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Medicine

एक माउस मॉडल में स्थापना और यूटीआई और CAUTI की विशेषता

Published: June 23, 2015 doi: 10.3791/52892
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Microbiology and Center for Women's Infectious Disease Research, Washington University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Abstract

मूत्र मार्ग में संक्रमण (यूटीआई) अत्यधिक प्रचलित रुग्णता का एक महत्वपूर्ण कारण हैं और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ इलाज के लिए तेजी से प्रतिरोधी रहे हैं। महिलाओं के अधिकतर यूटीआई से पीड़ित हैं: सभी महिलाओं के 50% अपने जीवनकाल में एक यूटीआई होगा। इसके अतिरिक्त, एक प्रारंभिक यूटीआई जीवन, दर्द और बेचैनी, दैनिक गतिविधियों के विघटन की गुणवत्ता में गंभीर गिरावट के साथ कुछ पीड़ित लगातार पुनरावृत्ति के साथ एक पुनरावृत्ति भुगतना होगा जिनके पास इन महिलाओं में से 20-40%, स्वास्थ्य देखभाल की लागत में वृद्धि हुई है, और कुछ उपचार के विकल्प अन्य लंबे समय तक एंटीबायोटिक प्रोफिलैक्सिस से अधिक है। Uropathogenic Escherichia कोलाई (UPEC) यूटीआई का अधिग्रहण समुदाय के प्राथमिक प्रेरणा का एजेंट है। कैथेटर जुड़े यूटीआई (CAUTI) एक लाख सालाना अमेरिका में घटनाओं और नाटकीय स्वास्थ्य देखभाल की लागत के लिए लेखांकन सबसे आम अस्पताल का अधिग्रहण संक्रमण है। UPEC भी CAUTI का प्राथमिक कारण है, जबकि अन्य प्रेरणा का एजेंट उदर सहित वृद्धि हुई महत्व के हैंfaecalis। यहाँ हम इन मानव रोगों के नैदानिक ​​विशेषताओं के कई पुनरावृत्ति कि दो अच्छी तरह से स्थापित माउस मॉडल का उपयोग। यूटीआई के लिए, एक C3H / मुर्गी मॉडल मेजबान प्रतिक्रियाओं IBC, गठन और filamentation सहित मानव में मनाया UPEC डाह की विशेषताओं के कई स्मरण दिलाता है। CAUTI, कैथेटर मूत्राशय प्रत्यारोपण बनाए रखने के लिए जो C57BL / 6 चूहों का इस्तेमाल करते हुए एक मॉडल के लिए, ई करने के लिए अतिसंवेदनशील होना दिखाया गया है faecalis मूत्राशय के संक्रमण। ये प्रतिनिधि मॉडल उपन्यास चिकित्सा और प्रबंधन या रोकथाम रणनीति के विकास के लिए अग्रणी है, जो यूटीआई रोग के रोगजनन में हड़ताली नए अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है।

Introduction

मूत्र पथ के संक्रमण (UTIs) सबसे आम बैक्टीरिया के संक्रमण से एक हैं और यूटीआई का अधिग्रहण अधिग्रहण, समुदाय और nosocomial के तंत्र के आधार पर दो श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है। समुदाय उपार्जित UTIs अक्सर अन्यथा स्वस्थ महिलाओं और पढ़ाई में होते हैं कि महिलाओं के लगभग 50% अपने जीवनकाल 1 में कम से कम एक यूटीआई होगा दिखाया है। इसके अतिरिक्त, पुनरावृत्ति एक बड़ी समस्या है। एक प्रारंभिक तीव्र संक्रमण है जो एक औरत एंटीबायोटिक उपचार और कई महिलाओं को अक्सर पुनरावृत्ति 2 के लिए जारी उचित बावजूद छह महीने के भीतर एक दूसरे संक्रमण होने के एक 25-40% मौका है। इन संक्रमणों के कारण बैक्टीरिया को भी तेजी से एंटीबायोटिक प्रतिरोधी आगे confounding उपचार प्रोटोकॉल 3-6 होते जा रहे हैं। यूटीआई रोग के प्रभाव और व्यापकता को रेखांकित, अमेरिका में स्वास्थ्य देखभाल संबंधी खर्चों में लगभग 2.5 अरब डॉलर की लागत व्यक्तियों के लाखों हर साल को प्रभावित1,7 .Nosocomial मुख्य रूप से इस तरह निबाह कैथेटर के रूप में विदेशी निकायों की उपस्थिति के साथ जुड़े रहे हैं UTIs हासिल कर ली। कैथेटर जुड़े UTIs (CAUTI) इस तरह के संक्रमण 8 के 70-80% ~ के लिए लेखांकन, यूटीआई का अधिग्रहण सबसे आम nosocomial रहते हैं। इसके अलावा, CAUTI वृद्धि की रुग्णता और मृत्यु दर के साथ जुड़ा हुआ है और इसे माध्यमिक खून में संक्रमण 9 का सबसे आम कारण है।

UTIs हासिल कर ली UPEC जुड़े समुदाय संभोग, खराब स्वास्थ्य या अलग मेजबान के बीच अन्य माइक्रोबियल जनसंख्या गतिशीलता के दौरान यांत्रिक हेरफेर के माध्यम से जठरांत्र संबंधी मार्ग में जलाशयों से मूत्राशय में बैक्टीरिया की शुरूआत की वजह से हो करने के लिए 10 आलों लगा रहे हैं। एक बार जब मूत्राशय के अंदर, UPEC कैप्सूल, लोहे के अधिग्रहण प्रणाली, जहर, एक डाह प्लाज्मिड, tRNAs, pathogenicity द्वीपों और रोगजनन में एक भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है कि उपनिवेशन कारकों सहित कई विषैलापन कारकों को रोजगार <समर्थन> 11-14। UPEC उपनिवेशवाद की स्थापना करने के लिए गंभीर, UPEC भी stereochemical विशिष्टता 15 के साथ रिसेप्टर्स समझते हैं कि चिपकने वाला निगरानी अशर मार्ग (कप) पिली के कई प्रकार के सांकेतिक शब्दों में बदलना। FimH adhesin साथ इत्तला दे दी प्रकार 1 पिली, UPEC द्वारा व्यक्त कर रहे हैं और दोनों मानव और माउस ब्लैडर 18 वर्ष की luminal सतह पर व्यक्त कर रहे हैं जो uroplakins 16 और α-1, β-3 integrins 17, mannosylated बाँध। ये FimH की मध्यस्थता बातचीत बैक्टीरियल बसाना और सतही उपकला कोशिकाओं 19,20 के आक्रमण की सुविधा। एक जीवाणु तेजी से परिपक्वता पर, ~ 10 4 बैक्टीरिया 21 शामिल कर सकते हैं जो एक intracellular जीवाणु समुदाय (IBC), फार्म करने के लिए विभाजित कर सकते हैं, जहां एक बार सेल के अंदर, UPEC कोशिका द्रव्य में बच सकते हैं। IBC के गठन के लिए कम से कम छह अलग माउस उपभेदों में प्रदर्शन किया गया है, C3H / मुर्गी, C3H / Hej, C57BL / 6, CBA, FVB / न्यू जर्सी और BALB / ग, और अलग अलग UPE की एक विस्तृत विविधता के साथसी तनाव और अन्य Enterobacteriaceae 22-24। हालांकि IBC के गठन के अस्थायी और स्थानिक मतभेद माउस पृष्ठभूमि और संक्रमित करने UPEC तनाव के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। C3H में / आद्य UPEC से संक्रमित मुर्गी चूहों UTI89 उपभेदों या CFT073 IBC, गठन के रूप में जल्दी 3 HPI (एचआर के बाद संक्रमण) के रूप में बैक्टीरिया के छोटे biomasses के रूप में देखे जा सकते हैं। इस समुदाय का विस्तार जारी है और रॉड के आकार का जीवाणु टर्मिनली विभेदित सतही छाता कोशिकाओं के cytoplasmic अंतरिक्ष का एक बड़ा प्रतिशत पर कब्जा है जब विकास लगभग 6 HPI के एक "मध्यबिंदु" पहुंचता है इसी तरह के आयामों को प्रदर्शित बहुमत के साथ एक अपेक्षाकृत तुल्यकालिक तरीके से इन जल्दी IBCs प्रपत्र और morphologies। ~ 8 HPI एक बेसिली से IBC के परिवर्तन में बैक्टीरिया आकृति विज्ञान COCCI करने के लिए। IBCs प्रकृति में क्षणिक हैं। इस प्रकार, बैक्टीरियल आबादी के निरंतर विस्तार में 12-18 HPI परिणामों से IBC, परिपक्वता, सेल वाई के बाहर उनके filamentation और प्रसार के द्वारा पीछापड़ोसी कोशिकाओं 23 के लिए बाद में फैल वें। इस प्रकार, IBC के आला मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और एंटीबायोटिक दवाओं के 25 से रक्षा के लिए एक वातावरण में तेजी से बैक्टीरिया विकास के लिए अनुमति देता है। चूहों में देखा जाता है कि UPEC संक्रमण के अलग चरणों भी मनुष्य 22,26-28 में यूटीआई मॉडल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक लाभकारी उपकरण के रूप में यूटीआई के माउस मॉडल का समर्थन है, ऐसे IBCs और filamentation के रूप में मनुष्य, में मनाया जाता है।

महिलाओं के बहुमत को अपने जीवनकाल में एक यूटीआई का अनुभव करते हैं, इन संक्रमणों के परिणाम लगातार बारम्बार cystitis के लिए, कोई पुनरावृत्ति के साथ तीव्र खुद को सीमित संक्रमण से लेकर कर सकते हैं। इसके अलावा, अध्ययन से एक आनुवंशिक घटक यूटीआई संवेदनशीलता 29 के लिए योगदान देता है, सुझाव यूटीआई के एक मजबूत पारिवारिक घटना से पता चला है। हम क्लीनिक में देखा भिन्न यूटीआई परिणामों जन्मजात माउस उपभेदों 30 के बीच में प्रयोगात्मक UPEC संक्रमण के अलग-अलग परिणामों से नजर आता जा सकता है कि मिल गया है। उदाहरण के लिए, C3H / मुर्गी, CBA, यूके, और C3H / HeOuJ चूहों एक संक्रामक खुराक पर निर्भर ढंग से, निरंतर, उच्च अनुमापांक बैक्टीरिया (> 10 4 कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) / एमएल), उच्च अनुमापांक जीवाणु के द्वारा होती लंबे समय से स्थायी, पुरानी cystitis के लिए, जल्दी हो जाता है बलिदान पर मूत्राशय बोझ> 4 हफ्तों के बाद संक्रमण (डब्ल्यूपीआई), क्रोनिक सूजन, और urothelial गल जाना। इन चूहों को भी पुरानी मूत्राशयशोथ के विकास के लिए बायोमार्कर के रूप में सेवा है कि पहले 24 HPI भीतर आईएल -6, जी-सीएसएफ, के.सी., और आईएल 5 का ऊंचा सीरम का स्तर प्रदर्शित करते हैं। प्लेसबो पढ़ाई यूटीआई मूत्राशयशोथ का पहला लक्षण के बाद कई हफ्तों के लिए उनके मूत्र में जीवाणुओं के उच्च स्तर को बनाए रखने होगा सामना कर महिलाओं का एक बड़ा प्रतिशत एंटीबायोटिक उपचार 31 नहीं दिया तो पता चला है कि के रूप में यह सही, कुछ महिलाओं में यूटीआई के प्राकृतिक पाठ्यक्रम का प्रतिनिधित्व कर सकते 32। इसके अलावा, C3H / मुर्गी चूहों का उपयोग, हम पुरानी मूत्राशयशोथ का एक इतिहास के बाद गंभीर आवर्तक संक्रमण के लिए एक महत्वपूर्ण जोखिम कारक है कि पाया। बारम्बार यूटीआई सबसे एसआई हैयूटीआई और C3H / मुर्गी माउस के gnificant नैदानिक ​​अभिव्यक्ति वर्तमान में पिछले प्रदर्शन के बाद एक वृद्धि की गड़बड़ी का स्मरण दिलाता है कि केवल अध्ययन किया मॉडल है। एक दूसरा यूटीआई परिणाम तीव्र UPEC संक्रमण लगभग एक सप्ताह के भीतर मूत्राशय सूजन और bacteriuria के संकल्प के साथ, खुद को सीमित है जहां C57BL / 6 चूहों में recapitulated है। दिलचस्प बात यह है कि इस मॉडल में, UPEC आसानी से UPEC संभवतः मनुष्यों के 33 में एक ही तनाव आवर्तक यूटीआई के लिए एक तंत्र है, 34, समझा एक सक्रिय यूटीआई reinitiate करने के लिए एक निष्क्रिय राज्य से उभर करने में सक्षम हैं, जिसमें से मूत्राशय ऊतक के भीतर मौन इंट्रासेल्युलर जलाशयों के रूप में।

यूटीआई संवेदनशीलता पर आनुवांशिक प्रभाव के अलावा, मूत्राशय में एक कैथेटर की शुरूआत बहुत एक संक्रमण होने के साथ ही एक संक्रमण पैदा करने में सक्षम बैक्टीरिया की रेंज बढ़ाने की संभावना बढ़ जाती है। यह मानव मूत्र कैथीटेराइजेशन ऊतकीय का कारण बनता है कि प्रदर्शन किया गया है औरकारण यांत्रिक एक मजबूत भड़काऊ प्रतिक्रिया में यह परिणाम है कि तनाव, विभाजन, लामिना propria और submucusa, urothelial thinning के शोफ, और urothelium और गुर्दे 35,36 के mucosal घाव को मूत्राशय में प्रतिरक्षात्मक बदल जाता है। इसके अतिरिक्त, कैथेटर, जिससे CAUTI पैदा करने के लिए कई प्रजातियों द्वारा उपयोग माहौल बनाने बैक्टीरियल कुर्की के लिए एक सतह प्रदान करता है। UPEC अभी भी एक प्रमुख योगदान कर रहे हैं, उदर faecalis इन CAUTI 37 में से 15% के लिए खातों ई। faecalis एक गंभीर स्वास्थ्य चिंता का विषय 38, प्रस्तुत प्रतिरोध उद्भव वन्कोम्य्सिं साथ एंटीबायोटिक दवाओं के लिए तेजी से प्रतिरोधी होता जा रहा है। ई faecalis विषाक्त पदार्थों और कैथेटर और उपकला 38 दोनों को कुर्की के लिए आवश्यक adhesins सहित कई विषैलापन कारकों के पास है। मूत्र कैथीटेराइजेशन के दौरान मेजबान मूत्र पथ 39,40 में माइक्रोबियल आसंजन, गुणा और प्रचार-प्रसार के लिए असुरक्षित है। ई faecaएक तंत्र का हिस्सा मूत्राशय में जारी रहती है और एक माउस CAUTI मॉडल 41 में reproduced है जो गुर्दे, करने के लिए प्रसार करने के लिए के रूप में फूल कैथेटर पर एक biofilm रूपों। हाल ही में, यह मूत्र कैथीटेराइजेशन के दौरान दिखाया गया है, फाइब्रिनोजेन (FG) भड़काऊ प्रतिक्रिया के हिस्से के रूप में मूत्राशय में जारी की है। Fg कोट कैथेटर, मूत्राशय में जम जाता है और ई के लिए आवश्यक है faecalis biofilm गठन, एक लगाव पाड़ के रूप में कार्य। CAUTI के C57BL 6 / माउस मॉडल में, हम पता चला कि ई faecalis बायोफिल्म कैथेटर पर गठन, और मूत्राशय में इस प्रकार दृढ़ता, विशेष रूप से अपनी टिप adhesin EbpA Ebp pilus पर निर्भर था। हम EbpA के एन टर्मिनल डोमेन विशेष रूप से कैथेटर कोटिंग FG को बांधता है कि पाया। इसके अतिरिक्त, यह पाया गया कि ई faecalis संक्रमण के दौरान मेटाबोलाइट स्रोत है, इस प्रकार biofilm गठन 42 को बढ़ाने के रूप में Fg का इस्तेमाल करता है।

माउस मॉडल अंडर के लिए महत्वपूर्ण सिद्ध कर दिया हैtanding के साथ ही यूटीआई और CAUTI 41 के नैदानिक ​​अभिव्यक्तियाँ अनुमान लगाया है। इस लेख में हम मूत्राशयशोथ UPEC की inoculum तैयारी का प्रदर्शन UTI89 और C3H / मुर्गी चूहों के transurethral टीका अलग। इसके अतिरिक्त, हम ई की कैथेटर C57BL / 6 चूहों में प्रविष्टि और टीका के लिए एक प्रोटोकॉल का प्रदर्शन faecalis OG1RF तनाव। इन तकनीकों के दोनों चूहों में सुसंगत और विश्वसनीय यूटीआई या CAUTI पैदा होती हैं। हम भी पुराने या आवर्तक मूत्राशयशोथ के विश्लेषण के लिए तीव्र cystitis और मूत्र संग्रह के दौरान IBC के गठन का पालन करने के लिए इस्तेमाल की तकनीक का प्रदर्शन। C3H / मुर्गी चूहों प्रारंभिक जीवाणु आक्रमण IBC, गठन, filamentation और पुरानी मूत्राशयशोथ 23,33,43 के विकास सहित UPEC रोगजनन के सभी पहलुओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। ये डाह मानकों को भी अन्य माउस पृष्ठभूमि 22,33 की एक किस्म में अध्ययन किया गया है। CAUTI के लिए, C57BL 6 / मॉडल बाद में बैक्टीरियल सह के साथ मूत्राशय में विदेशी शरीर आरोपण के लिए अनुमति देता है7 दिनों के लिए रखा जा सकता है जो lonization, संक्रमण 41 पोस्ट। इन मॉडलों को बाद में recapitulated या नैदानिक ​​मानव आबादी में देखा गया है जिनमें से बहुत मेजबान प्रतिक्रियाओं, नाश करने के लिए जीवाणु डाह तंत्र, यूटीआई के लिए मेजबान प्रतिक्रियाओं और तंत्र का आकलन करने के लिए उपयोगी किया गया है।

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Protocol

आचार बयान: वाशिंगटन विश्वविद्यालय के पशु अध्ययन समिति 2013/01/11 मंजूरी दे दी है और 2016/01/11 समाप्त हो रहा था, जो प्रोटोकॉल संख्या 20,120,216, के हिस्से के रूप में सभी माउस संक्रमण और प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी। जानवरों की देखभाल कुल मिलाकर राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद और यूएसडीए पशु की देखभाल संसाधन गाइड से प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल के लिए गाइड और उपयोग के अनुरूप था। इच्छामृत्यु प्रक्रियाओं के साथ संगत कर रहे हैं "पशु 2013 संस्करण की इच्छामृत्यु के लिए AVMA दिशानिर्देश।"

1. UPEC यूटीआई प्रोटोकॉल, टीका सुई तैयारी (चित्रा एस 1)

  1. 30 ग्राम सुई की टोपी निकालें। सुई की शाफ्ट पर PE10 ट्यूबिंग के लगभग 1 इंच थ्रेड। रात भर सुई विधानसभाओं बाँझ यूवी। Catheterized सुई बाँझ पेट्री प्लेटों में अनिश्चित काल के लिए भंडारित किया जा सकता है।

2. UPEC बैक्टीरियल inoculum तैयारी

  1. UTI89 inoculum तैयार (inocula करने से पहले 72 घंटा शुरूtion के दिन)
    1. एक जमे हुए स्टॉक से एक पौंड (Luria-Bertani) अगर प्लेट पर स्ट्रीक UTI89। 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं। एक कॉलोनी उठाओ और एक 125 मिलीलीटर फ्लास्क में लेग के 10 एमएल में यह टीका लगाना। स्थिर रुप से 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    2. स्थिर रुप से, 37 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 24 घंटे के लिए एक नया 125 मिलीलीटर फ्लास्क में लेग के 10 एमएल में रातोंरात संस्कृति के 10 μl टीका लगाना।
    3. स्थानांतरण 3 मिलीग्राम 3 मिनट के लिए 7000 XG पर बाँझ 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए और अपकेंद्रित्र (तनाव और वांछित inoculum के आकार के आधार पर अलग अलग होंगे) और 1X पीबीएस में गोली और सेंट्रीफ्यूज एक दूसरी बार resuspend। पीबीएस 1x 1 मिलीलीटर में बैक्टीरिया गोली Resuspend।
  2. बैक्टीरियल ऑप्टिकल घनत्व को मापने और वांछित inoculum के घनत्व के लिए एकाग्रता समायोजित करें। इस्तेमाल किया inoculum के मानक एकाग्रता 10 7 बैक्टीरिया है; हालांकि, इस अध्ययन के डिजाइन के कारण भिन्न हो सकते हैं।

3. बैक्टीरियल टीका

  1. 70% इथेनॉल और सी के साथ कार्य केंद्र साफ(बाँझ प्रवाह हुड का उपयोग करें या) शोषक कागज के साथ क्षेत्र के ऊपर।
  2. 1 मिलीलीटर (टीबी) सिरिंज में तैयार बैक्टीरियल inoculum के 0.9 मिलीलीटर के लिए ड्रा (हवाई बुलबुले को दूर)। फिर sterilely पॉलीथीन ट्यूबिंग ट्रिम, inoculum युक्त सिरिंज पर, PE10 टयूबिंग के साथ एक तैयार बाँझ टीका सुई संलग्न।
    नोट: मूत्राशय puncturing से बचने के लिए सुई की नोक से ऊपर ट्यूबिंग का 1 मिमी छोड़ दें।
  3. Parafilm का एक 1 इंच चौकोर टुकड़ा काटें और शीर्ष पर शल्य स्नेहक की एक थपका (एक पैसा के लगभग आकार) डाल दिया।
  4. जब तक (प्रोटोकॉल का विनिर्माण के बाद) isoflurane या vaporizer के चैंबर के 3 मिलीग्राम से लथपथ कपास गेंदों के साथ एक चाय-तर करने वाला गेंद युक्त एक 32 औंस ग्लास जार में डाल कर महिला C3H / मुर्गी चूहों चतनाशून्य बेहोश लेकिन अभी भी सामान्य रूप से साँस लेने में (1 सांस / सेक) ।
    नोट: कुछ IACUC समितियों एक जार या vaporizer का उपयोग अनुमोदन नहीं है। अपनी संस्था के IACUC समिति के संकेत का पालन करें।
    नोट: यदि ग्लास जारisoflurane-soakd कपास गेंदों का इस्तेमाल किया जाता है के साथ चाय-बॉल और / या नाक शंकु के साथ, पशु ध्यान से संवेदनाहारी अधिक मात्रा और मृत्यु से बचने के लिए मनाया जाना चाहिए। एक vaporizer और संज्ञाहरण कक्ष का उपयोग करने का लाभ यह है कि यह संयोग की अधिक मात्रा से बचा जाता है कि नियंत्रित isoflurane प्रशासन प्रदान करता है। चेतावनी: Isoflurane एक साँस लेना संवेदनाहारी है। एक अच्छी तरह हवादार क्षेत्र में प्रयोग करें और साँस लेना कम से कम।
  5. जार / vaporizer से माउस निकालें और एक कागज तौलिया पर अपनी पीठ पर डाल दिया और पैर फैला।
  6. एक नाक शंकु के साथ माउस की नाक एक छोटी राशि से युक्त एक कपास की गेंद (लगभग 1-2 मिलीलीटर के साथ या 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब (एक नियंत्रित isoflurance कुछ vaporizer इकाइयों पर सुसज्जित आता है कि खुराक प्रदान करता है कि vaporizer से जुड़ा एक ट्यूब) को कवर ) isoflurane की।
  7. धीरे पेशाब प्रेरित और एक voided मूत्राशय सुनिश्चित करने के लिए मूत्राशय धड़कना। 100% इथेनॉल पोंछ साथ periurethral क्षेत्र साफ कर लें। में, पहला टीका सुई / सिरिंज, बिंदु थपकाशल्य स्नेहक।
  8. , Transurethrally टीका सुई डालने लगभग 12 मिमी, और मूत्राशय धीरे (10 μl / सेक) में inoculum वितरित करने के लिए धीरे सिरिंज सवार पर नीचे दबाने से बैक्टीरिया समाधान के 50 μl के साथ प्रत्येक माउस टीका लगाना। माउस से टीका सुई निकालें।
    नोट: टीका लगाना करने के लिए शुरुआत जब मूत्रमार्ग उद्घाटन के अवसर पर inoculum की तत्काल वापसी सुई के अनुचित या अधूरा प्रविष्टि को इंगित करता है।
  9. नाक शंकु से माउस निकालें और अपने पिंजरे के लिए यह वापसी। दोहराएँ प्रत्येक माउस के लिए 3.3-3.8 कदम। Inoculum शर्तों / उपभेदों स्विचन जब / अगर, एक अनुमोदित sharps कंटेनर में सिरिंज और टीका सुई के निपटान और फिर 3.2 कदम शुरू करते हैं।
    नोट: Uropathogenic जीवों के साथ टीका आम तौर पर गंभीर दर्द के लक्षण पैदा नहीं करता। हालांकि, दुर्लभ मामलों में, रोगाणुओं की बड़ी खुराक का प्रबंध बुखार, भोजन और पानी के सेवन और असामान्य व्यवहार में कमी का कारण बन सकता है। एnimal स्वास्थ्य प्रयोग भर में निगरानी की जानी चाहिए। प्रकट दर्द लक्षण नोटिस, ऐसे Buprenorphine (0.05-0.1 मिलीग्राम / किग्रा दी subcutaneously) के रूप में एक एनाल्जेसिक, कर रहे हैं, लागू किया जा सकता है। प्रक्रियाएं प्रत्येक संस्था के IACUC के अनुसार होना चाहिए।

बैक्टीरियल बोझ 4. निर्धारण

  1. प्रत्येक मूत्राशय और गुर्दे जोड़ी काटा जा करने के लिए अलग से 5 मिलीलीटर ट्यूब तैयार करें। 1x पीबीएस / ट्यूब / माउस मूत्राशय के 1ml जोड़ें काटा जा सके। 1x पीबीएस / ट्यूब के 0.8 मिलीलीटर जोड़ें / माउस गुर्दे की जोड़ी काटा जा सके। एक दिया माउस के अनुरूप करने के लिए प्रत्येक ट्यूब लेबल। 1:10 धारावाहिक dilutions के लिए प्रत्येक कुएं में 1x पीबीएस के 180 μl युक्त एक 96 अच्छी तरह से थाली तैयार है।
  2. 70% इथेनॉल के साथ काम के क्षेत्र को साफ और एक शोषक कवर या कागज तौलिया के साथ क्षेत्र को कवर किया।
  3. माउस लगभग 1 मिनट के लिए सांस बंद हो जाता है जब तक isoflurane के साथ माउस anesthetize तो शोषक कवर या कागज तौलिया पर यह जगह (3.4 कदम देखें)। Euthana के अन्य तरीकोंएसआईए भी इस तरह के कार्बन डाइऑक्साइड के रूप में IACUC समितियों द्वारा स्वीकार किए जाते हैं, और isoflurane अधिक मात्रा के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
  4. सिर के आधार पर गर्दन निरोधक और क्षैतिज शरीर से दूर अव्यवस्था उत्पन्न होती है जब तक पूंछ खींच के होते हैं कि तेजी से गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से माउस बलिदान।
    नोट: अधिकांश IACUC समितियों इच्छामृत्यु और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के एक माध्यमिक साधन की आवश्यकता होती है एक आम तरीका है। IACUC समिति ने मंजूरी दे दी हालांकि, अगर अन्य तरीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है।
  5. अपनी पीठ पर मृत चूहे प्लेस और पेट पर 70% इथेनॉल स्प्रे। माउस काटना, गुर्दे विच्छेदन निम्न रक्त से संभावित प्रदूषण को कम करने के लिए आदेश में कहा कि, मूत्राशय और गुर्दे फसल। 1x पीबीएस युक्त तैयार 5 मिलीलीटर ट्यूबों में स्वतंत्र रूप से अंगों प्लेस (कदम 4.1 देखें)।
    नोट: बाहरी विच्छेदन के लिए और अंग कटाई संदूषण को कम करने के लिए विभिन्न कैंची का प्रयोग करें।
  6. अंगों टी में हैं सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब नलवह पीबीएस 1x। प्रत्येक माउस के लिए कदम दोहराएँ 4.3-4.5। स्वच्छ कैंची और प्रत्येक माउस के बाद 70% इथेनॉल में संदंश।

5. बैक्टीरियल रिकवरी

  1. एक ऊतक homogenizer के साथ गुर्दे प्रति 15 सेकंड और मूत्राशय प्रति 30 सेकंड 5 मिलीलीटर ट्यूब में काटा मूत्राशय और गुर्दे homogenize। 1x पीबीएस, 70% इथेनॉल और नमूनों के बीच 1x पीबीएस में homogenizer के क्रमिक रूप से कुल्ला।
  2. 10 -8 के लिए बाहर धारावाहिक 1:10 dilutions बनाओ और लेग अगर प्लेटों पर CFU के लिए प्रत्येक कमजोर पड़ने (कॉलोनी बनाने इकाइयों) थाली। 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें रातोंरात सेते हैं और कालोनियों अगले दिन गिनती।

6. IBC के गणन

  1. Aseptically मूत्राशय को हटाने और एक सिलिकॉन नीचे के साथ एक 6 अच्छी तरह से थाली में 1x पीबीएस में जगह है। प्लेट्स एक सिलिकॉन elastomer किट का उपयोग कर और अच्छी तरह से प्रत्येक में लगभग सिलिकॉन का 1 सेमी डालने के लिये तैयार किया जा सकता है, को देखने के निर्देश बनाती है। कैंची का उपयोग छमाही में मूत्राशय काटें।
  2. छोटे धातु पिन का उपयोग धीरे blad टेढ़ाडेर इतना है कि मूत्राशय लुमेन ऊपर की ओर का सामना करना पड़ रहा है। Urothelium की अधिकतम राशि संपर्क में है सुनिश्चित करने के लिए मूत्राशय वर्गों की सबसे बाहरी किनारों पर पिन जगह सुनिश्चित करें।
  3. Splaying के बाद, धीरे 1x पीबीएस के साथ एक बार मूत्राशय धो लें। Pipet द्वारा 1x पीबीएस निकालें। पूरे splayed मूत्राशय को कवर करने के लिए पर्याप्त 3% paraformaldehyde जोड़कर मूत्राशय को ठीक करें। चेतावनी: Paraformaldehyde कैंसर है। दस्ताने सहित उचित सुरक्षा उपकरण, हर समय पहना होना चाहिए। निपटान संस्थागत दिशा निर्देशों का पालन करना चाहिए।
  4. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। Paraformaldehyde समाधान निकालें। 1x पीबीएस के साथ एक बार धो लें।
  5. (पीबीएस 1x 2 मिमी 2 MgCl, 0.01% सोडियम deoxycholate और 0.02% nonidet-p40in) lacZ धोने समाधान धोने के प्रति 5 मिनट के लिए तीन बार से धो लें।
  6. पर्याप्त lacZ दाग धोने के समाधान निकालें और जोड़ (9.5 मिलीलीटर lacZ धोने समाधान, 0.4 मिलीग्राम 25 मिलीग्राम / एमएल एक्स-लड़की और 100 मिमी कश्मीर ferrOcyanide / कश्मीर ferricyanide की 0.1 मिलीग्राम) ब्लैडर कवर करने के लिए। 30 डिग्री सेल्सियस overni पर सेतेप्रकाश से सुरक्षित ght।
  7. इनक्यूबेटर से splayed ब्लैडर निकालें और एक विदारक गुंजाइश है, 40-60X बढ़ाई के साथ कल्पना के रूप में के रूप में नीले puncta दिखाई देते हैं जो IBCs, निरीक्षण करते हैं।
    नोट: कभी-कभी एक माउस मूत्रमार्ग के तहत ट्यूब की नियुक्ति करने से पहले पेशाब कर सकते हैं। इस मामले में, फिर से मूत्र एकत्र करने के लिए प्रयास करने से पहले 15-20 मिनट इंतज़ार करो।

7. मूत्र Bacteriuria CFU गणन के लिए संग्रह (CAUTI के लिए लागू नहीं)

  1. मूत्र पूर्व इकट्ठा या संक्रमण पोस्ट करने के लिए धीरे (माउस पिंजरे के ऊपर) पूंछ पकड़ और एक फ्लैट ऊंचा सतह पर रखकर माउस को नियंत्रित।
  2. माउस मूत्रमार्ग के तहत एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब पकड़ो। धीरे मूत्राशय के लिए दबाव लागू करने के लिए पूंछ के पास माउस की पीठ पर नीचे प्रेस। 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में मूत्र पकड़ो।
  3. 10 -7 के लिए बाहर धारावाहिक 1:10 dilutions बनाओ और उपयुक्त पौंड पर प्रत्येक कमजोर पड़ने की थाली 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें रातोंरात सेते हैं और कालोनियों अगले दिन गिनती।

8. CAUTI मॉडल प्रोटोकॉल, CAUTI मॉडल के लिए कैथेटर सुई तैयारी (चित्रा S2)

  1. 30 ग्राम सुई की टोपी निकालें। PE10 ट्यूबिंग और इस तरह के RenaSIL के रूप में सिलिकॉन टयूबिंग की 5 मिमी टुकड़ा की एक 7 मिमी टुकड़ा काट। ट्यूबिंग सुई के आधार छू तक PE10 टयूबिंग के साथ सुई धागा।
  2. तब PE10 युक्त सुई पर 5 मिमी टुकड़ा खिलाओ। रात भर सुइयों विधानसभाओं बाँझ यूवी।
    नोट: सिलिकॉन टयूबिंग लोड हो रहा है, सुई टिप अतीत का विस्तार ट्यूबिंग के लगभग 1 मिमी छोड़ दें।

9. ई faecalis OG1RF बैक्टीरियल inoculum तैयारी

  1. टीका दिन के लिए पहले 48 घंटा शुरू कर OG1RF inoculum तैयार करें। एक जमे हुए स्टॉक से एक BHI (मस्तिष्क दिल अर्क) थाली पर स्ट्रीक OG1RF।
  2. एक कॉलोनी उठाओ और BHI के 10 एमएल में यह टीका लगाना और 37 डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटे के लिए स्थिर रुप से यह हो जाना। संस्कृति अपकेंद्रित्र और बाँझ 1x पीबीएस के 1 मिलीलीटर की मात्रा में गोली (3 बार) धो लें।
  3. 1x पीबीएस में बैक्टीरिया गोली Resuspend। बैक्टीरियल ऑप्टिकल घनत्व को मापने और वांछित inoculum आकार करने के लिए एकाग्रता समायोजित करें। इस्तेमाल किया inoculum के मानक एकाग्रता 10 7 है; हालांकि, इस अध्ययन के डिजाइन के कारण भिन्न हो सकते हैं

10 कैथेटर आरोपण

  1. 70% इथेनॉल के साथ कार्य केंद्र साफ और एक शोषक कवर के साथ क्षेत्र को कवर (या बाँझ प्रवाह हुड का उपयोग करें)।
  2. एक खाली 1 मिलीलीटर (टीबी) सिरिंज से कैथेटर सुई संलग्न। Parafilm का एक 1 इंच चौकोर टुकड़ा काटें और शीर्ष पर शल्य स्नेहक की एक थपका (एक पैसा के लगभग आकार) डाल दिया।
    नोट: दो अलग सुइयों के कारण कैथेटर आरोपण के लिए आवश्यक यांत्रिक हेरफेर करने के लिए कैथेटर के बयान के लिए और कम से कम आकस्मिक टीका करने के लिए inoculum के लिए उपयोग किया जाता है। यह भी कम टीका सुइयों की तैयारी की सुविधा के लिए अनुमति देता है।
  3. एक चाय युक्त एक 32 औंस ग्लास जार में डाल कर C57BL / 6 चूहों चतनाशून्यisoflurane या vaporizer के चैंबर के 3 मिलीलीटर में लथपथ कपास गेंदों के साथ -infuser गेंद बेहोश लेकिन अभी भी सामान्य रूप से साँस लेने में (1 सांस / सेक) तक (निम्नलिखित प्रोटोकॉल का विनिर्माण)।
  4. फिर एक कागज तौलिया पर अपनी पीठ पर माउस डाला और पैर फैला। एक छोटी राशि isoflurane की (लगभग 1-2 एमएल) युक्त कपास गेंदों के साथ एक नाक शंकु या 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के साथ माउस की नाक को कवर।
    चेतावनी: Isoflurane एक साँस लेना संवेदनाहारी है। एक अच्छी तरह हवादार क्षेत्र में प्रयोग करें और शोधकर्ता द्वारा साँस लेना कम से कम।
  5. धीरे पेशाब प्रेरित और एक voided मूत्राशय सुनिश्चित करने के लिए मूत्राशय धड़कना। एक 100% इथेनॉल पोंछ साथ periurethral क्षेत्र साफ कर लें।
  6. एक कपास की नोक applicator का उपयोग कर 10% povidone आयोडीन समाधान के साथ periurethral क्षेत्र कीटाणुरहित। शल्य स्नेहक में, पहला टीका सुई / सिरिंज, बिंदु थपका।
    नोट: Povidine आयोडीन शराब की तुलना में मजबूत सड़न रोकनेवाला समाधान है जो कैथेटर आरोपण, के लिए प्रयोग किया जाता है। कैथेटर आरोपण की आवश्यकता हैअधिक यांत्रिक हेरफेर कैथेटर और प्रदूषण के लिए इस प्रकार एक अधिक से अधिक क्षमता डालने के लिए।
  7. मूत्रमार्ग खोलने में कैथेटर डालें। एक बार में, उपयोग चिमटी फलस्वरूप (5 मिमी सिलिकॉन) छोटे कैथेटर धक्का और मूत्राशय में जमा, मूत्राशय की ओर (7 मिमी PE10) लंबा टुकड़ा पुश करने के लिए। तुरंत, अभी भी जुड़ी 7 मिमी टयूबिंग के साथ, सुई निकालें।

11. बैक्टीरियल टीका

  1. नाक शंकु से माउस निकालें और अपने पिंजरे के लिए यह वापसी खंड 9. से तैयार inoculum का उपयोग कर, धारा 3 में जीवाणु टीका प्रोटोकॉल का पालन करें

बलिदान के हर समय बिंदु पर 12.

  1. मूत्राशय और गुर्दे के लिए 5 मिलीलीटर ट्यूब (अंगों कदम 4.1 पालन के लिए) और कैथेटर के लिए 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब तैयार करें। कैथेटर के नमूने के लिए 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में 1x पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ें
  2. चरणों 4.3-4.5 का पालन करें। मूत्राशय, गुर्दे और कैथेटर कटाई, माउस काटना, पीएलए1x पीबीएस और 1.5 मिलीलीटर Eppendorf में कैथेटर (कदम 12.1 देखें) युक्त 5 मिलीलीटर ट्यूबों में स्वतंत्र रूप से ऊतकों cing।
    नोट: बाहरी विच्छेदन के लिए और प्रदूषण कम करने के लिए अंग कटाई और कैथेटर पुनः प्राप्ति के लिए विभिन्न कैंची का प्रयोग करें
  3. तो फिर कदम 4.6 का पालन करें।

13. बैक्टीरियल रिकवरी

  1. अंगों के लिए, कदम 5.1 और 5.2 का पालन करें। 30 सेकंड के लिए अधिकतम गति पर बैक्टीरियल कैथेटर से वसूली, भंवर के लिए, 5 मिनट के एक अतिरिक्त 30 सेकंड के लिए अधिकतम गति पर फिर भंवर एक स्नान sonicator का उपयोग करने के लिए, और कैथेटर के नमूने sonicate।
  2. 10 -8 के लिए बाहर धारावाहिक 1:10 dilutions बनाओ और BHI प्लेटों पर CFU गणन के लिए प्रत्येक कमजोर पड़ने थाली। रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं और कालोनियों अगले दिन गिनती।

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Representative Results

सीधी और कैथेटर जुड़े यूटीआई के intravesical मॉडल इन आम और महंगा संक्रमण का प्रबंधन करने के लिए बैक्टीरियल रोगजनन, मेजबान ऊतक पर इन बीमारियों का प्रभाव है, और विकास और उपन्यास दृष्टिकोण के परीक्षण के आणविक तंत्र elucidating के लिए लचीला प्लेटफार्मों प्रदान करते हैं। माउस तनाव और रोगज़नक़ पर निर्भर करता है, intravesical टीका तीव्र की शुरुआत या नियमन के लिए आवश्यक कारकों (चित्रा 1 और 3), क्रोनिक या आवर्तक (चित्रा 2) मूत्राशयशोथ स्पष्ट करने के लिए मेजबान रोगज़नक़ बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। चित्र 1 में दिखाया गया डेटा आद्य UPEC मूत्राशयशोथ द्वारा तीव्र चरण (24 HPI) मूत्र पथ उपनिवेशन के प्रतिनिधि हैं UTI89 44 अलग। टीका के बाद संक्रमण के 24 चूहों बलिदान कर रहे हैं, जो बिंदु पर मानव संसाधन और homogenized मूत्राशय और गुर्दे ऊतक के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दी जाती है। ऊतक homogenates क्रमानुसार dilut हैंएड और बस्तियां बैक्टीरिया की गणना के लिए चढ़ाया। जीर्ण UPEC बसाना और मूत्राशय की सूजन की स्थापना की और एक संक्रामक खुराक और uropathogen निर्भर तरीके में कुछ माउस लाइनें (विशेषकर C3H / मुर्गी) में बनाए रखा जा सकता है। जीर्ण मूत्राशयशोथ लगातार उच्च अनुमापांक bacteriuria के रूप में परिभाषित किया गया है (> 10 4 CFU / एमएल), मूत्राशय सूजन और उच्च अनुमापांक जीवाणु मूत्राशय बोझ (> 10 4 CFU / मूत्राशय) बलिदान 33 पर। चित्रा 2 में दिखाया गया डेटा UTI89 के 2 10 x 7 CFUs साथ C3H / मुर्गी चूहों के टीकाकरण के बाद 4 सप्ताह होने वाली प्रतिनिधि CFUs हैं। चूहों के शेष 50-80% संक्रमण को हल करते समय इन प्रयोगात्मक शर्तों के तहत, संक्रमित चूहों का 20-50% पुरानी मूत्राशयशोथ का विकास। परिणाम के इस द्वंद्व पहले 24 HPI के भीतर निर्णय लिया है कि एक मेजबान रोगज़नक़ चौकी पर निर्भर है। में प्रकट करने के लिए शुरू होता है, जो जीवाणु titers का मनाया bimodal वितरण में जांच की चौकी के परिणाम के सक्रियकरण (या नहीं)बलिदान 28 डीपीआई पर 3 डीपीआई (दिनों के बाद संक्रमण) और मूत्राशय में कम से मूत्र (चित्रा 2) 33। आरंभिक संक्रमण एंटीबायोटिक चिकित्सा के साथ 33 को मंजूरी दे दी है के बाद पुरानी मूत्राशयशोथ के इतिहास के साथ चूहे काफी चुनौती पर बारम्बार पुरानी cystitis के लिए संवेदनशील हैं। इसी तरह, यूटीआई का एक इतिहास मानव में बारम्बार यूटीआई के लिए एक ज्ञात जोखिम कारक है। इस प्रकार, इस आवर्तक यूटीआई के रोगजनन अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया ही जाना जाता मॉडल है। प्रयोगात्मक वैकल्पिक माउस पृष्ठभूमि में यूटीआई मॉडलिंग करते हैं, तो यह माउस तनाव कुछ उपभेदों कम या ज्यादा प्रतिरोधी इन सिंड्रोम 33 के विकास के लिए कर रहे हैं यह देखते हुए कि, यूटीआई, आवर्तक यूटीआई या CAUTI के लिए अतिसंवेदनशील है, तो यह निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है।

तीव्र मूत्राशयशोथ का एक अतिरिक्त माप की IBC शुमार है। IBC के गठन टर्मिनली विभेदित सतही छाता कोशिकाओं तक ही सीमित है। पर IBC मात्रा का ठहराव तीव्र पुटी के दौरान बैक्टीरियल बोझ का एक जानकारीपूर्ण उपाय हैआईटीआई और IBCs के उच्च स्तर को पुरानी cystitis के 21 विकसित होने का खतरा साथ सहसंबंधी। IBC के गठन केवल रोग की तीव्र चरणों में होता है। सतही छाता कोशिकाओं के विभाजन के बाद, IBCs मनाया नहीं रह रहे हैं। C3H / मुर्गी यूटीआई मॉडल में, IBCs transurethrally मूत्राशय में UTI89 की ~ 1 10 x 7 CFU inoculating के बाद 6 घंटे मापा जा सकता है। Bladders सिलिकॉन प्लेटों पर धातु पिन के साथ splayed और lacZ की अभिव्यक्ति के लिए दाग रहे हैं। LacZ, β-galactosidase, कि cleaves एक सामान्य व्यक्त बैक्टीरियल एंजाइम है गैलेक्टोज और अन्य शर्करा के बीच β उठाना। इस एंजाइम दरार पर एक नीले रंग का उत्पादन जो एक्स-लड़की, एक β-galactoside एनालॉग, आपूर्ति से बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। धुंधला के बाद, ब्लैडर डॉट्स (चित्रा 3) की गणना के द्वारा समझा जा सकता है IBCs urothelium और IBCs पर punctae नीला / बैंगनी डॉट्स के रूप में प्रदर्शित होने के साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत imaged हैं। जबकि मैं की संख्यापशु प्रति गठन बीसी मूत्राशय (चित्रा 3 बी) के अनुसार देखा जाता है C3H / मुर्गी पृष्ठभूमि में, ~ 50 IBCs के एक औसत बदलता रहता है। एक खुराक निर्भर तरीके से IBCs वृद्धि हुई है। कि फार्म IBCs की संख्या UPEC और माउस पृष्ठभूमि उपभेदों के बीच होती है। उदाहरण के लिए, C57BL / 6, मूत्राशय के अनुसार कई सौ IBCs के गठन में ~ 1 10 x 7 UTI89 परिणामों के एक inoculum में।

यूटीआई का अधिग्रहण सीधी समुदाय से ऊपर मॉडलिंग की परे, हीथ देखभाल जुड़े UTIs स्वास्थ्य देखभाल प्रणाली के लिए एक महत्वपूर्ण बोझ का प्रतिनिधित्व करते हैं। UTIs सभी स्वास्थ्य देखभाल जुड़े संक्रमण का लगभग 40% का प्रतिनिधित्व करते हैं और सभी स्वास्थ्य देखभाल जुड़े UTIs के ऊपर से 95% कैथेटर 45 जुड़े रहे हैं। यहाँ हम इस मुश्किल नैदानिक ​​समस्या की प्रयोगात्मक विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है कि CAUTI के मूत्राशय प्रत्यारोपण माउस मॉडल प्रदर्शित करता है। चित्रा 4 में प्रस्तुत डाटा मॉडल ई के साथ 24 घंटा संक्रमण के प्रतिनिधि हैं faecalis एस OG1RF ट्रेन। 1 10 x 7 OG1RF की CFU intravesically एक unimplanted मूत्राशय में टीका कर रहे हैं, संक्रमण 24 HPI (चित्रा -4 ए) द्वारा स्पष्ट करने के लिए शुरू होता है और 3 डीपीआई द्वारा संक्रमण के 41 संकल्प किया है। इसके विपरीत, एक प्रत्यारोपित मूत्राशय unimplanted ब्लैडर में मनाया उन लोगों की तुलना में 24 HPI में 10 गुना अधिक है मूत्राशय उपनिवेशन के स्तर के साथ कैथेटर और मूत्राशय दोनों के उपनिवेश की स्थापना में परिणाम है, में OG1RF का टीका (चित्रा -4 ए और 4 बी)। साथ ही, इस संक्रमण कैथेटर नुकसान लगभग 7 डीपीआई 41 तक मूत्राशय में> 10 6 CFU पर बनाए रखा है। वर्णित प्रयोगात्मक मॉडल के सभी सहित लेकिन संक्रमित ऊतकों और सतहों के macroscopic और सूक्ष्म इमेजिंग के लिए विभिन्न तरीकों, बदल inoculum के आकार और रोग टाइम्स, प्रतिस्पर्धी संक्रमण के लिए अनन्य नहीं, प्रयोगात्मक लचीलेपन का एक उच्च डिग्री करने के लिए उत्तरदायी हैं, और प्रतिरक्षा विश्लेषण की मेजबानी ।

ve_content "> चित्र 1
चित्रा 1:। 24 घंटा मूत्र पथ बसाना महिला, 7-8 सप्ताह पुरानी C3H / मुर्गी चूहों transurethrally आद्य UPEC cystitis के ~ 2 10 x 7 CFU के साथ 24 घंटे के लिए UTI89 को अलग inoculated थे। काटा मूत्राशय और गुर्दे के ऊतकों से बरामद प्रतिनिधि CFUs एन, दिखाए जाते हैं = 5. धराशायी लाइन का पता लगाने (20 CFU) की निचली सीमा को दर्शाता है।

चित्र 2
चित्रा 2:। 28 दिन मूत्र पथ बसाना महिला, 7-8 सप्ताह पुरानी C3H / मुर्गी चूहों transurethrally ~ 2 10 x 7 CFU UTI89 साथ inoculated थे। मूत्र संकेत दिनों के बाद संक्रमण (डीपीआई) में जमा किया गया था और CFU गणन के लिए चढ़ाया। प्रतिनिधि 28 दिन मूत्राशय और गुर्दे की titers भी प्रदर्शित कर रहे हैं, एन का पता लगाने के = 8. मूत्र CFU निचली सीमा (1,000 CFU / एमएल) धराशायी लाइन से चिह्नित है। बिंदीदार रेखा प्रतिनिधिपता लगाने के टीएस ऊतक निचली सीमा, 20 CFU / ऊतक।

चित्र तीन
चित्रा 3:। IBC के गणन महिला, 7-8 सप्ताह पुरानी C3H / मुर्गी चूहों transurethrally ~ 1 10 x 7 CFU UTI89 साथ inoculated थे। Bladders 6 HPI काटा और IBC धुंधला के लिए splayed थे। LacZ धुंधला के बाद splayed मूत्राशय की (ए) के छवि। IBCs नीले डॉट्स के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। इनसेट छवि ब्लैक बॉक्स में छवि की धारा की एक डिजिटल बढ़ाई है। (बी) 6 HPI C3H / मुर्गी चूहों में गठित IBCs के प्रतिनिधि संख्या, एन = 10।

चित्रा 4
चित्रा 4: ई faecalis कैथेटर जुड़े यूटीआई। C57BL / 6 चूहों के साथ या के ~ 1 10 x 7 CFU साथ कैथेटर के बिना टीका गया (ए) ई faecalis उपस्थिति या कैथेटर के अभाव में मूत्राशय बसाना। (बी) ई faecalis कैथेटर बसाना। मान व्हिटनी यू परीक्षण माउस प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया था, पी <0.05 सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। **, पी <0.005।

चित्रा एस 1
चित्रा एस 1:। यूटीआई टीका सुई तैयारी आरेख सुई करने पर कैथेटर (1), सूत्रण आवश्यक सामग्री सहित टीका सुई तैयारी चरणों को प्रदर्शित करता है (2) और टीका से पहले ट्यूबिंग trimming (3)।

चित्रा S2
चित्रा S2 है। CAUTI टीका सुई तैयारी आरेख टीका कैथेटर (1), सूत्रण जरूरत टीका सुई तैयारी सामग्री को प्रदर्शित करता है (2) और आरोपण कैथेटर परसुई करने के लिए (3)।

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Discussion

सीधी समुदाय यूटीआई कई लाख प्राथमिक देखभाल यात्राओं के लिए हर साल 46 के लिए लेखांकन एक आम और महंगा संक्रमण है हासिल कर ली। इसके अलावा, CAUTIs नहीं रह CAUTI 45 का अधिग्रहण अस्पताल से उत्पन्न उपचार का जोड़ा लागत के लिए प्रदाताओं की प्रतिपूर्ति चिकित्सा और Medicaid सेवा केंद्रों के रूप में स्वास्थ्य सेवा प्रदाताओं के लिए बहुत महंगा हो गया है कि एक आम स्वास्थ्य सेवा का अधिग्रहण संक्रमण कर रहे हैं। इन प्रोटोकॉल में वर्णित यूटीआई, दोनों सीधी cystitis और CAUTI के माउस मॉडल, की शुरुआत बनाए रखने, और यूटीआई के कई रूपों के परिणाम नियमन के लिए आवश्यक मेजबान और रोगज़नक़ बातचीत के आणविक आधार को समझने के लिए अमूल्य उपकरण प्रदान करते हैं। इन मॉडलों को यूटीआई 23,47-49 का विश्लेषण करने के लिए शक्तिशाली बैक्टीरियल और माउस आनुवंशिकी, प्रतिरक्षा, सूक्ष्म, जैव रासायनिक और रासायनिक आनुवंशिक उपकरणों के आवेदन के लिए अनुमति देते हैं। इसके अतिरिक्त, प्रोटोकॉल यहाँ उल्लिखित एक मंच प्रदान किया हैविकास और बैक्टीरियल डाह के छोटे अणु inhibitors और उपन्यास टीकाकरण के लक्ष्यों और रणनीतियों 50-55 सहित उपन्यास चिकित्सीय और preventative रणनीतियों के परीक्षण के लिए।

सीधी मूत्राशयशोथ मॉडल के सफल आवेदन के लिए बनाए रखा जाना चाहिए कि कई महत्वपूर्ण शर्तों रहे हैं। सभी माउस anesthetization प्रक्रियाओं के साथ के रूप में, देखभाल की वजह से ओवर-anesthetization करने के लिए माउस मृत्यु दर को रोकने के लिए लिया जाना चाहिए। टीका कैथेटर की तैयारी, सिलिकॉन टयूबिंग इतने लंबे समय कैथीटेराइजेशन पर मूत्राशय की दीवार को नुकसान के रूप में पर्याप्त रूप से सुई की नोक कवर करने के लिए लंबे समय से नहीं बल्कि होना चाहिए। इसके अतिरिक्त, योनि खोलने की निकटता और आकार के कारण, देखभाल मूत्रमार्ग और नहीं योनि में inoculating कैथेटर डालने के लिए लिया जाना चाहिए। IBC के गणन के लिए मूत्राशय splaying के दौरान, यह ब्लैडर appro के लिए तय किया जा संभव निम्नलिखित विच्छेदन और ऊतकों के रूप में के रूप में जल्दी splayed होना आवश्यक हैximately 1 घंटा, लेकिन नहीं रातोंरात। LacZ धुंधला द्वारा की IBC गणन के लिए, यह प्रश्न में जीवाणु urothelial सेल बसाना दौरान lacZ कि उत्पादन भी आवश्यक है। LacZ एंजाइम का उत्पादन नहीं कर रहा है, जहां उपभेदों का उपयोग कर, यह IBCs विरोधी E के साथ immunofluorescence माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर की गणना करने के लिए अभी भी संभव है कोलाई एंटीबॉडी या GFP व्यक्त बैक्टीरिया। इस मॉडल की एक खास विशेषता यह रोग प्रगति और विभिन्न जन्मजात माउस लाइनों द्वारा प्रस्तुत गंभीरता के अलग-अलग पैटर्न और UPEC 33,56 तनाव का प्रोटोटाइप के अलग रोगजनक संभावित है। वे प्रयोगात्मक डिजाइन और व्याख्या 57,58 उलझी जबकि नैदानिक ​​और प्ररूपी अध्ययन में देखा गया है कि मेजबान संवेदनशीलता और रोगज़नक़ विविधता के प्राकृतिक विभिन्नता पुनरावृत्ति के रूप में इन मतभेदों को एक ताकत है और इस तकनीक की सीमा दोनों हैं। इन बदलावों मेजबान और बैक्टीरियल mechan की व्याख्या के लिए अनुमति तुलना के स्रोत प्रदानवाद सीधी यूटीआई 33,56 के रोगजनन modulating। हालांकि, उन्होंने यह भी माउस लाइन यूटीआई संवेदनशीलता के अलग डिग्री की वजह से, अत्यंत सावधानी एक अन्वेषक पूछ रहा है, विशेष रूप से प्रश्न हल करने के लिए सही माउस लाइन और UPEC तनाव के चयन में लिया जाना चाहिए, इसका मतलब। उदाहरण के लिए, C57BL / 6 चूहों जल्दी समय अंक पर उच्च बैक्टीरियल titers और IBCs की बड़ी संख्या के साथ पेश, तीव्र संक्रमण का एक उत्कृष्ट मॉडल हैं। इस तनाव फिर तेजी से गुर्दे की गंभीर संक्रमण और मौन इंट्रासेल्युलर जलाशयों 33,34 से उत्पन्न केवल लगातार उपनिवेशन के साथ 3 और 7 डीपीआई के बीच संक्रमण का निराकरण करता है। C57BL 6 / मॉडल सही रूप में तो वर्तमान और लक्षणों को हल जिसमें कई यूटीआई रोगियों के लिए सबसे आम परिणाम प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। इसके विपरीत, C3H / मुर्गी माउस पृष्ठभूमि उन्हें आवर्तक UTIs के अध्ययन के लिए एक आदर्श तनाव बना रही पुरानी cystitis के लिए संवेदनशीलता के एक उच्च डिग्री दर्शाती है। अन्य यूटीआई मॉडल भी स्थापित किया गया हैCBA में, यूके और C3H / Hej चूहों पृष्ठभूमि यूटीआई 33,59 के विशेष पहलुओं के अध्ययन के लिए उपयोगी साबित हो। सीधी cystitis के मॉडल के आधार पर प्रदर्शित प्राथमिक प्रयोगात्मक दोष, तीव्र पुरानी और बारम्बार cystitis के 60 के लिए आवश्यक उपन्यास बैक्टीरियल कारकों की खोज के लिए बड़े पैमाने पर आनुवंशिक जांच के तरीके के आवेदन को सीमित करने के लिए कई संक्रमण बाधाओं का अस्तित्व है।

सीधी cystitis के मॉडल के लिए महत्वपूर्ण कारणों से सभी दो अतिरिक्त चिंताओं के साथ प्रत्यारोपण आधारित CAUTI मॉडल के लिए लागू होते हैं। सबसे पहले, देखभाल प्रत्यारोपण की प्रविष्टि के कारण प्रत्यारोपण द्वारा प्रदत्त मूत्राशय के संक्रमण के लिए वृद्धि की संवेदनशीलता को, एक बाँझ फैशन में जगह लेता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए। दूसरा, यह कैथेटर दाखिल सुई को हटाने के दौरान जगह में आयोजित किया है कि आवश्यक है। CAUTI मॉडल के प्रमुख सीमाओं यह उपलब्ध मेजबान आनुवंशिक पृष्ठभूमि की एक कम दूरी की है कि, जनसंपर्क कर रहे हैंकैथेटर समय के साथ घटाने और अक्षमता के लिए opensity कारण आरोपण से उत्पन्न मूत्राशय में शिथिलता के लिए मूत्र इकट्ठा करने के लिए। प्रत्यारोपण के झड़ने और अनुदैर्ध्य मूत्र के माध्यम से संक्रमण की निगरानी करने में असमर्थता के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए, इस मॉडल आम तौर पर प्रत्येक वांछित समय बिंदु पर बलिदान किया जाना चाहिए बाद में समय अंक और चूहों के समूह के लिए catheterized चूहों की अधिक संख्या की आवश्यकता है। ऐसे C3H / मुर्गी के रूप में कुछ माउस उपभेदों, प्रत्यारोपण खोना, जिस पर निषेधात्मक आवृत्ति से सीमित मेजबान आनुवंशिक पृष्ठभूमि परिणाम (पी Guiton, व्यक्तिगत संचार 2010)। नतीजतन, ऊपर वर्णित CAUTI प्रोटोकॉल केवल C57BL 6 / माउस तनाव में अनुकूलित किया गया है। CAUTI के लिए उपलब्ध माउस उपभेदों की सीमा दुर्भाग्यपूर्ण है हालांकि, जबकि, कई जीनोमिक विविधताओं C57BL 6 / पृष्ठभूमि में स्थापित किया गया है और CAUTI मॉडल जीवों द्वारा उपनिवेशन की सुविधा के लिए मूत्राशय के माहौल को बदलकर यूटीआई के दौरान अध्ययन के लिए उपलब्ध जीवाणु विविधता फैलता है कर रहे हैंयूटीआई की murine मॉडल में अन्यथा गैर रोगजनक। इस का एक उदाहरण, ई में मूत्राशय की कैथेटर प्रेरित सूजन के दौरान जारी Fg की भूमिका की हाल की खोज है CAUTI 42 के दौरान faecalis विकास, biofilm गठन, और दृढ़ता। इस उदाहरण जीवाणु आणविक रोगजनन के तंत्र भी है लेकिन संक्रमण के दौरान मेजबान कारकों की भूमिका न केवल elucidating में CAUTI का प्रत्यारोपण मॉडल की शक्ति को दिखाता है। इन सभी सुविधाओं के पहले से understudied किया गया है जो इस प्रासंगिक नैदानिक ​​संक्रमण, समझने के लिए योगदान करते हैं।

ऊपर वर्णित प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के अलावा, सीधी cystitis और CAUTI के माउस मॉडल पद्धति संशोधनों की एक बड़ी संख्या के लिए उत्तरदायी हैं। सीधी मूत्राशयशोथ मॉडल के मामले में, इन संशोधनों के जीवाणुओं की संख्या को कम करने के लिए टीका मात्रा और inoculum के टपकाना के दौरान लागू बल कम करने में शामिल कर सकते हैं, संक्रमण की अवधि अलग-अलग रूप में जल्दी 1 HPI के रूप में समय बिंदुओं पर त्याग और डिग्री का आकलन करने के लिए gentamicin संरक्षण assays का उपयोग, गुर्दे 61 में शुरू की है जो uropathogen मूत्राशय उपकला कोशिकाओं 62 पर आक्रमण किया गया है। यह भी sectioned और विभिन्न मेजबान और / या बैक्टीरियल epitopes के लिए एंटीबॉडी के साथ दाग और फ्लोरोसेंट या confocal माइक्रोस्कोपी के तहत देखा जा सकता है HPI 6 और 24 के बीच चूहों से splayed ब्लैडर की IBC संरचना, बैक्टीरियल fluxing और filamentation और मेजबान ऊतक हालत 25,33 निरीक्षण करने के लिए बलिदान किया , 63,64। मेजबान के स्थानीय और प्रणालीगत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर uropathogen संक्रमण और / या आरोपण के प्रभाव को क्रमश: 33,65 मूत्र या सीरम में साइटोकाइन का स्तर निर्धारित करने के लिए Bioplex cytometric मनका सिस्टम या एलिसा आधारित assays का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है। अंत में, मूत्राशय ऊतक, स्थान और बस्तियां जीवाणुओं की आकृति विज्ञान और biofilm की संरचना की शर्त पर जमाकैथेटर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 25,41 सहित विभिन्न इमेजिंग तकनीक के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है।

संक्रमण की इन बुनियादी मॉडल भी बारम्बार यूटीआई और कई संक्रमणों के माध्यम से एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के विकास सहित अन्य नैदानिक ​​प्रासंगिक घटना की नकल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। C3H / मुर्गी मॉडल में, antimicrobials के प्रशासन के माध्यम से संक्रमण की निकासी के द्वारा पीछा पुरानी मूत्राशयशोथ की पूर्व विकास पुरानी मूत्राशयशोथ विकसित करने के लिए इन चूहों sensitizes जबकि इस संदर्भ में, तीव्र मूत्राशयशोथ करने के लिए वृद्धि के विरोध में C57BL / 6 चूहों परिणामों के संक्रमण दोहराया बाद में inoculations 66 पर। इसके अलावा यूटीआई के विकास के लिए जोखिम कारकों में से आणविक तंत्र की जांच की जा सकती है। मधुमेह और मोटापे दोनों UTIs की आवृत्ति और तीव्रता को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है। टाइप 2 मधुमेह आनुवंशिक रूप से FVB / न्यू जर्सी पृष्ठभूमि में चूहों में मॉडलिंग की जा सकती है और टाइप 1 मधुमेह के एक रासायनिक प्रेरित मॉडल alread गया हैY UPEC और लालकृष्ण दोनों की वजह से UTIs की गंभीरता वृद्धि दर्ज की गई pneumophila 67,68।

अंत में, इन मॉडल प्रणाली के इलाज या UTIs और CAUTIs रोकने के उद्देश्य से चिकित्सकीय तौर तरीकों के विकास और अनुकूलन के लिए एक आदर्श साबित जमीन का प्रतिनिधित्व करते हैं। इन मॉडलों द्वारा प्रदान की मेजबान रोगज़नक़ बातचीत की आणविक समझ पहले से ही 51-55 कारक महत्वपूर्ण डाह को लक्षित करने के उद्देश्य से प्रभावी टीकाकरण रणनीतियों के विकास में मदद की है। इसके अतिरिक्त, UPEC आसंजन के छोटे अणु अवरोधकों सीधी तीव्र और जीर्ण UTIs के इलाज में प्रभावी रूप में अच्छी तरह से CAUTIs के रूप में UPEC 12,69,70 के कारण होना दिखाया गया है। इन दोनों प्रोटोकॉल में वर्णित सीधी यूटीआई और CAUTI मॉडल मूत्र मार्ग में मेजबान रोगज़नक़ बातचीत की आणविक विवरण काटना प्रायोगिक उपकरण प्रदान करते हैं। ये उपकरण हमारे समझ का विस्तार करने के लिए कई मायनों में leveraged किया जा सकता हैशर्तों के इस परिसर में स्थापित की जी और अधिक प्रभावी उपचारात्मक उपायों के विकास की सुविधा।

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।

Acknowledgments

इस कार्य के लिए अनुदान, ORWH SCOR P50 के DK064540 द्वारा RO1 डीके 051,406, RO1 ऐ 108,749-01, F32 डीके 101,171, और F32 डीके 104,516-01 प्रदान किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material for catheter and needle preparation:
30 G needles BD Precision Glide 305106 30 G x ½ (0.3 mm x 13 mm)
PE10 polyethylene tubing BD 427400 Inside diameter -0.011 in (0.28 mm); outside diameter – 0.024 in (0.61 mm)
RenaSIL 025 platinum cured silicon tubing Braintree Scientific, Inc SIL 025 inside diameter-0.012 x outside diameter 0.025, 25 ft coil
Material for infections:
Isoflourane – Isothesia Butler Schein 29405 250 ml
Clear Glass Straight-Sided Jar Kimble Chase 5413289V 21
Stainless Steel Tea Infuser Schefs-Amazon Premium Loose Leaf Tea Infuser By Schefs - Stainless Steel - Large Capacity -
Non-sterile cotton balls Fisherbrand 22-456-880
50 ml Falcon tubes VWR 89039-660
Isotec 3 -vaporizer Ohmeda 1224478
Ear punch Fisher Scientific 13-812-201 (when necessary)
Betadine solution Betadine solution 10% Povidie-iodine topical solution
Q-tips Fisher Scientific 22-037-924 6 inches
Diapers for bench Fisherbrand 14206 63 Absorbent Underpads (20”X36”mats)
Surgical lubricant Surgilube 0281-0205-36
Dissecting scissor Fine Science tools, INC 14084-08
Micro-Adson Forceps Fine Science tools, INC 11018-12
1 ml syringe BD 309659 Tuberculin slip tip
Parafilm Bemis PM996 4 inches x 125 FT
Eppendorf rack Fisherbrand 05-541-1
Eppendorf tubes MIDSCI AVX-T-17-C
Harvesting catheters, bladders and kidneys:
Homogenizer PRO Scientific INC Bio-Gen Pro 200
5 ml polypropylene round-bottom tube BD 352063 for organ homogenization
Paper towel Georgia-Pacific
Ethanol Pharmco-AAPER 11100020S 200 proof
Costar™ Clear Polystyrene 96-Well Plates Corning 3788
1x Phosphate sodium saline Sigma-Aldrich P3813
BRANSONIC Ultrasonic cleaner 1210 Branson Ultrasonics Corporation 1210
IBC materials:
6-well tissue culture test plate Techno Plastic Products 92006
Pins Fine Science Tools 26002-20
Sylgard 184 Dow Corning 3097358-1004 Silicone Elastomer Kit
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside) Invitrogen 15520-034 Ultrapure
N, N-Dimethylformamide Sigma Aldrich D4551
MgCl2 (Magnesium chloride) Sigma Aldrich M8266
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich D6750
Nonidet-P40 Roche 11754599001 Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate (K-ferrOcyanide) Sigma Aldrich P3289
Potassium hexacyanoferrate(III) (K-ferrIcyanide) Sigma Aldrich 60299

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Tags

चिकित्सा अंक 100, UPEC, Uropathogenic कैथेटर मूत्र पथ के संक्रमण पर IBC पुरानी मूत्राशयशोथ

Erratum

Formal Correction: Erratum: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model
Posted by JoVE Editors on 08/18/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. The Protocol section has been updated.

The ethics statement has been updated from:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20120216, which was approved 01/11/2013 and expires 01/11/2016. Overall care of the animals was consistent with The guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

to:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20150226, which expires 12/10/2018. Overall care of the animals was consistent with The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

Step 3 has been updated from:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a 32 ounce glass jar containing a tea-infuser ball with cotton balls soaked with 3 ml of isoflurane or vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a jar or vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    NOTE: If glass jar with tea-ball and/or nose cone with isoflurane-soakd cotton balls are used, the animal must be carefully observed to avoid anesthetic overdose and death. The advantage of using a vaporizer and anesthesia chamber is that it provides controlled isoflurane administration that avoids accidental overdoses. CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the jar/vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) or 50 ml conical tube with a cotton ball containing a small amount (approximately 1-2 ml) of isoflurane.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.

to:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) to maintain anesthetization.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.
एक माउस मॉडल में स्थापना और यूटीआई और CAUTI की विशेषता
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Conover, M. S., Flores-Mireles, A.… More

Conover, M. S., Flores-Mireles, A. L., Hibbing, M. E., Dodson, K., Hultgren, S. J. Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. J. Vis. Exp. (100), e52892, doi:10.3791/52892 (2015).

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