Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

إنشاء وتوصيف UTI وCAUTI في نموذج الفأر

Published: June 23, 2015 doi: 10.3791/52892
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Microbiology and Center for Women's Infectious Disease Research, Washington University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Abstract

التهابات المسالك البولية (UTI) واسعة الانتشار، وهو سبب مهم للمراضة وتزداد مقاومة للعلاج بالمضادات الحيوية. تعاني النساء بشكل غير متناسب UTI: سوف 50٪ من جميع النساء لديهم التهاب المسالك البولية في حياتهم. بالإضافة إلى ذلك، 20-40٪ من هؤلاء النساء الذين لديهم وعلى UTI الأولي تعاني من تكرار مع بعض الذين يعانون تكرار المتكررة مع تدهور خطير في نوعية الحياة والألم وعدم الراحة، وتعطل الأنشطة اليومية، وزيادة تكاليف الرعاية الصحية، وقلة الخيارات العلاجية الأخرى من العلاج الوقائي بالمضادات الحيوية على المدى الطويل. Uropathogenic الإشريكية القولونية (UPEC) هو المسبب الرئيسي للمجتمع المكتسبة UTI. المرتبطة القسطرة UTI (CAUTI) هو الأكثر شيوعا المستشفى العدوى المكتسبة المحاسبة للحصول على مليون الحوادث في الولايات المتحدة سنويا، وتكاليف الرعاية الصحية الهائلة. في حين UPEC هو أيضا السبب الرئيسي لCAUTI، العوامل المسببة الآخرين من أهمية متزايدة بما في ذلك المعويةالبرازية. نحن هنا استخدام نموذجين الماوس راسخة أن ألخص العديد من الخصائص السريرية لهذه الأمراض التي تصيب الإنسان. لUTI، وهذا نموذج C3H / الدجاجة يلخص العديد من الميزات من UPEC الفوعة لوحظ في البشر بما في ذلك ردود المضيفة، وتشكيل IBC وfilamentation. لCAUTI، وهذا نموذج باستخدام C57BL / 6 الفئران، التي تحتفظ زرع المثانة قسطرة، وقد تبين أن تكون عرضة للE. البرازية عدوى المثانة. وتستخدم هذه النماذج التمثيلية للحصول على أفكار جديدة لفتا إلى التسبب في مرض التهاب المسالك البولية، مما يؤدي إلى تطوير علاجات جديدة واستراتيجيات إدارة أو منع.

Introduction

التهابات المسالك البولية (عدوى المسالك البولية) هي واحدة من الالتهابات البكتيرية الأكثر شيوعا ويمكن تقسيمها إلى فئتين استنادا إلى آلية الاستحواذ والمجتمع والمكتسبة بالمستشفيات المكتسبة UTI. وقد أظهرت عدوى المسالك البولية غالبا ما تحدث في النساء والدراسات الأصحاء المكتسبة من المجتمع وأن ما يقرب من 50٪ من النساء واحد على الأقل UTI في حياتهم 1. بالإضافة إلى ذلك، تكرار مشكلة كبيرة. وقالت امرأة لديها العدوى الحادة الأولي لديه فرصة 25-40٪ من وجود عدوى الثانية في غضون ستة أشهر رغم ذلك مناسبا العلاج بالمضادات الحيوية والعديد من النساء ما زلن أن يكون تكرار متكررة 2. البكتيريا التي تسبب هذه الالتهابات أصبحت أيضا المضادات الحيوية على نحو متزايد مقاومة المزيد من بروتوكولات العلاج التباس 3-6. UTI تؤثر على ملايين الأشخاص في كل عام تكلف ما يقرب من 2.5 مليار دولار في النفقات المتعلقة بالرعاية الصحية في الولايات المتحدة، مما يؤكد تأثير وانتشار المرضاكتسبت 1،7 .Nosocomial عدوى المسالك البولية ترتبط أساسا مع وجود أجسام غريبة مثل القسطرة سكنى. المرتبطة القسطرة البولية (CAUTI) تبقى المكتسبة بالمستشفيات الأكثر شيوعا المكتسبة UTI، وهو ما يمثل ~ 70-80٪ من هذه الإصابات 8. وعلاوة على ذلك، يرتبط CAUTI مع زيادة معدلات الاعتلال والوفيات وهذا هو السبب الأكثر شيوعا للالتهابات مجرى الدم الثانوية 9.

ويعتقد UPEC المجتمع المرتبطة المكتسبة عدوى المسالك البولية أن يكون ناجما عن إدخال البكتيريا إلى المثانة من الخزانات في الجهاز الهضمي عن طريق التلاعب الميكانيكية أثناء الجماع الجنسي، وسوء النظافة أو غيرها من ديناميات السكان الميكروبية بين مضيف آخر الكوات 10. مرة واحدة داخل المثانة، UPEC توظيف العديد من عوامل الفوعة، بما في ذلك كبسولة، ونظم الحصول على الحديد، والسموم، البلازميد الفوعة، tRNAs والجزر المرضية وعوامل الاستعمار التي ثبت أنها تلعب دورا في التسبب <سوب> 11-14. حاسمة لإنشاء UPEC الاستعمار، UPEC أيضا ترميز أنواع متعددة من كوصي اللصق فاتحة الطريق (CUP) الشعرة التي تعترف مستقبلات مع خصوصية الفراغية 15. نوع 1 الشعرة، يميل مع adhesin FimH، يتم التعبير من قبل UPEC وربط uroplakins 16 و α-1، β-3 integrins 17، والتي يتم التعبير عنها على سطح اللمعية كل قربة الإنسان والفأر 18 mannosylated. هذه التفاعلات بوساطة FimH تسهل الاستعمار الجرثومي وغزو الخلايا الظهارية السطحية 19،20. مرة واحدة داخل الخلية، يمكن UPEC الهروب إلى السيتوبلازم حيث بكتيريا واحدة يمكن تقسيم بسرعة لتشكيل المجتمع البكتيريا داخل الخلايا (IBC)، التي تقوم عليها النضج، يمكن أن تحتوي على البكتيريا ~ 10 4 21. وقد تجلى تشكيل IBC في لا يقل عن ستة سلالات مختلفة الماوس، C3H / الدجاجة، C3H / HEJ، C57BL / 6، CBA، FVB / NJ وBALB / ج، ومع طائفة واسعة من مختلف تعميم التعليم الابتدائيسلالات C وغيرها المعوية 22-24. لكن الاختلافات الزمنية والمكانية لتشكيل IBC يمكن أن تختلف تبعا لخلفية الماوس والضغط اصابة UPEC. في C3H / الفئران دجاجة مصابة UPEC تنميط سلالات UTI89 أو تشكيل CFT073، IBC يمكن تصور الكتل الحيوية كما صغيرة من البكتيريا في وقت مبكر من 3 HPI (عدوى آخر ساعة). استمر هذا المجتمع لتوسيع ويصل إلى "نقطة الوسط" للتنمية حوالي 6 HPI عندما تحتل قضيب على شكل بكتيريا نسبة كبيرة من مساحة هيولي من خلايا مظلة سطحية متباينة عضال هذه أوائل شكل الحاويات الوسيطة بطريقة متزامن نسبيا مع الأغلبية التي تظهر أبعاد مماثلة والأشكال التضاريسية. ~ 8 HPI البكتيريا في التغيير IBC من العصيات لمكورات التشكل. الحاويات الوسيطة هي عابرة في الطبيعة. وبالتالي، IBC النضج 12-18 النتائج HPI في التوسع المستمر للسكان البكتيريا، تليها filamentation وتشتيت للخروج من واي الخليةث انتشار لاحق إلى الخلايا المجاورة 23. وبالتالي، فإن مكانة IBC يسمح لنمو البكتيريا السريع في بيئة محمية من المضيف الاستجابات المناعية والمضادات الحيوية 25. ويلاحظ في مراحل متميزة من العدوى UPEC التي ينظر إليها في الفئران كما في البشر، مثل الحاويات الوسيطة وfilamentation، ودعم نموذج الفأر من UTI كأداة المفيدة التي يمكن استخدامها لنموذج UTI في البشر 22،26-28.

في حين أن الغالبية العظمى من النساء يعانين من التهاب المسالك البولية في حياتهم، ونتيجة هذه الالتهابات يمكن أن تتراوح من الإصابة الذاتي الحد الحاد مع عدم وجود تكرار لالتهاب المثانة المتكرر بشكل متكرر. وعلاوة على ذلك، فقد أظهرت الدراسات حدوث عائلي قوي من التهاب المسالك البولية، مما يشير إلى يساهم عنصر وراثي للحساسية UTI 29. لقد وجدنا أن نتائج UTI اختلاف ينظر في عيادات يمكن يتجلى في نتائج مختلفة من العدوى UPEC التجريبية بين السلالات الفطرية الماوس 30. على سبيل المثال، C3H / الدجاجة، CBAوالفئران DBA، وC3H / HeOuJ عرضة، بطريقة تعتمد على الجرعة المعدية، ليدوم طويلا، التهاب المثانة المزمن يتميز المستمرة، والبكتيريا عيار عالية (> 10 4 مستعمرة (كفو) / مل)، عيار عالية بكتيريا أعباء المثانة بتضحيات> 4 أسابيع بعد الإصابة (WPI)، والتهاب مزمن، ونخر الظهارة البولية. هذه الفئران أيضا عرض مستويات المصل مرتفعة من IL-6، G-CSF، KC، وIL-5 في HPI 24 الأولى التي تكون بمثابة المؤشرات الحيوية لتطوير التهاب المثانة المزمن. هذا قد يمثل بدقة المسار الطبيعي للUTI في بعض النساء، حيث أظهرت الدراسات همي أن نسبة كبيرة من النساء تعاني سوف UTI محافظة على مستويات عالية من البكتيريا في البول لعدة أسابيع بعد ظهور الأعراض الأولى من التهاب المثانة إذا لم تعط العلاج بالمضادات الحيوية 31 (32 عاما). وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام الفئران C3H / الدجاجة، وجدنا أن تاريخ من التهاب المثانة المزمن هو عامل خطر كبير للعدوى المتكررة الشديدة اللاحقة. المتكررة UTI هو الأكثر سيالمظاهر السريرية gnificant من التهاب المسالك البولية والماوس C3H / الدجاجة حاليا النموذج الوحيد الذي يلخص درس تهيء زادت بعد التعرض السابق. ولخص A نتائج UTI الثانية في C57BL / 6 الفئران حيث الإصابة UPEC الحاد محدودة ذاتيا، مع قرار من التهاب المثانة والجرثومية غضون ما يقرب من أسبوع. ومن المثير للاهتمام، في هذا النموذج، UPEC تشكيل بسهولة الخزانات داخل الخلايا هادئة داخل أنسجة المثانة التي UPEC قادرون على الخروج من حالة سبات على بدء لUTI نشط، ويحتمل أن تشرح آلية واحدة لنفس السلالة UTI المتكرر في البشر 33 و 34.

بالإضافة إلى التأثيرات الوراثية على UTI الحساسية، وإدخال قسطرة في المثانة يزيد كثيرا من احتمال وجود العدوى، وكذلك زيادة نطاق من البكتيريا قادرة على أن تسبب عدوى. وقد ثبت أن القسطرة البولية الإنسان تسبب النسيجية والتغيرات المناعية في المثانة بسبب الإجهاد الميكانيكي الذي يؤدي إلى الاستجابة الالتهابية قوية، تقشير، وذمة من الصفيحة المخصوصة وsubmucusa، ترقق الظهارة البولية، والغشاء المخاطي آفة من الظهارة البولية والكلى 35،36. بالإضافة إلى ذلك، توفر القسطرة سطح لالتصاق البكتيريا وبالتالي خلق بيئة التي تستخدمها العديد من الأنواع أن يسبب CAUTI. في حين UPEC لا تزال مساهما رئيسيا، وحسابات المعوية البرازية عن 15٪ من هذه CAUTI 37. E. البرازية تزداد مقاومة للمضادات الحيوية مع فانكومايسين مقاومة ظهور، مما يشكل مشكلة صحية خطيرة 38. E. البرازية تمتلك عوامل الفوعة عديدة من بينها السموم وadhesins اللازمة لمرفق لكل من القسطرة وظهارة 38. خلال القسطرة البولية، والمضيف هو عرضة للميكروبات التصاق والضرب ونشر في المسالك البولية 39،40. E. faecaالدعاوى تشكل الأغشية الحيوية على القسطرة كجزء من آلية لتستمر في المثانة وتنشر على الكلى، والذي يرد في الماوس CAUTI نموذج 41. في الآونة الأخيرة، وقد تبين أنه خلال القسطرة البولية، ويتم تحريرها الفيبرينوجين (FG) في المثانة كجزء من الاستجابة الالتهابية. FG يتراكم في المثانة، والمعاطف القسطرة، كما أنه ضروري لE. البرازية تشكيل بيوفيلم، يعمل بمثابة سقالة المرفق. في نموذج C57BL / 6 الماوس من CAUTI، اكتشفنا أن E. تشكيل بيوفيلم البرازية على القسطرة، وبالتالي استمرار في المثانة، وكان يعتمد على شعرة EBP، وتحديدا في EbpA طرف adhesin. وجدنا أن المجال N-محطة من EbpA يربط خصيصا لFG طلاء القسطرة. بالإضافة إلى ذلك، فقد وجد أن E. البرازية تستخدم FG كمصدر الأيض خلال العدوى، مما يعزز تشكيل بيوفيلم 42.

وقد أثبتت نماذج الماوس حاسم لالفضوليةtanding وكذلك التنبؤ المظاهر السريرية للالتهاب المسالك البولية وCAUTI 41. في هذه المقالة أن نبرهن إعداد اللقاح من التهاب المثانة UPEC عزل UTI89 والتلقيح عبر الاحليل من الفئران C3H / الدجاجة. بالإضافة إلى ذلك، علينا أن نظهر بروتوكول لإدخال القسطرة في C57BL / 6 الفئران والتلقيح من E. البرازية OG1RF سلالة. كل من هذه الأساليب تؤدي إلى التهاب المسالك البولية ثابت وموثوق بها أو CAUTI في الفئران. نحن أيضا عرض التقنيات المستخدمة لمراقبة تشكيل IBC خلال التهاب المثانة الحاد وجمع البول لتحليل التهاب المثانة المزمن أو المتكرر. وقد استخدمت الفئران C3H / الدجاجة لدراسة جوانب UPEC المرضية بما في ذلك الغزو الأولي البكتيرية، وتشكيل IBC، filamentation وتطوير التهاب المثانة المزمن 23،33،43. كما درست هذه المعايير الفوعة في مجموعة متنوعة من الخلفيات الماوس الأخرى 22،33. لCAUTI، وC57BL / 6 النموذج يسمح لزرع جسم غريب في المثانة مع زملاء البكتيرية لاحقاlonization، والتي لا يمكن الحفاظ عليه لمدة 7 أيام بعد الإصابة 41. كانت هذه نماذج مفيدة لتقييم آليات الفوعة البكتيرية، والاستجابات المضيفة لالتهاب المسالك البولية وآليات لتخريب الردود المضيف، والكثير منها تم تلخيصها في وقت لاحق أو التي لوحظت في البشر السريري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

بيان الأخلاق: وافقت لجنة الدراسات الحيوان في جامعة واشنطن جميع الإصابات الماوس والإجراءات كجزء من البروتوكول رقم 20120216، الذي وافق 2013/1/11 وتنتهي 2016/01/11. وكانت الرعاية الشاملة للحيوانات بما يتفق مع دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المجلس الوطني للبحوث ودليل الموارد العناية USDA الحيوان. إجراءات القتل الرحيم تتفق مع "المبادئ التوجيهية اخر احصاء للالقتل الرحيم للحيوانات 2013 طبعة".

1. UPEC بروتوكول UTI، تلقيح إبرة إعداد (الشكل S1)

  1. إزالة الغطاء من G 30 إبرة. كاتب الموضوع حوالي 1 بوصة من PE10 أنابيب على رمح من الإبرة. الأشعة فوق البنفسجية تعقيم المجالس إبرة بين عشية وضحاها. الإبر القثطار يمكن تخزينها لأجل غير مسمى في لوحات بتري معقمة.

2. UPEC البكتيرية اللقاح التحضير

  1. إعداد UTI89 اللقاح (تبدأ 72 ساعة قبل قائحيوم نشوئها)
    1. خط UTI89 على أحد LB (لوريا، Bertani) لوحة أجار من الأسهم المجمدة. احتضان ليلا 37 درجة مئوية. اختيار مستعمرة وذلك في تطعيم 10 مل من LB في قارورة 125 مل. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة، بشكل ثابت.
    2. تطعيم 10 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها إلى 10 مل من LB في 125 مل الجديدة قارورة ل24 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية، بشكل ثابت.
    3. نقل 3 مل (سوف تختلف بناء على سلالة والمطلوب حجم اللقاح) لالعقيمة 1.5 مل الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي في 7000 x ج لمدة 3 دقائق و resuspend بيليه في برنامج تلفزيوني 1X وأجهزة الطرد المركزي مرة ثانية. resuspend الكرية الجرثومي في 1 مل 1X PBS.
  2. قياس الكثافة البصرية البكتيرية وضبط تركيز لكثافة اللقاح المطلوب. تركيز قياسي من اللقاح المستخدم هو 10 7 البكتيريا. ومع ذلك، و يمكن أن يختلف ويرجع ذلك إلى تصميم الدراسة.

3. البكتيرية التلقيح

  1. تنظيف محطة عمل مع 70٪ من الإيثانول وجعلى المنطقة مع ورقة ماصة (أو استخدام معقم غطاء تدفق).
  2. رسم ما يصل الى 0.9 مل من اللقاح البكتيري مستعد في 1 مل (TB) حقنة (إزالة فقاعات الهواء). نعلق إبرة التطعيم معقمة أعدت مع PE10 أنابيب، على حقنة تحتوي على اللقاح، ثم تقليم sterilely أنابيب البولي ايثيلين.
    ملاحظة: ترك 1 ملم من الأنابيب فوق رأس الإبرة لتجنب ثقب المثانة.
  3. قطع 1 بوصة قطعة مربعة من parafilm ووضع لمسة من زيوت التشحيم الجراحية (حوالي حجم فلسا واحدا) على القمة.
  4. تخدير إناث الفئران C3H / الدجاجة من خلال وضعها في كوب 32 اوقية (الاونصة) جرة تحتوي على الكرة الشاي المساعد على التحلل مع كرات القطن المنقوعة مع 3 مل من الأيزوفلورين أو غرفة المرذاذ (بعد المصنوعات البروتوكول) حتى أغمي عليه ولكن لا يزال يتنفس بشكل طبيعي (1 التنفس / ثانية) .
    ملاحظة: بعض اللجان IACUC لا يوافقون على استخدام جرة أو المرذاذ. يرجى اتباع دلالة لجنة IACUC من مؤسستكم.
    ملاحظة: إذا عاء زجاجيمع الشاي الكرة و / أو مخروط الأنف مع تستخدم كرات القطن الأيزوفلورين soakd، والحيوان يجب التقيد بعناية لتجنب جرعة زائدة من مخدر والموت. وميزة استخدام غرفة المرذاذ والتخدير هو أنه يوفر إدارة الأيزوفلورين للرقابة التي يتجنب تعاطي جرعات زائدة عرضية. تنبيه: الأيزوفلورين هو مخدر الاستنشاق. استخدام في منطقة جيدة التهوية وتقليل الاستنشاق.
  5. إزالة الماوس من جرة / المرذاذ ووضعه على ظهره على منشفة ورقية ونشر الساقين.
  6. تغطية الأنف من الفأرة مع مخروط الأنف (أنبوب متصلة المرذاذ التي توفر جرعة تسيطر isoflurance التي تأتي مجهزة على بعض وحدات المرذاذ) أو 50 مل أنبوب مخروطي مع كرة من القطن تحتوي على كمية صغيرة (حوالي 1-2 مل ) من الأيزوفلورين.
  7. يخفق بلطف المثانة للحث على التبول وضمان المثانة باطلة. مسح المنطقة حول الإحليل مع الإيثانول بنسبة 100٪ مسح. ربت على التلقيح إبرة / المحاقن، ونقطة البداية، فيزيوت التشحيم الجراحي.
  8. تطعيم كل فأر مع 50 ميكرولتر من الحل البكتيريا عن طريق إدخال إبرة التطعيم transurethrally، ما يقرب من 12 ملم، والضغط على أسفل على المكبس حقنة بلطف في صرف اللقاح في المثانة بلطف (10 ميكرولتر / ثانية). إزالة إبرة التطعيم من الماوس.
    ملاحظة: العودة الفورية للاللقاح في فتح مجرى البول عند بداية لتطعيم تشير الإدراج غير لائق أو غير كاملة من الإبرة.
  9. إزالة الماوس من مخروط الأنف وإعادته إلى قفصه. كرر الخطوات من 3،3-3،8 لكل الماوس. عندما / إذا تبديل الظروف اللقاح / السلالات، والتخلص من المحاقن والتلقيح الإبرة في وعاء الأدوات الحادة وافق والبدء من جديد خطوة 3.2.
    ملاحظة: التلقيح مع الكائنات uropathogenic عموما لا يسبب أعراض شديدة الألم. ومع ذلك، في حالات نادرة، وإدارة جرعات كبيرة من مسببات الأمراض قد تسبب الحمى، والحد من تناول الغذاء والماء والسلوك الشاذ. Aيجب مراقبة الصحة نيمال في كافة مراحل التجربة. إذا ظهرت أعراض الألم العلنية هي إشعار، مسكن، مثل البوبرينورفين (0،05 حتي 0،1 ملغ / كغ تحت الجلد معين)، ويمكن تطبيقها. وينبغي أن تكون الإجراءات وفقا للIACUC كل مؤسسة.

4. تحديد أعباء البكتيرية

  1. إعداد منفصلة 5 مل أنابيب لكل المثانة والكلى الزوج أن تحصد. إضافة 1ml من PBS 1X / أنبوب / الماوس المثانة إلى أن تحصد. إضافة 0.8 مل من برنامج تلفزيوني 1X / أنبوب / زوج من الكلى الماوس لأن تحصد. تسمية كل أنبوب لتتوافق مع ماوس معين. إعداد لوحة 96-جيدا تحتوي على 180 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X في كل بئر ل01:10 التخفيفات التسلسلية.
  2. تنظيف منطقة العمل مع الايثانول 70٪ وتغطية المنطقة مع غطاء أو ورقة ماصة منشفة.
  3. تخدير الماوس مع isoflurane (انظر الخطوة 3.4) حتى يتوقف الماوس يتنفس لحوالي 1 دقيقة، ثم وضعه على غلاف أو ورقة ماصة منشفة. وسائل أخرى للeuthanaوتقبل سيا أيضا من قبل لجان IACUC، مثل ثاني أكسيد الكربون، ويمكن أن تكون بديلا عن جرعة زائدة الأيزوفلورين.
  4. التضحية الماوس عن طريق خلع عنق الرحم السريع الذي يتكون من تقييد الرقبة عند قاعدة الرأس وسحب الذيل أفقيا بعيدا عن الجسم حتى يحدث التفكك.
    ملاحظة: تتطلب معظم اللجان IACUC وسيلة ثانوية للقتل الرحيم وخلع عنق الرحم هو أسلوب شائع. ومع ذلك، وسائل أخرى يمكن استخدامها إذا تمت الموافقة عليها من قبل لجنة IACUC.
  5. وضع فأر ميت على ظهرها ورذاذ الايثانول 70٪ على البطن. تشريح الفأر، حصاد المثانة والكلى، في هذا النظام للحد من التلوث المحتمل من الدم بعد تشريح الكلى. وضع أجهزة مستقل في المعدة 5 مل أنابيب تحتوي على برنامج تلفزيوني 1X (راجع الخطوة 4.1).
    ملاحظة: استخدم مقص مختلفة لتشريح الخارجي وللحصاد الجهاز للحد من التلوث.
  6. الاستفادة من أنبوب لضمان الأجهزة هي في تيانه برنامج تلفزيوني 1X. كرر الخطوة 4،3-4،5 لكل الماوس. مقص وملقط في 70٪ من الإيثانول بعد كل فأر نظيفة.

5. البكتيرية الانتعاش

  1. التجانس المثانة والكلى تحصد في 5 مل أنابيب مع الخالط الأنسجة، 15 ثانية في الكلى و30 ثانية في المثانة. شطف الخالط بشكل تسلسلي في برنامج تلفزيوني 1X، و 70٪ من الإيثانول و1X PBS بين العينات.
  2. جعل المسلسل 01:10 التخفيفات إلى 10 -8 وطبق كل تخفيف لCFU (وحدات تشكيل مستعمرة) على لوحات أجار LB. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية خلال الليل والاعتماد المستعمرات في اليوم التالي.

6. IBC التعداد

  1. جو معقم و مطهر إزالة المثانة ووضعه في برنامج تلفزيوني 1X في لوحة 6 جيدا مع قاع السيليكون. لوحات يمكن إعدادها باستخدام مجموعة سيليكون المطاط الصناعي وسكب حوالي 1 سم من السيليكون في كل بئر، انظر بتصنيع التعليمات. قطع المثانة في نصف باستخدام المقص.
  2. باستخدام دبابيس معدنية صغيرة وسع بلطف BLADدير بحيث تجويف المثانة تواجه التصاعدي. تأكد من وضع المسامير على حواف الخارجية من الأقسام المثانة لضمان يتعرض كمية ممكنة من الظهارة البولية.
  3. بعد التفلطح، وغسل بلطف المثانة مرة واحدة مع 1X PBS. إزالة برنامج تلفزيوني 1X بواسطة الماصة. إصلاح المثانة عن طريق إضافة ما يكفي من 3٪ امتصاص العرق لتغطية المثانة مفلطحة بأكملها. تنبيه: لامتصاص العرق مسبب للسرطان. يجب ارتداء معدات الوقاية المناسبة، بما في ذلك القفازات، في جميع الأوقات. التخلص ينبغي أن يتبع المبادئ التوجيهية المؤسسية.
  4. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. إزالة حل لامتصاص العرق. يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X.
  5. تغسل بمحلول غسيل LacZ (2 مم MgCl 2، 0.01٪ deoxycholate الصوديوم و 0.02٪ nonidet-p40in 1X PBS) ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل يغسل.
  6. إزالة محلول الغسيل وإضافة ما يكفي من LacZ وصمة عار (9.5 مل LacZ محلول الغسيل، 0.4 مل 25 ملغ / مل X-غال و 0.1 مل من 100 ملي K-فيروسيانيد / K-فيري سيانيد) لتغطية الخزانات. احتضان عند 30 ° C overniGHT محمية من الضوء.
  7. إزالة قربة مفلطحة من الحاضنة ومراقبة الحاويات الوسيطة، والتي تظهر نقاط والزرقاء كما تصور مع نطاق تشريح، 40-60X التكبير.
    ملاحظة: في بعض الأحيان قد ماوس التبول قبل وضع أنبوب تحت الإحليل. في هذه الحالة، انتظر 15-20 دقيقة قبل محاولة جمع البول مرة أخرى.

7. البول كوكتيل لتجرثم كفو التعداد (لا ينطبق على CAUTI)

  1. لجمع البول قبل أو إصابة آخر كبح بلطف الماوس من خلال عقد الذيل وضعه على سطح مستو مرتفع (أعلى من الماوس قفص).
  2. عقد أنبوب معقم 1.5 مل تحت الإحليل الماوس. اضغط برفق على الجزء الخلفي من الماوس بالقرب من الذيل إلى ممارسة الضغط على المثانة. قبض على البول في الأنبوب 1.5 مل.
  3. جعل المسلسل 01:10 التخفيفات إلى 10 -7 وطبق كل تخفيف على LB. مناسب احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية خلال الليل والاعتماد المستعمرات في اليوم التالي.

8. CAUTI البروتوكول النموذجي، قسطرة إعداد إبر لCAUTI نموذج (الشكل S2)

  1. إزالة الغطاء من G 30 إبرة. قطع 7 ملم قطعة من PE10 أنابيب و 5 مم قطعة من أنابيب السيليكون مثل RenaSIL. كاتب الموضوع الإبرة مع PE10 أنابيب حتى يلمس الأنابيب قاعدة الإبرة.
  2. ثم إطعام 5 مم قطعة على الإبرة التي تحتوي على PE10. الأشعة فوق البنفسجية تعقيم الإبر المجالس بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: عند تحميل أنابيب السيليكون، وترك حوالي 1 ملم من أنابيب تمتد الماضي طرف الإبرة.

9. E. البرازية OG1RF البكتيرية اللقاح التحضير

  1. إعداد OG1RF اللقاح تبدأ 48 ساعة قبل يوم التلقيح. خط OG1RF الصعود إلى BHI (الدماغ القلب ضخ) لوحة من الأسهم المجمدة.
  2. اختيار مستعمرة وذلك في تطعيم 10 مل من BHI وتنمو بشكل ثابت لمدة 18 ساعة على 37 درجة مئوية. أجهزة الطرد المركزي في الثقافة ويغسل بيليه (3 مرات) في 1 مل حجم العقيمة برنامج تلفزيوني 1X.
  3. resuspend الكرية الجرثومي في برنامج تلفزيوني 1X. قياس الكثافة البصرية البكتيرية وضبط تركيز لحجم اللقاح المطلوب. تركيز قياسي من اللقاح المستخدم هو 10 7؛ ومع ذلك، و يمكن أن يختلف ويرجع ذلك إلى تصميم الدراسة

10. قسطرة زرع

  1. تنظيف محطة عمل مع 70٪ من الإيثانول وتغطية المنطقة مع غطاء ماصة (أو استخدام معقم غطاء تدفق).
  2. إرفاق قسطرة إبرة إلى فارغة 1 مل (TB) حقنة. قطع 1 بوصة قطعة مربعة من parafilm ووضع لمسة من زيوت التشحيم الجراحية (حوالي حجم فلسا واحدا) على القمة.
    ملاحظة: يتم استخدام اثنين من الإبر مختلفة لترسب القسطرة وللاللقاح إلى أدنى حد ممكن التلقيح العرضي بسبب التلاعب الميكانيكية اللازمة للقسطرة الزرع. وهذا يسمح أيضا لتوفير الراحة للإعداد أقل إبر التطعيم.
  3. تخدير C57BL / 6 الفئران عن طريق وضعها في كوب 32 اوقية (الاونصة) جرة تحتوي على الشايالكرة -infuser مع كرات القطن المنقوعة في 3 مل من الأيزوفلورين أو غرفة المرذاذ (بعد بتصنيع البروتوكول) حتى وعيه ولكن لا يزال يتنفس بشكل طبيعي (1 التنفس / ثانية).
  4. ثم وضع الماوس على ظهرها على منشفة ورقية ونشر الساقين. تغطية الأنف من الفأرة مع مخروط الأنف أو 50 مل أنبوب مخروطي مع كرات القطن تحتوي على كمية صغيرة (حوالي 1-2 مل) من الأيزوفلورين.
    تنبيه: الأيزوفلورين هو مخدر الاستنشاق. استخدام في منطقة جيدة التهوية وتقليل استنشاق من قبل الباحث.
  5. يخفق بلطف المثانة للحث على التبول وضمان المثانة باطلة. مسح المنطقة حول الإحليل مع الإيثانول بنسبة 100٪ مسح.
  6. تطهير المنطقة حول الإحليل مع 10٪ محلول البوفيدون اليود باستخدام قضيب من القطن طرف. ربت على التلقيح إبرة / المحاقن، ونقطة البداية، في مواد التشحيم الجراحي.
    ملاحظة: يتم استخدام Povidine اليود لزرع القسطرة، وهو حل العقيم أقوى من الكحول. يتطلب زرع قسطرةالمزيد من التلاعب الميكانيكية لادخال القسطرة، وبالتالي إمكانية أكبر للتلوث.
  7. إدراج قسطرة في فتح مجرى البول. مرة واحدة في، واستخدام الملقط لدفع (7 ملم PE10) قطعة طويلة نحو المثانة، وبالتالي دفع (5 ملم السيليكون) القسطرة الصغيرة وإيداعها في المثانة. إزالة الإبرة، مع 7 مم الأنابيب لا تزال تعلق على الفور.

11. البكتيرية التلقيح

  1. متابعة بروتوكول التلقيح البكتيرى في الباب 3، باستخدام اللقاح المحضر من قسم 9. إزالة الماوس من مخروط الأنف وإعادته إلى قفصه

12. في كل مرة نقطة النحر

  1. إعداد 5 مل أنابيب لالمثانة والكلى (للأجهزة اتبع الخطوة 4.1) و 1.5 مل إيبندورف أنبوب القسطرة ل. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X إلى 1.5 مل إيبندورف أنبوب للعينات القسطرة
  2. اتبع الخطوات 4،3-4،5. تشريح الفأر، حصاد المثانة والكلى والقسطرة، جيش التحرير الشعبى الصينىالوراثة والأنسجة بشكل مستقل إلى 5 مل أنابيب تحتوي على برنامج تلفزيوني 1X والقسطرة في 1.5 مل إيبندورف (راجع الخطوة 12،1).
    ملاحظة: استخدم مقص مختلفة لتشريح الخارجي وللحصاد الجهاز واسترجاع القسطرة للحد من التلوث
  3. ثم اتبع الخطوة 4.6.

13. البكتيرية الانتعاش

  1. لأجهزة، اتبع الخطوات 5.1 و 5.2. لاسترداد البكتيرية من القسطرة، دوامة في أقصى سرعة لمدة 30 ثانية، يصوتن العينات القسطرة لمدة 5 دقائق باستخدام sonicator الحمام، ثم دوامة في أقصى سرعة لمدة 30 ثانية إضافية.
  2. جعل المسلسل 01:10 التخفيفات إلى 10 -8 وطبق كل تخفيف لCFU التعداد على لوحات BHI. احتضان لوحات على 37 درجة مئوية خلال الليل والاعتماد المستعمرات في اليوم التالي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نماذج من داخل المثانة غير معقدة والقسطرة UTI المرتبطة توفر منصات مرنة لتوضيح الآليات الجزيئية المرضية البكتيرية، وتأثير هذه الأمراض على الأنسجة المضيف، وتطوير واختبار نهج جديدة لإدارة هذه العدوى المشتركة والمكلفة. اعتمادا على سلالة الماوس والممرض، التلقيح إينترفسكل يمكن استخدامها لدراسة التفاعلات المضيف الممرض لتوضيح العوامل اللازمة لبدء أو تحوير الحادة (الشكل 1 و 3)، المزمن أو المتكرر (الشكل 2) التهاب المثانة. البيانات هو مبين في الشكل 1 هي تمثيلية من المرحلة الحادة (24 HPI) المسالك البولية الاستعمار من قبل UPEC التهاب المثانة تنميط عزل UTI89 44. بعد التلقيح، ويسمح للالتهابات لتطوير لمدة 24 ساعة وعندها يتم التضحية الفئران والمثانة والكلى النسيج المتجانس. والخليط الأنسجة هي مخفف متسلسلإد ومطلي لتعداد البكتيريا استعمار. يمكن أن تنشأ الاستعمار UPEC المزمن والتهاب المثانة والحفاظ في بعض خطوط الماوس (لا سيما C3H / الدجاجة) في جرعة المعدية وممرض لجهاز البول بطريقة تعتمد. ويعرف التهاب المثانة المزمن كما المستمرة الجرثومية عيار عالية (> 10 4 CFU / مل)، والتهاب المثانة وعيار ارتفاع أعباء المثانة البكتيرية (> 10 4 CFU / المثانة) في التضحية 33. البيانات هو مبين في الشكل 2 هي CFUs التمثيلية التي تحدث 4 أسابيع بعد التلقيح من الفئران C3H / الدجاجة مع 2 × 10 7 CFUs من UTI89. في ظل هذه الظروف التجريبية، 20-50٪ من الفئران المصابة تطوير التهاب المثانة المزمن في حين أن الباقي 50-80٪ من الفئران حل العدوى. وهذه الازدواجية في النتيجة تعتمد على نقطة تفتيش المضيف الممرض الذي قرر داخل HPI 24 الأولى. تفعيل (أو لا) النتائج نقاط التفتيش في توزيع النسقين لوحظ من التتر البكتيرية، والتي تبدأ في إظهار فيالبول في 3 نقطة في البوصة (أيام من العدوى آخر) والمثانة في التضحية 28 نقطة في البوصة (الشكل 2) 33. الفئران الذين لديهم تاريخ من التهاب المثانة المزمن وميالا إلى حد كبير في التهاب المثانة المزمن المتكرر على التحدي بعد يتم مسح العدوى الأولية مع العلاج بالمضادات الحيوية 33. وبالمثل، فإن تاريخ UTI هو أحد عوامل الخطر المعروفة لالتهاب المسالك البولية المتكررة في البشر. وهكذا، وهذا هو النموذج الوحيد المعروف تستخدم لدراسة التسبب في التهاب المسالك البولية المتكررة. عندما النمذجة تجريبيا UTI في الخلفيات الماوس بديلة، من المهم تحديد ما إذا كانت سلالة الفأر هو عرضة لالتهاب المسالك البولية، التهاب المسالك البولية المتكررة أو CAUTI، بالنظر إلى أن بعض السلالات هي أكثر أو أقل مقاومة لتطوير هذه المتلازمات 33.

لقياس إضافية من التهاب المثانة الحاد IBC التعداد. يقتصر تشكيل IBC للخلايا مظلة سطحية متباينة عضال. IBC الكمي هو إجراء بالمعلومات من عبء البكتيرية خلال الكيس الحاديتيس ومستويات عالية من الحاويات الوسيطة ترتبط مع خطر الاصابة التهاب المثانة المزمن 21. تشكيل IBC يحدث إلا في المراحل الحادة من المرض. بعد تقشير الخلايا السطحية مظلة، الحاويات الوسيطة لم تعد الملاحظة. في نموذج UTI C3H / الدجاجة، الحاويات الوسيطة يمكن قياسها 6 ساعات بعد بتلقيح ~ 1 × 10 7 CFU من UTI89 في المثانة transurethrally. ومفلطحة قربة مع المسامير المعدنية على لوحات السيليكون وملطخة للتعبير عن LacZ. LacZ، β غالاكتوزيداز، هو الإنزيم البكتيري أعرب عادة أن يشق الربط بين β الجلاكتوز والسكريات الأخرى. هذا الإنزيم يمكن استخدامها للكشف عن البكتيريا عن طريق توريد X-غال، والتماثلية β-غالاكتوزيد، التي تنتج اللون الأزرق على الانقسام. بعد التلوين، يتم تصوير قربة تحت المجهر تشريح مع الحاويات الوسيطة كما تظهر punctae الزرقاء / نقاط الأرجواني على الظهارة البولية والحاويات الوسيطة يمكن حصرها عن طريق حساب النقاط (الشكل 3A). في حين بلغ عدد IBCS شكلت لكل حيوان يختلف، في C3H / الخلفية الدجاجة في المتوسط ​​~ 50 الحاويات الوسيطة وينظر في المثانة (الشكل 3B). زيادة الحاويات الوسيطة بطريقة تعتمد على الجرعة. عدد الحاويات الوسيطة التي تشكل ما بين UPEC وسلالات خلفية الماوس. على سبيل المثال، في C57BL / 6، وهو اللقاح من ~ 1 × 10 7 UTI89 النتائج في تشكيل عدة مئات من الحاويات الوسيطة في المثانة.

ما وراء المجتمع غير معقدة المكتسبة UTI غرار أعلاه، الرعاية الصحية المرتبطة عدوى المسالك البولية تمثل عبئا كبيرا على نظام الرعاية الصحية. عدوى المسالك البولية تمثل حوالي 40٪ من جميع حالات العدوى المصاحبة للرعاية الصحية، وتصل إلى 95٪ من جميع خدمات الرعاية الصحية المرتبطة عدوى المسالك البولية هي القسطرة المرتبطة 45. نحن هنا يبرهن على وجود نموذج الفأر المثانة زرع من CAUTI التي تمثل نظاما قويا للتحليل التجريبي لهذه المشكلة السريرية الصعبة. البيانات المقدمة في الشكل 4 هي تمثيلية من 24 ساعة العدوى مع نموذج E. البرازية الصورة تدريب OG1RF. عندما 1 × 10 7 CFU من OG1RF يتم تلقيح intravesically إلى المثانة unimplanted، يبدأ العدوى إلى اضحا بنسبة 24 HPI (الشكل 4A) وبنسبة 3 نقطة في البوصة وحل إصابة 41. على العكس، تلقيح OG1RF إلى نتائج زرع المثانة في استعمار كل من القسطرة والمثانة، مع 10 أضعاف أعلى مستويات المثانة الاستعمار في 24 HPI من تلك التي لوحظت في قربة unimplanted (الشكل 4A و 4B). بالإضافة إلى ذلك، يتم الاحتفاظ هذه العدوى في> 10 6 كفو في المثانة حتى فقدان القسطرة حوالي 7 نقطة في البوصة 41. جميع النماذج التجريبية وصفها قابلة للدرجة عالية من المرونة التجريبية، بما في ذلك ولكن ليس حكرا على الطرق المختلفة لتصوير العيانية والمجهرية في الأنسجة والأسطح المصابة، والأحجام اللقاح تغيير والأوقات المرض، العدوى تنافسية، واستضافة التحاليل المناعية .

ve_content "> الشكل 1
الشكل 1: 24 ساعة المسالك البولية الاستعمار أنثى، 7-8 الاسبوع القديمة C3H / الفئران دجاجة تم تلقيح transurethrally مع ~ 2 × 10 7 CFU من UPEC التهاب المثانة تنميط عزل UTI89 لمدة 24 ساعة. وترد CFUs تمثيلية تعافى من المثانة والكلى الأنسجة التي تحصد، ن = 5. خط متقطع يدل على الحد الأدنى من الكشف (20 كفو).

الرقم 2
الشكل 2: 28 يوم المسالك البولية الاستعمار أنثى، 7-8 الاسبوع C3H القديم / الفئران دجاجة تم تلقيح transurethrally مع ~ 2 × 10 7 CFU UTI89. كان البول تتجمع في المشار إليه عدوى أيام آخر (نقطة في البوصة) ومطلي لCFU التعداد. كما يتم عرض تمثيلية المثانة 28 يوما والكلى التتر، ن يرمز = 8. البول كفو الحد الأدنى من الكشف (1000 خلية / مل) من خلال خط متقطع. تمثيلا خط منقطنهاية الخبر الحد الأنسجة أقل من الكشف، 20 CFU / الأنسجة.

الشكل (3)
الرقم 3: IBC تعداد أنثى، 7-8 الاسبوع C3H القديم / الفئران دجاجة تم تلقيح transurethrally مع ~ 1 × 10 7 CFU UTI89. تم حصاد قربة 6 HPI ومفلطحة لIBC تلطيخ. (A) صورة المثانة مفلطحة بعد LacZ تلطيخ. يتم تمثيل الحاويات الوسيطة كنقاط الزرقاء. الصورة أقحم هو التكبير الرقمي للقسم من الصورة في مربع أسود. (B) أرقام التمثيلية للالحاويات الوسيطة التي تشكلت في الفئران C3H / الدجاجة 6 HPI، ن = 10.

الرقم 4
الرقم 4: E. البرازية المرتبطة القسطرة UTI. C57BL / تم تلقيح 6 الفئران مع أو بدون القسطرة مع ~ 1 × 10 7 CFU لل (A) E. البرازية الاستعمار المثانة في وجود أو عدم وجود القسطرة. (B) E. البرازية القسطرة الاستعمار. وقد استخدم مان ويتني U اختبار للتجارب الماوس، اعتبر p <0.05 دلالة إحصائية. **، p <0.005.

الرقم S1
الرقم S1: UTI إعداد التلقيح إبرة يعرض مخطط التلقيح خطوات إعداد إبرة بما في ذلك المواد اللازمة (1)، خيوط من القسطرة إلى إبرة (2) وتقليم الأنبوب قبل التلقيح (3).

الرقم S2
الرقم S2: CAUTI إعداد التلقيح إبرة يعرض رسم بياني إعداد المواد التلقيح إبرة الحاجة (1)، خيوط للقسطرة التلقيح (2) وغرس قسطرة فيإلى الإبرة (3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

اكتسب المجتمع غير معقدة UTI هو عدوى شائعة ومكلفة يمثل عدة ملايين من مرة الرعاية الصحية الأولية في كل عام 46. بالإضافة إلى ذلك، CAUTIs هي العدوى المكتسبة الرعاية الصحية الشائعة التي أصبحت مكلفة لمقدمي الرعاية الصحية باعتبارها مراكز الرعاية الصحية والخدمات الطبية للغاية لم تعد تسدد مقدمي تكاليف إضافية تتمثل في العلاج الناتجة عن المستشفى المكتسبة CAUTI 45. نماذج الماوس من التهاب المسالك البولية، التهاب المثانة غير معقدة على حد سواء وCAUTI، وصفت في هذه البروتوكولات توفر أدوات لا تقدر بثمن لفهم الأساس الجزيئي للمضيف والممرض التفاعلات اللازمة لبدء وصيانة وتحوير نتائج عدة أشكال التهاب المسالك البولية. هذه النماذج تسمح لتطبيق علم الوراثة قوية البكتيرية والماوس، المناعية، المجهرية، والأدوات الوراثية الحيوية والكيميائية لتحليل UTI 23،47-49. بالإضافة إلى ذلك، البروتوكولات المذكورة هنا وقد وفرت إطارالتطوير واختبار الاستراتيجيات العلاجية والوقائية الجديدة بما في ذلك مثبطات الصغيرة جزيء من الفوعة البكتيرية والأهداف التطعيم جديدة واستراتيجيات 50-55.

هناك العديد من الشروط الهامة التي يجب الحفاظ على التطبيق الناجح للنموذج التهاب المثانة غير معقدة. كما هو الحال مع جميع الإجراءات الماوس تخدير، يجب توخي الحذر لمنع وفيات الماوس بسبب الإفراط في التخدير. عند إعداد القسطرة التلقيح، يجب أن تكون أنابيب السيليكون طويلة بما يكفي لتغطية رأس الإبرة ولكن ليس ذلك طالما أن الضرر جدار المثانة على القسطرة. بالإضافة إلى ذلك، نظرا لقربها وحجم فتحة المهبل، يجب توخي الحذر لادخال القسطرة بتلقيح في مجرى البول وليس المهبل. خلال التفلطح المثانة لIBC التعداد، فمن الضروري أن يكون قربة مفلطحة في أسرع وقت ممكن تشريح التالية والأنسجة تكون ثابتة لAPPROximately 1 ساعة، ولكن ليس بين عشية وضحاها. لIBC التعداد من قبل LacZ تلطيخ، فمن الضروري أيضا أن البكتيريا في مسألة إنتاج LacZ خلال الاستعمار خلية الظهارة البولية. عند استخدام سلالات حيث لم يتم إنتاج إنزيم LacZ، فإنه لا يزال من الممكن تعداد الحاويات الوسيطة باستخدام المناعي المجهري مع مكافحة E. الأجسام المضادة كولاي أو البكتيريا معربا عن GFP. ميزة واحدة معينة من هذا النموذج هو أنماط مختلفة من تطور المرض وشدة قدمها مختلف خطوط الماوس الفطرية والقدرة المسببة للأمراض متفاوتة من تنميط UPEC سلالات 33،56. هذه الاختلافات على حد سواء قوة والحد من هذه التقنية لأنها تلخص الاختلاف الطبيعي قابلية المضيف وتنوع العوامل المسببة للأمراض التي لوحظت في الدراسات السريرية والمظهرية في حين تعقيد التصميم التجريبي وتفسير 57،58. توفر هذه الاختلافات مصادر المقارنة السماح لاستجلاء المضيف وميكان البكتيريةالمذهبين تحوير التسبب في غير معقدة UTI 33،56. ومع ذلك، فإنها تعني أيضا أنه نظرا لدرجة متفاوتة من خط الماوس UTI الحساسية، ويجب اتخاذ أقصى درجات الحذر في اختيار خط الماوس الصحيح والضغط UPEC لمعالجة مسألة معينة محقق يسأل. على سبيل المثال، C57BL / 6 الفئران ونموذجا ممتازا من العدوى الحادة، مع تقديم التتر البكتيرية عالية وأعداد كبيرة من الحاويات الوسيطة في وقت مبكر نقاط الوقت. هذه السلالة ثم بسرعة حل العدوى بين 3 و 7 نقطة في البوصة مع الاستعمار المستمر الوحيد الناتجة عن التهابات حادة في الكلى والخزانات داخل الخلايا هادئة 33،34. يجوز للC57BL / 6 نموذج بدقة تمثل النتيجة الأكثر شيوعا للكثير من المرضى التهاب المسالك البولية التي الأعراض الحالية ومن ثم حلها. على العكس من ذلك، على خلفية الماوس C3H / الدجاجة يسلك على درجة عالية من القابلية للالتهاب المثانة المزمن مما يجعلها عبئا المثالي لدراسة التهابات المسالك البولية المتكررة. كما تم إنشاء نماذج UTI أخرىفي CBA، DBA وC3H / HEJ الفئران خلفية تثبت مفيدة لدراسة جوانب معينة من UTI 33،59. العيب الابتدائية التجريبية التي أظهرتها نموذج التهاب المثانة غير معقدة هو وجود اختناقات العدوى متعددة تحد من تطبيق منهجيات الفحص الجيني على نطاق واسع لاكتشاف العوامل البكتيرية الجديدة اللازمة لالحادة والمزمنة والمتكررة التهاب المثانة 60.

تطبيق الاعتبارات الهامة لنموذج التهاب المثانة غير معقدة فقط إلى زرع أساس نموذج CAUTI مع اثنين من مخاوف إضافية. أولا، يجب توخي الحذر لضمان أن الإدراج من عملية الزرع تتم بطريقة معقمة، وذلك بسبب زيادة التعرض للعدوى المثانة التي يمنحها عملية الزرع. ثانيا، من الضروري أن القسطرة سيعقد في المكان أثناء إزالة الإبرة زرع. القيود الرئيسية لنموذج CAUTI هي أن لديها مجموعة انخفض من خلفيات وراثية المضيف المتاحة، والعلاقات العامةopensity لفقدان القسطرة مع مرور الوقت وعدم القدرة على جمع البول بسبب ضعف المثانة الناجمة عن زرع. للتعويض عن فقدان الزرع وعدم القدرة على مراقبة العدوى عن طريق تحليل البول الطولي، يتطلب هذا النموذج بشكل عام ارتفاع أعداد الفئران مقسطر للحصول على نقاط وقت لاحق ومجموعات من الفئران لا بد من التضحية في كل نقطة زمنية المطلوب. المضيف محدود الوراثية النتائج الخلفيات من وتيرة باهظة الذي بعض سلالات الفئران، مثل C3H / الدجاجة، تفقد عملية الزرع (P. Guiton والاتصالات الشخصية 2010). ونتيجة لذلك، فقط تم تحسين البروتوكولات CAUTI المذكورة أعلاه في سلالة الماوس C57BL / 6. ومع ذلك، في حين أن الحد من سلالات الفئران المتاحة لCAUTI أمر مؤسف، تم إنشاء العديد من الاختلافات الجينومية في C57BL / 6 الخلفية ونموذج CAUTI يوسع التنوع الجرثومي المتاحة للدراسة خلال UTI عن طريق تغيير البيئة المثانة لتسهيل الاستعمار الكائنات الحية التي هيخلاف ذلك غير ممرضة في نموذج الفئران من التهاب المسالك البولية. مثال على ذلك، هو الاكتشاف الأخير لدور FG صدر خلال القسطرة التي يسببها التهاب المثانة في E. نمو البرازية، وتشكيل بيوفيلم، والمثابرة خلال CAUTI 42. يوضح هذا المثال قوة نموذج زرع من CAUTI في توضيح ليس فقط الآليات الجزيئية بكتيريا المرضية ولكن أيضا على دور العوامل المضيفة خلال العدوى. كل هذه الميزات تسهم في فهم هذه العدوى السريرية ذات الصلة، والتي تم الكافي في السابق.

بالإضافة إلى النهج التجريبية المذكورة أعلاه، ونماذج الماوس من التهاب المثانة غير معقدة وCAUTI قابلة لعدد كبير من التعديلات المنهجية. في حالة نموذج التهاب المثانة غير معقدة، يمكن لهذه التعديلات تشمل خفض حجم التلقيح والقوة المطبقة خلال تقطير من اللقاح للحد من عدد من البكتيرياالتي أدخلت على الكلى 61، تتفاوت مدة العدوى، والتضحية في نقطة زمنية في وقت مبكر من 1 HPI واستخدام المقايسات حماية جنتاميسين لتقييم إلى أي مدى قد غزا ممرض لجهاز البول في المثانة الخلايا الظهارية 62. التضحية قربة مفلطحة من الفئران بين 6 و 24 HPI يمكن أيضا مقطوع وملطخة أجسام مضادة لمختلف المضيفة و / أو الحواتم البكتيرية، ولاحظ تحت المجهر فلوري أو متحد البؤر لمراقبة IBC هيكل، الصهر البكتيرية وfilamentation والأنسجة المضيف حالة 25،33 ، 63،64. تأثير الإصابة ممرض لجهاز البول و / أو زرع على الاستجابات المناعية المحلية والنظامية للمضيف يمكن تقييم استخدام نظام cytometric حبة Bioplex أو فحوصات ELISA استنادا إلى تحديد مستويات خلوى في البول أو الدم على التوالي 33،65. أخيرا، وحالة الأنسجة المثانة، موقع ومورفولوجية البكتيريا استعمار وهيكل بيوفيلم أودعت علىيمكن تقييم القسطرة من قبل مختلف تقنيات التصوير بما في ذلك الإلكترون المجهري 25،41.

ويمكن أيضا أن هذه النماذج الأساسية للعدوى أن تتكيف مع تقليد غيرها من الظواهر ذات الصلة سريريا بما المتكررة UTI وتطوير استجابة مناعية التكيف عبر إصابات متعددة. في هذا السياق، كرر إصابة C57BL / 6 النتائج الفئران في زيادة المقاومة للالتهاب المثانة الحاد بينما في النموذج C3H / الدجاجة، وتطوير السابقة التهاب المثانة المزمن تليها إزالة العدوى عن طريق إدارة مضادات الميكروبات محسس هذه الفئران لتطوير التهاب المثانة المزمن على التطعيمات اللاحقة 66. بالإضافة إلى الآليات الجزيئية من عوامل الخطر لتطوير UTI يمكن دراستها. على حد سواء ثبت السكري والسمنة لزيادة وتيرة وشدة عدوى المسالك البولية. داء السكري من النوع 2 يمكن أن تكون على غرار وراثيا في الفئران في الخلفية FVB / NJ ولها بالفعل نموذجا يسببها كيميائيا من داء السكري من النوع 1ذ ثبت أن زيادة شدة عدوى المسالك البولية التي تسببها كل من UPEC وK. المستروحة 67،68.

وأخيرا، فإن هذه النظم نموذج تمثل الأرض تثبت مثالية لتطوير وتحسين طرائق علاجية تهدف إلى علاج أو الوقاية من عدوى المسالك البولية وCAUTIs. فهم الجزيئي للتفاعلات العوامل المسببة للأمراض المضيفة التي تقدمها هذه النماذج قد سهلت بالفعل وضع استراتيجيات التطعيم فعالة تهدف إلى استهداف الفوعة أهمية العوامل 51-55. بالإضافة إلى ذلك، وقد ثبت أن مثبطات جزيء صغير من UPEC التصاق أن تكون فعالة في علاج عدوى المسالك البولية الحاد والمزمن غير معقدة وكذلك CAUTIs الناجمة عن UPEC 12،69،70. كل من التهاب المسالك البولية وCAUTI نماذج غير معقدة وصفها في هذه البروتوكولات توفر أدوات تجريبية لتشريح التفاصيل الجزيئية من التفاعلات المضيف الممرض في المسالك البولية. يمكن الاستفادة هذه الأدوات في العديد من الطرق لتوسيع التفهم لديناغرام من هذه مجموعة معقدة من الظروف وتسهيل تطوير التدخلات العلاجية أكثر فعالية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgments

تم توفير التمويل لهذا العمل من ORWH SCOR P50 DK064540، RO1 DK 051406، RO1 AI 108749-01، F32 DK 101171، وF32 DK 104516-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material for catheter and needle preparation:
30 G needles BD Precision Glide 305106 30 G x ½ (0.3 mm x 13 mm)
PE10 polyethylene tubing BD 427400 Inside diameter -0.011 in (0.28 mm); outside diameter – 0.024 in (0.61 mm)
RenaSIL 025 platinum cured silicon tubing Braintree Scientific, Inc SIL 025 inside diameter-0.012 x outside diameter 0.025, 25 ft coil
Material for infections:
Isoflourane – Isothesia Butler Schein 29405 250 ml
Clear Glass Straight-Sided Jar Kimble Chase 5413289V 21
Stainless Steel Tea Infuser Schefs-Amazon Premium Loose Leaf Tea Infuser By Schefs - Stainless Steel - Large Capacity -
Non-sterile cotton balls Fisherbrand 22-456-880
50 ml Falcon tubes VWR 89039-660
Isotec 3 -vaporizer Ohmeda 1224478
Ear punch Fisher Scientific 13-812-201 (when necessary)
Betadine solution Betadine solution 10% Povidie-iodine topical solution
Q-tips Fisher Scientific 22-037-924 6 inches
Diapers for bench Fisherbrand 14206 63 Absorbent Underpads (20”X36”mats)
Surgical lubricant Surgilube 0281-0205-36
Dissecting scissor Fine Science tools, INC 14084-08
Micro-Adson Forceps Fine Science tools, INC 11018-12
1 ml syringe BD 309659 Tuberculin slip tip
Parafilm Bemis PM996 4 inches x 125 FT
Eppendorf rack Fisherbrand 05-541-1
Eppendorf tubes MIDSCI AVX-T-17-C
Harvesting catheters, bladders and kidneys:
Homogenizer PRO Scientific INC Bio-Gen Pro 200
5 ml polypropylene round-bottom tube BD 352063 for organ homogenization
Paper towel Georgia-Pacific
Ethanol Pharmco-AAPER 11100020S 200 proof
Costar™ Clear Polystyrene 96-Well Plates Corning 3788
1x Phosphate sodium saline Sigma-Aldrich P3813
BRANSONIC Ultrasonic cleaner 1210 Branson Ultrasonics Corporation 1210
IBC materials:
6-well tissue culture test plate Techno Plastic Products 92006
Pins Fine Science Tools 26002-20
Sylgard 184 Dow Corning 3097358-1004 Silicone Elastomer Kit
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside) Invitrogen 15520-034 Ultrapure
N, N-Dimethylformamide Sigma Aldrich D4551
MgCl2 (Magnesium chloride) Sigma Aldrich M8266
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich D6750
Nonidet-P40 Roche 11754599001 Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate (K-ferrOcyanide) Sigma Aldrich P3289
Potassium hexacyanoferrate(III) (K-ferrIcyanide) Sigma Aldrich 60299

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. Dis Mon. 49, 53-70 (2003).
  2. Foxman, B., et al. Risk factors for second urinary tract infection among college women. American journal of epidemiology. 151, 1194-1205 (2000).
  3. Gupta, K., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Increasing antimicrobial resistance and the management of uncomplicated community-acquired urinary tract infections. Annals of internal medicine. 135, 41-50 (2001).
  4. Gupta, K., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Isolation of fluoroquinolone-resistant rectal Escherichia coli. after treatment of acute uncomplicated cystitis. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 56, 243-246 (2005).
  5. Gupta, K., Sahm, D. F., Mayfield, D., Stamm, W. E. Antimicrobial resistance among uropathogens that cause community-acquired urinary tract infections in women: a nationwide analysis. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 89-94 (2001).
  6. Gupta, K., Scholes, D., Stamm, W. E. Increasing prevalence of antimicrobial resistance among uropathogens causing acute uncomplicated cystitis in women. Jama. 281, 736-738 (1999).
  7. Jarvis, W. R. Selected aspects of the socioeconomic impact of nosocomial infections: morbidity, mortality, cost, and prevention. Infect Control Hosp Epidemiol. 17, 552-557 (1996).
  8. Lo, E., et al. Strategies to prevent catheter-associated urinary tract infections in acute care hospitals: 2014 update. Infection control and hospital epidemiology : the official journal of the Society of Hospital Epidemiologists of America. 35, 464-479 (2014).
  9. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature reviews Urology. 7, 653-660 (2010).
  10. Hooton, T. M., Stamm, W. E. Diagnosis and treatment of uncomplicated urinary tract infection. Infect Dis Clin North Am. 11, 551-581 (1997).
  11. Hannan, T. J., et al. LeuX tRNA-dependent and -independent mechanisms of Escherichia coli. pathogenesis in acute cystitis. Molecular microbiology. 67, 116-128 (2008).
  12. Cusumano, C. K., Hung, C. S., Chen, S. L., Hultgren, S. J. Virulence plasmid harbored by uropathogenic Escherichia coli. functions in acute stages of pathogenesis. Infection and immunity. 78, 1457-1467 (2010).
  13. Dhakal, B. K., Mulvey, M. A. The UPEC pore-forming toxin alpha-hemolysin triggers proteolysis of host proteins to disrupt cell adhesion, inflammatory, and survival pathways. Cell host & microbe. 11, 58-69 (2012).
  14. Garcia, E. C., Brumbaugh, A. R., Mobley, H. L. Redundancy and specificity of Escherichia coli. iron acquisition systems during urinary tract infection. Infection and immunity. 79, 1225-1235 (2011).
  15. Bergsten, G., Wullt, B., Svanborg, C. Escherichia coli., fimbriae, bacterial persistence and host response induction in the human urinary tract. International journal of medical microbiology : IJMM. 295, 487-502 (2005).
  16. Zhou, G., et al. Uroplakin Ia is the urothelial receptor for uropathogenic Escherichia coli.: evidence from in vitro FimH binding. J Cell Sci. 114, 4095-4103 (2001).
  17. Eto, D. S., Jones, T. A., Sundsbak, J. L., Mulvey, M. A. Integrin-mediated host cell invasion by type 1-piliated uropathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 3, e100 (2007).
  18. Taganna, J., de Boer, A. R., Wuhrer, M., Bouckaert, J. Glycosylation changes as important factors for the susceptibility to urinary tract infection. Biochemical Society transactions. 39, 349-354 (2011).
  19. Mulvey, M. A., et al. Induction and evasion of host defenses by type 1-piliated uropathogenic Escherichia coli. Science. 282, 1494-1497 (1998).
  20. Mysorekar, I. U., Mulvey, M. A., Hultgren, S. J., Gordon, J. I. Molecular regulation of urothelial renewal and host defenses during infection with uropathogenic Escherichia coli. The Journal of biological chemistry. 277, 7412-7419 (2002).
  21. Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population Dynamics and Niche Distribution of Uropathogenic Escherichia coli. during Acute and Chronic Urinary Tract Infection. Infect. Immun. 79, 4250-4259 (2011).
  22. Garofalo, C. K., et al. Escherichia coli. from urine of female patients with urinary tract infections is competent for intracellular bacterial community formation. Infection and immunity. 75, 52-60 (2007).
  23. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli. in urinary tract pathogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 1333-1338 (2004).
  24. Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae. urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infection and immunity. 76, 3337-3345 (2008).
  25. Anderson, G. G., et al. Intracellular bacterial biofilm-like pods in urinary tract infections. Science. 301, 105-107 (2003).
  26. Robino, L., et al. Detection of intracellular bacterial communities in a child with Escherichia coli. recurrent urinary tract infections. Pathogens and disease. 68, 78-81 (2013).
  27. Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4, e329 (2007).
  28. Horsley, H., et al. Enterococcus faecalis subverts and invades the host urothelium in patients with chronic urinary tract infection. PloS one. 8, e83637 (2013).
  29. Hopkins, W. J., Uehling, D. T., Wargowski, D. S. Evaluation of a familial predisposition to recurrent urinary tract infections in women. American Journal of Medical Genetics. 83, 422-424 (1999).
  30. Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli. urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infection and immunity. 66, 2798-2802 (1998).
  31. Mabeck, C. E. Treatment of uncomplicated urinary tract infection in non-pregnant women. Postgraduate medical journal. 48, 69-75 (1972).
  32. Ferry, S., Holm, S., Stenlund, H., Lundholm, R., Monsen, T. The natural course of uncomplicated lower urinary tract infection in women illustrated by a randomized placebo controlled study. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 36, 296-301 (2004).
  33. Hannan, T. J., Mysorekar, I. U., Hung, C. S., Isaacson-Schmid, M. L., Hultgren, S. J. Early severe inflammatory responses to uropathogenic E. coli. predispose to chronic and recurrent urinary tract infection. PLoS Pathog. 6, (2010).
  34. Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli. persistence and eradication from the urinary tract. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 14170-14175 (2006).
  35. Glahn, B. E., Braendstrup, O., Olesen, H. P. Influence of drainage conditions on mucosal bladder damage by indwelling catheters. II. Histological study. Scandinavian journal of urology and nephrology. 22, 93-99 (1988).
  36. Goble, N. M., Clarke, T., Hammonds, J. C. Histological changes in the urinary bladder secondary to urethral catheterisation. British journal of urology. 63, 354-357 (1989).
  37. Ronald, A. The etiology of urinary tract infection: traditional and emerging pathogens. Dis Mon. 49, 71-82 (2003).
  38. Arias, C. A., Murray, B. E. The rise of the Enterococcus.: beyond vancomycin resistance. Nature reviews. Microbiology. 10, 266-278 (2012).
  39. Garibaldi, R. A., Burke, J. P., Dickman, M. L., Smith, C. B. Factors predisposing to bacteriuria during indwelling urethral catheterization. The New England journal of medicine. 291, 215-219 (1974).
  40. Warren, J. W. Catheter-associated urinary tract infections. Infect Dis Clin North Am. 11, 609-622 (1997).
  41. Guiton, P. S., Hung, C. S., Hancock, L., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. Enterococcal biofilm formation and virulence in an optimized murine model of foreign body-associated urinary tract infections. Infection and immunity. 78, 4166-4175 (2010).
  42. Flores-Mireles, A. L., Pinkner, J. S., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. EbpA vaccine antibodies block binding of Enterococcus faecalis. to fibrinogen to prevent catheter-associated bladder infection in mice. Science translational medicine. 6, 254ra127 (2014).
  43. Martinez, J. J., Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Pinkner, J. S., Hultgren, S. J. Type 1 pilus-mediated bacterial invasion of bladder epithelial cells. The EMBO Journal. 19, 2803-2812 (2000).
  44. Hultgren, S. J., Schwan, W. R., Schaeffer, A. J., Duncan, J. L. Regulation of production of type 1 pili among urinary tract isolates of Escherichia coli. Infection and immunity. 54, 613-620 (1986).
  45. Chenoweth, C. E., Gould, C. V., Saint, S. Diagnosis, Management, and Prevention of Catheter-Associated Urinary Tract Infections. Infect. Dis. Clin. North Am. 28, 105-+ (2014).
  46. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7, 653-660 (2002).
  47. Justice, S. S., Hunstad, D. A., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Filamentation by Escherichia coli. subverts innate defenses during urinary tract infection. Proc Natl Acad Sci USA. 103, (1988).
  48. Song, J., et al. TLR4-mediated expulsion of bacteria from infected bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14966-14971 (2009).
  49. Wang, H., Min, G., Glockshuber, R., Sun, T., Kong, X. P. Uropathogenic E. coli. adhesin-induced host cell receptor conformational changes: implications in transmembrane signaling transduction. Journal of molecular biology. 392, 352-361 (2009).
  50. Cusumano, C. K., et al. Treatment and prevention of urinary tract infection with orally active FimH inhibitors. Science translational medicine. 3, 109-115 (2011).
  51. Langermann, S., Ballou, W. R. Vaccination utilizing the FimCH complex as a strategy to prevent Escherichia coli. urinary tract infections. J Infect Dis. 183, S84-S86 (2001).
  52. Langermann, S., et al. Vaccination with FimH adhesin protects cynomolgus monkeys from colonization and infection by uropathogenic Escherichia coli. J Infect Dis. 181, 774-778 (2000).
  53. Langermann, S., et al. Prevention of mucosal Escherichia coli. infection by FimH-adhesin-based systemic vaccination. Science. 276, 607-611 (1997).
  54. Alteri, C. J., Hagan, E. C., Sivick, K. E., Smith, S. N., Mobley, H. L. T. Mucosal Immunization with Iron Receptor Antigens Protects against Urinary Tract Infection. Plos Pathogens. 5, (2009).
  55. Russo, T. A., et al. The siderophore receptor IroN of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. is a potential vaccine candidate. Infect. Immun. 71, 7164-7169 (2003).
  56. Schwartz, D. J., et al. Positively selected FimH residues enhance virulence during urinary tract infection by altering FimH conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15530-15537 (2013).
  57. Czaja, C. A., et al. Prospective cohort study of microbial and inflammatory events immediately preceding Escherichia coli. recurrent urinary tract infection in women. J Infect Dis. 200, 528-536 (2009).
  58. Chen, S. L., et al. Genomic Diversity and Fitness of E. coli. Strains Recovered from the Intestinal and Urinary Tracts of Women with Recurrent Urinary Tract Infection. Science Translational Medicine. 5, 2013 (2013).
  59. Schilling, J. D., Mulvey, M. A., Vincent, C. D., Lorenz, R. G., Hultgren, S. J. Bacterial invasion augments epithelial cytokine responses to Escherichia coli. through a lipopolysaccharide-dependent mechanism. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 166, 1148-1155 (2001).
  60. Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population Dynamics and Niche Distribution of Uropathogenic Escherichia coli. during Acute and Chronic Urinary Tract Infection. Infect. Immun. 79, 4250-4259 (2011).
  61. Chan, C. Y., St John,, L, A., Abraham, S. N. Mast Cell Interleukin-10 Drives Localized Tolerance in Chronic Bladder Infection. Immunity. 38, 349-359 (2013).
  62. Justice, S. S., Lauer, S. R., Hultgren, S. J., Hunstad, D. A. Maturation of intracellular Escherichia coli. communities requires SurA. Infect. Immun. 74, 4793-4800 (2006).
  63. Justice, S. S., Hunstad, D. A., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Filamentation by Escherichia coli. subverts innate defenses during urinary tract infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19884-19889 (2006).
  64. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli. in urinary tract pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 1333-1338 (2004).
  65. Guiton, P. S., Hannan, T. J., Ford, B., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. Enterococcus faecalis. Overcomes Foreign Body-Mediated Inflammation To Establish Urinary Tract Infections. Infect. Immun. 81, 329-339 (2013).
  66. Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder. Journal of Immunology. 176, 3080-3086 (2006).
  67. Rosen, D. A., Hung, C. -S., Kline, K. A., Hultgren, S. J. Streptozocin-induced diabetic mouse model of urinary tract infection. Infect. Immun. 76, 4290-4298 (2008).
  68. Daneshgari, F., Leiter, E. H., Liu, G., Reeder, J. Animal Models of Diabetic Uropathy. Journal of Urology. 182, S8-S13 (2009).
  69. Guiton, P. S., et al. Combinatorial Small-Molecule Therapy Prevents Uropathogenic Escherichia coli. Catheter-Associated Urinary Tract Infections in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56, 4738-4745 (2012).
  70. Totsika, M., et al. A FimH Inhibitor Prevents Acute Bladder Infection and Treats Chronic Cystitis Caused by Multidrug-Resistant Uropathogenic Escherichia coli. ST131. Journal of Infectious Diseases. 208, 921-928 (2013).

Tags

الطب، العدد 100،

Erratum

Formal Correction: Erratum: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model
Posted by JoVE Editors on 08/18/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. The Protocol section has been updated.

The ethics statement has been updated from:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20120216, which was approved 01/11/2013 and expires 01/11/2016. Overall care of the animals was consistent with The guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

to:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20150226, which expires 12/10/2018. Overall care of the animals was consistent with The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

Step 3 has been updated from:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a 32 ounce glass jar containing a tea-infuser ball with cotton balls soaked with 3 ml of isoflurane or vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a jar or vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    NOTE: If glass jar with tea-ball and/or nose cone with isoflurane-soakd cotton balls are used, the animal must be carefully observed to avoid anesthetic overdose and death. The advantage of using a vaporizer and anesthesia chamber is that it provides controlled isoflurane administration that avoids accidental overdoses. CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the jar/vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) or 50 ml conical tube with a cotton ball containing a small amount (approximately 1-2 ml) of isoflurane.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.

to:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) to maintain anesthetization.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.
إنشاء وتوصيف UTI وCAUTI في نموذج الفأر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Conover, M. S., Flores-Mireles, A.… More

Conover, M. S., Flores-Mireles, A. L., Hibbing, M. E., Dodson, K., Hultgren, S. J. Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. J. Vis. Exp. (100), e52892, doi:10.3791/52892 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter