse af et vandbad eller varmeblok. Snap chill på is i 2 min.
    2. Mikrocentrifuge ved 14.000 xg i 5 min for at pelletere celledebris. Retur til is. DNA-prøver kan fryses ved -20 ° C, indtil de skal, men skal optøs på is.
  2. Screening for klasse 1 integrons hjælp af PCR:
    BEMÆRK: Blandede kulturer fra O / N inkubation screenes for klasse 1 integrons bruger HS463a / HS464 PCR-protokol (tabel 1).
    1. Optø alle PCR-reagenser på is, væk fra enhver potentiel sources af kontaminerende DNA. Make up 48 pi PCR mastermiksens per prøve, herunder negative kontroller (tabel 2). Dispensere 48 pi PCR Master mix til hvert rør, ved hjælp barriere tips.
    2. Tilsæt 2 pi optøet DNA til individuelle PCR-rør ved hjælp barriere tips. Kør passende program i PCR thermocycler.
    3. At vurdere resultaterne af amplifikationen, elektroforese 7 pi PCR-produkt på en 2% agarosegel hældt og køre i TBE-buffer (90 mM TRIS-borat, 2 mM EDTA). Omfatter en molekylvægt markering, såsom en 100 bp stige.
    4. Stolpe pletten af ​​gelen med en DNA-farve, og visualisere anvendelse af en UV transilluminator. Kontrollere, at der ikke er sket opformering i den negative kontrol. Et stærkt bånd på omkring 470 bp for en bestemt prøve, angiver, at den blandede kultur indeholder bakterier, der bærer en klasse 1 integron. Rene kolonier vil nu blive isoleret fra enhver blandet kultur, der returneres en positiv PCR.

  1. Serielle fortyndinger og sprede plader:
    BEMÆRK: For at isolere enkelte kolonier fra PCR-positive blandede kulturer, er den blandede kultur serielt fortyndet 10 gange i natriumphosphatbuffer, og derefter udpladet at inddrive enkelte kolonier.
    1. Der tilsættes 1 ml blandet kultur til 9 ml 0,1 M natriumphosphatbuffer, pH 7,0 og bland ved inversion. Der tilsættes 1 ml af fortynding til yderligere 9 ml phosphatbuffer, og gentag indtil en seriel fortynding af 10 -8 nås.
    2. Spred 100 pi af de 10 -4 til 10 -8 fortyndinger på LB-agar, in duplo. Inkubér pladerne O / N ved den samme temperatur anvendt til den indledende blandede kultur. Plader kan derefter opbevares ved 4 ° C indtil brug, men det er bedst at behandle de enkelte kolonier temmelig hurtigt.
  2. Enkelt koloni udvælgelse og kogt DNA forberedelse:
    1. Pick enkelte kolonier fra de serielle fortynding plader, SEat der er valgt så mange forskellige kolonityper som muligt, ved hjælp af kriterier såsom koloni størrelse, form og farve. Brug sterile tandstikkere til at vælge enkelte kolonier fra spredning plade.
    2. Berør tandstikker til kolonien, og derefter overføre til et PCR-rør indeholdende 100 pi sterilt vand. Hvis et stort antal kolonier skal screenes, så kolonier kan fremstilles på en mikrotiter bakke. Spin tandstikker mellem fingrene til at løsne nogle af cellerne i vandet.
    3. Under anvendelse af samme tandstikker, pode en LB plade med en stribe af kolonien. Store antal kolonier kan lagres på mærkede plader, hvis hver stribe er ca. 1 cm lange. Gentag trin 1 til 3, indtil du har valgt et passende antal isolater.
    4. Inkubér LB-plader O / N, ved den samme temperatur som den, der anvendes til den indledende beriget kultur. Kulturer kan derefter opbevares ved 4 ° C indtil brug.
    5. For at forberede DNA fra bakteriesuspensioner følge trinene som outlined i afsnit 3.1. Til screening af rene kultur lysater, udføre HS463a / HS464 PCR som beskrevet i afsnit 3.2. Isolater at returnere en positiv PCR vil blive anvendt til fremstilling af genomisk DNA (afsnit 5), og til yderligere analyser.

5. Genomisk DNA Udvinding af Integron-positive enkelte kolonier Brug Bead Beating 25

  1. Pode 5 ml LB-bouillon med en prøve af renkultur isoleret i afsnit 4.2. Inkuber O / N, rystning ved den samme temperatur, der blev anvendt til den indledende beriget kultur.
  2. Pellet celler ved 4.000 xg i 7 min, og fjern supernatanten. Resuspender de pelleterede celler i 1 ml CLS-TC opløsning i et lyserende Matrix E hurtig prep rør. Ved hjælp af en perle bankende maskine, behandle prøven på 5,5 m / sek i 30 sek.
  3. Centrifugerør ved 14.000 xg i 5 min og inddrive 700 pi supernatant i et sterilt 1,5 ml rør.
  4. Tilføj 700 pi bindende matrix fortyndet 1: 5 med 6 M guanidinium thiocyanat og blandes ved stuetemperatur i 5 min. Centrifuger ved 14.000 xg i 1 min, discard supernatant.
  5. Tilføj 800 pi salt ethanolvask (70% ethanol, 0,1 M natriumacetat) og vortex indtil pelleten er fuldt resuspenderet. Vask i 5 minutter ved stuetemperatur, centrifugeres ved 14.000 xg i 1 min og kassér supernatanten. Sikre alle supernatanten er fjernet, ved anvendelse af en mikropipette om nødvendigt derefter lad det lufttørre i 5 min.
  6. Pellet resuspenderes matrix i 200 pi TE (10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH 7,6) ved pipettering op og ned. Inkuber ved stuetemperatur i 3 min. Centrifuger ved 14.000 xg i 3 min og overførsel 160 pi af det eluerede DNA i et sterilt rør. Køre en portion af det genomiske DNA-ekstraktion på en 2% w / v agarosegel for at kontrollere udbyttet og integriteten af ​​DNA ekstraktion. Det oprensede genomiske DNA opbevares ved -20 ° C og optøet på is, når det kræves til PCR-analyse.

6. Diagnostiske PCR'er og DNA sekventering

BEMÆRK:genomisk DNA fremstillet i afsnit 5 vil blive brugt til alle diagnostiske PCR'er, og bekræfte den positive test for klasse 1 integrons.

  1. Optø genomisk DNA på is, kortvarigt vortexes DNA-prøven og puls centrifugering ved 14.000 x g i 20 sek. Gentag PCR for klassen 1 integron-integrase gen hjælp HS463a / HS464 (tabel 1), hvilket bekræfter, at isolatet er positiv for 471 bp amplikon (afsnit 3.2).
  2. Identifikation af positive kulturer til artsniveau opnås ved analyse af det lille subunit rRNA-genet (16S rDNA). Amplificere 16S-genet ved anvendelse af primerne F27 / r1492 (tabel 1). Kontroller PCR-produkter ved hjælp af elektroforese. Alle bakterielle mål bør generere en 16S amplikon på omkring 1450 bp.
  3. Sekvens 16S rRNA-genet amplicon at bestemme arter identitet, men da der sandsynligvis er flere positive PCR'er fra trin 6.2, og mange af disse positive vil være de samme bakteriearter, vil vi først skelne forskellige arter using restriktionsspaltning af 16S PCR-produkt.
    1. Fordøje en alikvot af 16S PCR med restriktionsenzymet Hinf 1. Helst enzym, som genkender 4 bp spaltningssteder vil gøre, men Hinf 1 genererer god diversitet fra 16S mål, og er en pålidelig, billig enzym.
  4. Opsæt en 30 pi begrænsning fordøje mastermiksens (tabel 2) i et sterilt rør og tilsæt 20 ul un-purfied 16S PCR-produkt. Inkuber i et 37 ° C vandbad O / N. Kontroller digest på en 2% agarosegel.
  5. Score fordøjelsesmønstre produceret af Hinf 1. Isolater med den samme 16S restriktion profil er sandsynligvis den samme art. Snarere end sekventering hver 16S PCR-produkt, sekvens højst tre repræsentanter fra hver Hinf 1 restriktion mønster.
  6. Oprense 16S PCR-produkter under anvendelse af et kommercielt kit. En enkeltstrenget exonuklease kit kan anvendes, men kolonne baseret eller udfældning metoder fungerer også godt for at fjerne unincorporated primere og enkeltstrengede DNA. Sekvens af 16S amplikonerne bruger primer R910 (tabel 1), oprettelse reaktionerne som angivet af sekventering facilitet.
  7. Brug det resulterende DNA-sekvens for at forespørge NCBI DNA-database med BLASTN funktion ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ). Større end 97% nukleotididentitet er normalt tages som arter identitet.

7. Kortlægning og karakterisering af Integrons og kassette Arrays

BEMÆRK: Klasse 1 integrons stammer fra menneske-dominerede økosystemer vil sandsynligvis være de mest almindelige integrons i alle dine prøver. Disse integrons alle har en nylig enkelt oprindelse, og har derfor et højt konserveret DNA-sekvens 5.

  1. Skelne mellem en klasse 1 integrons stammer fra menneskelige kilder, og dem, der forekommer naturligt i miljøprøver ved at udføre enPCR med primersæt intI1F165 / intI1R476 10 (tabel 1).
    BEMÆRK: Klasse 1 integrons fra kliniske eller kommensale bakterier vil generere en ~ 300 bp produkt, mens miljøklasse 1 integrons ikke vil generere noget produkt.
  2. Karakterisere de kliniske integrons ved at forstærke kassetten array med primer sæt HS458 / HS459. Dette PCR vil amplificere regionen mellem intI1 og 3'konserverede segment fra endepunktet for de fleste kassette arrays. Fordi antallet og identiteten af ​​kassetter er variabel, vil størrelsen af ​​PCR-produktet også variere.
  3. Oprense amplikoner og sekventere DNA ved hjælp af hvert af amplifikationsprimerne. Brug sekvenser at forhøre DNA-databaser under anvendelse af BLASTN funktion ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ).
  4. Sørg navngivning af kassetter følger standardiseret nomenklatur 9, da mange data depositioner for integron genkassettes bruger inkonsistente eller tvetydige navne. Lægge særlig vægt på nye genkassetter, da disse kan indkode nye fænotyper, herunder gener, som giver øget overførbarhed, patogenicitet eller virulens 8,21.
    BEMÆRK: Prækliniske former af klasse 1 integron stadig cirkulerer i naturlige miljøer. Især dem, der er knyttet til aktive Tn 402 transposoner, er af størst interesse 26. Kassetten arrays af disse integrons vil ikke opformere ved primer HS458 / HS459, men kan forstærkes med MRG284 / MRG285 primersæt (tabel 1), genererer ampliconer af forskellig størrelse afhængig af kassette indhold. PCR-produkter bør renses og DNA sekventeret som beskrevet i afsnit 7.2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Screening af blandede kulturer og bakterielle isolater for intI1

Primersæt HS463a / HS464 PCR kan anvendes til at påvise tilstedeværelsen af klasse 1 integron-integrase-gen, intI1 (figur 1). Denne primer sæt fungerer godt til at detektere intI1 i blandede kulturer, og bruges også til at screene bakterielle kolonier høstet fra spread plader (figur 2). Positive isolater bør generere en enkelt stærk bånd ved 471 bp under anvendelse af denne primer sæt (figur 3A). Hovedparten af positive isolater vil bære intI1 der har stammede fra mennesker eller deres landbrugs- og husdyr. Disse isolater vil også være positive i en PCR under anvendelse af primere F165 / R476, som skal generere en 311 bp amplikon (figur 1). Miljømæssige kilder intI1 vil generelt ikke være positiv i denne anden analyse.

Karakterisering af integron kassette arrays

402 associeret klasse 1 integrons kan forstærkes ved hjælp af primere HS458 / HS459. Disse primere henholdsvis målrette integron rekombinationssted, og 3'-enden af kassetten array, som normalt ender i qacEΔ sul1 genfusion (figur 1). Størrelsen af PCR-produkter der genereres i dette assay varierer afhængigt af antallet og identiteten af kassetter i arrayet (figur 3B). Miljømæssige klasse 1 integrons ofte er forankrede i bakterielle kromosomer, og deres kassette arrays kan forstærkes af primere, som er målrettet de proximale og distale fleste rekombinationssteder (figur 1). Primere MRG284 / 285 er designet til at forstærke denne region, og igen, fordi indholdet kassetten varierer, størrelsen af de amplikoner varierer også (figur 3C). Sekventering af HS458 / 459 PCRprodukter vil normalt genvinde kendte antibiotikaresistens determinanter, mens sekventering MRG284 / 285 PCR-produkter generelt vil komme genkassetter der koder polypeptider med ukendt funktion.

Identificering bakteriearter

Bakterier identificeres ved anvendelse 16S rDNA sekventering og database sammenligninger. Genomisk DNA anvendes som template for amplifikation af 16S lille underenhed-rRNA-genet. Anvendelse af primerne foreslået, bør dette generere et amplikon på ca. 1450 bp. Fordi et stort antal kolonier kan screenes på en gang, er en hierarkisk screeningsmetode anvendes. Amplificerede 16S PCR produkter fordøjet med restriktionsenzymet Hinf 1, og disse fordøjelser separeres på agarosegeler. Enkelte arter vil generere karakteristiske mønstre efter digest, således at isolater af samme art kan let identificeres (figur 3D). Sekventering af 16S rRNA-gen-PCR-produkter fra højst treisolerer repræsenterer nogen begrænsning mønster muliggør effektiv identifikation af alle de sandsynlige arter i en samling af integron positive isolater.

Figur 1
Figur 1. Opbygning af klasse 1 integrons. Skematisk tegning af klinisk og miljømæssige klasse 1 integrons, der viser PCR-primer bindingssteder, der er nævnt i manuskriptet. Klasse 1 integrons består af en integron-integrase gen (intI1), der katalyserer opsamling og udtryk for genkassetter at danne en kassette array. Før fremkomsten af ​​antibiotika, at størstedelen af ​​klasse 1 integrons var kromosomale og bar genkassetter hvis funktioner er endnu ikke fastlagt. Stærk udvælgelse via brug af antibiotika har voldsomt øget overflod af én sekvens variant af klasse 1 integron associeret med Tn 402 transposonen.Disse "kliniske" integrons har erhvervet arrays af kassetter, der koder for antibiotikaresistens. Det er disse integrons, der i øjeblikket forurenende naturlige miljøer og fødevareproduktionskæden. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Skematisk rutediagram til detektering klasse 1 integrons i fødevarer. Prøver af fødevarer anvendes til at inokulere medier og generere en blandet bakteriekultur. Disse blandede kulturer screenes for tilstedeværelsen af ​​klasse 1 integrons, og positive kulturer anvendes til fremstilling spread plader. Individuelle kolonier fra de spredte pladerne screenes igen for integrons. Positive kulturer er oprenset, DNA ekstraheret og karakteriseret for kassette indhold af DNA sequencing. Sekventering af 16S rRNA-genet bruges til arter identifikation. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Repræsentant elektroforetisk analyser fra screeningsprocessen. (A) Screening enkelte kolonier ved hjælp intI1 primere HS463a / 464. Positive kolonier generere en stærk enkelt bånd på 471 bp. (B) Forstærkning af kassette arrays fra Tn 402 integrons anvendelse af primere HS458 / 459. Denne PCR genererer variabel produktstørrelser afhængig af identiteten og størrelsen af ​​de indgående kassetter i arrayet. Identifikation af disse kassetter kræver DNA-sekventering. (C) Forstærkning af kassette arrays fra miljøklasse 1 integrons anvendelse af primere MRG284 / 285. Dette PCR genererer også variable produktstørrelser afhængig af identiteten og størrelsen af ​​de indgående kassetter i opstillingen, men kassettebånd i er usandsynligt at kode antibiotikaresistens miljømæssige arrays. (D) Screening af 16S PCR-produkter ved fordøjelse med Hinf 1. Isolater med identiske restriktionsmønstre er sandsynligvis den samme art. Hvis et stort antal en enkelt begrænsning type er genvundet, kun nogle få af disse skal være sekventeret. Klik her for at se en større version af dette tal.

PCR Gentarget Primer navn Retning Sequence 5 '- 3' Cykelforhold Reference
HS463a / HS464 Klasse 1 Integron HS464 Fremad ACATGCGTGTAAATCATCGTCG 94 ° C 3 min; 35 cykler 94 ° C 30 sek, 60 ° C 30 sek, 72 ° C 1 min 30 sek; 72 ° C 5 min Stokes et al., 2006 28
HS463a Reverse CTGGATTTCGATCACGGCACG
F27 / r1492 16S rRNA F27 Fremad AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 94 ° C 3 min; 35 cykler 94 ° C 30 sek, 60 ° C 30 sek, 72 ° C 1 min 30 sek; 72 ° C 5 min Lane, 1991 29
r1492 Reverse TACGGYTACCTTGTTACGACTT
intI1F165 / IntI1R476 Klinisk klasse 1 integron Inti1F165 Fremad CGAACGAGTGGCGGAGGGTG 94 ° C 3 min; 35 cykler 94 ° C 30 sek, 55 ° C 30 sek, 72 ° C 1 min 30 sek; 72 ° C 5 min Gillings 2014 10
intI1R476 Reverse TACCCGAGAGCTTGGCACCCA
HS549 / HS550 3'CS Clinical Integron HS549 Fremad ACTAAGCTTGCCCCTTCCGC 94 ° C 3 min; 35 cykler 94 ° C 30 sek, 65 ° C 30 sek, 72 ° C 1 min 30 sek; 72 ° C 5 min Stokes et al., 2006 28
HS550 Reverse CTAGGCATGATCTAACCCTCGG
HS458 / HS459 Klinisk kassette-array HS458 Fremad GCAAAAAGGCAGCAATTATGAGCC 946; C 3 min; 35 cykler 94 ° C 30 sek, 55 ° C 30 sek, 72 ° C 1 min 30 sek; 72 ° C 5 min Holmes et al., 2003 30
HS459 Reverse GTTTGATGTTATGGAGCAGCAACG
MRG284 / MRG285 Miljømæssige kassette MRG284 Fremad GTTACGCCGTGGGTCGATG 94 ° C 3 min; 35 cykler 94 ° C 30 sek, 55 ° C 30 sek, 72 ° C 1 min 30 sek; 72 ° C 5 min Gillings et al., 2009 21
MRG285 Reverse CCAGAGCAGCCGTAGAGC

Tabel 1. Primer sekvenser og PCR-betingelser, der anvendes til identifikation af klasse 1 integrons og deres tilknyttede genkassetter.

Tabel 2. PCR og begrænsning fordøje Mastermix vælgere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Identifikationen af integrons og deres tilknyttede genkassetter er potentielt et vigtigt skridt i at forudsige fremkomsten af nye opportunistiske patogener, sporing veje for patogener ind i den menneskelige fødekæde, og identificere nye modstand og virulensdeterminanter 8,21,26. Formålet med dette dokument var at beskrive en strømlinet tilgang til screening prøver til klasse 1 integrons, der karakteriserer deres kassette arrays og identificere de bakteriearter, som de bor. Kritiske trin i protokollen indebærer god mikrobiologisk praksis og forhindre PCR forurening, der ville generere falske positiver.

Den her beskrevne protokol kan let modificeres til at opdage andre klinisk relevante integrons, herunder klasse 2 og klasse 3 integrons, der også findes i humane patogener. Det kan også modificeres til at detektere integrons i mikrobielle samfund fra vand, biofilm, jord eller sediment. Der er nogle limitations til denne teknik, som udspringer fra en afhængighed af dyrkning af bakterieceller. Mange miljømæssige bakterier er ikke let dyrkbar, og protokollen beskrevet her ville ikke registrere disse arter. Rækken af ​​arter, som genvindes kunne udvides ved anvendelse af forskellige bakterielle medier formuleringer og længere inkubationstider. De fleste arter af interesse for menneskers sundhed, er ikke desto mindre sandsynligt, at vokse under de betingelser, der er beskrevet her.

Denne protokol har nogle fordele i forhold til teknikker, der bruger plating på selektive medier. Brug ske om identiteten af ​​resistens determinanter båret af enkelte isolater og nye resistensgener Ingen antagelser kan inddrives og karakteriseret. I mere generelle vendinger, kan arbejdsgangen også tilpasses til at afsløre ethvert element af resistome 27 eller mobilome som kunne være af interesse 4. Sådanne assays er vigtige for forståelsen af ​​dynamikken i de forskellige DNA-elementer, der er involveret i entibiotic modstand, og afgørende for at bevare den svindende arsenal af antimikrobielle forbindelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget relevant at præsentere.

Acknowledgments

Tak til Michaela Hall, Larissa Bispo og Gustavo Tavares for teknisk bistand.

Materials

PCR-reagenser Volumen (pi) Restriktionsfordøjelse reagenser Volumen (pi)
Sterilt vand 21.5 Sterilt vand 23
10x GoTaq White 25 Puffer B 5
RNAseA [1 mg / ml] 0,5 Bovint serumalbumin [1 mg / ml] 1
Forward Primer [50 pM] 0,5 Hinfl [10 enheder / pl] 1
Reverse primer [50 pM] 0,5
Mastermix volumen 48 Mastermix volumen 30
DNA-template 2 PCR skabelon 20
Final PCR volumen 50 Endelig restriktionsfordøjelse volumen 50
Name Company Catalog Number Comments
GoTaq Colourless Mastermix Promega M7132 Used in all PCRs
RNAse (Ribonuclease A from bovine pancreas) Sigma R6513-10MG Used in all PCRs
HinFI restriction enzyme Promega R6201 Used to digest 16S rDNA PCR poducts. Enzyme comes with optimal buffer and BSA
100 bp ladder GE Healthcare 27400701 Used as a size standard on all agarose gels
GelRed DNA stain Biotium 41003 CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material
Guanidinium thiocyanate Life Technologies AM9422 CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material
CLS-TC Solution MP Biomedicals 6540409 Resuspension solution used at the begining of the genomic DNA extraction
Lysing Matrix E FastPrep tubes MP Biomedicals 116914500 Tube required for mechanical disruption of bacterial cell walls. This code is used for packs of 500 tubes, smaller quantities are available.
Binding matrix MP Biomedicals 116540408 Diluted 1:5 with 6 M guanidinium thiocyanate and used in the genomic DNA extraction method.
Fast Prep machine MP Biomedicals Number of options available MP Biomedicals has a number of FastPrep machines available to purchase. Visit http://www.mpbio.com for more information

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, K., et al. Tackling antibiotic resistance. Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).
  2. Davies, J., Davies, D. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).
  3. Costa, V. M., et al. Antibiotic resistance is ancient. Nature. 477 (7365), 457-461 (2011).
  4. Gillings, M. R. Evolutionary consequences of antibiotic use for the resistome, mobilome and microbial pangenome. Front. Microbiol. 4, 4 (2013).
  5. Gillings, M., et al. The evolution of class 1 integrons and the rise of antibiotic resistance. J. Bacteriol. 190 (14), 5095-5100 (2008).
  6. Brassard, S., Lapointe, J., Roy, P. H. Diversity and relative strength of tandem promoters for the antibiotic-resistance genes of several integrons. Gene. 142 (1), 49-54 (1994).
  7. Partridge, S. R., et al. Definition of the attI1 site of class 1 integrons. Microbiol. 146 (11), 2855-2864 (2000).
  8. Gillings, M. R. Integrons: Past, Present, and Future. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 78 (2), 257-277 (2014).
  9. Partridge, S. R., Tsafnat, G., Coiera, E., Iredell, J. R. Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons. FEMS Microbiol. Rev. 33 (4), 757-784 (2009).
  10. Gillings, M. R., et al. Using the class 1 integron-integrase gene as a proxy for anthropogenic pollution. ISME J. In press, (2014).
  11. Gaze, W. H., et al. Impacts of anthropogenic activity on the ecology of class 1 integrons and integron-associated genes in the environment. ISME J. 5, 1253-1261 (2011).
  12. Gerzova, L., et al. Characterization of microbiota composition and presence of selected antibiotic resistance genes in carriage water of ornamental fish. PLoS ONE. 9, e103865 (2014).
  13. Power, M., Emery, S., Gillings, M. Into the wild: dissemination of antibiotic resistance determinants via a species recovery program. PLoS ONE. 8, e63017 (2013).
  14. Stokes, H. W., Gillings, M. R. Gene flow, mobile genetic elements and the recruitment of antibiotic resistance genes into Gram-negative pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 35 (5), 790-819 (2011).
  15. Moura, A., Oliveira, C., Henriques, I., Smalla, K., Correia, A. Broad diversity of conjugative plasmids in integron-carrying bacteria from wastewater environments. FEMS Microbiol. Lett. 330 (2), 157-164 (2012).
  16. Schlüter, A., Krause, L., Szczepanowski, R., Goesmann, A., Pühler, A. Genetic diversity and composition of a plasmid metagenome from a wastewater treatment plant. J. Biotech. 136 (1-2), 65-76 (2008).
  17. Taylor, N. G. H., Verner-Jeffreys, D. W., Baker-Austin, C. Aquatic systems: maintaining, mixing and mobilising antimicrobial resistance. TREE. 26 (6), 278-284 (2011).
  18. Stalder, T., et al. Quantitative and qualitative impact of hospital effluent on dissemination of the integron pool. ISME J. 8, 768-777 (2014).
  19. Allen, H. K., et al. Call of the wild: antibiotic resistance genes in natural environments. Nature Rev. Microbiol. 8, 251-259 (2010).
  20. Wellington, E. M., et al. The role of the natural environment in the emergence of antibiotic resistance in Gram-negative bacteria. Lancet Infect. Dis. 13 (2), 155-165 (2013).
  21. Gillings, M. R., et al. Mobilization of a Tn402-like class 1 integron with a novel cassette array via flanking miniature inverted-repeat transposable element-like structures. Appl. Env. Microbiol. 75 (18), 6002-6004 (2009).
  22. Graham, D. W., Collignon, P., Davies, J., Larsson, D. J., Snape, J. Underappreciated role of regionally poor water quality on globally increasing antibiotic resistance. Env. Sci. Technol. 48 (20), 11746-11747 (2014).
  23. Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. The antibiotic resistome: what's new. Curr. Opinion Microbiol. 21, 45-50 (2014).
  24. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. 63, e3998-e3998 (2011).
  25. Gillings, M. R. Rapid Extraction of PCR-Competent DNA from Recalcitrant Environmental Samples. Env. Microbiol. 1096, 17-23 (2014).
  26. Sajjad, A., Holley, M. P., Labbate, M., Stokes, H., Gillings, M. R. Preclinical class 1 integron with a complete Tn402-like transposition module. Appl. Env. Microbiol. 77 (1), 335-337 (2011).
  27. Wright, G. D. Antibiotic resistance in the environment: A link to the clinic. Curr. Opinion Microbiol. 13 (5), 589-594 (2010).
  28. Stokes, H., Nesbo, C., Holley, M., Bahl, M., Gillings, M., Boucher, Y. Class 1 integrons predating the association with Tn402.-like transposition genes are present in a sediment microbial community. Journal of Bacteriology. 188, 5722-5730 (2006).
  29. Lane, D. J. Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. , John Wiley &Sons, Inc. 115-175 (1991).
  30. Holmes, A. J., et al. Recombination activity of a distinctive integron-gene cassette system associated with stutzeri. populations in soil. Journal of Bacteriology. 185, 918-928 (2003).

Tags

Environmental Sciences integron lateral genoverførsel epidemiologi resistome antibiotikaresistens forurening xenogenetic
Screening Levnedsmidler for klasse 1 Integrons og genkassetter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Waldron, L. S., Gillings, M. R.… More

Waldron, L. S., Gillings, M. R. Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes. J. Vis. Exp. (100), e52889, doi:10.3791/52889 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter