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Medicine

Aufbau und Charakterisierung von UTI und CAUTI in einem Mausmodell

Published: June 23, 2015 doi: 10.3791/52892
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Microbiology and Center for Women's Infectious Disease Research, Washington University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Abstract

Harnwegsinfektionen (HWI) sind weit verbreitet, eine wesentliche Ursache für Morbidität und werden zunehmend resistent gegen die Behandlung mit Antibiotika. Frauen sind überproportional von UTI betroffen: 50% der Frauen eine UTI in ihrem Leben haben. Zusätzlich 20-40% dieser Frauen, die eine anfängliche UTI wird eine Wiederholung mit einigen Leiden häufigen Rezidiven mit schwerwiegenden Verschlechterung der Lebensqualität, Schmerzen und Beschwerden, Unterbrechung der täglichen Arbeit zu leiden haben, erhöht Kosten für das Gesundheitswesen, und nur wenige Behandlungsmöglichkeiten andere als langfristige Antibiotikaprophylaxe. Uropathogenen Escherichia coli (UPEC) ist der wichtigste Erreger der ambulant erworbenen UTI. Katheter-assoziierten Harnwegsinfektionen (CAUTI) ist die häufigste Krankenhausinfektion Anteil von einer Million Ereignissen in den USA jährlich und dramatischen Kosten für das Gesundheitswesen. Während UPEC ist auch die Hauptursache für CAUTI sind der gestiegenen Bedeutung einschließlich Enterococcus andere Erregerfaecalis. Hier nutzen wir zwei etablierte Mausmodelle, die viele der klinischen Merkmale dieser Krankheiten beim Menschen zu rekapitulieren. Für UTI, rekapituliert ein C3H / HeN Modell viele der Merkmale von UPEC die Virulenz beim Menschen, einschließlich Wirtsreaktionen, IBC Bildung und Filamentierung beobachtet. Für CAUTI ein Modell mit C57BL / 6-Mäuse, die Blasenkatheter Implantate zu erhalten, hat sich gezeigt, anfällig zu sein E. faecalis Blasenentzündung. Diese repräsentative Modelle werden verwendet, um markante neue Einblicke in die Pathogenese der Krankheit UTI, die zur Entwicklung neuer Therapeutika und Management oder Präventionsstrategien führen wird gewinnen.

Introduction

Harnwegsinfektionen (HWI) sind eine der häufigsten bakteriellen Infektionen und kann in zwei Kategorien auf der Basis des Mechanismus der Übernahme, Gemeinschaft und nosokomiale erworben UTI aufgeteilt werden. Ambulant erworbenen Harnwegsinfekte häufig bei ansonsten gesunden Frauen und Studien auftreten, haben gezeigt, dass etwa 50% der Frauen mindestens eine UTI in ihrer Lebenszeit 1 haben. Zusätzlich ist Rezidiv ein großes Problem. Eine Frau, die einen anfänglichen akuten Infektion hat hat eine 25-40% ige Chance, mit einer zweiten Infektion innerhalb von sechs Monaten trotz entsprechender Behandlung mit Antibiotika und viele Frauen weiterhin häufigen Rezidiven 2 haben. Die Bakterien, die diese Infektionen verursachen, sind ebenfalls immer Antibiotika-resistente weitere verwirrende Behandlungsprotokolle 3-6. UTI betreffen Millionen von Menschen jedes Jahr kostet etwa 2,5 Milliarden US-Dollar in der Gesundheitsversorgung Aufwendungen in den USA und unterstreicht die Wirkung und die Verbreitung der Krankheit1,7 .Nosocomial erworbenen Harnwegsinfekte werden hauptsächlich mit der Anwesenheit von Fremdkörpern wie Dauerkatheter verbunden. Katheter-assoziierten Harnwegsinfektionen (CAUTI) bleiben die häufigste nosokomiale erworben UTI Anteil von ~ 70-80% solcher Infektionen 8. Darüber hinaus wird CAUTI mit erhöhter Morbidität und Mortalität verbunden und es ist die häufigste Ursache für sekundäre Infektionen Blutkreislauf 9 ist.

UPEC assoziiert ambulant erworbenen HWI werden gedacht, um durch die Einführung von Bakterien in die Blase aus Stauseen im Gastrointestinaltrakt durch mechanische Manipulation während des Geschlechtsverkehrs, mangelnde Hygiene oder andere mikrobielle Populationsdynamik zwischen verschiedenen Host verursacht werden Nischen 10. Einmal in der Blase, UPEC beschäftigen zahlreiche Virulenzfaktoren einschließlich Kapsel, Eisen Erfassungssysteme, Toxine, eine Virulenzplasmid, tRNAs, Pathogenitätsinseln und Kolonisierung Faktoren, die gezeigt haben, um eine Rolle in der Pathogenese spielen <sup> 11-14. Entscheidend für die Einrichtung von UPEC Kolonisation, UPEC auch kodieren mehrere Arten von Klebe Chaperon Platzanweiser Weg (CUP) Pili, die stereochemische Rezeptoren mit Spezifität 15 zu erkennen. Typ 1-Pili, die FimH Adhäsin gekippt wird, werden durch UPEC exprimiert und BIND mannosylierten uroplakins 16 und α-1, β-3-Integrine 17, die auf der luminalen Oberfläche der menschlichen und Maus-Blasen 18 exprimiert werden. Diese FimH-vermittelte Wechselwirkungen erleichtern die bakterielle Besiedelung und Invasion der oberflächlichen Epithelzellen 19,20. Einmal in der Zelle, kann UPEC ins Cytoplasma entkommen, wo ein einzelnes Bakterium kann rasch zu teilen, um eine intrazelluläre Bakteriengesellschaft (IBC), die bei der Reifung kann ~ 10 4 Bakterien enthalten 21 bilden. IBC Formation in mindestens sechs verschiedenen Mausstämmen nachgewiesen, C3H / Hen C3H / HeJ, C57BL / 6, CBA, FVB / NJ und BALB / c, und mit einer Vielzahl von verschiedenen UPEC-Stämme und andere Enterobacteriaceae 22-24. Jedoch zeitlichen und räumlichen Differenzen IBC Bildung kann in Abhängigkeit von der Maus Hintergrund und dem infizierenden UPEC Stamm variieren. In C3H / HeN-Mäusen mit dem prototypischen UPEC infiziert Stämme UTI89 oder CFT073, IBC Bildung kann so klein Biomassen von Bakterien so früh wie 3 hpi (h nach Infektion) visualisiert werden. Diese Gemeinschaft expandiert weiter und erreicht einen "Mittelpunkt" der Entwicklung ca. 6 hpi, wenn die stabförmigen Bakterien nehmen einen großen Prozentsatz der Cytoplasmaraum terminal differenzierter oberflächlichen Schirmzellen diese frühen IBCs Form in relativ synchron mit der Mehrheit die ähnliche Abmessungen und Morphologien. ~ 8 hpi die Bakterien in der IBC Wechsel von einem Bazillen zu Morphologie Kokken. IBCs sind vorübergehender Natur. So IBC Reifung von 12 bis 18 hpi Ergebnisse in die weitere Expansion der Bakterienpopulation, die durch ihre Filamentierung und Verbreitung folgte aus der Zelle with anschließende Ausbreitung auf benachbarte Zellen 23. So erlaubt zum schnellen Bakterienwachstum in einer Umgebung von Wirtsimmunantworten und Antibiotika 25 geschützt IBC Nische. Die unterschiedlichen Stufen der UPEC Infektion, bei Mäusen sind auch beim Menschen, wie beispielsweise IBC und Filamentierung beobachtet, die Unterstützung der Mausmodell der UTI als nützliches Werkzeug, das verwendet werden kann, um UTI bei Menschen 22,26-28 modellieren.

Während eine Mehrheit der Frauen erleben eine UTI in ihrer Lebenszeit, kann das Ergebnis dieser Infektionen von einer akuten Infektion selbstlimitierend ohne Wiederkehr liegen, häufig wiederkehrenden Blasenentzündungen. Weitere Studien haben eine starke familiäre Auftreten von UTI gezeigt, was auf eine genetische Komponente UTI Anfälligkeit 29 trägt. Wir haben festgestellt, dass die unterschiedlichen Ergebnisse UTI in Kliniken gesehen kann durch die unterschiedlichen Ergebnisse der experimentellen UPEC Infektion unter Inzucht-Mäusestämmen 30 gespiegelt werden. Zum Beispiel C3H / Hen CBASind DBA und C3H / HeOuJ Mäuse anfällig, in einer infektiösen Dosis-abhängigen Weise, lang anhaltende, chronische Zystitis, die durch anhalt, hohe Titer Bakterien (> 10 4 koloniebildenden Einheiten (CFU) / ml), hohe Titer Bakterien Blase Belastungen an Opfer> 4 Wochen nach der Infektion (WPI), chronische Entzündungen und urothelial Nekrose. Diese Mäuse zeigen auch erhöhte Serumspiegel von IL-6, G-CSF, KC, und IL-5 innerhalb der ersten 24 hpi, die als Biomarker für die Entwicklung chronischer Zystitis dienen. Dies kann genau den natürlichen Verlauf der UTI stellen in einigen Frauen, als Placebo-Studien haben gezeigt, dass ein großer Prozentsatz der Frauen mit UTI wird ein hohes Maß an Bakterien im Urin für einige Wochen nach der ersten Symptome der Zystitis zu behalten, wenn keine Behandlung mit Antibiotika 31 gegeben , 32. Ferner wurde unter Verwendung C3H / HeN-Mäusen, fanden wir, dass eine Geschichte der chronischen Zystitis ist ein signifikanter Risikofaktor für die spätere schwere wiederkehrenden Infektionen. Wiederkehrende UTI ist die significant klinische Manifestation der UTI und der C3H / HeN Maus ist derzeit das einzige Modell untersucht, die eine erhöhte Veranlagung nach vorheriger Exposition rekapituliert. Eine zweite UTI Ergebnis ist in C57BL / 6 Mäusen rekapituliert, wo akute UPEC-Infektion ist selbstlimitierend, mit einer Auflösung von Blasenentzündung und Bakteriurie innerhalb von etwa einer Woche. Interessant ist, dass in diesem Modell, UPEC bilden leicht Ruheintrazellulären Lagerstätten innerhalb der Blase Gewebe, aus dem UPEC in der Lage sind, die aus einem Ruhezustand, um eine aktive UTI reinitiate möglicherweise Erläuterung eines Mechanismus für die gleiche Belastung rezidivierenden HWI bei Menschen 33, 34.

Zusätzlich zu genetischen Einflüsse auf UTI Suszeptibilität, die Einführung eines Katheters in die Blase erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass eine Infektion als auch die Erhöhung der Reihe von Bakterien in der Lage, eine Infektion zu verursachen. Es wurde gezeigt, daß menschliche Blasenkatheterisierung bewirkt histologischen undimmunologische Veränderungen in der Blase durch mechanische Beanspruchung, die in einem robusten Entzündungsreaktion führt, Peeling, Ödeme der Lamina propria und submucusa, urothelial Ausdünnung und Schleimhautveränderung des Urothel und Nieren 35,36. Zusätzlich liefert der Katheter eine Oberfläche für bakterielle Befestigungs wodurch eine von mehreren Arten verwendet werden, um CAUTI verursachen Umgebung schaffen. Während UPEC sind immer noch ein wesentlicher Faktor, Enterococcus faecalis Konten für 15% dieser CAUTI 37. E. faecalis wird zunehmend resistent gegen Antibiotika mit Vancomycinresistenz Entstehung, die ein ernstes Gesundheitsproblem 38. E. faecalis besitzen zahlreiche Virulenzfaktoren einschließlich Toxinen und Adhäsine zur Befestigung sowohl des Katheters und des Epithels 38 notwendig. Während Blasenkatheterisierung, ist der Host anfällig für mikrobielle Adhäsion, die Vermehrung und Verbreitung in den Harnwegen 39,40. E. FAECAlis bildet einen Biofilm auf dem Katheter als Teil eines Mechanismus, der in der Blase bestehen und zu verbreiten, die Nieren, die in einem Maus-Modell CAUTI 41 wiedergegeben ist. Seit kurzem ist es während Blasenkatheterisierung gezeigt wird Fibrinogen (Fg) in die Blase als Teil der Entzündungsreaktion freigesetzt. FG akkumuliert in der Blase, Mäntel der Katheter und ist essentiell für E. faecalis Biofilmbildung, die als Anhang Schafott. In einer C57BL / 6-Mausmodell CAUTI entdeckten wir, dass E. faecalis Biofilmbildung auf den Katheter und somit die Persistenz in der Blase, war abhängig von der Ebp Pilus, insbesondere seine Spitze Adhäsin EBPA. Wir fanden, dass die N-terminale Domäne von EBPA spezifisch an FG Beschichten des Katheters. Zusätzlich wurde gefunden, dass E. faecalis nutzt Fg als Metabolit Quelle während der Infektion und somit eine Verbesserung der Biofilmbildung 42.

Mausmodelle kritisch unders bewährttanding sowie die Vorhersage klinischen Manifestationen der UTI und CAUTI 41. In diesem Artikel zeigen wir, Inokulumzubereitung der Zystitis UPEC isolieren UTI89 und transurethrale Inokulation von C3H / HeN Mäusen. Ein Protokoll für das Einführen des Katheters in C57BL / 6 Mäusen und Inokulation des E. Außerdem zeigen wir, faecalis OG1RF Belastung. Beide Verfahren führen zu einheitlichen und zuverlässigen UTI oder CAUTI bei Mäusen. Wir zeigen Ihnen auch Techniken zur IBC Formation während akute Blasenentzündung und Urinentnahme für die Analyse der chronischen oder rezidivierenden Blasenentzündungen zu beobachten. C3H / HeN Mäuse verwendet worden, um Aspekte der UPEC Pathogenese einschließlich anfängliche bakterielle Invasion, IBC Bildung, Filamentierung und die Entwicklung chronischer Blasenentzündung 23,33,43 studieren. Diese Parameter wurden auch die Virulenz in einer Vielzahl von anderen Maushinter 22,33 sucht. Für CAUTI ermöglicht der C57BL / 6-Modell für Fremdkörperimplantation in die Blase und anschließenden bakteriellen CoIonisation, die 7 Tage lang aufrechterhalten werden kann nach der Infektion 41. Diese Modelle waren nützlich für die Bewertung der bakteriellen Virulenz-Mechanismen, Host antwortet UTI und Mechanismen zur Wirtsreaktionen, von denen viele in der Folge rekapituliert wurden oder in klinischen Humanpopulationen beobachtet zu untergraben.

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Protocol

Ethics Statement: Die Washington University Animal Studies Committee genehmigt alle Maus-Infektionen und Verfahren als Teil der Protokollnummer 20120216, die 2013.01.11 genehmigt wurde, und endet 2016.01.11. Insgesamt Pflege der Tiere war konsistent mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren von der National Research Council und der USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasie-Verfahren sind im Einklang mit den "AVMA Richtlinien für die Euthanasie von Tieren Ausgabe 2013".

1. UPEC UTI Protocol, Impfnadel Vorbereitung (Abbildung S1)

  1. Entfernen Sie die Kappe des 30 G Nadel. Faden ungefähr 1 Zoll von PE10 Schlauch auf dem Schaft der Nadel. UV die Nadelanordnungen über Nacht zu sterilisieren. Katheterisiert Nadeln können auf unbestimmte Zeit in sterile Petrischalen gelagert werden.

2. UPEC Bakterieninokulum Vorbereitung

  1. Bereiten UTI89 Inokulum (Start 72 Stunden vor der Inokulation Tag)
    1. Streak UTI89 auf eine LB (Luria-Bertani) Agar-Platte aus einem gefrorenen Vorrat. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C. Wählen Sie eine Kolonie und impfen ihn in 10 ml LB in einen 125-ml-Kolben. Bei 37 ° C während 24 Stunden, statisch.
    2. Inokulieren 10 ul Übernachtkultur in 10 ml LB in einem neuen 125 ml Kolben für weitere 24 h bei 37 ° C statisch.
    3. Transfer 3 ml sterile 1,5-ml-Röhrchen und zentrifugieren (wird am Stamm und gewünschte Inokulumgröße variieren) bei 7.000 × g für 3 min und das Pellet in 1x PBS und zentrifugieren ein zweites Mal. Resuspendieren Bakterienpellet in 1 ml 1x PBS.
  2. Messen bakterielle optische Dichte und passen auf die gewünschte Konzentration Inokulumdichte. Die Standard-Konzentration des Inokulums beträgt 10 7 Bakterien; dies kann jedoch variieren aufgrund der Gestaltung der Studie.

3. Bakterieninokulation

  1. Reinigen Sie die Workstation mit 70% Ethanol und cüber Bereich mit saugfähigem Papier (oder verwenden Sie sterile Flow-Haube).
  2. Draw bis 0,9 ml der vorbereiteten Bakterienimpfmaterial in eine 1 ml (TB) Spritze (Luftblasen zu entfernen). Bringen Sie einen bereit sterile Impfnadel mit PE10 Schlauch, auf die Spritze mit dem Impfstoff, dann steril die Polyethylenschlauch trimmen.
    Hinweis: lassen 1 mm Schlauch oberhalb der Spitze der Nadel zu vermeiden Stechen der Blase.
  3. Schneiden Sie ein 1-Zoll-Quadrat Stück Parafilm und legte einen Klecks chirurgische Schmiermittel (ungefähr die Größe eines Cent) oben.
  4. Betäuben weiblichen C3H / HeN-Mäusen, indem man sie in einem 32 Unzen Glas, die ein Tee-Ei Ball mit Wattebällchen mit 3 ml Isofluran oder Verdampferkammer eingeweicht (folgende fertigt Protokoll) bis bewusstlos, aber immer noch normal atmen (1 Atemzug / sec) .
    Hinweis: Einige IACUC Ausschüsse nicht die Verwendung eines Glases oder Verdampfer zu genehmigen. Bitte folgen Sie dem Hinweis auf die IACUC Ausschuss Ihrer Institution.
    HINWEIS: Wenn Glasmit Tee-Kugel und / oder Nasenkonus mit Isofluran-soakd Watte verwendet werden, müssen das Tier genau zu beachten, um Überdosis Narkosemittel und Tod zu vermeiden. Der Vorteil der Verwendung eines Verdampfers und Anästhesiekammer ist, daß sie gesteuert Isofluran Verabreichung dass versehentliche Überdosierung vermieden. ACHTUNG: Isofluran ist ein Inhalationsanästhetikum. Verwenden Sie in einem gut belüfteten Ort und minimieren Einatmen.
  5. Entfernen Sie die Maus aus dem Glas / Verdampfer und legen Sie sie auf dem Rücken auf einem Papiertuch und breitete die Beine.
  6. Bedecken Nase der Maus mit einem Nasenkegel (ein Rohr mit dem Verdampfer, die eine kontrollierte isoflurance Dosis, die bei einigen Verdampfereinheiten ausgestattet kommt bereitstellt) oder 50 ml konischen Röhrchen mit einem Wattebausch, das eine geringe Menge (etwa 1-2 ml ) von Isofluran.
  7. Klopfen Sie vorsichtig die Blase beim Wasserlassen zu induzieren und sorgen für eine mit Hohlräumen versehene Blase. Wischen Sie die periurethralen Bereich mit 100% Ethanol abwischen. Dab die Impfung Nadel / Spritze, zeigen erste, in derchirurgische Gleitmittel.
  8. Inokulieren jeder Maus mit 50 ul der Bakterienlösung durch Einführen der Impfnadel transurethral, ​​ungefähr 12 mm, und Niederdrücken des Spritzenstempels vorsichtig, um das Inokulum in die Blase sanft (10 & mgr; l / sec) zu verzichten. Entfernen Sie die Impfung Nadel aus der Maus.
    HINWEIS: Sofortige Rückkehr Inokulum an der Harnröhrenöffnung, wenn zu Beginn zu impfen zeigt falsche oder unvollständige Einführung der Nadel.
  9. Entfernen Sie die Maus vom Nasenkonus und wieder in seinem Käfig. Wiederholen Sie die Schritte 3,3-3,8 für jede Maus. Wenn / wenn Schalt Inokulum Bedingungen / Stämme, entsorgen Sie die Spritze und Impfung Nadel in einem zugelassenen Entsorgungsboxen und beginnen Sie erneut mit Schritt 3.2.
    HINWEIS: Die Impfung mit uropathogenen Organismen in der Regel nicht starken Schmerzen Symptome verursachen. Doch in seltenen Fällen die Verabreichung hoher Dosen von Krankheitserregern kann Fieber, Verminderung der Futter- und Wasseraufnahme und Verhaltensstörungen verursachen. EINnimal Gesundheit sollte während des gesamten Experiments überwacht. Wenn offene Schmerzsymptome sind Vorankündigung, ein Analgetikum, wie Buprenorphin (0,05 bis 0,1 mg / kg subkutan), angewendet werden. Verfahren sollten gemäß dem IACUC jeder Institution.

4. Bestimmung der Bakterienlasten

  1. Bereiten separaten 5-ml-Röhrchen für jede Blase und Nieren Paar, geerntet werden. 1 ml 1x PBS / Rohr / Blasemaus In den geerntet werden. In 0,8 ml 1x PBS / Rohr / Paar Maus Nieren, geerntet werden. Beschriften Sie jedes Rohr, um auf eine Maus entsprechen. Bereiten Sie eine Platte mit 96 Vertiefungen mit 180 ul 1x PBS in jede Vertiefung für 01.10 Verdünnungsreihen.
  2. Reinigen Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol und decken den Bereich mit einem saugfähigen Abdeckung oder Papiertuch.
  3. Betäuben die Maus mit Isofluran (siehe Schritt 3.4), bis die Maus aufhört zu atmen für ca. 1 min, dann legen Sie sie auf dem absorbierenden Abdeckung oder Papiertuch. Andere Verfahren der euthanasia werden auch von IACUC Ausschüsse, wie Kohlendioxid akzeptiert und kann zum Überdosis Isofluran ersetzt werden.
  4. Opfern Sie die Maus durch schnelle Genickbruch, die der Zurückhalten des Halses an der Basis des Kopfes und ziehen den Schwanz horizontal vom Körper weg, bis Dislokation auftritt besteht.
    HINWEIS: Die meisten IACUC Ausschüsse erfordern ein zweites Mittel zur Euthanasie und Genickbruch ist eine gängige Methode. Jedoch können auch andere Verfahren verwendet werden, wenn durch die IACUC Ausschuss genehmigt werden.
  5. Legen Sie die tote Maus auf dem Rücken und Spray 70% Ethanol auf dem Bauch. Zerlegen der Maus, Ernte der Nieren und Blase, die in dieser Reihenfolge, um eine mögliche Kontamination aus dem Blut nach der Nieren Dissektion minimieren. Legen Sie die Organe unabhängig voneinander in die vorbereiteten Röhrchen mit 5 ml 1x PBS (siehe Schritt 4.1).
    HINWEIS: Verwenden Sie verschiedene Scheren für die externe Präparation und für den Organraub, um eine Kontamination zu minimieren.
  6. Tippen Sie auf das Rohr, um sicherzustellen, dass die Organe sind in ter 1x PBS. Wiederholen Sie die Schritte 4,3-4,5 für jede Maus. Sauberen Schere und Pinzette in 70% Ethanol nach jeder Maus.

5. Bakterielle Wieder

  1. Homogenisieren geernteten Harnblase und Nieren in den 5-ml-Röhrchen mit einer Gewebe-Homogenisator 15 sec pro Niere und 30 Sekunden pro Blasen. Homogenisator sequentiell Spülung in 1 × PBS, 70% Ethanol und 1x PBS zwischen den Proben.
  2. Stellen Sie serielle Verdünnungen 1.10 out bis 10 -8 und Schild Jede Verdünnung für CFU (koloniebildende Einheiten) auf LB-Agarplatten. Die Platten bei 37 ° C Inkubieren über Nacht und zählen Kolonien am nächsten Tag.

6. IBC Enumeration

  1. Aseptisch entfernen Sie die Blase und legen Sie sie in 1x PBS in einer 6-Lochplatte mit einem Silikon-Unterseite. Die Platten können mit einem Silikonelastomer-Kit und Gießen ca. 1 cm aus Silikon in jeder gut vorbereitet sein, siehe Herstelleranweisungen. Schneiden Sie die Blase in der Mitte mit einer Schere.
  2. Mit kleinen Metallnadeln leicht spreizen die bladder so dass die Blasenlumen nach oben weist. Achten Sie darauf, die Stifte an den äußersten Rändern der Blase Abschnitte setzen, um sicherzustellen, die maximale Menge an Urothel ausgesetzt ist.
  3. Nach dem Spreizen, vorsichtig waschen die Blase einmal mit 1x PBS. Entfernen Sie die 1x PBS mit einer Pipette. Befestigen Sie die Blase durch Zugabe von 3% Paraformaldehyd genug, um den gesamten gespreizten Blase abzudecken. ACHTUNG: Paraformaldehyd ist krebserregend. Geeignete Schutzausrüstung, einschließlich der Handschuhe, sind jederzeit getragen werden. Entsorgung muss Institutionsrichtlinien zu folgen.
  4. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde. Entfernen Paraformaldehydlösung. Einmal mit 1x PBS waschen.
  5. LacZ mit Waschlösung (2 mM MgCl 2, 0,01% Natriumdesoxycholat und 0,02% Nonidet-p40in 1x PBS) dreimal für 5 Minuten pro Waschgang waschen.
  6. Entfernen der Waschlösung und füge ausreichend LacZ-Färbung (9,5 ml LacZ Waschlösung, 0,4 ml 25 mg / ml X-gal und 0,1 ml 100 mM K-Ferrocyanid / K-Ferricyanid), um die Blasen zu bedecken. Inkubieren bei 30 ° C overnight vor Licht geschützt.
  7. Entfernen gespreizt Blasen von Inkubator und beobachten IBCs, die als mit einem Binokular, 40-60X Vergrößerung sichtbar gemacht, wie blau puncta angezeigt.
    HINWEIS: Manchmal kann eine Maus vor der Platzierung des Rohrs unter der Harnröhre urinieren. In diesem Fall warten Sie 15-20 Minuten bevor Sie versuchen, Urin wieder zu sammeln.

7. Urinentnahme für Bakteriurie CFU Enumeration (gilt nicht für CAUTI)

  1. Um Urin vorge sammeln oder nach der Infektion sanft zurückhalten die Maus, indem Sie den Schwanz und stellen Sie es auf eine ebene erhöhten Fläche (oben auf der Maus Käfig).
  2. Halten Sie eine sterile 1,5 ml-Röhrchen unter der Maus Urethra. Drücken Sie vorsichtig auf die Rückseite der Maus in der Nähe des Schwanzes, um Druck auf die Blase anzuwenden. Fangen Sie den Urin in der 1,5-ml-Tube.
  3. Stellen Sie serielle Verdünnungen 1.10 out bis 10 -7 und Platte jeder Verdünnung auf entsprechende LB. Die Platten bei 37 ° C Inkubieren über Nacht und zählen Kolonien am nächsten Tag.

8. CAUTI Modell Protocol, Katheter-Nadel Vorbereitung CAUTI Modell (Abbildung S2)

  1. Entfernen Sie die Kappe des 30 G Nadel. Schneiden Sie ein 7 mm Stück PE10 Schlauch und 5 mm Stück Silikonschlauch wie RenaSIL. Fädeln Sie die Nadel mit PE10 Schlauch, bis die Schläuche der Basis der Nadel berührt.
  2. Dann füttern die 5 mm Stück auf den PE10 haltigen Nadel. UV die Nadeln Baugruppen über Nacht zu sterilisieren.
    HINWEIS: Beim Laden der Silikonschlauch, lassen Sie etwa 1 mm des Schlauchs an der Nadelspitze erstreckt.

9. E. faecalis OG1RF Bakterieninokulum Vorbereitung

  1. Vorbereitung OG1RF Inokulum beginnend 48 Stunden vor der Inokulation Tag. Streak OG1RF auf eine BHI (Brain Heart Infusion) Platte aus einem gefrorenen Vorrat.
  2. Wählen eine Kolonie und inokulieren es in 10 ml BHI und wachsen sie statisch 18 h bei 37 ° C. Zentrifugieren Sie die Kultur und das Waschen des Pellets (3 mal) in 1 ml Volumina sterile 1x PBS.
  3. Resuspendieren Bakterienpellet in 1x PBS. Messen Sie bakterielle optische Dichte und stellen Sie die Konzentration auf die gewünschte Inokulumgröße. Die Standard-Konzentration des Inokulums beträgt 10 7; jedoch kann dieser aufgrund der Gestaltung der Studie variieren

10. Katheter Implantation

  1. Reinigen Sie die Workstation mit 70% Ethanol und decken den Bereich mit einem saugfähigen Abdeckung (oder verwenden Sie sterile Flow-Haube).
  2. Bringen Katheter-Nadel in eine leere 1 ml (TB) Spritze. Schneiden Sie ein 1-Zoll-Quadrat Stück Parafilm und legte einen Klecks chirurgische Schmiermittel (ungefähr die Größe eines Cent) oben.
    Anmerkung: Zwei verschiedene Nadeln für die Abscheidung des Katheters und ein Inokulum minimiert zufälligen Inokulation aufgrund der mechanischen Manipulation zur Katheterimplantation notwendig ist. Dies ermöglicht auch die Bequemlichkeit der Herstellung weniger Impfnadeln.
  3. Betäuben C57BL / 6 Mäusen, indem man sie in einem 32 Unzen Glas, die ein Tee--infuser Ball mit Watte in 3 ml Isofluran oder Verdampferkammer eingeweicht (folgende fertigt Protokoll) bis bewusstlos, aber immer noch normal atmen (1 Atemzug / sec).
  4. Dann legen Sie die Maus auf dem Rücken auf einem Papiertuch und breitete die Beine. Decken Sie die Nase der Maus mit einem Nasenkonus oder 50 ml konischen Röhrchen mit Watte mit einer geringen Menge (etwa 1-2 ml) von Isofluran.
    ACHTUNG: Isofluran ist ein Inhalationsanästhetikum. Verwenden Sie in einem gut belüfteten Bereich und Einatmen minimieren, indem Forscher.
  5. Klopfen Sie vorsichtig die Blase beim Wasserlassen zu induzieren und sorgen für eine mit Hohlräumen versehene Blase. Wisch periurethralen Bereich mit 100% Ethanol zu wischen.
  6. Desinfizieren Sie die periurethralen Bereich mit 10% Povidon-Iod-Lösung mit einem Baumwollspitze Applikator. Dab die Inokulation Nadel / Spritze, zeigen erste, in das Operations Schmiermittel.
    HINWEIS: Povidin-Jod ist für Katheter-Implantation, die eine stärkere aseptische Lösung als Alkohol verwendet wird. Katheter Implantation benötigtWeitere mechanische Manipulation, um den Katheter und somit ein größeres Potential für die Kontamination einzufügen.
  7. Stecken Sie den Katheter in die Harnröhrenöffnung. Einmal in, mit Hilfe einer Pinzette, um den (7 mm PE10) langes Stück in Richtung auf die Blase drücken, damit Drücken der (5 mm Silikon) kleinen Katheter und Ablegen in die Blase. Entfernen Sie die Nadel, mit der 7 mm Schlauch noch angebracht, sofort.

11. Bakterieninokulation

  1. Folgen Sie dem Bakterieninokulation Protokoll in Abschnitt 3, unter Verwendung der hergestellten Inokulum aus Abschnitt 9. Entfernen Sie die Maus vom Nasenkonus und senden es an seinem Käfig

12. Zu jedem Zeitpunkt der Opferung

  1. Bereiten Sie 5 ml Röhrchen für Blase und Niere (Für Organe folgen Schritt 4.1) und 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen für Katheter. 1 ml 1x PBS in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen für Katheterproben
  2. Führen Sie die Schritte 4,3-4,5. Präparieren Sie die Maus, der Ernte der Blase, Nieren und Katheter, placing die Gewebe unabhängig voneinander in 5 ml Röhrchen mit 1x PBS und der Katheter in die 1,5-ml-Eppendorf (siehe Schritt 12.1).
    HINWEIS: Verwenden Sie verschiedene Scheren für die externe Präparation und für den Organraub und Retrieval-Katheter, um eine Kontamination zu minimieren
  3. Dann folgen Sie Schritt 4.6.

13. Bakterielle Wieder

  1. Für Organe, führen Sie die Schritte 5.1 und 5.2. Für bakterielle Erholung von Kathetern, Vortex bei maximaler Geschwindigkeit für 30 Sekunden beschallt der Katheter Proben für 5 min mit einem Ultraschallbad und anschließend Wirbel bei maximaler Geschwindigkeit für weitere 30 Sek.
  2. Stellen Sie serielle Verdünnungen 1.10 out bis 10 -8 und Schild Jede Verdünnung für CFU-Enumeration auf BHI-Platten. Die Platten bei 37 ºC über Nacht inkubieren und zählen Kolonien am nächsten Tag.

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Representative Results

Die intravesikale Modelle unkompliziert und Katheter assoziierten UTI bieten flexible Plattformen für die Aufklärung der molekularen Mechanismen der bakteriellen Pathogenese, die Auswirkungen dieser Krankheiten auf Wirtsgewebe, und die Entwicklung und Erprobung neuer Ansätze, um diese gemeinsame und teure Infektionen zu verwalten. In Abhängigkeit von der Mausstamm und Krankheitserreger können intravesical Impfung verwendet werden, um Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen, um Faktoren für die Initiierung oder akute Modulation notwendig (Bild 1 und 3), chronischen oder wiederholten (Abbildung 2) Zystitis erläutern werden. Die in Figur 1 gezeigten Daten sind repräsentativ für akuten Phase (24 hpi) Harnwege Kolonisierung durch den prototypischen UPEC Zystitis isolieren UTI89 44. Nach der Inokulation werden die Infektionen erlaubt, 24 Stunden lang, an welcher Stelle die Mäuse getötet und die Blasen- und Nierengewebe homogenisiert zu entwickeln. Die Gewebehomogenaten seriell DILUTed und zur Zählung von Bakterien besiedeln plattiert. Chronische UPEC Kolonisierung und Blasenentzündung kann etabliert und in einigen Mauslinien (insbesondere C3H / hen) in einer infektiösen Dosis und Uropathogen abhängig gepflegt werden. Chronische Blasenentzündung als persistent hohen Titer Bakteriurie festgelegt (> 10 4 KBE / ml), Blasenentzündung und Blasen hohen Titer bakterielle Belastungen (> 10 4 KBE / Blase) bei 33 Opfer. Die in 2 gezeigten Daten sind repräsentativ CFUs vorkommenden 4 Wochen nach der Inokulation von C3H / HeN-Mäusen mit 2 x 10 7 CFU UTI89. Unter diesen experimentellen Bedingungen, 20-50% der infizierten Mäuse entwickeln eine chronische Zystitis, während die verbleibenden 50-80% der Mäuse die Infektion aufzulösen. Diese Dualität der Ausgang ist abhängig von einer Wirt-Pathogen-Checkpoint, der innerhalb der ersten 24 hpi entschieden wird. Aktivierung (oder nicht) von den Checkpoint Ergebnisse in der beobachteten bimodale Verteilung von bakteriellen Titer, das zu manifestieren beginnt inder Urin in 3 dpi (Tage nach der Infektion) und in der Blase bei der Tötung 28 dpi (Figur 2) 33. Mäuse mit einer Geschichte von chronischen Blasenentzündung deutlich wiederkehrende chronische Blasenentzündung bei Herausforderung veranlagt nach der Erstinfektion mit Antibiotika-Therapie 33 gelöscht. In ähnlicher Weise ist eine Geschichte der UTI ein bekannter Risikofaktor für wiederkehrende Harnwegsinfektionen bei Menschen. Somit ist dies das einzige bekannte Modell verwendet, um die Pathogenese von rezidivierenden Harnwegsinfektionen studieren. Bei experimentell Modellierung UTI in alternativen Maus Hintergründe, ist es wichtig, festzustellen, ob die Mausstamm ist anfällig für UTI, wiederkehrende Harnwegsinfektionen oder CAUTI, da einige Stämme sind mehr oder weniger resistent gegen die Entwicklung dieser Syndrome 33.

Eine zusätzliche Messung der akuten Zystitis ist IBC-Enumeration. IBC Bildung zu den terminal differenzierten oberflächlichen Schirmzellen beschränkt. IBC Quantifizierung ist ein informatives Maß der bakteriellen Belastung während der akuten Zysteitis und hohe IBCs korrelieren mit dem Risiko für chronische Cystitis 21. IBC Bildung tritt nur in den akuten Phasen der Erkrankung. Nach der Ablösung der oberflächlichen Schirmzellen sind IBCs nicht mehr beobachtet. In der C3H / HeN UTI Modell können IBCs 6 Stunden nach der Inokulation von ~ 1 × 10 7 CFU von UTI89 in die Blase transurethral gemessen werden. Blasen sind mit Metallstiften auf Silikonplatten gespreizten und für die Expression von LacZ gefärbt. LacZ, β-Galactosidase, ist ein allgemein ausgedrückt bakterielle Enzym, das die Bindung zwischen β Galactose und andere Zucker. Dieses Enzym kann verwendet werden, um Bakterien, die durch Zuführen von X-gal, ein β-galactosid Analog, welches bei der Spaltung eine blaue Farbe erzeugt, detektieren. Nach der Färbung werden die Blasen unter einem Binokular mit der IBC als Pünktchen blau / lila Punkte auf dem Urothel und IBCs erscheinen abgebildet kann durch Zählen der Punkte (3A) aufgezählt werden. Während die Anzahl von IBCs pro Haustier gebildet variiert, in dem C3H / HeN Hintergrund durchschnittlich ~ 50 IBCs pro Harnblase (Figur 3B) zu sehen. IBCs Anstieg in einer dosisabhängigen Weise. Die Anzahl der IBC, die Form variiert zwischen UPEC und Maus Hintergrund Stämme. Beispielsweise in C57BL / 6, ein Inokulum von ~ 1 × 10 7 UTI89 resultiert in der Bildung von mehreren hundert pro IBCs Blase.

Beyond the unkompliziert ambulant erworbenen UTI oben modelliert, Heide-Care-assoziierten Harnwegsinfektionen stellen eine erhebliche Belastung für das Gesundheitssystem. HWI stellen etwa 40% der gesamten Gesundheitsversorgung assoziierten Infektionen und bis zu 95% aller Gesundheits assoziierten Harnwegsinfektionen sind Katheter zugeordnet 45. Hier zeigen wir eine Blase Implantat Mausmodell der CAUTI, die ein leistungsfähiges System für die experimentelle Analyse dieser schwierigen klinischen Problem darstellt. Die in Figur 4 gezeigten Daten repräsentativ 24 hr-Infektionen mit dem Modell gibt E. faecalis s trainieren OG1RF. Bei 1 × 10 7 CFU von OG1RF werden intravesikal in eine nicht implantierten Blase eingeimpft, beginnt die Infektion klar um 24 hpi (4A) und nach 3 dpi die Infektion 41 gelöst. Umgekehrt Inokulation OG1RF in einem implantierten Blase ergibt Kolonisierung sowohl der Katheter und der Blase, mit 10-fach höhere Blasen Kolonisierung Ebenen bei 24 hpi als in den nicht implantierten Blasen beobachtet (4A und 4B). Zusätzlich diese Infektion bei> 10 6 CFU in der Blase bis Katheter Verlust ca. 7 dpi 41 gehalten. Alle beschriebenen experimentellen Modellen zugänglich sind zu einem hohen Grad von experimentellen Flexibilität, einschließlich, aber nicht ausschließlich, verschiedene Ansätze für die makroskopische und mikroskopische Abbildung der infizierten Geweben und Oberflächen, verändert Inokulum Größen und Krankheitszeiten, konkurrenz Infektionen und immunologische Analysen Rechner .

ve_content "> Abbildung 1
Abb. 1: 24-Stunden-Harnwege Kolonisierung weiblich, 7-8 Wochen alten C3H / HeN Mäuse wurden transurethral mit ~ 2 × 10 7 CFU des prototypischen UPEC Zystitis geimpft isolieren UTI89 24 h. Repräsentative CFUs aus den geernteten Blasen- und Nierengewebe gewonnen werden, dargestellt ist, n = 5. Eine gestrichelte Linie zeigt die untere Nachweisgrenze (20 CFU).

Figur 2
Abb. 2: 28 Tage Harnwege Kolonisierung weiblich, 7-8 Wochen alten C3H / HeN Mäuse wurden transurethral mit ~ 2 × 10 7 CFU UTI89 impft. Urin sammeln sich an angegebenen Tagen nach der Infektion (dpi) und für CFU-Enumeration überzogen. Repräsentative 28 Tage Blasen- und Nieren Titer werden ebenfalls angezeigt, n = 8. Urin CFU untere Nachweisgrenze (1.000 CFU / ml) wird durch die gestrichelte Linie bezeichnet. Gepunktete Linie Vertrets das Gewebe untere Nachweisgrenze, 20 KBE / Gewebe.

Figur 3
Abb. 3: IBC Aufzählung weiblich, 7-8 Wochen alten C3H / HeN Mäuse wurden transurethral mit ~ 1 × 10 7 CFU UTI89 impft. Blasen wurden 6 hpi geerntet und zur IBC Färbung gespreizt. (A) Foto des abgespreizten Blase nach LacZ-Färbung. IBCs sind als blaue Punkte dargestellt. Der Bildeinsatz ist eine digitale Vergrößerung der Abschnitt des Bildes in der Black Box. (B) Repräsentative Zahlen von IBCs in C3H / HeN Mäusen gebildet 6 hpi, n = 10.

Figur 4
Abbildung 4: E. faecalis katheterassoziierten UTI. C57BL / 6-Mäuse wurden mit oder ohne Katheter mit ~ 1 × 10 7 CFU des inokulierten (A) E. faecalis Blase Kolonisierung in Gegenwart oder Abwesenheit eines Katheters. (B) E. faecalis Katheter Kolonisation. Mann-Whitney U-Test wurde für Mausexperimenten verwendet wurde, wurde p <0,05 statistisch signifikant. **; P <0,005.

Abbildung S1
Abbildung S1:. UTI Impfnadel Vorbereitung Diagramm zeigt Impfnadel Vorbereitungsschritte einschließlich der benötigten Materialien (1), Gewindeschneiden des Katheters an der Nadel (2) und den Zuschnitt der Rohrleitung vor der Impfung (3).

Abbildung S2
Abbildung S2:. CAUTI Impfnadel Vorbereitung Diagramm zeigt Impfnadel Herstellung benötigten Materialien (1), Einfädeln der Impfung Katheter (2) und Implantationskatheter aufan der Nadel (3).

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Discussion

Unkompliziert ambulant erworbenen UTI ist eine häufige und teure Infektion entfallen mehrere Millionen Grundversorgung Besucher jedes Jahr 46. Darüber hinaus sind Cautis eine gemeinsame Gesundheits erworbenen Infektionen gewordenen extrem teuer Gesundheitsdienstleister wie die Centers of Medicare und Medicaid Services nicht mehr erstattet Anbieter für die zusätzlichen Kosten für die Behandlung von im Krankenhaus erworbenen CAUTI 45 ergibt. Die Maus-Modellen der UTI, sowohl unkomplizierten Zystitis und CAUTI, in diesen Protokollen beschrieben liefern wertvolle Werkzeuge für das Verständnis der molekularen Grundlagen der Wirt und Pathogen-Interaktionen für die Einleitung, die Aufrechterhaltung und die Modulation der Ergebnisse der verschiedenen Formen der UTI notwendig. Diese Modelle erlauben für die Anwendung der leistungsfähigen Bakterien und Mausgenetik, immunologische, mikroskopische, biochemische und chemische genetische Werkzeuge für die Analyse von UTI 23,47-49. Zusätzlich können die Protokolle hier skizzierten haben eine Plattform zur Verfügung gestelltfür die Entwicklung und Erprobung neuer therapeutischer und präventiver Strategien einschließlich der niedermolekularen Inhibitoren der bakteriellen Virulenz und neuartigen Impfung Ziele und Strategien 50-55.

Es gibt einige wichtige Bedingungen, die für die erfolgreiche Anwendung der unkomplizierten Zystitis Modell erhalten bleiben muss. Wie bei allen Maus anesthetization Verfahren muss darauf geachtet werden, um Maussterblichkeit aufgrund von Über anesthetization verhindern. Bei der Vorbereitung der Inokulation Katheter muss die Siliconschlauchleitung ausreichend lang, um die Spitze der Nadel abdecken, jedoch nicht so lange, um die Wand der Blase auf Katheterisierung beschädigen. Zusätzlich aufgrund der Nähe und der Größe der Vaginalöffnung, muss darauf geachtet werden, den Impf-Katheter in die Harnröhre und die Vagina nicht einzulegen. Während Blase Spreizung für IBC-Enumeration, ist es unerlässlich, dass die Blasen so schnell wie möglich nach Präparation und das Gewebe gespreizt werden für appro fixiert werdenximately 1 Stunde, aber nicht über Nacht. Für IBC Aufzählung von LacZ-Färbung, ist es auch notwendig, dass das Bakterium in Frage produzieren LacZ während Urothelzellkulturen Kolonisation. Bei der Verwendung von Stämmen, wo die LacZ-Enzym nicht erzeugt wird, ist es immer noch möglich, aufzuzählen IBCs durch Immunfluoreszenzmikroskopie mit anti- E. coli Antikörper oder GFP-exprimierenden Bakterien. Ein besonderes Merkmal dieses Modells ist, die unterschiedlichen Muster des Fortschreitens der Krankheit und der Schwere von verschiedenen Inzucht-Mauslinien präsentiert und die unterschiedliche pathogene Potential des prototypischen UPEC Stämme 33,56. Diese Unterschiede sind sowohl eine Stärke und Beschränkung dieser Technik, da sie die natürliche Variation der Suszeptibilität und Erreger Vielfalt, die in klinische und phänotypische Studien beobachtet wurde, während kompliziert experimentellen Design und Auslegung 57,58 rekapitulieren. Diese Variationen stellen Quellen Vergleich so dass für die Aufklärung von Wirt und Bakterien mechanIsmen die Modulation der Pathogenese der unkomplizierten HWI 33,56. Sie können aber auch bedeuten, dass aufgrund der unterschiedlichen Grad der Mauslinie UTI Anfälligkeit muss äußerste Sorgfalt bei der Auswahl des richtigen Mauslinie und UPEC Belastung für den besonderen Frage ein Ermittler fragt genommen werden. Sind beispielsweise C57BL / 6-Mäuse ein ausgezeichnetes Modell der akuten Infektion präsentiert hoher Bakterien Titer und eine große Zahl von IBCs zu frühen Zeitpunkten. Dieser Stamm dann schnell löst die Infektion zwischen 3 und 7 dpi mit dem einzigen anhaltenden Kolonisierung einer schweren Niereninfektionen und Ruheintrazellulären Lagerstätten 33,34 resultieren. Die C57BL / 6-Modell kann genau stellen die häufigsten Resultat für UTI viele Patienten, in der Gegenwart und dann Beschwerden zu beheben. Umgekehrt zeigt der C3H / HeN Maus Hintergrund eine hohe Anfälligkeit für chronische Blasenentzündung macht sie zur idealen Sorte für die Untersuchung wiederkehrende Harnwegsinfekte. Andere UTI Modelle haben auch festgestellt,in CBA, DBA, und C3H / HeJ Mäusen Hintergrund erweist sich die für das Studium besondere Aspekte der UTI 33,59. Der primäre experimentelle Nachteil durch die unkomplizierten Zystitis Modell ausgestellt ist die Existenz von mehreren Infektionen Engpässe Begrenzung der Anwendung von großen genetischen Screening Methoden für die Entdeckung von neuen Bakterienfaktoren für akute, chronische und wiederkehrenden Blasenentzündungen 60 notwendig.

Die kritischen Überlegungen zur unkomplizierten Zystitis Modell alle gelten für das Implantat auf Basis CAUTI Modell mit zwei zusätzlichen Bedenken. Zunächst muß darauf geachtet werden, dass das Einsetzen des Implantats in sterile Weise erfolgt aufgrund der erhöhten Anfälligkeit für Blaseninfektion durch das Implantat übertragen. Zweitens ist es wesentlich, dass der Katheter während der Entfernung der Implantationsnadel an ihrem Platz gehalten werden. Die Haupteinschränkungen der CAUTI Modells sind, daß sie einen verringerten Bereich verfügbarer Host genetischen Hintergründen, die propensity für Katheter Verlust im Laufe der Zeit und die Unfähigkeit, Urin aufgrund von Blasenfunktionsstörungen Implantation einzuziehen. Für Implantatverlust und die Unfähigkeit, die Infektion über Längs Harnanalyse überwachen zu kompensieren, erfordert dieses Modell im Allgemeinen eine höhere Anzahl von katheterisiert Mäusen späteren Zeitpunkten und Mäusegruppen müssen bei jedem gewünschten Zeitpunkt geopfert werden. Die begrenzten Wirts genetischen Hintergründen ergibt sich aus der Verbots Frequenz, bei der einige Mausstämmen, wie C3H / Henne, verliert das Implantat (P. Guiton, persönliche Mitteilung 2010). Als Ergebnis haben die oben beschriebenen CAUTI Protokolle allein in der C57BL / 6-Mausstamm optimiert. Während jedoch die Begrenzung der verfügbaren Mausstämme für CAUTI ist bedauerlich, viele genomische Variationen in der C57BL / 6-Hintergrund etabliert und die CAUTI Modell erweitert das bakteriologische Diversity für Studie verfügbar bei UTI durch Änderung der Umgebung, um Blasen Kolonisierung durch Organismen zu erleichtern, daß sindansonsten nicht-pathogenen im Mausmodell der UTI. Ein Beispiel hierfür ist die kürzliche Entdeckung der Rolle von Fg während Katheter induzierte Entzündung der Blase in E. Freigabe faecalis Wachstum, die Biofilmbildung und Ausdauer während CAUTI 42. Dieses Beispiel zeigt die Leistung des Implantatmodell CAUTI bei der Aufklärung nicht nur bakterielle molekularen Mechanismen der Pathogenese, sondern auch die Rolle von Wirtsfaktoren während der Infektion. Alle diese Merkmale tragen zum Verständnis dieser relevanten klinischen Infektion, die zuvor under wurde.

Zusätzlich zu den oben beschriebenen experimentellen Ansätzen, die Mausmodelle für unkomplizierte Zystitis und CAUTI zugänglich eine Vielzahl von Methoden Modifikationen. In dem Fall des unkomplizierte Zystitis Modell können diese Modifikationen umfassen die Verringerung der Inokulation Volumens und der während der Instillation des Inokulums angewendete Kraft, um die Anzahl von Bakterien zu reduzierenin die Nieren 61 eingeführt wird, Variieren der Dauer der Infektion, Einbußen zu Zeitpunkten so früh wie 1 hpi und mit Gentamicin-Schutz-Tests, um den Grad zu bewerten, zu dem die Uropathogen hat die Blase Epithelzellen 62 eingedrungen. Die gespreizten Blasen von Mäuse getötet zwischen 6 und 24 hpi können auch geschnitten und mit Antikörpern gegen verschiedene Wirts und / oder bakterielle Epitope färbt und unter Fluoreszenz oder konfokale Mikroskopie beobachtet IBC Struktur, bakterielle Fluxen und Filamentierung und Wirtsgewebe erhalten 25,33 beobachten , 63,64. Die Wirkung der Uropathogen Infektion und / oder Implantation über die lokale und systemische Immunantworten des Wirtes kann mit dem Bioplex zytometrische Bead-System oder einem ELISA-basierten Assays, die Cytokin-Spiegel im Urin oder Serum bzw. 33,65 bestimmen beurteilen. Schließlich wird der Zustand der Blasengewebe, Ort und die Morphologie der kolonisierenden Bakterien und der Struktur des Biofilms abgeschieden aufDer Katheter kann durch verschiedene bildgebende Verfahren wie die Elektronenmikroskopie 25,41 beurteilt werden.

Diese Grundmodellen der Infektion kann auch angepasst ist, um andere klinisch relevante Phänomene imitieren einschließlich rezidivierenden Harnwegsinfektionen und die Entwicklung einer adaptiven Immunantwort über mehrere Infektionen werden. In diesem Zusammenhang wiederholt Infektion von C57BL / 6-Mäusen zu einer erhöhten Resistenz gegen akute Blasenentzündung während in dem C3H / HeN-Modell, die vor Entwicklung chronischer Cystitis, gefolgt durch Überführung der Infektion durch die Verabreichung von antimikrobiellen Mitteln sensibilisiert diesen Mäusen zu chronischer Zystitis entwickeln auf nachfolgende Impfungen 66. Zusätzlich sind die molekularen Mechanismen der Risikofaktoren für die Entwicklung von UTI sucht werden können. Diabetes und Fettleibigkeit haben beide wurde gezeigt, dass die Häufigkeit und Schwere von Harnwegsinfektionen erhöhen. Typ-2-Diabetes können genetisch in Mäuse in der FVB / NJ Hintergrund modelliert werden und eine chemisch induzierte Modell von Typ 1 Diabetes already gezeigt worden, um die Schwere UTIs sowohl UPEC und K. verursacht erhöhen pneumophila 67,68.

Schließlich werden diese Modellsysteme stellen eine ideale Testgelände für die Entwicklung und Optimierung von therapeutischen Modalitäten bei der Behandlung oder Prävention HWI und Cautis abzielen. Die molekulare Verständnis der Wirt-Pathogen-Interaktionen von diesen Modellen vorgesehen hat bereits die Entwicklung von wirksamen Impfstrategien bei Targeting wichtig Virulenz richtet Faktoren 51-55 erleichtert. Zusätzlich Kleinmolekül-Inhibitoren der Adhäsion UPEC haben sich als wirksam bei der Behandlung von akuten und chronischen unkomplizierte HWI sowie Cautis durch UPEC 12,69,70 verursacht werden. Sowohl die unkompliziert in diesen Protokollen beschrieben UTI und CAUTI Modelle bieten die experimentellen Tools, um die molekularen Details der Wirt-Pathogen-Interaktionen in den Harnwegen zu sezieren. Diese Werkzeuge können in vielen Arten die understandin erweitern genutzt werdeng dieses komplexe Reihe von Bedingungen und die Entwicklung von effektiveren therapeutischen Interventionen.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgments

Die Finanzierung für diese Arbeit wurde von ORWH SCOR P50 DK064540 vorgesehen, RO1 DK 051406, RO1 AI 108749-01, F32 DK 101.171 und F32 DK 104516-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material for catheter and needle preparation:
30 G needles BD Precision Glide 305106 30 G x ½ (0.3 mm x 13 mm)
PE10 polyethylene tubing BD 427400 Inside diameter -0.011 in (0.28 mm); outside diameter – 0.024 in (0.61 mm)
RenaSIL 025 platinum cured silicon tubing Braintree Scientific, Inc SIL 025 inside diameter-0.012 x outside diameter 0.025, 25 ft coil
Material for infections:
Isoflourane – Isothesia Butler Schein 29405 250 ml
Clear Glass Straight-Sided Jar Kimble Chase 5413289V 21
Stainless Steel Tea Infuser Schefs-Amazon Premium Loose Leaf Tea Infuser By Schefs - Stainless Steel - Large Capacity -
Non-sterile cotton balls Fisherbrand 22-456-880
50 ml Falcon tubes VWR 89039-660
Isotec 3 -vaporizer Ohmeda 1224478
Ear punch Fisher Scientific 13-812-201 (when necessary)
Betadine solution Betadine solution 10% Povidie-iodine topical solution
Q-tips Fisher Scientific 22-037-924 6 inches
Diapers for bench Fisherbrand 14206 63 Absorbent Underpads (20”X36”mats)
Surgical lubricant Surgilube 0281-0205-36
Dissecting scissor Fine Science tools, INC 14084-08
Micro-Adson Forceps Fine Science tools, INC 11018-12
1 ml syringe BD 309659 Tuberculin slip tip
Parafilm Bemis PM996 4 inches x 125 FT
Eppendorf rack Fisherbrand 05-541-1
Eppendorf tubes MIDSCI AVX-T-17-C
Harvesting catheters, bladders and kidneys:
Homogenizer PRO Scientific INC Bio-Gen Pro 200
5 ml polypropylene round-bottom tube BD 352063 for organ homogenization
Paper towel Georgia-Pacific
Ethanol Pharmco-AAPER 11100020S 200 proof
Costar™ Clear Polystyrene 96-Well Plates Corning 3788
1x Phosphate sodium saline Sigma-Aldrich P3813
BRANSONIC Ultrasonic cleaner 1210 Branson Ultrasonics Corporation 1210
IBC materials:
6-well tissue culture test plate Techno Plastic Products 92006
Pins Fine Science Tools 26002-20
Sylgard 184 Dow Corning 3097358-1004 Silicone Elastomer Kit
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside) Invitrogen 15520-034 Ultrapure
N, N-Dimethylformamide Sigma Aldrich D4551
MgCl2 (Magnesium chloride) Sigma Aldrich M8266
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich D6750
Nonidet-P40 Roche 11754599001 Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate (K-ferrOcyanide) Sigma Aldrich P3289
Potassium hexacyanoferrate(III) (K-ferrIcyanide) Sigma Aldrich 60299

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Tags

Medizin Ausgabe 100, UPEC, Uropathogenen Katheter Harnwegsinfektionen IBC chronische Blasenentzündung

Erratum

Formal Correction: Erratum: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model
Posted by JoVE Editors on 08/18/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. The Protocol section has been updated.

The ethics statement has been updated from:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20120216, which was approved 01/11/2013 and expires 01/11/2016. Overall care of the animals was consistent with The guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

to:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20150226, which expires 12/10/2018. Overall care of the animals was consistent with The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

Step 3 has been updated from:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a 32 ounce glass jar containing a tea-infuser ball with cotton balls soaked with 3 ml of isoflurane or vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a jar or vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    NOTE: If glass jar with tea-ball and/or nose cone with isoflurane-soakd cotton balls are used, the animal must be carefully observed to avoid anesthetic overdose and death. The advantage of using a vaporizer and anesthesia chamber is that it provides controlled isoflurane administration that avoids accidental overdoses. CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the jar/vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) or 50 ml conical tube with a cotton ball containing a small amount (approximately 1-2 ml) of isoflurane.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.

to:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) to maintain anesthetization.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.
Aufbau und Charakterisierung von UTI und CAUTI in einem Mausmodell
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Conover, M. S., Flores-Mireles, A.… More

Conover, M. S., Flores-Mireles, A. L., Hibbing, M. E., Dodson, K., Hultgren, S. J. Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. J. Vis. Exp. (100), e52892, doi:10.3791/52892 (2015).

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