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Medicine

Establecimiento y caracterización de IU y ITUAC en un modelo de ratón

Published: June 23, 2015 doi: 10.3791/52892
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Microbiology and Center for Women's Infectious Disease Research, Washington University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Abstract

Infecciones del tracto urinario (ITU) son altamente prevalentes, una causa importante de morbilidad y son cada vez más resistentes al tratamiento con antibióticos. Las mujeres se ven desproporcionadamente afectados por la UTI: 50% de todas las mujeres tendrán una infección urinaria en su vida. Además, el 20-40% de estas mujeres que tienen una inicial UTI sufrirá una recurrencia con algunas recurrencias frecuentes que sufren con grave deterioro en la calidad de vida, el dolor y el malestar, la interrupción de las actividades diarias, el aumento de los costes sanitarios, y pocas opciones de tratamiento otra que la profilaxis antibiótica a largo plazo. Uropatógena Escherichia coli (UPEC) es el agente causal principal de la UTI adquirida en la comunidad. IU asociada al catéter (ITUAC) es el hospital infección adquirida más común que representa un millón de ocurrencias en los EE.UU. cada año y los costes sanitarios dramáticos. Mientras UPEC es también la principal causa de infección urinaria, otros agentes causantes son de una mayor importancia incluyendo Enterococcusfaecalis. Aquí utilizamos dos modelos bien establecidos de ratón que recapitular muchas de las características clínicas de estas enfermedades humanas. Para IU, un modelo C3H / HeN recapitula muchas de las características de la UPEC virulencia observadas en los seres humanos, incluyendo las respuestas de acogida, formación de IBC y filamentation. Para ITUAC, un modelo utilizando ratones C57BL / 6, que retienen los implantes de catéter de la vejiga, se ha demostrado ser susceptibles a E. faecalis infección de la vejiga. Estos modelos representativos se están utilizando para obtener nuevos conocimientos sorprendentes sobre la patogénesis de la enfermedad de IU, que está llevando al desarrollo de nuevas terapias y estrategias de gestión o de prevención.

Introduction

Infecciones del tracto urinario (ITU) son una de las infecciones bacterianas más comunes y se pueden dividir en dos categorías basadas en el mecanismo de la adquisición, la comunidad y nosocomial adquirida UTI. Infecciones urinarias a menudo ocurren en mujeres y estudios por lo demás sanos adquirida en la comunidad han demostrado que aproximadamente el 50% de las mujeres tendrán al menos una infección urinaria en su vida 1. Además, la recurrencia es un problema importante. Una mujer que tiene una infección aguda inicial Ocasión 25-40% de tener una segunda infección dentro de los seis meses a pesar del tratamiento antibiótico adecuado y muchas mujeres siguen teniendo recurrencias frecuentes 2. Las bacterias que causan estas infecciones son cada vez más los protocolos de tratamiento cada vez más resistentes a los antibióticos de confusión 3-6. IU afecta a millones de personas cada año cuesta aproximadamente 2,5 millones de dólares en gastos relacionados con el cuidado de la salud en los EE.UU., lo que subraya el impacto y la prevalencia de la enfermedad1,7 .Nosocomial adquirió las ITU se asocian principalmente con la presencia de cuerpos extraños tales como catéteres permanentes. Infecciones urinarias asociadas a catéter (ITUAC) siguen siendo los nosocomial más común adquirida IU, lo que representa ~ 70-80% de estas infecciones 8. Además, ITUAC se asocia con aumento de la morbilidad y la mortalidad y es la causa más común de infecciones del torrente sanguíneo secundarias 9.

UPEC comunidad asociada adquirida UTI se cree que es causada por la introducción de bacterias en la vejiga de los embalses en el tracto gastrointestinal a través de la manipulación mecánica durante la relación sexual, la falta de higiene u otras dinámicas de población microbiana entre los diferentes nichos de acogida 10. Una vez dentro de la vejiga, UPEC emplean numerosos factores de virulencia, incluyendo cápsula, sistemas de adquisición de hierro, toxinas, un plásmido de virulencia, tRNAs, islas de patogenicidad y factores de colonización que han demostrado desempeñar un papel en la patogénesis <sup> 11-14. Fundamental para el establecimiento de la UPEC la colonización, la UPEC también codifican múltiples tipos de chaperón adhesiva ujier vía (CUP) pili que reconocen los receptores con especificidad estereoquímica 15. Tipo 1 pili, punta con la adhesina FimH, se expresan por la UPEC y se unen uroplaquinas 16 y α-1, β-3 integrinas 17, que se expresan en la superficie luminal de las dos vejigas humanas y de ratón 18 manosilado. Estas interacciones FimH mediada facilitan la colonización bacteriana y la invasión de las células epiteliales superficiales 19,20. Una vez dentro de la célula, UPEC puede escapar al citoplasma, donde una sola bacteria puede dividirse rápidamente para formar una comunidad bacteriana intracelular (IBC), que, tras la maduración, puede contener ~ 10 4 bacterias 21. Formación de IBC se ha demostrado en al menos seis diferentes cepas de ratón, C3H / gallina, C3H / HeJ, C57Bl / 6, CBA, FVB / NJ y BALB / c, y con una amplia variedad de UPECepas C y otras enterobacterias 22-24. Sin embargo las diferencias temporales y espaciales de la formación de IBC pueden variar dependiendo de los antecedentes del ratón y la cepa UPEC infectar. En ratones C3H / HeN infectadas con el prototipo de la UPEC cepas UTI89 o la formación CFT073, IBC pueden ser visualizados como pequeños biomasas de bacterias ya en 3 hpi (infección post hr). Esta comunidad sigue creciendo y alcanza un "punto medio" de desarrollo aproximadamente 6 hpi cuando las bacterias en forma de barra ocupan un gran porcentaje del espacio citoplásmico de células paraguas superficiales diferenciadas terminalmente Estos forma temprana los GRG de una manera relativamente sincrónica con la mayoría presentan dimensiones similares y morfologías. ~ 8 hpi las bacterias en el cambio de un IBC bacilos a cocos morfología. RIG son de naturaleza transitoria. Por lo tanto, IBC maduración 12-18 resultados hpi en continua expansión de la población bacteriana, seguida de su filamentation y la dispersión de la conexión wi celularth propagación posterior a las células vecinas 23. Por lo tanto, el nicho IBC permite rápido crecimiento bacteriano en un entorno protegido de las respuestas y antibióticos 25 inmune del huésped. Las distintas etapas de la infección UPEC que se ven en ratones también se observan en los seres humanos, tales como los RIG y filamentación, apoyando el modelo de ratón de infección del tracto urinario como una herramienta beneficiosa que puede ser utilizado para modelar UTI en los seres humanos 22,26-28.

Si bien la mayoría de las mujeres experimentan una infección urinaria en su vida, el resultado de estas infecciones puede variar desde una infección autolimitada aguda sin recurrencia, a la cistitis recurrente frecuente. Además, los estudios han mostrado una fuerte incidencia familiar de IU, lo que sugiere un componente genético contribuye a la susceptibilidad UTI 29. Hemos encontrado que los resultados UTI diferentes visto en las clínicas pueden ser reflejadas por los distintos resultados de la infección experimental UPEC entre puras cepas de ratón 30. Por ejemplo, C3H / gallina, CBA, Los ratones DBA, y C3H / HeOuJ son susceptibles, en una forma dependiente de la dosis infecciosa, a la larga duración cistitis, crónica que se caracteriza por, bacterias alto título de persistentes (> 10 4 unidades formadoras de colonias (ufc) / ml), bacterianas alto título cargas de la vejiga en el sacrificio> 4 semanas después de la infección (WPI), inflamación crónica y necrosis urotelial. Estos ratones también muestran niveles séricos elevados de IL-6, G-CSF, KC, y IL-5 dentro de la primera 24 hpi que sirven como biomarcadores para el desarrollo de la cistitis crónica. Esto puede representar con precisión el curso natural de la infección urinaria en algunas mujeres, ya que los estudios con placebo han demostrado que un gran porcentaje de las mujeres que experimentan ITU mantendrá altos niveles de bacterias en la orina durante varias semanas después de los primeros síntomas de la cistitis, si no se da tratamiento antibiótico 31 , 32. Además, el uso de ratones C3H / HeN, se encontró que una historia de la cistitis crónica es un factor de riesgo significativo para posteriores infecciones recurrentes graves. IU recurrente es el más simanifestación clínica gnificant de IU y el ratón C3H / gallina es actualmente el único modelo estudiado que recapitula una mayor predisposición después de la exposición anterior. Un segundo resultado UTI se recapitula en ratones C57BL / 6, donde la infección aguda UPEC es autolimitada, con la resolución de la inflamación de la vejiga y la bacteriuria plazo aproximado de una semana. Curiosamente, en este modelo, UPEC formar fácilmente reservorios intracelulares quiescentes dentro del tejido de la vejiga de la que UPEC son capaces de salir de un estado latente para reiniciar una UTI activo, potencialmente explicar un mecanismo para misma cepa IU recurrente en seres humanos 33, 34.

Además de las influencias genéticas en UTI susceptibilidad, la introducción de un catéter en la vejiga aumenta en gran medida la probabilidad de tener una infección, así como el aumento de la gama de bacterias capaces de causar una infección. Se ha demostrado que el cateterismo urinario humano provoca histológico ycambios inmunológicos en la vejiga debido a la tensión mecánica que se traduce en una respuesta inflamatoria robusta, exfoliación, edema de la lámina propia y submucusa, adelgazamiento urotelial, y lesión de la mucosa del urotelio y riñón 35,36. Además, el catéter proporciona una superficie para la unión bacteriana a crear un entorno utilizado por varias especies de causar ITUAC. Mientras UPEC siguen siendo un importante contribuyente, Enterococcus faecalis representa el 15% de estos ITUAC 37. E. faecalis es cada vez más resistente a los antibióticos con vancomicina aparición de resistencia, lo que plantea un problema de salud grave 38. E. faecalis poseen numerosos factores de virulencia, incluyendo las toxinas y adhesinas necesarias para la unión a tanto el catéter y el epitelio 38. Durante el cateterismo urinario, el anfitrión es vulnerable a la adhesión microbiana, multiplicación y diseminación en el 39,40 de las vías urinarias. E. Faecalis forma una biopelícula en el catéter, como parte de un mecanismo de persistir en la vejiga y difundir a los riñones, que se reproduce en un modelo de ratón ITUAC 41. Recientemente, se ha demostrado durante la cateterización urinaria, fibrinógeno (Fg) se libera en la vejiga, como parte de la respuesta inflamatoria. Fg se acumula en la vejiga, recubre el catéter y es esencial para E. faecalis la formación de biopelículas, que funciona como un andamio archivo adjunto. En un modelo de ratón C57BL / 6 de ITUAC, descubrimos que E. la formación de biopelículas faecalis en el catéter, y por lo tanto la persistencia en la vejiga, era dependiente de la pilus Ebp, específicamente su EBPA adhesina tip. Se encontró que el dominio N-terminal de EBPA se une específicamente a FG revestir el catéter. Además, se encontró que E. faecalis utiliza Fg como fuente metabolito durante la infección, mejorando así la formación de biopelículas 42.

Los modelos de ratón han demostrado ser fundamental para understanding, así como la predicción de las manifestaciones clínicas de la infección del tracto urinario y la infección urinaria 41. En este artículo se demuestra la preparación del inóculo de la cistitis UPEC aislamos UTI89 e inoculación transuretral de ratones C3H / HeN. Además, demostramos un protocolo para la inserción del catéter en ratones C57BL / 6 y la inoculación de la E. cepa faecalis OG1RF. Ambas técnicas conducen a UTI consistente y fiable o ITUAC en ratones. También mostramos técnicas utilizadas para observar la formación de IBC durante la cistitis aguda y de recogida de orina para el análisis de la cistitis crónica o recurrente. Ratones C3H / HeN se han utilizado para estudiar los aspectos de la UPEC patogénesis incluyendo invasión bacteriana inicial, la formación IBC, filamentación y el desarrollo de la cistitis crónica 23,33,43. Estos parámetros de virulencia también se han estudiado en una variedad de otros antecedentes de ratón 22,33. Para ITUAC, el / modelo C57BL 6 permite la implantación de un cuerpo extraño en la vejiga con la posterior co bacterianaionización, que se puede mantener durante 7 días después de la infección 41. Estos modelos han sido útiles para la evaluación de los mecanismos de virulencia bacteriana, las respuestas del huésped a IU y mecanismos para subvertir las respuestas de acogida, gran parte del cual ha sido posteriormente recapituladas u observadas en las poblaciones humanas clínicos.

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Protocol

Declaración de Ética: La Comisión de Estudios Animal de la Universidad de Washington aprobó todas las infecciones del ratón y procedimientos como parte del protocolo número 20120216, que fue aprobado y expira 11/01/2013 11/01/2016. El cuidado general de los animales fue consistente con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Consejo Superior de Investigaciones Científicas y la Guía de Recursos de Cuidado de Animales del USDA. Procedimientos de eutanasia son consistentes con las "directrices AVMA para la eutanasia de animales 2013 edición."

1. UPEC Protocolo UTI, Inoculación Preparación de la aguja (Figura S1)

  1. Retire la tapa de la aguja de 30 G. Hilo de aproximadamente 1 pulgada de tubo de PE10 sobre el eje de la aguja. UV esterilizar los conjuntos de aguja durante la noche. Agujas sondaje se pueden almacenar indefinidamente en placas de Petri estériles.

2. Preparación del inóculo bacteriano UPEC

  1. Preparar UTI89 inóculo (inicio de 72 horas antes de la inoculacióndía ción)
    1. Streak UTI89 sobre una LB (Luria-Bertani) placa de agar de una madre congelada. Incubar durante la noche a 37 ° C. Escoja una colonia e inocular en 10 ml de LB en un matraz de 125 ml. Se incuba a 37 ° C durante 24 horas, de forma estática.
    2. Inocular 10 l de cultivo durante la noche en 10 ml de LB en un nuevo frasco de 125 ml para una 24 horas adicionales a 37 ° C, de forma estática.
    3. Transferencia de 3 ml (varían en función de la tensión y el tamaño del inóculo se desea) a estériles tubos de 1,5 ml y se centrifuga a 7000 g durante 3 min y resuspender el precipitado en 1x PBS y centrifugar por segunda vez. Resuspender el sedimento bacteriano en 1 ml de PBS 1x.
  2. Medir la densidad óptica bacteriana y ajustar la concentración de la densidad de inóculo deseado. La concentración estándar del inóculo utilizado es 10 7 bacterias; sin embargo, esto puede variar debido al diseño del estudio.

3. La inoculación bacteriana

  1. Limpiar la estación de trabajo con etanol al 70% y cen el borde con papel absorbente (o utilice campana de flujo estéril).
  2. Dibuja hasta 0,9 ml del inóculo bacteriano preparado en un 1 ml (TB) de la jeringa (quitar las burbujas de aire). Coloque una aguja de inoculación estéril preparada con tubería PE10, en la jeringa que contiene el inóculo, a continuación estérilmente recortar el tubo de polietileno.
    NOTA: Dejar 1 mm de tubo por encima de la punta de la aguja para evitar la punción de la vejiga.
  3. Corte un pedazo cuadrado de 1 pulgada de parafina y poner un poco de lubricante quirúrgico (aproximadamente del tamaño de una moneda de diez centavos) en la parte superior.
  4. Anestesiar ratones C3H / HeN femeninos poniéndolos en un frasco de vidrio 32 oz que contiene una bola de té-infusor con bolas de algodón empapadas con 3 ml de isoflurano o cámara vaporizador (siguiendo fabrica protocolo) hasta inconsciente pero todavía respirando normalmente (1 respiración / seg) .
    NOTA: Algunos comités IACUC no aprueban el uso de un frasco o vaporizador. Por favor, siga la indicación del comité IACUC de su institución.
    NOTA: Si el tarro de cristalcon té-ball y / o cono de la nariz con se utilizan bolas de algodón-isoflurano soakd, el animal debe ser observado cuidadosamente para evitar una sobredosis de anestesia y la muerte. La ventaja de usar una cámara de vaporizador y la anestesia es que proporciona la administración de isoflurano controlada que evita sobredosis accidentales. PRECAUCIÓN: El isoflurano es un anestésico de inhalación. Use en un área bien ventilada y minimizar la inhalación.
  5. Retire el ratón de la jarra / vaporizador y colocarlo en la espalda a una toalla de papel y extender las piernas.
  6. Cubrir la nariz del ratón con un cono de la nariz (un tubo conectado al vaporizador que proporciona una dosis controlada isoflurance que viene equipado en algunas unidades de vaporizador) o 50 ml tubo cónico con una bola de algodón que contiene una pequeña cantidad (aproximadamente 1-2 ml ) de isoflurano.
  7. Palpitar suavemente la vejiga para inducir la micción y garantizar una vejiga anulado. Limpie el área periuretral con etanol al 100% limpie. Frote la aguja de inoculación / jeringa, punto primero, en ellubricante quirúrgico.
  8. Inocular cada ratón con 50 l de la solución de bacterias mediante la inserción de la aguja transuretral de la inoculación, aproximadamente 12 mm, y presionando hacia abajo el émbolo de la jeringa suavemente para dispensar el inóculo en la vejiga suavemente (10 l / seg). Retire la aguja de inoculación del ratón.
    NOTA: el retorno inmediato de inóculo en la abertura de la uretra al empezar a inocular indica la inserción incorrecta o incompleta de la aguja.
  9. Retire el ratón de cono de la nariz y devolverlo a su jaula. Repita los pasos 3.3 a 3.8 para cada ratón. Cuando / si indicador del estado de inóculo / cepas, deseche la jeringa y la aguja de inoculación en un contenedor de objetos punzantes aprobado y empezar de nuevo el paso 3.2.
    NOTA: La inoculación con organismos uropatógenos generalmente no causa síntomas de dolor severo. Sin embargo, en raras ocasiones, la administración de grandes dosis de patógenos puede causar fiebre, disminución de la ingesta de alimentos y el agua y el comportamiento anormal. LANimal salud debe ser monitoreado durante todo el experimento. Si los síntomas de dolor son evidentes aviso, un analgésico, como la buprenorfina (0,05-,1 mg / kg por vía subcutánea), se puede aplicar. Los procedimientos deben estar de acuerdo con IACUC de cada institución.

4. Determinación de las cargas bacterianas

  1. Preparar separadas tubos de 5 ml por cada vejiga y los riñones par que se recogerá. Añadir 1 ml de PBS 1x / tubo / vejiga ratón para ser cosechado. Añadir 0,8 ml de PBS 1x / tubo / par de riñones de ratones que se recogerá. Etiqueta de cada tubo para corresponder a un ratón dado. Preparar una placa de 96 pocillos que contenía 180 l de 1x PBS en cada pocillo para 01:10 diluciones en serie.
  2. Limpie el área de trabajo con etanol al 70% y cubrir la zona con una tapa o papel toalla absorbente.
  3. Anestesiar el ratón con isoflurano (véase el paso 3.4) hasta que el ratón deja de respirar durante aproximadamente 1 min, luego se coloca en la tapa o papel toalla absorbente. Otros métodos de euthanasia también son aceptados por los comités IACUC, tales como dióxido de carbono, y puede ser sustituido por sobredosis de isoflurano.
  4. Sacrificio el ratón por dislocación cervical rápido que consiste en restringir el cuello en la base de la cabeza y tirando de la cola horizontalmente lejos del cuerpo hasta que se produce la dislocación.
    NOTA: La mayoría de los comités IACUC requieren un medio secundario de la eutanasia y la dislocación cervical es un método común. Sin embargo, otros métodos pueden ser utilizados si son aprobados por el comité de IACUC.
  5. Coloque el ratón muerto en su parte posterior y rociar etanol al 70% en el abdomen. Diseccionar el ratón, cosechar la vejiga y los riñones, en ese orden para minimizar la contaminación potencial de la sangre después de la disección del riñón. Coloca los órganos de forma independiente en los preparados tubos de 5 ml que contienen 1x PBS (consulte el paso 4.1).
    NOTA: Use tijeras diferentes para la disección externa y para la extracción de órganos para reducir al mínimo la contaminación.
  6. Toque en el tubo para asegurar que los órganos están en tél 1x PBS. Repita el paso 4.3 a 4.5 para cada ratón. Tijeras y pinzas limpias en etanol al 70% después de cada ratón.

5. Recuperación bacteriana

  1. Homogeneizar la vejiga y los riñones cosechada en los tubos de 5 ml con un homogeneizador de tejidos, 15 seg por el riñón y 30 segundos por vejiga. Enjuague secuencialmente homogeneizador en 1x PBS, etanol al 70% y 1x PBS entre las muestras.
  2. Hacer diluciones seriadas 1:10 a 10 -8 y la placa de dilución para cada CFU (unidades formadoras de colonias) en placas de agar LB. Incubar las placas a 37 ° C durante la noche y contar las colonias al día siguiente.

6. Enumeración IBC

  1. Eliminar asépticamente la vejiga y colocarlo en PBS 1x en una placa de 6 pocillos con fondo silicona. Las placas se pueden preparar usando un kit de elastómero de silicona y verter aproximadamente 1 cm de silicona en cada pocillo, ver instrucciones del fabricante. Cortar la vejiga por la mitad con unas tijeras.
  2. El uso de pernos de metal pequeñas splay suavemente el bladder de manera que el lumen de la vejiga quede hacia arriba. Asegúrese de colocar los pasadores en los bordes exteriores de las secciones de la vejiga para asegurar la cantidad máxima de urotelio se expone.
  3. Después de ensanchamiento, lavar suavemente la vejiga una vez con PBS 1x. Retire la PBS 1x por pipeta. Fijar la vejiga mediante la adición de suficiente 3% de paraformaldehído para cubrir toda la vejiga extendidas. PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es cancerígeno. Equipo de protección adecuado, incluyendo guantes, se debe usar en todo momento. La eliminación debe seguir las directrices institucionales.
  4. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hr. Retire solución de paraformaldehído. Lavar una vez con PBS 1x.
  5. Lavar con solución de lavado LacZ (2 mM MgCl2, 0,01% de desoxicolato de sodio y 0,02% Nonidet-p40in 1x PBS) tres veces durante 5 minutos por lavado.
  6. Retire la solución de lavado y añadir suficiente mancha LacZ (9,5 ml de solución de lavado LacZ, 0,4 ml 25 mg / ml de X-gal y 0,1 ml de 100 mM de K-ferrocianuro / K-ferricianuro) para cubrir las vejigas. Se incuba a 30 ° C overniGHT protegido de la luz.
  7. Retire vejigas extendidos de la incubadora y observar los RIG, que aparecen como puntos lagrimales azul como se visualiza con un microscopio de disección, ampliación 40-60X.
    NOTA: A veces un ratón puede orinar antes de la colocación del tubo debajo de la uretra. En este caso, espere 15 a 20 minutos antes de tratar de recoger la orina de nuevo.

7. La orina Colección de bacteriuria CFU Enumeración (No aplicable para ITUAC)

  1. Para recoger la orina antes o después de la infección frenar suavemente el ratón mediante la celebración de la cola y colocarlo sobre una superficie plana elevada (parte superior de la jaula del ratón).
  2. Mantenga un tubo de 1,5 ml estéril debajo de la uretra ratón. Presione suavemente en la parte posterior del ratón cerca de la cola para aplicar presión en la vejiga. Atrapa la orina en el tubo de 1,5 ml.
  3. Hacer diluciones seriadas 1:10 a 10 -7 y placa cada dilución en LB. apropiada Incubar las placas a 37 ° C durante la noche y contar las colonias al día siguiente.

8. ITUAC Protocolo Modelo, Catéter Preparación Agujas de ITUAC Modelo (Figura S2)

  1. Retire la tapa de la aguja de 30 G. Corte un pedazo de tubo de 7 mm PE10 y 5 mm trozo de tubo de silicona como RenaSIL. Enhebrar la aguja con un tubo PE10 hasta que el tubo toca la base de la aguja.
  2. Luego de comer la pieza 5 mm en la aguja que contiene PE10. UV esterilizar las asambleas agujas durante la noche.
    NOTA: Al cargar el tubo de silicona, deje aproximadamente 1 mm de la tubería que se extiende más allá de la punta de la aguja.

9. E. faecalis OG1RF bacteriana Preparación del inóculo

  1. Preparar el inóculo de partida OG1RF 48 hr antes de la inoculación días. Streak OG1RF sobre una placa BHI (infusión de cerebro corazón) a partir de una acción congelada.
  2. Escoja una colonia e inocular en 10 ml de BHI y crecer estáticamente durante 18 horas a 37 ° C. Centrifugar la cultura y lavar el pellet (3 veces) en volúmenes de 1 ml de PBS 1x estéril.
  3. Resuspender el sedimento bacteriano en PBS 1x. Medir la densidad óptica bacteriana y ajustar la concentración a la tamaño del inóculo deseado. La concentración estándar del inóculo utilizado es 10 7; sin embargo, esto puede variar debido al diseño del estudio

10. Catéter de implantación

  1. Limpie la estación de trabajo con 70% de etanol y cubrir la zona con una cubierta absorbente (o usar campana de flujo estéril).
  2. Conecte el catéter de aguja a un vacío de 1 ml (TB) de la jeringa. Corte un pedazo cuadrado de 1 pulgada de parafina y poner un poco de lubricante quirúrgico (aproximadamente del tamaño de una moneda de diez centavos) en la parte superior.
    NOTA: Dos agujas de diferentes se utilizan para la deposición del catéter y para el inóculo de la inoculación accidental minimizado debido a la manipulación mecánica necesaria para la implantación del catéter. Esto también permite la conveniencia de la preparación de un menor número de agujas de inoculación.
  3. Anestesiar C57BL / 6 ratones poniéndolos en un frasco de vidrio 32 oz contiene un tébola -infuser con bolas de algodón empapadas en 3 ml de isoflurano o cámara vaporizador (siguiendo fabrica protocolo) hasta inconsciente pero todavía respirando normalmente (1 respiración / seg).
  4. A continuación, poner el ratón sobre la espalda a una toalla de papel y extender las piernas. Cubrir la nariz del ratón con un cono de nariz o 50 ml tubo cónico con bolas de algodón que contienen una pequeña cantidad (aproximadamente 1-2 ml) de isoflurano.
    PRECAUCIÓN: El isoflurano es un anestésico de inhalación. Use en un área bien ventilada y minimizar la inhalación por el investigador.
  5. Palpitar suavemente la vejiga para inducir la micción y garantizar una vejiga anulado. Limpie el área periuretral con un 100% de etanol limpie.
  6. Desinfectar la zona periuretral con 10% de solución de povidona yodada utilizando un aplicador de algodón de punta. Frote la aguja de inoculación / jeringa, punto primero, en el lubricante quirúrgico.
    NOTA: povidona-yodo se utiliza para la implantación del catéter, que es una solución aséptica más fuerte que el alcohol. La implantación del catéter requieremanipulación más mecánico para insertar el catéter y por lo tanto un mayor potencial de contaminación.
  7. Insertar el catéter en la abertura uretral. Una vez dentro, el uso de pinzas para empujar el (7 mm PE10) pieza larga hacia la vejiga, en consecuencia, empujando el (5 mm de silicona) pequeño catéter y depositarlo en la vejiga. Retire la aguja, con el tubo de 7 mm todavía unido, inmediatamente.

11. La inoculación bacteriana

  1. Siga el protocolo de la inoculación bacteriana en la sección 3, mediante el inóculo preparado de la sección 9. Retire el ratón desde el cono de la nariz y devolverlo a su jaula

12. En cada momento del Sacrificio

  1. Preparar tubos de 5 ml para la vejiga y el riñón (por órganos siguen el paso 4.1) y 1,5 ml tubo Eppendorf de catéteres. Añadir 1 ml de PBS 1x en 1,5 ml tubo Eppendorf para muestras de catéter
  2. Siga los pasos 4.3 a 4.5. Diseccionar el ratón, cosechando la vejiga, los riñones y el catéter, placing los tejidos independientemente en 5 tubos ml que contenían PBS 1x y el catéter en el 1,5 ml Eppendorf (véase el paso 12.1).
    NOTA: Use tijeras diferentes para la disección externa y para la extracción de órganos y recuperación catéter para minimizar la contaminación
  3. A continuación, siga el paso 4.6.

13. Recuperación bacteriana

  1. Por órganos, siga los pasos 5.1 y 5.2. Para la recuperación bacteriana de los catéteres, vórtice a velocidad máxima durante 30 seg, sonicar las muestras de catéter durante 5 min usando un sonicador de baño, y luego vórtice a la máxima velocidad por un 30 seg adicional.
  2. Hacer diluciones seriadas 1:10 a 10 -8 y la placa de dilución para cada CFU enumeración en placas de BHI. Incubar las placas a 37 ºC durante la noche y contar las colonias al día siguiente.

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Representative Results

Los modelos intravesical de IU asociada sin complicaciones y el catéter proporcionan plataformas flexibles para dilucidar los mecanismos moleculares de la patogénesis bacteriana, el impacto de estas enfermedades en el tejido de acogida, así como el desarrollo y ensayo de nuevos enfoques para gestionar estas infecciones comunes y costosos. Dependiendo de la cepa de ratón y el patógeno, la inoculación intravesical se puede utilizar para estudiar las interacciones huésped-patógeno para dilucidar los factores necesarios para iniciar o modular aguda (Figura 1 y 3), crónico o recurrente (Figura 2) la cistitis. Los datos mostrados en la Figura 1 son representativos de fase aguda (24 hpi) la colonización del tracto urinario por la cistitis prototípico UPEC aislar UTI89 44. Después de la inoculación, las infecciones se dejó desarrollar durante 24 hr momento en el cual se sacrifican los ratones y el tejido de la vejiga y el riñón homogeneizado. Los homogeneizados de tejidos son en serie diluted y chapada para la enumeración de bacterias colonizadoras. La colonización crónica UPEC y la inflamación de la vejiga pueden establecerse y mantenerse en algunas líneas de ratones (en particular C3H / HeN) en una dosis infecciosa y la forma dependiente uropatógeno. Cistitis crónica se define como bacteriuria alta titulación persistentes (> 10 4 CFU / ml), inflamación de la vejiga y de la vejiga de alto título cargas bacterianas (> 10 4 CFU / vejiga) en el sacrificio 33. Los datos mostrados en la Figura 2 son las UFC representativos que ocurren 4 semanas después de la inoculación de los ratones C3H / HeN con 2 x 10 7 UFC de UTI89. Bajo estas condiciones experimentales, el 20-50% de los ratones infectados desarrollan cistitis crónica, mientras que el 50-80% restante de los ratones resolver la infección. Esta dualidad de los resultados depende de un puesto de control de huésped-patógeno que se decidió en las primeras 24 hpi. La activación (o no) de los resultados de punto de control en la distribución bimodal observada de títulos bacterianos, que comienza a manifestarse enla orina a las 3 ppp (días después de la infección) y en la vejiga al sacrificio 28 dpi (Figura 2) 33. Los ratones con una historia de la cistitis crónica están predispuestos de manera significativa a la cistitis crónica recurrente tras la exposición después de la infección inicial se borra con terapia de antibióticos 33. Del mismo modo, una historia de infección urinaria es un factor de riesgo conocido para la infección urinaria recurrente en los seres humanos. Por lo tanto, este es el único modelo conocido usado para estudiar la patogénesis de la IU recurrente. Al modelar experimentalmente UTI en fondos de ratón alternos, es importante para determinar si la cepa de ratón es susceptible a la infección del tracto urinario, ITU recurrente o ITUAC, dado que algunas cepas son más o menos resistente al desarrollo de estos síndromes 33.

Una medida adicional de cistitis aguda es la enumeración IBC. Formación IBC está restringida a las células paraguas superficiales diferenciadas terminalmente. IBC cuantificación es una medida informativa de la carga bacteriana durante quiste agudaitis y altos niveles de RIG se correlacionan con el riesgo de desarrollar cistitis crónica 21. Formación IBC sólo se produce en las etapas agudas de la enfermedad. Después de la exfoliación de las células superficiales paraguas, RIG ya no son observados. En el modelo de IU C3H / gallina, los RIG se puede medir 6 horas después de la inoculación de ~ 1 x 10 7 UFC de UTI89 en la vejiga transuretral. Las vejigas están extendidos con pasadores metálicos sobre placas de silicona y se tiñeron para la expresión de LacZ. LacZ, β-galactosidasa, es una enzima bacteriana comúnmente expresado que escinde el enlace β entre galactosa y otros azúcares. Esta enzima puede ser utilizado para detectar bacterias mediante el suministro de X-gal, un análogo de β-galactósido, que produce un color azul tras la escisión. Después de la tinción, las vejigas son imágenes con un microscopio de disección con el RIG apareciendo como punctae puntos azules / púrpuras en el urotelio y RIG se pueden enumerar contando los puntos (Figura 3A). Aunque el número de IChalecos formadas por animal varía, en el C3H / fondo HeN un promedio de ~ 50 IBC son vistos por la vejiga (Figura 3B). Aumento de los GRG de una manera dependiente de la dosis. El número de los RIG que forman varía entre cepas UPEC y fondo del ratón. Por ejemplo, en ratones C57BL / 6, un inóculo de 1 x 10 ~ 7 UTI89 resultados en la formación de varios cientos de RIG por vejiga.

Más allá de la comunidad no complicada adquirida UTI modelo anterior, el cuidado de salud asociado infecciones urinarias representan una carga importante para el sistema de atención de salud. Infecciones urinarias representan aproximadamente el 40% de todas las infecciones asociadas al cuidado de la salud y hasta el 95% de toda la atención de la salud asociado ITU son catéter asociado 45. Aquí se demuestra un modelo de ratón de implantes de vejiga de ITUAC que representa un sistema de gran alcance para el análisis experimental de este problema clínico difícil. Los datos presentados en la Figura 4 son representativos de 24 hr infecciones con el modelo E. faecalis s entrenar OG1RF. Cuando 1 x 10 7 UFC de OG1RF se inoculan por vía intravesical en una vejiga no implantado, la infección comienza a claro por 24 hpi (Figura 4A) y por 3 dpi la infección se ha resuelto 41. Por el contrario, la inoculación de OG1RF en un implantados resultados de la vejiga en la colonización de tanto el catéter y la vejiga, con 10 niveles de colonización vejiga veces más alta a 24 hpi que los observados en las vejigas no implantados (Figura 4A y 4B). Además, esta infección se mantiene a> 10 6 UFC en la vejiga hasta la pérdida del catéter aproximadamente 7 dpi 41. Todos los modelos experimentales descritas son susceptibles a un alto grado de flexibilidad experimental, incluyendo pero no exclusivo de diversos enfoques para la formación de imágenes macroscópica y microscópica de los tejidos y superficies infectadas, tamaños de inóculo alterados y los tiempos de enfermedades, infecciones competitivos, y reciben a los análisis inmunológicos .

ve_content "> Figura 1
Figura 1:. 24 hr colonización del tracto urinario femenino, 7-8 semanas de edad ratones C3H / HeN se inocularon transuretral con ~ 2 x 10 7 UFC de la cistitis prototípico UPEC aislar UTI89 durante 24 horas. UFC representativos recuperadas de los tejidos de la vejiga y los riñones cosechados se muestran, n = 5. La línea de puntos marca el límite inferior de detección (20 CFU).

Figura 2
Figura 2:. 28 días la colonización del tracto urinario femenino, 7-8 semanas de edad ratones C3H / HeN se inocularon transuretral con ~ 2 x 10 7 UFC UTI89. La orina era cobrar en días post infección indicada (ppp) y plateado para el recuento de UFC. También se muestran Representante de la vejiga 28 días y riñón títulos, n = 8. CFU orina menor límite de detección (1000 UFC / ml) se denota por la línea discontinua. Represen línea de puntosts límite del tejido inferior de detección, 20 UFC / tejido.

Figura 3
Figura 3:. IBC enumeración Mujer, 7-8 semanas de edad ratones C3H / HeN se inocularon transuretral con ~ 1 x 10 7 UFC UTI89. Las vejigas se cosecharon 6 hpi y extendidos para la tinción de IBC. (A) Imagen de la vejiga extendidas después de la tinción LacZ. RIG se representan como puntos azules. La imagen insertada es una ampliación digital de la sección de la imagen en el cuadro negro. (B) los números representativos de los RIG formados en ratones C3H / HeN 6 hpi, n = 10.

Figura 4
Figura 4: E. faecalis asociada al catéter UTI. C57BL / 6 ratones fueron inoculados con o sin catéteres con ~ 1 x 10 7 UFC de la (A) E. faecalis colonización de la vejiga en la presencia o ausencia de catéter. (B) E. faecalis colonización del catéter. Prueba de Mann-Whitney se utilizó para experimentos con ratones, p <0,05 fue considerado estadísticamente significativo. **, P <0,005.

Figura S1
Figura S1:. UTI preparación aguja de inoculación Diagrama de muestra de inoculación pasos de preparación de aguja incluyendo materiales necesarios (1), roscado del catéter a la aguja (2) y el recorte de la tubería antes de la inoculación (3).

Figura S2
Figura S2:. Preparación aguja de inoculación ITUAC Diagrama muestra materiales de preparación de aguja de inoculación necesarios (1), roscado del catéter inoculación (2) y el catéter de implantación ena la aguja (3).

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Discussion

Comunidad no complicada adquirió UTI es una infección común y costoso que representa varios millones de consultas de atención primaria cada año 46. Además, ITUAC son una infección adquirida sanitaria común que ha llegado a ser extremadamente costoso para los proveedores de salud como los Centros de Servicios de Medicare y Medicaid no reembolsa a los proveedores por el costo añadido de trato que resulta de un hospital adquirida ITUAC 45. Los modelos de ratón de infección urinaria, tanto la cistitis no complicada y ITUAC, descritas en estos protocolos proporcionan herramientas muy valiosas para la comprensión de las bases moleculares de las interacciones de acogida y de patógenos necesarios para iniciar, mantener y modular el resultado de varias formas de infección urinaria. Estos modelos permiten la aplicación de potentes genética bacteriana y de ratón, inmunológicos, microscópico, herramientas genéticos bioquímicos y químicos para el análisis de UTI 23,47-49. Además, los protocolos descritos aquí han proporcionado una plataformapara el desarrollo y prueba de nuevas estrategias terapéuticas y preventivas incluidos los inhibidores de molécula pequeña de la virulencia bacteriana y las metas de vacunación novedosas y estrategias 50-55.

Hay varias condiciones críticas que se deben mantener para la aplicación exitosa del modelo de la cistitis no complicada. Al igual que con todos los procedimientos de anestesia ratón, se debe tener cuidado para prevenir la mortalidad del ratón debido a un exceso de anestesia. Cuando se prepara el catéter de la inoculación, el tubo de silicona debe ser suficientemente largo para cubrir la punta de la aguja pero no tan largo como para dañar la pared de la vejiga en el cateterismo. Además, debido a la proximidad y el tamaño de la abertura vaginal, se debe tener cuidado para insertar el catéter de inoculación en la uretra y la vagina no. Durante ensanchamiento de la vejiga para la enumeración IBC, es esencial que las vejigas ser extendidas lo más rápidamente posible después de la disección y el tejido se fija para aproximadamente 1 hora, pero no durante la noche. Para IBC enumeración por tinción con LacZ, también es necesario que la bacteria en cuestión producir LacZ durante la colonización de células uroteliales. Cuando se utilizan cepas donde no se produce la enzima LacZ, todavía es posible enumerar los GRG usando microscopía de inmunofluorescencia con anti E. anticuerpos coli o bacterias que expresan GFP. Una característica particular de este modelo es de los diferentes patrones de progresión de la enfermedad y la gravedad presentado por diferentes líneas de ratones endogámicos y la variación de potencial patógeno de la prototípica UPEC cepas 33,56. Estas diferencias son a la vez una fortaleza y la limitación de esta técnica, ya que recapitulan la variación natural de la susceptibilidad del huésped y la diversidad de patógenos que se ha observado en estudios clínicos y fenotípicas mientras que complica el diseño experimental e interpretación 57,58. Estas variaciones proporcionan fuentes de comparación que permiten la elucidación de anfitrión y mechan bacterianaismos modulación de la patogénesis de la infección urinaria no complicada 33,56. Sin embargo, también significa que, debido al grado variable de línea de ratones UTI susceptibilidad, mayor cuidado debe tenerse en la elección de la línea de ratón correcto y cepa UPEC para abordar la cuestión particular, un investigador está pidiendo. Por ejemplo, C57BL / 6 ratones son un excelente modelo de infección aguda, presentando con altos títulos bacterianas y un gran número de RIG en puntos de tiempo tempranos. Esta cepa se resuelve rápidamente la infección entre los 3 y 7 ppp con la única colonización persistente como consecuencia de infecciones renales graves y reservorios intracelulares quiescentes 33,34. El modelo C57BL / 6 puede representar con precisión el resultado más común para muchos pacientes de UTI en la que los síntomas presentes y luego se resuelven. Por el contrario, el fondo de ratón C3H / HeN exhibe un alto grado de susceptibilidad a la cistitis crónica por lo que una cepa ideal para estudiar infecciones urinarias recurrentes. También se han establecido Otros modelos UTIen ACB, DBA y C3H / HeJ ratones fondo demostrando útil para estudiar aspectos particulares de IU 33,59. El inconveniente experimental primaria exhibida por el modelo de la cistitis no complicada es la existencia de múltiples cuellos de botella de infección que limitan la aplicación de gran escala metodologías de cribado genético para el descubrimiento de nuevos factores bacterianos necesarios para la cistitis aguda, crónica y recurrente 60.

Las consideraciones críticas para el modelo de la cistitis no complicada todos aplican al modelo ITUAC basada implante con dos preocupaciones adicionales. En primer lugar, se debe tener cuidado para asegurar que la inserción del implante se lleva a cabo de una manera estéril, debido a la mayor susceptibilidad a la infección de la vejiga conferida por el implante. En segundo lugar, es esencial que el catéter se mantiene en su lugar durante la retirada de la aguja de implantación. Las principales limitaciones del modelo ITUAC son que tiene un menor rango de las bases genéticas de acogida disponibles, el propensity para la pérdida de catéter con el tiempo y la incapacidad para recoger la orina debido a la disfunción de la vejiga resultante de la implantación. Para compensar la pérdida del implante y la incapacidad para controlar la infección a través de análisis de orina longitudinal, este modelo general, requiere un mayor número de ratones sondaje para los puntos de tiempo posteriores y grupos de ratones deben ser sacrificados en cada punto de tiempo deseado. Las anfitrionas limitada genéticos fondos resultados de la frecuencia prohibitivo en la que algunas cepas de ratones, como C3H / gallina, pierden el implante (P. Guiton, comunicación personal 2010). Como resultado, los protocolos ITUAC descritos anteriormente únicamente se han optimizado en la cepa C57BL / 6 mouse. Sin embargo, mientras que la limitación de cepas de ratón disponibles para ITUAC es lamentable, muchas variaciones genómicas se han establecido en el C57BL / 6 de fondo y el modelo ITUAC expande la diversidad bacteriológica disponibles para el estudio durante UTI alterando el entorno de la vejiga para facilitar la colonización por organismos que sonde lo contrario no patógeno en el modelo murino de infección del tracto urinario. Un ejemplo de esto, es el reciente descubrimiento de la función de Fg liberado durante inducida catéter inflamación de la vejiga en E. crecimiento faecalis, la formación de biopelículas, y la persistencia durante ITUAC 42. Este ejemplo ilustra el poder del modelo de implante de ITUAC en la aclaración de no sólo los mecanismos moleculares de la patogénesis bacteriana, sino también el papel de los factores del huésped durante la infección. Todas estas características contribuyen a la comprensión de esta infección clínica relevante, que ha sido poco estudiados previamente.

Además de los enfoques experimentales descritos anteriormente, los modelos de ratón de la cistitis no complicada y ITUAC son susceptibles de un gran número de modificaciones metodológicas. En el caso del modelo de cistitis no complicada, estas modificaciones pueden incluir la reducción del volumen de la inoculación y la fuerza aplicada durante la instilación del inóculo para reducir el número de bacteriasintroducido en los riñones 61, variando la duración de la infección, sacrificando en puntos de tiempo tan temprano como 1 hpi y el uso de ensayos de protección de gentamicina para evaluar el grado en que la uropatógeno ha invadido la vejiga 62 células epiteliales. Las vejigas extendidas de los ratones sacrificados entre 6 y 24 hpi también puede ser seccionado y se tiñeron con anticuerpos frente a diversos huésped y / o epítopos bacterianas y observada bajo fluorescente o microscopía confocal para observar la estructura de IBC, fundente bacteriana y filamentación y tejido huésped condición 25,33 , 63,64. El efecto de la infección uropatógeno y / o implantación en las respuestas inmunitarias locales y sistémicas del huésped se puede evaluar utilizando el sistema de citometría de grano Bioplex o ensayos basados ​​en ELISA para determinar los niveles de citoquinas en la orina o suero, respectivamente 33,65. Por último, la condición del tejido de la vejiga, la ubicación y morfología de las bacterias que colonizan y la estructura del biofilm depositado sobreel catéter se puede evaluar por diversas técnicas de imagen incluyendo microscopía electrónica 25,41.

Estos modelos básicos de la infección también pueden ser adaptados para imitar otros fenómenos clínicamente relevantes incluyendo la IU recurrente y el desarrollo de una respuesta inmune adaptativa a través de múltiples infecciones. En este contexto, repetida infección de ratones C57BL / 6 ratones resulta en una mayor resistencia a la cistitis aguda mientras que en el modelo C3H / HeN, el desarrollo previo de la cistitis crónica seguido por el aclaramiento de la infección a través de la administración de antimicrobianos sensibiliza a estos ratones para desarrollar cistitis crónica en inoculaciones posteriores 66. Además los mecanismos moleculares de factores de riesgo para el desarrollo de la UTI pueden ser examinados. La diabetes y la obesidad han sido ambos demostrado que aumenta la frecuencia y severidad de las infecciones urinarias. La diabetes tipo 2 se pueden modelar genéticamente en ratones en el fondo FVB / NJ y un modelo inducido químicamente de la diabetes tipo 1 ha already ha demostrado que aumenta la gravedad de las infecciones urinarias causadas tanto por la UPEC y K. pneumophila 67,68.

Por último, estos sistemas de modelos representan un campo de pruebas ideal para el desarrollo y optimización de las modalidades terapéuticas encaminadas a tratar o prevenir las infecciones urinarias y ITUAC. La comprensión molecular del patógeno de acogida que ofrecen estos modelos ya ha facilitado el desarrollo de estrategias de vacunación eficaces destinadas a la orientación importantes factores de virulencia 51-55. Además, inhibidores de moléculas pequeñas de UPEC adhesión se han demostrado ser eficaces en el tratamiento de infecciones del tracto urinario sin complicaciones agudas y crónicas, así como ITUAC causada por UPEC 12,69,70. Tanto los modelos de IU no complicada y ITUAC descritas en estos protocolos proporcionan las herramientas experimentales para diseccionar los detalles moleculares de las interacciones huésped-patógeno en el tracto urinario. Estas herramientas se pueden aprovechar en muchas formas de ampliar nuestra understanding de este complejo conjunto de condiciones y facilitar el desarrollo de las intervenciones terapéuticas más eficaces.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

La financiación de este trabajo fue proporcionado por ORWH SCOR P50 DK064540, SR1 DK 051 406, SR1 AI 108749-01, F32 DK 101 171, y F32 DK 104516-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material for catheter and needle preparation:
30 G needles BD Precision Glide 305106 30 G x ½ (0.3 mm x 13 mm)
PE10 polyethylene tubing BD 427400 Inside diameter -0.011 in (0.28 mm); outside diameter – 0.024 in (0.61 mm)
RenaSIL 025 platinum cured silicon tubing Braintree Scientific, Inc SIL 025 inside diameter-0.012 x outside diameter 0.025, 25 ft coil
Material for infections:
Isoflourane – Isothesia Butler Schein 29405 250 ml
Clear Glass Straight-Sided Jar Kimble Chase 5413289V 21
Stainless Steel Tea Infuser Schefs-Amazon Premium Loose Leaf Tea Infuser By Schefs - Stainless Steel - Large Capacity -
Non-sterile cotton balls Fisherbrand 22-456-880
50 ml Falcon tubes VWR 89039-660
Isotec 3 -vaporizer Ohmeda 1224478
Ear punch Fisher Scientific 13-812-201 (when necessary)
Betadine solution Betadine solution 10% Povidie-iodine topical solution
Q-tips Fisher Scientific 22-037-924 6 inches
Diapers for bench Fisherbrand 14206 63 Absorbent Underpads (20”X36”mats)
Surgical lubricant Surgilube 0281-0205-36
Dissecting scissor Fine Science tools, INC 14084-08
Micro-Adson Forceps Fine Science tools, INC 11018-12
1 ml syringe BD 309659 Tuberculin slip tip
Parafilm Bemis PM996 4 inches x 125 FT
Eppendorf rack Fisherbrand 05-541-1
Eppendorf tubes MIDSCI AVX-T-17-C
Harvesting catheters, bladders and kidneys:
Homogenizer PRO Scientific INC Bio-Gen Pro 200
5 ml polypropylene round-bottom tube BD 352063 for organ homogenization
Paper towel Georgia-Pacific
Ethanol Pharmco-AAPER 11100020S 200 proof
Costar™ Clear Polystyrene 96-Well Plates Corning 3788
1x Phosphate sodium saline Sigma-Aldrich P3813
BRANSONIC Ultrasonic cleaner 1210 Branson Ultrasonics Corporation 1210
IBC materials:
6-well tissue culture test plate Techno Plastic Products 92006
Pins Fine Science Tools 26002-20
Sylgard 184 Dow Corning 3097358-1004 Silicone Elastomer Kit
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside) Invitrogen 15520-034 Ultrapure
N, N-Dimethylformamide Sigma Aldrich D4551
MgCl2 (Magnesium chloride) Sigma Aldrich M8266
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich D6750
Nonidet-P40 Roche 11754599001 Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate (K-ferrOcyanide) Sigma Aldrich P3289
Potassium hexacyanoferrate(III) (K-ferrIcyanide) Sigma Aldrich 60299

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Medicina Número 100, UPEC, Uropatógena catéter infección del tracto urinario IBC cistitis crónica

Erratum

Formal Correction: Erratum: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model
Posted by JoVE Editors on 08/18/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. The Protocol section has been updated.

The ethics statement has been updated from:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20120216, which was approved 01/11/2013 and expires 01/11/2016. Overall care of the animals was consistent with The guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

to:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20150226, which expires 12/10/2018. Overall care of the animals was consistent with The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

Step 3 has been updated from:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a 32 ounce glass jar containing a tea-infuser ball with cotton balls soaked with 3 ml of isoflurane or vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a jar or vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    NOTE: If glass jar with tea-ball and/or nose cone with isoflurane-soakd cotton balls are used, the animal must be carefully observed to avoid anesthetic overdose and death. The advantage of using a vaporizer and anesthesia chamber is that it provides controlled isoflurane administration that avoids accidental overdoses. CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the jar/vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) or 50 ml conical tube with a cotton ball containing a small amount (approximately 1-2 ml) of isoflurane.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.

to:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) to maintain anesthetization.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.
Establecimiento y caracterización de IU y ITUAC en un modelo de ratón
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Conover, M. S., Flores-Mireles, A.… More

Conover, M. S., Flores-Mireles, A. L., Hibbing, M. E., Dodson, K., Hultgren, S. J. Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. J. Vis. Exp. (100), e52892, doi:10.3791/52892 (2015).

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