Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Oprichting en karakterisering van UTI en Cauti in een muismodel

Published: June 23, 2015 doi: 10.3791/52892
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Microbiology and Center for Women's Infectious Disease Research, Washington University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Abstract

Urineweginfecties (UTI) een hoge prevalentie, een belangrijke oorzaak van morbiditeit en steeds resistent zijn tegen behandeling met antibiotica. Vrouwtjes worden onevenredig getroffen door UTI: 50% van alle vrouwen zal een UTI in hun leven hebben. Bovendien, 20-40% van de vrouwen die een eerste UTI zal een herhaling met enkele lijden frequente recidieven met een ernstige verslechtering van de kwaliteit van leven, pijn en ongemak, verstoring van de dagelijkse activiteiten te lijden, toegenomen kosten van de gezondheidszorg, en weinig behandelingsopties andere dan op lange termijn antibiotica profylaxe. Uropathogene Escherichia coli (UPEC) is de belangrijkste verwekker van de gemeenschap verworven UTI. Katheter geassocieerd UTI (Cauti) is de meest voorkomende ziekenhuis verworven infectie goed voor een miljoen exemplaren in de VS jaarlijks en dramatische kosten van de gezondheidszorg. Terwijl UPEC is de primaire oorzaak van Cauti andere veroorzakers zijn van toegenomen belang zoals Enterococcusfaecalis. Hier gebruiken we twee gevestigde muismodellen dat veel van de klinische karakteristieken van deze menselijke ziekten recapituleren. Voor UTI, een C3H / HeN model recapituleert veel van de functies van UPEC virulentie waargenomen bij de mens, waaronder gastheer reacties, IBC vorming en filamentatie. Voor Cauti een model gebruikt C57BL / 6 muizen, die catheter blaas implantaten behouden, is gevoelig te zijn E. faecalis blaasontsteking. Deze representatieve modellen worden gebruikt om opvallende nieuwe inzichten in de pathogenese van de ziekte UTI, wat leidt tot de ontwikkeling van nieuwe therapeutische en beheer of preventiestrategieën.

Introduction

Urineweginfecties (UWI) zijn één van de meest voorkomende bacteriële infecties en kan worden onderverdeeld in twee categorieën op basis van het mechanisme van de overname, de gemeenschap en nosocomiale verworven UTI. Gemeenschap verworven UTIs vaak voor bij gezonde vrouwen en studies hebben aangetoond dat ongeveer 50% van de vrouwen minstens één UTI in hun leven 1. Bovendien herhaling is een groot probleem. Een vrouw die een eerste acute infectie heeft, heeft een 25-40% kans op een tweede infectie binnen zes maanden, ondanks de juiste behandeling met antibiotica en veel vrouwen blijven frequente recidieven 2 hebben. De bacteriën die deze infecties worden steeds antibioticaresistente verdere verstorende behandelingsprotocollen 3-6. UTI invloed miljoenen mensen per jaar kost ongeveer 2,5 miljard dollar in de gezondheidszorg gerelateerde kosten in de VS, het benadrukken van de impact en de prevalentie van de ziekte1,7 .Nosocomial verworven urineweginfecties zijn vooral geassocieerd met de aanwezigheid van buitenlandse instanties, zoals inwonende katheters. Katheter geassocieerde urineweginfecties (Cauti) blijven de meest voorkomende nosocomiale UTI verworven, goed voor ~ 70-80% van dergelijke infecties 8. Bovendien Cauti is geassocieerd met verhoogde morbiditeit en mortaliteit en het is de meest voorkomende oorzaak van secundaire infecties bloedbaan 9.

UPEC geassocieerd gemeenschap verworven urineweginfecties zijn gedacht te worden veroorzaakt door de introductie van bacteriën in de blaas van reservoirs in het maagdarmkanaal via mechanische manipulatie tijdens de geslachtsgemeenschap, slechte hygiëne of andere microbiële populatiedynamiek tussen verschillende gastheer niches 10. Eenmaal in de blaas, UPEC gebruik talrijke virulentiefactoren, zoals capsule, iron acquisition systems, toxinen, een virulentie plasmide, tRNAs, pathogeniteit eilanden en kolonisatie factoren waarvan is aangetoond een rol te spelen in de pathogenese <sup> 11-14. Van cruciaal belang voor de oprichting van UPEC kolonisatie, UPEC ook coderen meerdere soorten lijm chaperone Usher pathway (CUP) pili dat receptoren met stereo- specificiteit 15 herkennen. Type 1 pili, gaven de adhesine FimH, worden uitgedrukt door UPEC en binden gemannosyleerd uroplakins 16 en α-1, β-3 integrines 17, die zijn uitgedrukt op het luminale oppervlak van zowel mens en muis blazen 18. Deze FimH-gemedieerde interacties bevorderen bacteriële kolonisatie en invasie van de oppervlakkige epitheelcellen 19,20. Eenmaal in de cel kan UPEC ontsnappen in het cytoplasma, waar een bacterie snel kan verdelen om een intracellulaire bacteriële gemeenschappen (IBC), die bij rijping kan 10 4 bacteriën bevatten 21 ~ vormen. IBC formatie is aangetoond in ten minste zes verschillende muizenstammen, C3H / HeN, C3H / HeJ, C57BL / 6, CBA, FVB / NJ en BALB / c, en met een groot aantal verschillende UPEC stammen en andere Enterobacteriaceae 22-24. Maar in tijd en ruimte verschillen IBC vorming kan variëren afhankelijk van de muis achtergrond en de infecterende UPEC-stam. In C3H / HeN muizen geïnfecteerd met de prototypische UPEC stammen UTI89 of CFT073, IBC formatie kan worden gevisualiseerd als kleine biomassa bacteriën zo vroeg als 3 hpi (uur na infectie). Deze gemeenschap blijft groeien en bereikt een "middelpunt" van het complex op ongeveer 6 HPI wanneer de staafvormige bacterie nemen een groot percentage van de cytoplasmatische ruimte van terminaal gedifferentieerde cellen oppervlakkige paraplu Deze vroege IBC vorm relatief synchrone wijze met de meeste vergelijkbare afmetingen tonen en morfologie. ~ 8 hpi de bacteriën in de IBC overgang van een bacillen morfologie kokken. IBC's zijn van voorbijgaande aard. Aldus IBC rijping 12-18 HPI resultaten in verdere expansie van de bacteriële populatie, gevolgd door hun filamentatie en dispersie uit de cel with daaropvolgende verspreiding naar naburige cellen 23. Zo is de IBC niche zorgt voor een snelle bacteriegroei in een omgeving beschermd tegen gastheer immuunreacties en antibiotica 25. De verschillende stadia van UPEC infectie die wordt waargenomen bij muizen zijn ook waargenomen bij mensen, zoals IBC en filamentatie, ondersteunen het muizenmodel van UTI als een voordelig instrument dat kan worden gemodelleerd UTI bij mensen 22,26-28.

Terwijl een meerderheid van de vrouwen ervaren een UTI in hun leven, kan de uitkomst van deze infecties variëren van acute zelfbeperkende infectie met geen recidief, frequent terugkerende blaasontsteking. Verder hebben studies aangetoond een sterk familiair voorkomen van UTI, hetgeen duidt op een genetische component bijdraagt ​​aan UTI gevoeligheid 29. We hebben ontdekt dat de verschillende UTI uitkomsten gezien in klinieken kan worden weerspiegeld door de verschillende uitkomsten van experimentele UPEC infectie onder inteelt muizenstammen 30. Bijvoorbeeld, C3H / HeN, CBA, DBA, en C3H / HeOuJ muizen gevoelig, in een infectueuze dosis-afhankelijke manier, om langdurige, chronische cystitis gekenmerkt door aanhoudende, hoge titer bacteriën (> 10 4 kolonievormende eenheden (CFU) / ml), hoge titer bacteriële blaas lasten op offer> 4 weken na infectie (WPI), chronische ontsteking, en urotheliale necrose. Deze muizen ook worden weergegeven verhoogde serumniveaus van IL-6, G-CSF, KC en IL-5 in de eerste 24 HPI die dienen als biomarkers voor de ontwikkeling van chronische cystitis. Dit kan goed mogelijk de natuurlijke loop van UTI vertegenwoordigen bij sommige vrouwen, placebo studies hebben aangetoond dat een groot percentage van de vrouwen die UTI zal hoge bacteriën in hun urine handhaven gedurende enkele weken na de eerste symptomen van blaasontsteking indien niet gegeven antibiotica 31 , 32. Verder gebruik C3H / HeN muizen, vonden we dat een geschiedenis van chronische cystitis is een belangrijke risicofactor voor de volgende ernstige terugkerende infecties. Terugkerende UTI is de meest significant klinische manifestatie van UTI en de C3H / HeN muis is momenteel de enige bestudeerde model dat een verhoogde aanleg na eerdere blootstelling recapituleert. Een tweede UTI uitkomst wordt gerecapituleerd in C57BL / 6 muizen, waar acute UPEC infectie zelfbeperkend, met een resolutie van de blaas ontsteking en bacteriurie binnen ongeveer een week. Interessant is dat in dit model, UPEC vormen gemakkelijk rustende intracellulaire reservoirs binnen de blaas weefsel waarvan UPEC in staat zijn die uit een slapende toestand naar een actieve UTI hervatten, eventueel verklaren één mechanisme voor dezelfde stam terugkerende UTI bij mensen 33, 34.

Naast de genetische invloeden op UTI gevoeligheid, invoering van een katheter in de blaas verhoogt de kans op een infectie en verhoogt het bereik van bacteriën in staat om een ​​infectie te veroorzaken. Er is aangetoond dat menselijke Blaaskatheterisatie veroorzaakt histologische enimmunologische veranderingen in de blaas door mechanische stress die resulteert in een sterke ontstekingsreactie, afschilfering, oedeem van de lamina propria en submucusa, urotheel dunner en mucosale laesie van het urotheel en nieren 35,36. Bovendien, de katheter een oppervlaktebescherming voor bacteriële hechting zo een omgeving gebruiken Verscheidene soorten Cauti veroorzaken creëren. Terwijl UPEC zijn nog steeds een belangrijke bijdrage, Enterococcus faecalis is goed voor 15% van deze Cauti 37. E. faecalis wordt steeds meer resistent tegen antibiotica met vancomycine weerstand ontstaan, die een ernstig gezondheidsprobleem zorg 38. E. faecalis bezitten vele virulentiefactoren zoals toxinen en adhesinen nodig zijn voor bevestiging aan zowel de katheter en epithelium 38. Tijdens Blaaskatheterisatie is de gastheer gevoelig voor microbiële hechting, vermenigvuldigen en verspreiden in de urinewegen 39,40. E. faecalis vormen een biofilm op de katheter als onderdeel van een mechanisme te volharden in de blaas en verspreidt onder de nieren, is weergegeven in een muis 41 model Cauti. Recentelijk is aangetoond tijdens Blaaskatheterisatie wordt fibrinogeen (Fg) vrij in de blaas als onderdeel van de ontstekingsreactie. Fg accumuleert in de blaas, bedekt de catheter en is essentieel voor E. faecalis biofilm vorming, functioneren als een bijlage schavot. In een C57BL / 6 muis-model van Cauti, dat ontdekten we E. faecalis biofilm vorming op de katheter, en derhalve persistentie in de blaas, afhankelijk was van de Ebp pilus specifiek zijn punt adhesine EbpA. We vonden dat het N-terminale domein van EbpA specifiek bindt aan FG bekleden van de katheter. Bovendien werd gevonden dat E. faecalis gebruikt Fg als metaboliet bron tijdens infectie, waardoor het verbeteren biofilmvorming 42.

Muismodellen hebben kritische bewezen understanding en voorspellen van klinische manifestaties van UTI en Cauti 41. In dit artikel tonen we inoculum voorbereiding van de blaasontsteking UPEC isoleren UTI89 en transurethrale inoculatie van C3H / HeN muizen. Verder tonen we een protocol voor catheter inbrengen in C57BL / 6 muizen en inoculatie van de E. faecalis OG1RF stam. Beide technieken leiden tot consistente en betrouwbare UTI of Cauti bij muizen. We geven ook de technieken die worden gebruikt om de vorming van IBC observeren tijdens acute blaasontsteking en urine verzamelen voor de analyse van chronische of recidiverende blaasontsteking. C3H / HeN-muizen werden gebruikt om aspecten van UPEC pathogenese waaronder initiële bacteriële invasie, IBC vorming filamentatie en de ontwikkeling van chronische blaasontsteking 23,33,43 bestuderen. Deze virulentie parameters zijn ook onderzocht bij een verscheidenheid van andere muizen achtergronden 22,33. Voor Cauti, de C57BL / 6-model zorgt voor een vreemd lichaam implantatie in de blaas met daaropvolgende bacteriële colonization, die kan worden gehandhaafd gedurende 7 dagen na infectie 41. Deze modellen zijn nuttig voor de beoordeling van bacteriële virulentie mechanismen, gastheer reacties op UTI en mechanismen om gastheer reacties, waarvan een groot deel is vervolgens recapituleerde of waargenomen in klinische menselijke bevolking ondermijnen geweest.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ethiek statement: De Rijksuniversiteit Animal Comité Studies Washington keurden alle muis infecties en procedures in het kader van het protocol nummer 20120216, dat werd goedgekeurd 2013/01/11 en verloopt 2016/01/11. Algehele verzorging van de dieren was in overeenstemming met de gids van de Zorg en gebruik van proefdieren van de National Research Council en de USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasie procedures zijn in overeenstemming met de "AVMA richtlijnen voor de euthanasie van dieren 2013 editie."

1. UPEC UTI Protocol, Inenting Naald Voorbereiding (figuur S1)

  1. Verwijder de dop van de 30 G naald. Draad ongeveer 1 inch van PE10 buis op de as van de naald. UV nachts steriliseren de naaldsamenstellen. Gekatheteriseerde naalden kan onbeperkt worden opgeslagen in steriele petrischalen.

2. UPEC Bacteriële Inoculumbereiding

  1. Bereid UTI89 inoculum (start 72 uur vóór de inoculatie dag)
    1. Streak UTI89 op een LB (Luria-Bertani) agar plaat uit een bevroren voorraad. Incubeer overnacht bij 37 ° C. Kies een kolonie en beënt deze in 10 ml van LB in een 125 ml kolf. Incubeer bij 37 ° C gedurende 24 uur, statisch.
    2. Inoculeer 10 pl overnachtkweek in 10 ml van LB in een nieuwe kolf van 125 ml gedurende nog 24 uur bij 37 ° C, statisch.
    3. Transfer 3 ml (zal variëren op basis van stam en de gewenste kiemen) om steriele 1,5 ml buizen en centrifugeer bij 7000 xg gedurende 3 min en resuspendeer de pellet in 1x PBS en centrifuge een tweede keer. Resuspendeer de bacteriële pellet in 1 x PBS 1 ml.
  2. Meet bacteriële extinctie en concentratie op de gewenste inoculumdichtheid. De standaardconcentratie van het inoculum gebruikte 10 7 bacteriën; dit kan echter variëren afhankelijk van de opzet van de studie.

3. Bacteriële Inoculatie

  1. Reinig het werkstation met 70% ethanol en cdan met absorberend papier (of gebruik steriel stroom kap).
  2. Trekken tot 0,9 ml van de bereide bacteriële inoculum in een 1 ml (TB) spuit (verwijder luchtbellen). Bevestig een bereide steriele inenting naald met PE10 buis, op de spuit met de entstof, dan steriel trim de polyethyleen buis.
    OPMERKING: Laat 1 mm buis boven de punt van de naald te beschadigen de blaas.
  3. Snij een 1 inch vierkant stuk parafilm en zet een schar van chirurgische smeermiddel (ongeveer de grootte van een dubbeltje) bovenop.
  4. Verdoven vrouwelijke C3H / HeN muizen door ze in een 32 ounce glazen pot met daarin een thee-ei bal met watten doorweekt met 3 ml van isofluraan of verdamper kamer (volgende produceert protocol) tot onbewuste maar toch normaal ademt (1 adem / sec) .
    OPMERKING: Sommige IACUC commissies niet het gebruik van een pot of verdamper te keuren. Volg de aanwijzingen van de IACUC commissie van uw instelling.
    LET OP: Als glazen potmet thee-ball en / of neuskegel met isofluraan-soakd katoenen ballen worden gebruikt, moeten de dieren zorgvuldig worden nageleefd om verdoving overdosis en de dood te voorkomen. Het voordeel van het gebruik van een verdamper en anesthesie kamer is dat het gecontroleerde isoflurane bestuur dat per ongeluk een overdosis voorkomt. LET OP: Isofluraan is een inhalatie verdoving. Gebruik in een goed geventileerde ruimte en het minimaliseren van inademing.
  5. Verwijder de muis uit de pot / verdamper en plaats deze op zijn rug op een papieren handdoek en verspreid de benen.
  6. Bedek de neus van de muis met een neuskegel (een buis aangesloten op de verdamper dat een geregelde isofluraan dosis die is uitgerust op sommige vaporizer units verschaft) of 50 ml conische buis met een watje met een kleine hoeveelheid (ongeveer 1-2 ml ) van isofluraan.
  7. Zachtjes trillen de blaas te plassen veroorzaken en zorgen voor een nietige blaas. Veeg de periurethrale met 100% ethanol te vegen. Dep de inenting naald / spuit, punt eerst, in dechirurgische smeermiddel.
  8. Inoculeer elke muis met 50 ul van de bacterieoplossing aan door de inoculatie naald transurethraal, ongeveer 12 mm, en drukken de zuiger voorzichtig naar inoculum in de blaas zachtjes (10 gl / sec) afgeven. Verwijder de inenting naald uit de muis.
    OPMERKING: Onmiddellijke terugkeer van inoculum op de urethrale opening bij het begin te enten geeft onjuiste of onvolledige inbrengen van de naald.
  9. Verwijder de muis uit neus en terug te sturen naar zijn kooi. Herhaal stap 3,3-3,8 voor elke muis. Wanneer / als het schakelen entstof voorwaarden / stammen, gooi de spuit en inenting naald in een goedgekeurde naaldcontainer en begin opnieuw stap 3.2.
    OPMERKING: Inenting met uropathogene organismen het algemeen niet leiden tot ernstige pijnklachten. Echter, in zeldzame gevallen, de toediening van grote doses van pathogenen koorts, vermindering voeding en wateropname en abnormaal gedrag. EENnimal gezondheid moet worden gecontroleerd gedurende het experiment. Als openlijke pijnklachten zijn gegevens, een analgeticum zoals buprenorfine (0.05-0.1 mg / kg subcutaan), kunnen worden toegepast. De procedures moeten in overeenstemming zijn met IACUC elke instelling.

4. Bepaling van bacteriële lasten

  1. Maak afzonderlijke 5 ml buisjes per blaas en nieren pair te oogsten. 1 ml 1x PBS / tube / muis blaas toe om geoogst te worden. Voeg 0,8 ml 1x PBS / tube / paar muis nieren te worden geoogst. Label elke buis te corresponderen met een bepaalde muis. Bereid een 96-wells plaat met 180 ul 1 x PBS in elk putje van 01:10 seriële verdunningen.
  2. Reinig de werkruimte met 70% ethanol en bestrijken het gebied met een absorberende deksel of een papieren handdoek.
  3. Verdoven van de muis met isofluraan (zie stap 3.4) tot de muis stopt met ademen ongeveer 1 min, plaats deze dan op de absorberende deksel of een papieren handdoek. Andere methoden van euthanasia worden ook geaccepteerd door IACUC commissies, zoals kooldioxide, en kan worden vervangen isofluraan overdosis.
  4. Offer de muis door snelle cervicale dislocatie die bestaat bevestigingssysteem voor de hals bij de basis van de kop en de staart horizontaal trekken van het lichaam totdat dislocatie optreedt.
    LET OP: De meeste IACUC comités vereisen een secundaire middel van euthanasie en cervicale dislocatie is een gemeenschappelijke methode. Echter, kunnen andere methoden worden gebruikt indien goedgekeurd door de IACUC commissie.
  5. Plaats de dode muis op zijn rug en spuit 70% ethanol op de buik. Ontleden muis, verzamel de blaas en de nieren, in die volgorde om mogelijke verontreiniging van het bloed na de nieren dissectie te minimaliseren. Plaats de organen onafhankelijk in de voorbereide 5 ml buisjes met 1x PBS (zie stap 4.1).
    OPMERKING: Gebruik verschillende schaar voor de externe dissectie en orgaanroof op besmetting te minimaliseren.
  6. Tik op de buis om ervoor te zorgen de organen zijn in tHij 1x PBS. Herhaal stap 4,3-4,5 voor elke muis. Schoon schaar en forceps in 70% ethanol na elke muis.

5. Bacteriële Recovery

  1. Homogeniseren geoogste blaas en nieren in de 5 ml buizen met een tissue homogenisator, 15 sec per nieren en 30 sec per blaas. Spoel homogenisator opeenvolgend in 1x PBS, 70% ethanol en 1x PBS tussen de monsters.
  2. Maak seriële 1:10 verdunningen out tot 10 -8 en plaat elke verdunning voor CFU (kolonievormende eenheden) op LB agarplaten. Incubeer de platen bij 37 ° C overnacht en tel kolonies de volgende dag.

6. IBC Enumeration

  1. Aseptisch verwijderen van de blaas en plaats het in 1x PBS in een 6-wells plaat met een siliconen bodem. De platen kunnen worden bereid onder toepassing van een siliconenelastomeer kit overgieten ongeveer 1 cm van silicone in elk putje, zie instructies van de fabrikant. Snijd de blaas in de helft met een schaar.
  2. Met behulp van kleine metalen pinnen voorzichtig splay het bladder zodat de blaas lumen wordt naar boven. Zorg ervoor dat de pennen plaatsen op de buitenste randen van de blaas secties om ervoor te zorgen de maximale hoeveelheid urothelium wordt blootgesteld.
  3. Na verwijden voorzichtig wassen de blaas eenmaal met 1x PBS. Verwijder de 1x PBS door pipet. Bevestig de blaas door toevoeging van voldoende 3% paraformaldehyde om de gehele gespreid blaas dekken. LET OP: Paraformaldehyde is kankerverwekkend. Veiligheidsuitrusting, inclusief handschoenen, moeten worden gedragen ten alle tijden. Vernietiging moet institutionele richtlijnen volgen.
  4. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Verwijder paraformaldehyde oplossing. Was eenmaal met 1x PBS.
  5. Wassen met LacZ wasoplossing (2 mM MgCl2, 0,01% natrium deoxycholaat en 0,02% nonidet-p40in 1x PBS) driemaal gedurende 5 min per wasbeurt.
  6. Verwijder wasoplossing en voeg voldoende LacZ kleuring (9,5 ml LacZ wasoplossing, 0,4 ml 25 mg / ml X-gal en 0,1 ml van 100 mM K-ferrocyanide / K-ferricyanide) te dekken de blazen. Incubeer bij 30 ° C overniGHT beschermd tegen licht.
  7. Verwijder splayed blazen uit incubator en observeren IBC's, die als blauwe puncta verschijnen als gevisualiseerd met een dissectie scope, 40-60X vergroting.
    Opmerking: soms muis kan vóór de plaatsing van de buis onder de urinebuis urineren. In dit geval, wacht 15-20 minuten voordat u urine weer te verzamelen.

7. Urine Collection voor Bacteriurie CFU opsomming (Niet van toepassing voor Cauti)

  1. Om urine pre verzamelen of na infectie zachtjes bedwingen met de muis door het houden van de staart en het op een vlakke verhoogde oppervlak (bovenkant van de muis kooi).
  2. Houd een steriele 1,5 ml buis onder de muis urethra. Druk licht op de achterkant van de muis bij de tail druk uit op de blaas. Vang de urine in de 1,5 ml buis.
  3. Maak seriële 1:10 verdunningen out tot 10 -7 en plaat van elke verdunning op geschikte LB. Incubeer de platen bij 37 ° C overnacht en tel kolonies de volgende dag.

8. Cauti Model Protocol, Catheter Naald Voorbereiding voor Cauti Model (figuur S2)

  1. Verwijder de dop van de 30 G naald. Knip een 7 mm stuk PE10 buizen en 5 mm stuk silicone slangen zoals RenaSIL. Rijg de naald met PE10 buis totdat de buis raakt de basis van de naald.
  2. Dan voeden de 5 mm stuk op de-PE10 met naald. UV nachts steriliseren de naalden assemblages.
    NB: Bij het laden van de siliconen slangen, laat ongeveer 1 mm van de slang tot voorbij de naald.

9. E. faecalis OG1RF Bacteriële Inoculumbereiding

  1. Bereid OG1RF inoculum vanaf 48 uur voor de inoculatie dag. Streak OG1RF op een BHI (hersenen het hart infusie) plaat uit een bevroren voorraad.
  2. Kies een kolonie en beënt deze in 10 ml BHI en groeien statisch gedurende 18 uur bij 37 ° C. Centrifugeer de kweek en was de pellet (3 maal) in 1 ml volumes steriele 1x PBS.
  3. Resuspendeer de bacteriële pellet in 1x PBS. Meet bacteriële optische dichtheid en de concentratie op de gewenste inoculum. De standaardconcentratie van het inoculum gebruikte 10 7; dit kan echter variëren afhankelijk van de opzet van de studie

10. Catheter Implantatie

  1. Reinig het werkstation met 70% ethanol en bestrijken het gebied met een absorberende deksel (of gebruik steriel stroom kap).
  2. Bevestig de katheter-naald naar een lege 1 ml (TB) spuit. Snij een 1 inch vierkant stuk parafilm en zet een schar van chirurgische smeermiddel (ongeveer de grootte van een dubbeltje) bovenop.
    OPMERKING: Twee verschillende naalden worden gebruikt voor afzetting van de katheter en het inoculum te minimaliseren toevallige inoculatie vanwege de mechanische manipulatie nodig catheter implantatie. Dit maakt ook het gemak van het bereiden minder entnaalden.
  3. Verdoven C57BL / 6 muizen door ze in een 32 ounce glazen pot met een kopje thee-infuser bal met watten gedrenkt in 3 ml van isofluraan of verdamper kamer (volgende produceert protocol) tot onbewuste maar toch normaal ademt (1 adem / sec).
  4. Dan zet de muis op zijn rug op een papieren handdoek en verspreid de benen. Bedek de neus van de muis met een neus of een 50 ml conische buis met watten dat een kleine hoeveelheid (ongeveer 1-2 ml) van isofluraan.
    LET OP: Isofluraan is een inhalatie verdoving. Gebruik in een goed geventileerde ruimte en het minimaliseren van inhalatie door onderzoeker.
  5. Zachtjes trillen de blaas te plassen veroorzaken en zorgen voor een nietige blaas. Veeg periurethral met een 100% ethanol vegen.
  6. Ontsmet de periurethrale met 10% povidonjood-oplossing met behulp van een katoen-tip applicator. Dep de inenting naald / spuit, punt eerst, in de chirurgische smeermiddel.
    OPMERKING: Povidine jodium wordt gebruikt voor implantatie katheter, die een sterkere antisepticum dan alcohol. Catheter implantatie vereistmeer mechanische manipulatie om de catheter en dus een grotere kans op contaminatie te voegen.
  7. Breng de katheter in de urethra opening. Eenmaal in, gebruik pincet om de (7 mm PE10) lang stuk in de richting van de blaas te duwen, dus druk op de (5 mm silicone) kleine katheter en storten het in de blaas. Verwijder de naald, met de 7 mm slang nog in bijlage, onmiddellijk.

11. Bacteriële Inenting

  1. Volg de bacteriële enting protocol in hoofdstuk 3, met behulp van de bereide inoculum uit paragraaf 9. Verwijder de muis uit de neuskegel en terug te sturen naar zijn kooi

12. op elk tijdstip van het Offer

  1. Bereid 5 ml buizen voor blaas en nier (voor organen stap volgen 4,1) en 1,5 ml Eppendorf buis catheters. Voeg 1 ml 1X PBS in 1,5 ml Eppendorf buis catheter samples
  2. Volg de stappen 4,3-4,5. Prepareer de muis, het oogsten van de blaas, nieren en catheter, placing de weefsels onafhankelijk in 5 ml buisjes met 1x PBS en de katheter in de 1,5 ml Eppendorf (zie stap 12.1).
    OPMERKING: Gebruik verschillende schaar voor de externe dissectie en voor orgel oogsten en katheter ophalen om besmetting te minimaliseren
  3. Volg dan stap 4.6.

13. Bacteriële Recovery

  1. Voor organen, volgt u de stappen 5.1 en 5.2. Voor bacteriële herstel van katheters, vortex bij maximale snelheid 30 sec, ultrasone trillingen de katheter monsters gedurende 5 min met een badsonificeerinrichting en vervolgens vortex bij maximale snelheid gedurende nog 30 sec.
  2. Maak seriële 1:10 verdunningen out tot 10 -8 en plaat elke verdunning voor CFU opsomming op BHI platen. Incubeer de platen bij 37 ° C 's nachts en tel kolonies de volgende dag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De intravesicale modellen van ongecompliceerde en katheter geassocieerd UTI bieden flexibele platforms voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen van bacteriële pathogenese, de impact van deze ziekten op host weefsel, en de ontwikkeling en het testen van nieuwe benaderingen van deze gemeenschappelijke en kostbare infecties te beheren. Afhankelijk van de muizenstam en ziekteverwekker, kunnen intravesicale inoculatie worden gebruikt om gastheer-pathogeen interacties te bestuderen factoren voor het initiëren of moduleren van acute (figuur 1 en 3), chronische of terugkerende (figuur 2) cystitis helderen. De in figuur 1 gegevens representatief van acute fase (24 HPI) urinewegen kolonisatie door de prototypische UPEC cystitis isoleren UTI89 44. Na inoculatie worden de infecties kunnen ontwikkelen gedurende 24 uur waarna de muizen gedood en de blaas en nierweefsel gehomogeniseerd. De weefselhomogenaten zijn serieel diluted en vergulde voor de opsomming van de koloniserende bacteriën. Chronische UPEC kolonisatie en blaasontsteking kan worden ingesteld en gehandhaafd in sommige muis lijnen (met name C3H / HeN) in een aanstekelijke dosis en uropathogeen afhankelijke manier. Chronische cystitis is persistente hoge titer bacteriuria (> 10 4 CFU / ml), blaasontsteking en hoge titer bacteriële blaas lasten (> 10 4 CFU / blaas) en opoffering 33. De in figuur 2 gegevens representatief CFU optredende 4 weken na inoculatie van C3H / HeN muizen met 2 x 10 7 CFU's van UTI89. Onder deze experimentele condities, 20-50% van de geïnfecteerde muizen ontwikkelen chronische cystitis, terwijl de resterende 50-80% van de muizen oplossen van de infectie. Deze dualiteit van het resultaat is afhankelijk van een gastheer-pathogeen checkpoint dat wordt besloten binnen de eerste 24 hpi. Activering (of niet) van de checkpoint resultaten in de waargenomen bimodale verdeling van bacteriële titers, die begint te manifesteren inde urine van 3 dpi (dagen na infectie) en in de blaas bij opoffering 28 dpi (figuur 2) 33. Muizen met een geschiedenis van chronische cystitis aanzienlijk aanleg voor terugkerende chronische blaasontsteking Bij provocatie na de eerste infectie wordt vereffend met antibiotica 33. Ook een geschiedenis van UTI is een bekende risicofactor voor recidiverende UTI bij mensen. Dit is dus het enige bekende model gebruikt om de pathogenese van terugkerende UTI bestuderen. Bij experimenteel modelleren UTI in afwisselende muis achtergrond is het van belang om te bepalen of de muizenstam is gevoelig voor UTI, terugkerende UTI of Cauti Daar sommige stammen min of meer resistent tegen het ontwikkelen van deze syndromen 33.

Een extra meting van acute blaasontsteking is IBC opsomming. IBC vorming beperkt tot de terminaal gedifferentieerde oppervlakkige paraplu cellen. IBC kwantificering is een informatieve maatregel van bacteriële last tijdens acute cysteitis en hoge niveaus van IBC correleren met het risico op het ontwikkelen van chronische blaasontsteking 21. IBC formatie treedt alleen op in de acute fase van de ziekte. Na de peeling van de oppervlakkige paraplu cellen, IBC's zijn niet meer waargenomen. In de C3H / HeN UTI model kan IBC's worden gemeten 6 uur na het enten ~ 1 x 10 7 CFU van UTI89 in de blaas transurethraal. Blazen worden gespreid met metalen pinnen op siliconen platen en gekleurd voor de expressie van LacZ. LacZ, β-galactosidase, is een algemeen uitgedrukt bacterieel enzym dat splitst de β koppeling tussen galactose en andere suikers. Dit enzym kan worden gebruikt voor het detecteren van bacteriën door het leveren van X-gal, een β-galactoside analogon, dat een blauwe kleur na splitsing produceert. Na kleuring worden de blazen afgebeeld onder een dissectie microscoop met de IBC's verschijnen als punctae blauw / paarse stippen op de urothelium en IBC's kan worden opgesomd door het tellen van de punten (figuur 3A). Hoewel het aantal IGraad gevormd per dier varieert, in de C3H / HeN achtergrond een gemiddelde van ~ 50 IBC's worden gezien per blaas (Figuur 3B). IBC verhogen op een dosisafhankelijke manier. Het aantal IBC's die vorm varieert tussen UPEC en muis achtergrond stammen. Bijvoorbeeld, in C57BL / 6, een inoculum van 1 x 10 ~ 7 UTI89 resulteert in de vorming van enkele honderden IBC per blaas.

Voorbij de ongecompliceerde gemeenschap verworven UTI boven gemodelleerd, heide-care geassocieerd UTIs vertegenwoordigen een aanzienlijke last voor de gezondheidszorg. UTIs vertegenwoordigen ongeveer 40% van alle gezondheidszorg geassocieerde infecties en tot 95% van alle gezondheidszorg in verband urineweginfecties zijn katheter geassocieerd 45. Hier laten we zien een blaas implantaat muismodel van Cauti dat een krachtig systeem voor de experimentele analyse van deze moeilijke klinisch probleem vertegenwoordigt. De in figuur 4 gegevens representatief van 24 uur infectie met het model E. faecalis s trainen OG1RF. Bij 1 x 10 7 CFU zijn van OG1RF intravesicaal geënt in een geïmplanteerde blaas, de infectie begint te duidelijk door 24 hpi (Figuur 4A) en door 3 dpi de infectie is verdwenen 41. Omgekeerd inoculatie van OG1RF in een geïmplanteerde blaas leidt tot kolonisatie van zowel de katheter en de blaas, met een 10-voudig hogere blaas kolonisatie niveaus 24 HPI waargenomen dan bij de geïmplanteerde blazen (figuur 4A en 4B). Bovendien is deze infectie gehandhaafd op> 10 6 CFU in de blaas tot catheter verlies circa 7 dpi 41. Alle beschreven experimentele modellen vatbaar zijn voor een hoge mate van flexibiliteit experimenten, met inbegrip van maar niet exclusief voor verscheidene benaderingen van het macroscopische en microscopische beeldvorming van het geïnfecteerde weefsel en oppervlakken, veranderde inoculum afmetingen en ziekte soms concurrerende infecties en gastheer immunologische analyses .

ve_content "> Figuur 1
Figuur 1:. 24 hr urinewegen kolonisatie Vrouw, 7-8 weken oude C3H / HeN muizen werden transurethraal geënt met ~ 2 x 10 7 CFU van de prototypische UPEC cystitis isoleren UTI89 voor 24 uur. Vertegenwoordiger CFU's hersteld van de geoogste blaas en nieren weefsels worden getoond, n = 5. Binnen de stippellijn zit je in de ondergrens van detectie (20 CFU).

Figuur 2
Figuur 2:. 28 dagen urinewegen kolonisatie Vrouw, 7-8 weken oude C3H / HeN muizen werden transurethraal geënt met ~ 2 x 10 7 CFU UTI89. Urine was collect op aangegeven dagen na infectie (dpi) en plated voor CFU opsomming. Representatieve 28 dagen blaas en nieren titers worden getoond, n = 8. Urine CFU detectielimiet (1000 CFU / ml) wordt aangeduid door de stippellijn. Gestippelde lijn vertegents het weefsel ondergrens van detectie, 20 CFU / weefsel.

Figuur 3
Figuur 3:. IBC opsomming Vrouw, 7-8 weken oude C3H / HeN muizen werden transurethraal ingeënt met ~ 1 x 10 7 CFU UTI89. Blazen werden geoogst 6 HPI en gespreid voor IBC vlekken. (A) Afbeelding van gespreid blaas na LacZ kleuring. IBC's worden weergegeven als blauwe stippen. Het beeld inzet is een vergroting van het digitale gedeelte van het beeld in de zwarte doos. (B) Vertegenwoordiger aantallen IBC's gevormd in C3H / HeN muizen 6 HPI, n = 10.

Figuur 4
Figuur 4: E. faecalis katheters UTI. C57BL / 6-muizen werden geïnoculeerd met of zonder katheters met ~ 1 x 10 7 CFU van de (A) E. faecalis blaas kolonisatie in aanwezigheid of afwezigheid van de katheter. (B) E. faecalis catheter kolonisatie. Mann-Whitney U test werd gebruikt voor muisexperimenten, p <0,05 werd beschouwd als statistisch significant. **, P <0,005.

Figuur S1
Figuur S1. UTI inenting naald bereiding Diagram toont inoculatie naald bereidingsstappen inclusief benodigde materialen (1), schroefdraad van de katheter op de naald (2) en trimmen van de buis voor enting (3).

Figuur S2
Figuur S2:. Cauti inenting naald voorbereiding Diagram toont inenting naald voorbereiding materialen die nodig zijn (1), draadsnijden van de inenting katheter (2) en implantatie katheter opde naald (3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ongecompliceerde gemeenschap verworven UTI is een veel voorkomende en kostbare infectie goed voor enkele miljoenen eerstelijns gezondheidszorg bezoeken per jaar 46. Daarnaast Cautis zijn een gemeenschappelijke zorg verworven infectie die zeer kostbaar om zorgverleners als de Centra van Medicare en Medicaid Services is geworden niet meer vergoedt providers voor de extra kosten van de behandeling als gevolg van het ziekenhuis verworven Cauti 45. De muismodellen van UTI, zowel ongecompliceerde cystitis en Cauti, in deze protocollen beschreven verschaffen waardevolle hulpmiddelen voor het begrijpen van de moleculaire basis van de gastheer en pathogeen interacties voor het initiëren, handhaven en moduleren van de resultaten van verschillende vormen van UTI. Deze apparaten kan de toepassing van sterke bacteriële en muisgenetica, immunologische, microscopische, biochemische en chemische genetische hulpmiddelen voor de analyse van UTI 23,47-49. Bovendien, de protocollen hier geschetste een platform hebben verstrektvoor de ontwikkeling en het testen van nieuwe therapeutische en preventieve strategieën, waaronder kleine molecule remmers van bacteriële virulentie en nieuwe vaccinatie doelen en strategieën 50-55.

Er zijn een aantal kritische voorwaarden waaraan moet worden gehandhaafd voor de succesvolle toepassing van de ongecompliceerde cystitis model. Zoals met alle muis verdoving procedures, moet ervoor worden genomen om de muis sterfte te voorkomen als gevolg van over-verdoving. Bij de voorbereiding van de catheter inoculatie, moet de silicone buis, zolang de wand van de blaas catheterisatie schade voldoende lang om de punt van de naald omvatten maar zijn. Bovendien, vanwege de nabijheid en de grootte van de vaginale opening, zorg moet worden genomen om de enten katheter in de urethra en niet de vagina te voegen. Tijdens blaas verwijden IBC opsomming, is het essentieel dat de blazen als snel gespreid mogelijk na dissectie en weefsel voor voorkomend vastgesteldbatterijvak ongeveer 1 uur, maar niet 's nachts. Voor IBC telling van LacZ kleuring, is het ook noodzakelijk dat de bacterie in kwestie produceert LacZ tijdens urotheel kolonisatie. Bij gebruik Voorzover van het LacZ enzym niet wordt geproduceerd, is het nog steeds mogelijk om op te sommen IBC middels immunofluorescentie microscopie met anti E. coli antilichamen of GFP tot expressie brengende bacteriën. Een bijzonder kenmerk van dit model is de verschillende patronen van ziekteprogressie en de ernst door verschillende ingeteelde muizenlijnen en de variërende pathogene potentieel van de prototypische UPEC stammen 33,56. Deze verschillen zijn zowel een kracht en de beperking van deze techniek omdat ze recapituleren de natuurlijke variatie van de gastheer de gevoeligheid en diversiteit ziekteverwekker die is waargenomen in klinische studies en fenotypische terwijl complicerende experimenteel ontwerp en interpretatie 57,58. Deze variaties geven bronnen van vergelijking waardoor voor de opheldering van de gastheer en bacteriële mechanismen moduleren van de pathogenese van ongecompliceerde UTI 33,56. Echter, ze betekenen ook dat door de verschillende mate van muizenlijn UTI gevoeligheid dient voorzichtig te worden genomen bij het kiezen van de juiste muizenlijn en UPEC-stam voor het aanpakken van specifieke vraag een onderzoeker vraagt. Bijvoorbeeld, C57BL / 6 muizen een uitstekend model van acute infectie, presenteren met hoge bacteriële titers en grote aantallen IBC op vroege tijdstippen. Deze stam vervolgens snel opgelost infectie tussen 3 en 7 dpi met het enige blijvende kolonisatie gevolge van ernstige nier- infecties en intracellulaire latente reservoirs 33,34. De C57BL / 6-model kan nauwkeurig de meest voorkomende uitkomst vormen voor veel UTI patiënten die symptomen aanwezig zijn en vervolgens op te lossen. Omgekeerd C3H / HeN muizen achtergrond vertoont een hoge mate van gevoeligheid voor chronische blaasontsteking waardoor ze ideaal voor het bestuderen stam terugkerende urineweginfecties. Andere UTI modellen zijn ook vastgesteldin CBA, DBA en C3H / HeJ muizen achtergrond blijkt nuttig voor het bestuderen van bepaalde aspecten van UTI 33,59. De belangrijkste experimentele nadeel vertoond door de ongecompliceerde cystitis model is het bestaan ​​van meerdere infecties knelpunten door de toepassing van grootschalige genetische screening methoden voor de ontdekking van nieuwe bacteriële benodigde factoren voor acute, chronische en terugkerende blaasontsteking 60.

De kritische overwegingen voor de ongecompliceerde cystitis model al van toepassing op het implantaat gebaseerd Cauti model met twee extra zorgen. Ten eerste moet erop worden gelet dat het inbrengen van het implantaat vindt plaats in een steriele wijze, door de verhoogde gevoeligheid voor blaasontsteking door het implantaat verleend. Ten tweede, is het essentieel dat de catheter op zijn plaats worden gehouden tijdens het verwijderen van de naald implanteren. De belangrijkste beperkingen van de Cauti model is dat het af- genomen beschikbare gastheer genetische achtergronden, de propensity voor catheter verlies over de tijd en het onvermogen om urine te verzamelen vanwege blaasstoornis gevolg van implantatie. Ter compensatie voor implantatie verlies en het onvermogen om de infectie via longitudinale urineonderzoek controleren, dit model vereist in het algemeen hogere aantallen gecatheteriseerd muizen latere tijdstippen en groepen muizen worden opgeofferd op elke gewenst tijdstip. De beperkte gastheer genetische achtergronden resultaten van de verboden frequentie waarmee bepaalde muizenstammen, zoals C3H / HeN, verliest het implantaat (P. Guiton, Personal Communication 2010). Dientengevolge hebben de Cauti protocols bovenbeschreven uitsluitend geoptimaliseerd in de C57BL / 6 muizenstam. Echter, terwijl de beperking van de beschikbare muizenstammen voor Cauti is jammer, veel genomische variaties zijn in de C57BL / 6 achtergrond vastgesteld en de Cauti model breidt de bacteriologische diversiteit beschikbaar voor onderzoek tijdens UTI door het veranderen van de blaas omgeving om kolonisatie te vergemakkelijken door organismen die zijnanderszins niet pathogeen in het muizenmodel van UTI. Een voorbeeld hiervan is de recente ontdekking van de rol van Fg vrijkomt bij de katheter veroorzaakte blaasontsteking in E. groei faecalis, biofilmvorming en doorzettingsvermogen tijdens Cauti 42. Dit voorbeeld illustreert het vermogen van het implantaat model van Cauti ophelderen niet alleen bacteriële moleculaire mechanismen van pathogenese, maar ook de rol van gastheerfactoren tijdens het infectieproces. Al deze functies dragen bij aan het begrijpen van deze relevante klinische infectie, die eerder weinig bestudeerd.

Naast de experimentele benaderingen hierboven beschreven, de muismodellen van ongecompliceerde cystitis en Cauti vatbaar zijn voor een groot aantal methodologische wijzigingen. Bij de ongecompliceerde cystitis model, kunnen deze wijzigingen omvatten vermindering van het volume inoculatie en de tijdens het indruppelen van de inoculum kracht om het aantal bacteriën te verlageningebracht in de nieren 61, het variëren van de duur van de infectie, offeren op tijdstippen al 1 HPI en middels gentamicine bescherming assays voor het beoordelen in hoeverre de uropathogeen heeft de blaas epitheelcellen 62 binnengedrongen. De gespreide blazen van muizen gedood tussen 6 en 24 HPI kunnen worden doorgesneden en gekleurd met antilichamen tegen diverse gastheer en / of bacteriële epitopen en bekeken onder fluorescentie of confocale microscopie IBC structuur, bacterieel fluxen en filamentatie en gastheerweefsel staat 25,33 observeren , 63,64. Het effect van uropathogeen infectie en / of implantatie op de lokale en systemische immune responsen van de gastheer kan worden beoordeeld met behulp van de Bioplex cytometrische bead systeem of ELISA gebaseerde testen cytokine niveaus in de urine of serum respectievelijk 33,65 bepaalt. Tenslotte, de conditie van de blaas weefsel locatie en morfologie koloniseren bacteriën en de structuur van de biofilm afgezet opde katheter kan worden bepaald door verscheidene beeldvormende technieken waaronder elektronenmicroscopie 25,41.

Deze fundamentele modellen van infectie kan ook worden aangepast aan andere klinisch relevante verschijnselen nabootsen inclusief terugkerende UTI en de ontwikkeling van een adaptieve immuunreactie via meerdere infecties. In dit verband herhaalde infectie van C57BL / 6 muizen resulteert in verhoogde weerstand tegen acute blaasontsteking, terwijl in de C3H / HeN model voorafgaande ontwikkeling van chronische cystitis, gevolgd door klaring van de infectie door toediening van antimicrobiële stoffen sensibiliseert deze muizen ontwikkelen chronische blaasontsteking op latere inentingen 66. Daarnaast zijn de moleculaire mechanismen van risicofactoren voor het ontwikkelen van UTI kan worden onderzocht. Diabetes en obesitas zijn beide blijkt de frequentie en ernst van urineweginfecties vergroten. Type 2 diabetes kan genetisch worden gemodelleerd in muizen in de FVB / NJ achtergrond en een chemisch geïnduceerde model van type 1 diabetes already aangetoond dat het de ernst van urineweginfecties veroorzaakt door zowel UPEC en K. vergroten pneumophila 67,68.

Tot slot, deze modelsystemen vormen een ideale testbaan voor de ontwikkeling en optimalisatie van de therapeutische modaliteiten gericht op het behandelen of voorkomen van urineweginfecties en Cautis. De moleculaire begrip van gastheer pathogeen interacties die door deze modellen heeft al vergemakkelijkt de ontwikkeling van effectieve vaccinatie strategieën gericht op targeting belangrijke virulentiefactoren 51-55. Daarnaast zijn kleinmoleculige remmers van UPEC adhesie effectief gebleken bij de behandeling van ongecompliceerde acute en chronische urineweginfecties en Cautis veroorzaakt door UPEC 12,69,70 te zijn. Zowel de ongecompliceerde UTI en Cauti modellen in deze protocollen beschreven bieden de experimentele instrumenten om de moleculaire details van de gastheer-pathogeen interacties ontleden in de urinewegen. Deze tools kunnen worden ingezet op vele manieren om onze understandin uitbreideng van dit complex geheel van omstandigheden en de ontwikkeling van meer effectieve therapeutische interventies te vergemakkelijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Financiering voor dit werk werd geleverd door ORWH SCOR P50 DK064540, RO1 DK 051.406, RO1 AI 108749-01, F32 DK 101.171 en F32 DK 104516-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material for catheter and needle preparation:
30 G needles BD Precision Glide 305106 30 G x ½ (0.3 mm x 13 mm)
PE10 polyethylene tubing BD 427400 Inside diameter -0.011 in (0.28 mm); outside diameter – 0.024 in (0.61 mm)
RenaSIL 025 platinum cured silicon tubing Braintree Scientific, Inc SIL 025 inside diameter-0.012 x outside diameter 0.025, 25 ft coil
Material for infections:
Isoflourane – Isothesia Butler Schein 29405 250 ml
Clear Glass Straight-Sided Jar Kimble Chase 5413289V 21
Stainless Steel Tea Infuser Schefs-Amazon Premium Loose Leaf Tea Infuser By Schefs - Stainless Steel - Large Capacity -
Non-sterile cotton balls Fisherbrand 22-456-880
50 ml Falcon tubes VWR 89039-660
Isotec 3 -vaporizer Ohmeda 1224478
Ear punch Fisher Scientific 13-812-201 (when necessary)
Betadine solution Betadine solution 10% Povidie-iodine topical solution
Q-tips Fisher Scientific 22-037-924 6 inches
Diapers for bench Fisherbrand 14206 63 Absorbent Underpads (20”X36”mats)
Surgical lubricant Surgilube 0281-0205-36
Dissecting scissor Fine Science tools, INC 14084-08
Micro-Adson Forceps Fine Science tools, INC 11018-12
1 ml syringe BD 309659 Tuberculin slip tip
Parafilm Bemis PM996 4 inches x 125 FT
Eppendorf rack Fisherbrand 05-541-1
Eppendorf tubes MIDSCI AVX-T-17-C
Harvesting catheters, bladders and kidneys:
Homogenizer PRO Scientific INC Bio-Gen Pro 200
5 ml polypropylene round-bottom tube BD 352063 for organ homogenization
Paper towel Georgia-Pacific
Ethanol Pharmco-AAPER 11100020S 200 proof
Costar™ Clear Polystyrene 96-Well Plates Corning 3788
1x Phosphate sodium saline Sigma-Aldrich P3813
BRANSONIC Ultrasonic cleaner 1210 Branson Ultrasonics Corporation 1210
IBC materials:
6-well tissue culture test plate Techno Plastic Products 92006
Pins Fine Science Tools 26002-20
Sylgard 184 Dow Corning 3097358-1004 Silicone Elastomer Kit
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside) Invitrogen 15520-034 Ultrapure
N, N-Dimethylformamide Sigma Aldrich D4551
MgCl2 (Magnesium chloride) Sigma Aldrich M8266
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich D6750
Nonidet-P40 Roche 11754599001 Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate (K-ferrOcyanide) Sigma Aldrich P3289
Potassium hexacyanoferrate(III) (K-ferrIcyanide) Sigma Aldrich 60299

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. Dis Mon. 49, 53-70 (2003).
  2. Foxman, B., et al. Risk factors for second urinary tract infection among college women. American journal of epidemiology. 151, 1194-1205 (2000).
  3. Gupta, K., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Increasing antimicrobial resistance and the management of uncomplicated community-acquired urinary tract infections. Annals of internal medicine. 135, 41-50 (2001).
  4. Gupta, K., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Isolation of fluoroquinolone-resistant rectal Escherichia coli. after treatment of acute uncomplicated cystitis. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 56, 243-246 (2005).
  5. Gupta, K., Sahm, D. F., Mayfield, D., Stamm, W. E. Antimicrobial resistance among uropathogens that cause community-acquired urinary tract infections in women: a nationwide analysis. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 89-94 (2001).
  6. Gupta, K., Scholes, D., Stamm, W. E. Increasing prevalence of antimicrobial resistance among uropathogens causing acute uncomplicated cystitis in women. Jama. 281, 736-738 (1999).
  7. Jarvis, W. R. Selected aspects of the socioeconomic impact of nosocomial infections: morbidity, mortality, cost, and prevention. Infect Control Hosp Epidemiol. 17, 552-557 (1996).
  8. Lo, E., et al. Strategies to prevent catheter-associated urinary tract infections in acute care hospitals: 2014 update. Infection control and hospital epidemiology : the official journal of the Society of Hospital Epidemiologists of America. 35, 464-479 (2014).
  9. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature reviews Urology. 7, 653-660 (2010).
  10. Hooton, T. M., Stamm, W. E. Diagnosis and treatment of uncomplicated urinary tract infection. Infect Dis Clin North Am. 11, 551-581 (1997).
  11. Hannan, T. J., et al. LeuX tRNA-dependent and -independent mechanisms of Escherichia coli. pathogenesis in acute cystitis. Molecular microbiology. 67, 116-128 (2008).
  12. Cusumano, C. K., Hung, C. S., Chen, S. L., Hultgren, S. J. Virulence plasmid harbored by uropathogenic Escherichia coli. functions in acute stages of pathogenesis. Infection and immunity. 78, 1457-1467 (2010).
  13. Dhakal, B. K., Mulvey, M. A. The UPEC pore-forming toxin alpha-hemolysin triggers proteolysis of host proteins to disrupt cell adhesion, inflammatory, and survival pathways. Cell host & microbe. 11, 58-69 (2012).
  14. Garcia, E. C., Brumbaugh, A. R., Mobley, H. L. Redundancy and specificity of Escherichia coli. iron acquisition systems during urinary tract infection. Infection and immunity. 79, 1225-1235 (2011).
  15. Bergsten, G., Wullt, B., Svanborg, C. Escherichia coli., fimbriae, bacterial persistence and host response induction in the human urinary tract. International journal of medical microbiology : IJMM. 295, 487-502 (2005).
  16. Zhou, G., et al. Uroplakin Ia is the urothelial receptor for uropathogenic Escherichia coli.: evidence from in vitro FimH binding. J Cell Sci. 114, 4095-4103 (2001).
  17. Eto, D. S., Jones, T. A., Sundsbak, J. L., Mulvey, M. A. Integrin-mediated host cell invasion by type 1-piliated uropathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 3, e100 (2007).
  18. Taganna, J., de Boer, A. R., Wuhrer, M., Bouckaert, J. Glycosylation changes as important factors for the susceptibility to urinary tract infection. Biochemical Society transactions. 39, 349-354 (2011).
  19. Mulvey, M. A., et al. Induction and evasion of host defenses by type 1-piliated uropathogenic Escherichia coli. Science. 282, 1494-1497 (1998).
  20. Mysorekar, I. U., Mulvey, M. A., Hultgren, S. J., Gordon, J. I. Molecular regulation of urothelial renewal and host defenses during infection with uropathogenic Escherichia coli. The Journal of biological chemistry. 277, 7412-7419 (2002).
  21. Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population Dynamics and Niche Distribution of Uropathogenic Escherichia coli. during Acute and Chronic Urinary Tract Infection. Infect. Immun. 79, 4250-4259 (2011).
  22. Garofalo, C. K., et al. Escherichia coli. from urine of female patients with urinary tract infections is competent for intracellular bacterial community formation. Infection and immunity. 75, 52-60 (2007).
  23. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli. in urinary tract pathogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 1333-1338 (2004).
  24. Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae. urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infection and immunity. 76, 3337-3345 (2008).
  25. Anderson, G. G., et al. Intracellular bacterial biofilm-like pods in urinary tract infections. Science. 301, 105-107 (2003).
  26. Robino, L., et al. Detection of intracellular bacterial communities in a child with Escherichia coli. recurrent urinary tract infections. Pathogens and disease. 68, 78-81 (2013).
  27. Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4, e329 (2007).
  28. Horsley, H., et al. Enterococcus faecalis subverts and invades the host urothelium in patients with chronic urinary tract infection. PloS one. 8, e83637 (2013).
  29. Hopkins, W. J., Uehling, D. T., Wargowski, D. S. Evaluation of a familial predisposition to recurrent urinary tract infections in women. American Journal of Medical Genetics. 83, 422-424 (1999).
  30. Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli. urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infection and immunity. 66, 2798-2802 (1998).
  31. Mabeck, C. E. Treatment of uncomplicated urinary tract infection in non-pregnant women. Postgraduate medical journal. 48, 69-75 (1972).
  32. Ferry, S., Holm, S., Stenlund, H., Lundholm, R., Monsen, T. The natural course of uncomplicated lower urinary tract infection in women illustrated by a randomized placebo controlled study. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 36, 296-301 (2004).
  33. Hannan, T. J., Mysorekar, I. U., Hung, C. S., Isaacson-Schmid, M. L., Hultgren, S. J. Early severe inflammatory responses to uropathogenic E. coli. predispose to chronic and recurrent urinary tract infection. PLoS Pathog. 6, (2010).
  34. Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli. persistence and eradication from the urinary tract. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 14170-14175 (2006).
  35. Glahn, B. E., Braendstrup, O., Olesen, H. P. Influence of drainage conditions on mucosal bladder damage by indwelling catheters. II. Histological study. Scandinavian journal of urology and nephrology. 22, 93-99 (1988).
  36. Goble, N. M., Clarke, T., Hammonds, J. C. Histological changes in the urinary bladder secondary to urethral catheterisation. British journal of urology. 63, 354-357 (1989).
  37. Ronald, A. The etiology of urinary tract infection: traditional and emerging pathogens. Dis Mon. 49, 71-82 (2003).
  38. Arias, C. A., Murray, B. E. The rise of the Enterococcus.: beyond vancomycin resistance. Nature reviews. Microbiology. 10, 266-278 (2012).
  39. Garibaldi, R. A., Burke, J. P., Dickman, M. L., Smith, C. B. Factors predisposing to bacteriuria during indwelling urethral catheterization. The New England journal of medicine. 291, 215-219 (1974).
  40. Warren, J. W. Catheter-associated urinary tract infections. Infect Dis Clin North Am. 11, 609-622 (1997).
  41. Guiton, P. S., Hung, C. S., Hancock, L., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. Enterococcal biofilm formation and virulence in an optimized murine model of foreign body-associated urinary tract infections. Infection and immunity. 78, 4166-4175 (2010).
  42. Flores-Mireles, A. L., Pinkner, J. S., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. EbpA vaccine antibodies block binding of Enterococcus faecalis. to fibrinogen to prevent catheter-associated bladder infection in mice. Science translational medicine. 6, 254ra127 (2014).
  43. Martinez, J. J., Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Pinkner, J. S., Hultgren, S. J. Type 1 pilus-mediated bacterial invasion of bladder epithelial cells. The EMBO Journal. 19, 2803-2812 (2000).
  44. Hultgren, S. J., Schwan, W. R., Schaeffer, A. J., Duncan, J. L. Regulation of production of type 1 pili among urinary tract isolates of Escherichia coli. Infection and immunity. 54, 613-620 (1986).
  45. Chenoweth, C. E., Gould, C. V., Saint, S. Diagnosis, Management, and Prevention of Catheter-Associated Urinary Tract Infections. Infect. Dis. Clin. North Am. 28, 105-+ (2014).
  46. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7, 653-660 (2002).
  47. Justice, S. S., Hunstad, D. A., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Filamentation by Escherichia coli. subverts innate defenses during urinary tract infection. Proc Natl Acad Sci USA. 103, (1988).
  48. Song, J., et al. TLR4-mediated expulsion of bacteria from infected bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14966-14971 (2009).
  49. Wang, H., Min, G., Glockshuber, R., Sun, T., Kong, X. P. Uropathogenic E. coli. adhesin-induced host cell receptor conformational changes: implications in transmembrane signaling transduction. Journal of molecular biology. 392, 352-361 (2009).
  50. Cusumano, C. K., et al. Treatment and prevention of urinary tract infection with orally active FimH inhibitors. Science translational medicine. 3, 109-115 (2011).
  51. Langermann, S., Ballou, W. R. Vaccination utilizing the FimCH complex as a strategy to prevent Escherichia coli. urinary tract infections. J Infect Dis. 183, S84-S86 (2001).
  52. Langermann, S., et al. Vaccination with FimH adhesin protects cynomolgus monkeys from colonization and infection by uropathogenic Escherichia coli. J Infect Dis. 181, 774-778 (2000).
  53. Langermann, S., et al. Prevention of mucosal Escherichia coli. infection by FimH-adhesin-based systemic vaccination. Science. 276, 607-611 (1997).
  54. Alteri, C. J., Hagan, E. C., Sivick, K. E., Smith, S. N., Mobley, H. L. T. Mucosal Immunization with Iron Receptor Antigens Protects against Urinary Tract Infection. Plos Pathogens. 5, (2009).
  55. Russo, T. A., et al. The siderophore receptor IroN of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. is a potential vaccine candidate. Infect. Immun. 71, 7164-7169 (2003).
  56. Schwartz, D. J., et al. Positively selected FimH residues enhance virulence during urinary tract infection by altering FimH conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15530-15537 (2013).
  57. Czaja, C. A., et al. Prospective cohort study of microbial and inflammatory events immediately preceding Escherichia coli. recurrent urinary tract infection in women. J Infect Dis. 200, 528-536 (2009).
  58. Chen, S. L., et al. Genomic Diversity and Fitness of E. coli. Strains Recovered from the Intestinal and Urinary Tracts of Women with Recurrent Urinary Tract Infection. Science Translational Medicine. 5, 2013 (2013).
  59. Schilling, J. D., Mulvey, M. A., Vincent, C. D., Lorenz, R. G., Hultgren, S. J. Bacterial invasion augments epithelial cytokine responses to Escherichia coli. through a lipopolysaccharide-dependent mechanism. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 166, 1148-1155 (2001).
  60. Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population Dynamics and Niche Distribution of Uropathogenic Escherichia coli. during Acute and Chronic Urinary Tract Infection. Infect. Immun. 79, 4250-4259 (2011).
  61. Chan, C. Y., St John,, L, A., Abraham, S. N. Mast Cell Interleukin-10 Drives Localized Tolerance in Chronic Bladder Infection. Immunity. 38, 349-359 (2013).
  62. Justice, S. S., Lauer, S. R., Hultgren, S. J., Hunstad, D. A. Maturation of intracellular Escherichia coli. communities requires SurA. Infect. Immun. 74, 4793-4800 (2006).
  63. Justice, S. S., Hunstad, D. A., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Filamentation by Escherichia coli. subverts innate defenses during urinary tract infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19884-19889 (2006).
  64. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli. in urinary tract pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 1333-1338 (2004).
  65. Guiton, P. S., Hannan, T. J., Ford, B., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. Enterococcus faecalis. Overcomes Foreign Body-Mediated Inflammation To Establish Urinary Tract Infections. Infect. Immun. 81, 329-339 (2013).
  66. Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder. Journal of Immunology. 176, 3080-3086 (2006).
  67. Rosen, D. A., Hung, C. -S., Kline, K. A., Hultgren, S. J. Streptozocin-induced diabetic mouse model of urinary tract infection. Infect. Immun. 76, 4290-4298 (2008).
  68. Daneshgari, F., Leiter, E. H., Liu, G., Reeder, J. Animal Models of Diabetic Uropathy. Journal of Urology. 182, S8-S13 (2009).
  69. Guiton, P. S., et al. Combinatorial Small-Molecule Therapy Prevents Uropathogenic Escherichia coli. Catheter-Associated Urinary Tract Infections in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56, 4738-4745 (2012).
  70. Totsika, M., et al. A FimH Inhibitor Prevents Acute Bladder Infection and Treats Chronic Cystitis Caused by Multidrug-Resistant Uropathogenic Escherichia coli. ST131. Journal of Infectious Diseases. 208, 921-928 (2013).

Tags

Geneeskunde , UPEC, Uropathogene catheter urineweginfectie IBC chronische blaasontsteking

Erratum

Formal Correction: Erratum: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model
Posted by JoVE Editors on 08/18/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. The Protocol section has been updated.

The ethics statement has been updated from:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20120216, which was approved 01/11/2013 and expires 01/11/2016. Overall care of the animals was consistent with The guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

to:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20150226, which expires 12/10/2018. Overall care of the animals was consistent with The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

Step 3 has been updated from:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a 32 ounce glass jar containing a tea-infuser ball with cotton balls soaked with 3 ml of isoflurane or vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a jar or vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    NOTE: If glass jar with tea-ball and/or nose cone with isoflurane-soakd cotton balls are used, the animal must be carefully observed to avoid anesthetic overdose and death. The advantage of using a vaporizer and anesthesia chamber is that it provides controlled isoflurane administration that avoids accidental overdoses. CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the jar/vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) or 50 ml conical tube with a cotton ball containing a small amount (approximately 1-2 ml) of isoflurane.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.

to:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) to maintain anesthetization.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.
Oprichting en karakterisering van UTI en Cauti in een muismodel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Conover, M. S., Flores-Mireles, A.… More

Conover, M. S., Flores-Mireles, A. L., Hibbing, M. E., Dodson, K., Hultgren, S. J. Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. J. Vis. Exp. (100), e52892, doi:10.3791/52892 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter