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Abstract
尿路感染症（UTI）、罹患率の重要な原因で非常に流行しており、抗生物質による治療に対してますます耐性があります。女性は不釣り合いUTIに罹患している：すべての女性の50％が彼らの一生の間にUTIを持っています。さらに、初期のUTIを持ってこれらの女性の20〜40％は生活、痛みや不快感の質の深刻な悪化といくつかの苦しみ頻繁に再発して再発を被るだろう、毎日の活動、増加医療費、およびその他のいくつかの治療法の選択肢の破壊長期的な抗生物質の予防より。尿路病原性大腸菌 （UPEC）は、UTI取得コミュニティの主な原因物質です。カテーテル関連UTI（CAUTI）は百万年間、米国での発生と劇的な医療費の会計処理の最も一般的な院内感染です。 UPECもCAUTIの主な原因であるが、他の原因物質は、 腸球菌などの増加に重要ですフェカリス。ここでは、これらのヒト疾患の臨床的特徴の多くを再現する2つのよく確立されたマウスモデルを利用しています。 UTIは、C3H / HENモデルは、宿主応答、IBCの形成及びフィラメンテーションを含む、ヒトで観察されたUPEC病原性の機能の多くを再現します。 CAUTI、カテーテル膀胱インプラントを保持C57BL / 6マウスを用いたモデルについて、E.に感受性であることが示されていますフェカリス膀胱感染。これらの代表的なモデルは、新規な治療薬および管理や予防戦略の開発につながっているUTI疾患の病因、に印象的な新しい洞察を得るために使用されています。
Introduction
尿路感染症（UTI）の最も一般的な細菌感染症の一つであり、UTI取得し、取得、コミュニティと院内のメカニズムに基づいて、2つのカテゴリーに分けることができます。市中のUTIは、多くの場合、女性の約50％が一生の1に少なくとも一つのUTIを有することを示しているそうでなければ健康な女性との研究で発生します。さらに、再発の主要な問題です。初期の急性感染症を持っている女性は、適切な抗生物質治療にもかかわらず、6カ月以内に第二の感染症を有する25〜40％の確率を持っており、多くの女性が頻繁に再発2を持ち続けます。これらの感染症の原因菌も3-6ますます抗生物質耐性をさらに交絡治療プロトコルになっています。 UTIは、疾患の影響と有病率を強調し、米国のヘルスケア関連費用が約25億ドルで数百万人を毎年影響を及ぼし1,7 .Nosocomialは主に、留置カテーテルなどの異物の存在に関連しているのUTIを取得しました。カテーテル関連尿路感染症（CAUTI）は、このような感染症の8〜70〜80％を占め、UTI取得し、最も一般的な院内のまま。また、CAUTIを増加罹患率と死亡率に関連付けられている、それが二次血流感染9の最も一般的な原因です。
UPEC関連するコミュニティは尿路感染を取得し、性交中に機械的操作を介して消化管における貯留層から膀胱への細菌の導入によって引き起こされることが異なるホスト·ニッチ10との間に不衛生または他の微生物個体群動態を考えられています。一旦膀胱内部、UPECは、カプセル、鉄獲得システム、毒素、病原性プラスミドのtRNA、病原性島および病因に役割を果たすことが示されているコロニー形成因子を含む多数の病原性因子を使用します<SUP> 11-14。 UPECの定着の確立に重要な、UPECは、接着剤シャペロンアッシャー経路の複数のタイプの立体特異性15と受容体を認識する（CUP）線毛をコードします。 FimHアドヘシンでチップソー1型線毛は、UPECで表現され、マンノシルウロプラキン16とα-1、ヒトおよびマウスの膀胱18の内腔表面上に発現されたβ-3インテグリン17を結合しています。これらのFimH媒介性の相互作用は、細菌のコロニー形成および表在上皮細胞19,20の侵入を容易にします。一旦細胞の内部に、UPECは、単一の細菌が急速に成熟すると、〜10 4の細菌21を含めることができ、細胞内細菌群集（IBC）を形成するために分割することができる細胞質に脱出することができます。 IBCの形成は、少なくとも6つの異なるマウス系統において実証されている、C3H / HEN、C3H / HEJ、C57BL / 6、CBA、FVB / NJおよびBALB / c、および異なるUPEの多種多様なC株および他の腸内細菌科22-24。しかし、IBC形成の時間的、空間的な違いは、マウスの背景と感染UPEC株に応じて変えることができます。原型UPECはUTI89またはCFT073の株に感染したC3H / HeNマウスでは、IBCの形成は、早ければ3 HPI（時間後の感染症）のような細菌の小さなバイオマスとして可視化することができます。このコミュニティは拡大し続けており、棒状の細菌が、最終分化表面的な傘の細胞の細胞質領域の大きな割合を占めているときに、開発の約6 HPIの「中間点」に達する同様の寸法を表示過半数と比較的同期した方法でこれらの初期のIBCSフォームおよび形態。 〜8 HPI桿菌からのIBCの変更中の細菌は形態を球菌します。 IBCSは、本質的に一時的です。したがって、細菌集団の継続的な拡大で12〜18 HPI結果からIBC成熟、細胞のWiのうち、それらのフィラメント化と分散が続きます隣接セル23に目以降の広がり。このように、IBCのニッチは、宿主免疫応答および抗生物質25から保護された環境の急速な細菌の増殖を可能にします。マウスで見られるUPEC感染の異なる段階は、ヒト22,26-28にUTIをモデル化するために使用することができる有益なツールとしてUTIのマウスモデルをサポートする、例えば、IBCSおよびフィラメンテーションのように、ヒトにおいて観察されます。
大多数の女性が一生の間にUTIを経験しているが、これらの感染症の結果は、無再発急性自己限定感染から、頻繁な再発性膀胱炎の範囲とすることができます。また、研究では、遺伝的要素がUTI感受性29に貢献を示唆し、UTIの強い家族発生を示しています。私たちは、診療所で見られる異なるUTIの成果は、近交系マウス系統30のうち、実験UPEC感染の異なる成果によりミラーリングすることができることを見出しました。例えば、C3H / HEN、CBA、DBA、およびC3H / HeOuJマウスは感染用量依存的に、永続的な、高力価の細菌（> 10 4コロニー形成単位（CFU）/ ml）を、高力価の細菌によって特徴付けられる長期的な、慢性膀胱炎に、影響を受けやすいです犠牲に膀胱負担> 4週間後に感染（WPI）、慢性炎症、および尿路上皮壊死。これらのマウスは、慢性膀胱炎の開発のためのバイオマーカーとして働く第24 HPI内のIL-6、G-CSF、KC、およびIL-5の上昇した血清レベルを示します。プラセボ研究は抗生物質治療31が与えられていない場合はUTIを経験した女性の大部分は、膀胱炎の最初の症状の後に数週間のために彼らの尿中の細菌の高いレベルを保持することが示されているように、これは正確に、何人かの女性にUTIの自然経過を表すことができます、32。また、C3H / HeNマウスを使用して、我々は慢性膀胱炎の歴史はその後の深刻な再発感染の重要な危険因子であることがわかりました。再発UTIは、最もSiでありますgnificant臨床UTIの症状およびC3H / HENマウスは現在、以前の曝露後に増加した素因を再現するだけで勉強したモデルです。第UTIの結果は、急性UPEC感染はほぼ週間以内に膀胱炎と細菌の解像度で、自己制限であるC57BL / 6マウスに再現されています。興味深いことに、このモデルでは、UPECは、容易に潜在的に人間33、34で同系統の再発UTIのための1つのメカニズムを説明する、アクティブUTIを再開するために休止状態から出現することが可能であるUPECから膀胱組織内の静止状態の細胞内貯蔵部を形成します。
UTIの感受性に遺伝的影響に加えて、膀胱へのカテーテルの導入は、非常に感染を有するだけでなく、感染症を引き起こすことができる細菌の範囲を増加させる可能性を増大させます。これは、人間の尿カテーテルは、組織学的を引き起こすことが実証されていると堅牢な炎症反応、剥離、粘膜固有層とsubmucusaの浮腫、尿路上皮間伐、および尿路上皮および腎臓35,36の粘膜病変をもたらす機械的ストレスに起因する膀胱内の免疫学的変化。さらに、カテーテルによりCAUTIを引き起こすために、いくつかの種によって利用環境を作り出す細菌の付着のための表面を提供します。 UPECは依然として主要な原因であるが、 エンテロコッカスフェカリスは、これらのCAUTI 37の15％を占めています。E.フェカリスは、深刻な健康問題38を装った、バンコマイシン耐性出現と抗生物質に対してますます耐性になってきている。E.フェカリスは、毒素やカテーテルおよび上皮38の両方に取り付けるために必要なアドヘシンを含む多数の病原性因子を有しています。尿カテーテルの間に、ホストは、尿路39,40における微生物付着性、乗算と普及に対して脆弱である。E. faecaLISは、膀胱に持続し、マウスCAUTIモデル41で再現された腎臓、に普及するための機構の一部として、カテーテル上のバイオフィルムを形成しています。最近、それは尿カテーテル挿入中に示されており、フィブリノーゲン（FG）は、炎症応答の一部として膀胱内に放出されます。 FGがコートカテーテル、膀胱内に蓄積し、 大腸菌のために不可欠ですフェカリスバイオフィルム形成、取付足場として機能します。 CAUTIのC57BL / 6マウスモデルでは、E.ことを発見しましたフェカリスバイオフィルムカテーテルに形成し、したがって膀胱内の持続性は、EBPの線毛、特にその先端付着EBPAに依存していました。我々はEBPAのN末端ドメインは、特にカテーテルを被覆FGに結合することがわかりました。さらに、それがすることが見出されたE.フェカリスは、このようにバイオフィルムの形成42を高め、感染の間に代謝物源としてのFgを利用しています。
マウスモデルは、アンダーに重要であることが証明されていますtandingならびにUTIとCAUTI 41の臨床症状を予測します。この記事では、膀胱炎UPECの接種材料の準備を実証UTI89およびC3H / HeNマウスの経尿道的接種を分離します。さらに、当社は、C57BL / 6マウスおよびEの接種にカテーテル挿入のためのプロトコルを示していますフェカリス OG1RF株。これらの技術の両方が、マウスにおいて一貫性と信頼性UTIやCAUTIにつながります。我々はまた、慢性または再発性膀胱炎の分析のための急性膀胱炎や尿収集中IBCの形成を観察するために使用される技術を表示します。 C3H / HeNマウスは、最初の細菌の侵入、IBCの形成、フィラメンテーションおよび慢性膀胱炎23,33,43の開発などUPECの病因の側面を研究するために使用されてきました。これらの病原性パラメータは、他のマウスの背景22,33の様々な研究されています。 CAUTIのために、C57BL / 6モデルは、その後の細菌共同で膀胱内に異物の注入を可能にします7日間維持することができlonizationは、感染41を投稿してください。これらのモデルは、UTIとメカニズムに対する宿主応答は、宿主応答を破壊するために、細菌の病原性メカニズムを評価するために有用で、その多くは、その後に再現し、または臨床的ヒト集団において観察されたています。
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Protocol
倫理文：ワシントン大学動物実験委員会は、2013年1月11日に承認され、2016年1月11日に満了したプロトコル番号20120216の一部としてすべてのマウスの感染と手順を承認しました。動物の全体的なケアが国家研究評議会と米国農務省動物ケアリソースガイドから実験動物の管理と使用に関するガイドと一致しました。安楽死手順はと一致している「安楽死動物の2013年版のAVMAガイドライン」。
1. UPEC UTIプロトコル、接種針の製造（図S1）
- 30 G針のキャップを外します。針のシャフトにPE10チューブの約1インチを通します。 UV一晩針アセンブリを滅菌します。カテーテル針は滅菌ペトリ皿に無期限に保存することができます。
2. UPEC細菌接種の準備
- UTI89接種を準備する（接種材料の前に72時間を開始ション日）
- 凍結ストックからLB（ルリア - ベルターニ）寒天プレート上にストリークUTI89。 37℃で一晩インキュベートします。コロニーを採取し、125ミリリットルのフラスコにLB 10mlの中にそれを接種。静的に、24時間、37℃でインキュベートします。
- 静的に、37℃でさらに24時間、新しい125ミリリットルのフラスコ中のLB 10mlの中に一晩培養物10μlを接種。
- 転送3ミリリットル（株及び所望の接種サイズによって異なります）3分間7,000×gで1.5ミリリットルチューブと遠心分離機を無菌で、1×PBSと遠心機で二回目のペレットを再懸濁します。 PBS 1×1ミリリットル中に細菌ペレットを再懸濁します。
- 細菌の光学密度を測定し、所望の接種濃度に濃度を調整します。使用接種材料の標準的な濃度は、10 7個の細菌です。しかしながら、この研究の設計に起因して変化し得ます。
3.細菌接種
- 70％エタノール、およびcを持つワークステーションを清掃してください吸収紙の領域の上（または滅菌流フードを使用します）。
- 1ミリリットル（TB）を注射器に準備された細菌接種0.9 mlまでの描画（気泡を除去）。その後、無菌ポリエチレンチューブをトリム、接種材料を含むシリンジに、PE10チューブを用いて調製し、滅菌接種針を取り付けます。
注：膀胱穿刺を避けるために、針の先端の上にチューブの1ミリメートルを残します。 - パラフィルムの1平方インチの部分をカットし、上に手術用潤滑剤のDAB（ダイムの約サイズ）を置きます。
- まで（プロトコル製造以下）イソフルランまたは気化室の3ミリリットルを浸したコットンボールとティー注入器ボールを含む32オンスのガラスジャーにそれらを置くことによってメスのC3H / HeNマウスを麻酔無意識が、まだ正常に呼吸（1呼吸/秒） 。
注：一部のIACUC委員会は、瓶や気化器の使用を承認しません。ご自身の機関のIACUC委員会の指示に従ってください。
注：もしガラスジャーイソフルランsoakdコットンボールを使用すると、茶のボールおよび/またはノーズコーンと、動物は、慎重に麻酔薬の過剰投与と死亡の危険を避けるために、観察されなければなりません。気化器及び麻酔チャンバーを使用することの利点は、偶発的な過剰投与を回避する制御イソフルランの投与を提供することです。注意：イソフルランは吸入麻酔薬です。換気の良い場所で使用し、吸入を最小限に抑えます。 - ジャー/気化器からマウスを取り外し、ペーパータオルに背の上に置き、足を広げ。
- 少量（約1〜2 mlを含む綿ボールでノーズコーン（一部の気化ユニットに装備されています制御イソフルランの用量を提供する気化器に接続されたチューブ）を有するマウスの鼻または50mlコニカルチューブをカバー）イソフルランの。
- 静かに排尿を誘導し、ボイド膀胱を確保するために膀胱をドキドキ。 100％エタノールで尿道周囲領域を拭き拭き。に、最初の接種針/注射器、ポイントをDAB外科用潤滑剤。
- 経尿道的に接種針を挿入することにより、菌液を50μl、約12ミリメートル、及び（10μL/秒）優しく膀胱に接種材料を分配するために静かにシリンジプランジャーを押し下げると、各マウスに接種。マウスからの接種針を外します。
注：接種し始めて尿道口での接種物の即時復帰は、針の不適切または不完全な挿入を示しています。 - ノーズコーンからマウスを削除し、そのケージに戻します。繰り返しは、各マウスについて3.3から3.8を繰り返します。とき/スイッチング接種条件/株場合、承認されたシャープコンテナに注射し、接種針の処分および3.2のステップを再び開始します。
注：尿路病原性生物の接種は、一般的に激しい痛みの症状を引き起こすことはありません。ただし、まれに、病原体の大用量の投与は、発熱、食物および水摂取の減少や異常な動作を引き起こす可能性があります。 Animalの健康は、実験を通して監視する必要があります。明白な痛みの症状は、予告、そのようなブプレノルフィン（0.05〜0.1ミリグラム/ kgを皮下投与）などの鎮痛薬、であれば、適用することができます。手順は、各機関のIACUCに従うべきです。
細菌負担の4決意
- 収穫される各膀胱と腎臓のペアのための独立した5ミリリットルのチューブを準備します。収穫する1×PBS /チューブ/マウス膀胱の1ミリリットルを追加します。収穫する、マウスの腎臓の1×PBS /チューブ/ペアの0.8ミリリットルを追加します。指定されたマウスに対応して各チューブにラベルを付けます。午前1時10分の段階希釈のために、各ウェルに1×PBSの180μLを含む96ウェルプレートを準備します。
- 70％エタノールで作業領域をきれいにし、吸収性のカバーやペーパータオルでエリアをカバーしています。
- マウスが約1分間呼吸を停止するまで（ステップ3.4参照）イソフルランでマウスを麻酔し、吸収性のカバーや紙タオルの上に置きます。 euthanaする他の方法SIAはまた二酸化炭素などのIACUC委員会によって受け入れられ、そしてイソフルラン過剰投与の代わりに用いることができます。
- ヘッドの基部に首を拘束し、水平方向に離れて身体から転位が発生するまで尾を引いてから成り急速頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げます。
注：ほとんどのIACUC委員会は、安楽死の二次手段を必要とし、頚椎脱臼は一般的な方法です。 IACUC委員会によって承認された場合は、他の方法を用いることができます。 - その背中に死んだマウスを置き、腹部に70％エタノールを噴霧。マウスを解剖、腎切開後の血液からの潜在的な汚染を最小限にすることために、膀胱および腎臓を採取。 1×PBSを含む調製した5 mlチューブに独立した器官を配置する（ステップ4.1を参照してください）。
注：外部の解剖用と臓器収穫汚染を最小限にするために使用するさまざまなハサミ。 - 臓器がTであることを確認するために、チューブをタップします彼はPBSを1倍。各マウスを繰り返しステップ4.3から4.5まで。各マウスの後、70％エタノールで清潔なハサミやピンセット。
5.細菌の回復
- 組織ホモジナイザーで5 mlチューブ、腎臓あたり15秒、膀胱あたり30秒で収穫された膀胱や腎臓をホモジナイズします。サンプル間で1×PBS、70％エタノールおよび1×PBS中でホモジナイザーを順次洗浄します。
- 10 -8のうち連続1時10分希釈液を作成し、LB寒天プレート上のCFUのための各希釈（コロニー形成単位）をプレート。 37℃で一晩プレートをインキュベートし、翌日コロニーをカウントします。
6. IBC列挙
- 無菌的に膀胱を除去し、シリコーン底部を有する6ウェルプレートに1×PBSに入れてください。プレートは、命令を生産参照シリコーンエラストマーキットを用いて調製し、各ウェル中のシリコーンの約1cmを注入することができます。はさみを使用して半分に膀胱をカット。
- 小さな金属製のピンを使用すると、静かに宣伝ちらしをスプレイデルは、そのように、膀胱内腔は上を向いています。尿路上皮の最大量が露出されていることを確認するために膀胱部の最も外側の縁部にピンを配置してください。
- 扇形に開く後、静かに1×PBSで一度膀胱を洗浄します。ピペットで1×PBSを削除します。全体スプレイ膀胱をカバーするのに十分な3％のパラホルムアルデヒドを添加することにより、膀胱を修正しました。注意：パラホルムアルデヒドは発がん性です。手袋などの適切な保護具は、常に着用します。処分は、機関のガイドラインに従ってください。
- 1時間室温でインキュベートします。パラホルムアルデヒド溶液を除去します。 1×PBSで1回洗浄。
- （PBS 1×2のMgCl 2、0.01％デオキシコール酸ナトリウムおよび0.02％のNonidet-p40in）のLacZ洗浄溶液の洗浄あたり5分間、3回洗浄します。
- 洗浄溶液を除去し、十分にLacZ染色を追加（9.5ミリリットルのLacZの洗浄溶液、0.4ミリリットル25 mg / mlのX-galおよび100mMのK-フェロシアン化物/ K-フェリシアンの0.1ミリリットル）の膀胱をカバーします。 30℃overniでインキュベート光から保護GHT。
- インキュベーターからスプレイブラダーを削除し、IBCSを観察、解剖範囲で可視化した青色斑点として表示され、40-60X倍率。
注：時々、マウスは尿道下管を配置する前に排尿することがあります。この場合、再び尿を採取する前に、15〜20分待ちます。
7.尿細菌CFU計数のためのコレクション（CAUTIには適用されません）
- 尿前を収集したり、感染を投稿することは静かに尾を保持し、（マウスケージの上部）平らな上昇面にそれを置くことによって、マウスを抑えます。
- マウスの尿道で無菌1.5mlチューブを保持します。静かに膀胱に圧力を適用するために尾の近くにマウスの背中を下に押してください。 1.5mlチューブに尿をキャッチ。
- 10 -7〜うちのシリアル1:10希釈液を作成し、適切なLBの上の各希釈液をめっき37℃で一晩プレートをインキュベートし、翌日コロニーをカウントします。
8. CAUTIモデルプロトコル、CAUTIモデルのカテーテルニードル準備（図S2）
- 30 G針のキャップを外します。 PE10チューブなどRenaSILなどのシリコーンチューブの5ミリメートル片の7ミリメートルの部分をカットします。チューブは、針の基部に接触するまでPE10チューブを針に糸を通します。
- そして、PE10含有針に5ミリメートルピースを養います。 UV一晩針アセンブリを滅菌します。
注：シリコンチューブをロードする際、針の先端を越えて延びているチューブの1mm程度にしておきます。
9. E.フェカリス OG1RF細菌接種の準備
- 接種前の日に48時間を開始OG1RF接種を準備します。凍結ストックからのBHI（ブレインハートインフュージョン）プレート上にストリークOG1RF。
- コロニーを採取し、BHIの10ミリリットルにそれを接種し、37℃で18時間静的に成長します。文化を遠心し、滅菌1×PBS 1 mlの容量でペレット（3回）洗浄します。
- 1×PBS中に細菌ペレットを再懸濁します。細菌の光学密度を測定し、所望の接種サイズに濃度を調整します。使用接種物の標準濃度は10 7です。しかしながら、これは、試験の設計に変えることができます
10.カテーテル移植
- 70％エタノールでワークステーションを清掃し、吸収性のカバーでエリアをカバー（または滅菌流フードを使用します）。
- 空の1ミリリットル（TB）シリンジにカテーテル針を取り付けます。パラフィルムの1平方インチの部分をカットし、上に手術用潤滑剤のDAB（ダイムの約サイズ）を置きます。
注：二つの異なる針は、カテーテルの堆積のためにカテーテル注入のために必要な機械的操作による最小化偶発接種に対する接種材料に使用されます。これはまた、より少ない接種針を製造する便宜を可能にします。 - お茶を含む32オンスのガラスジャーにそれらを置くことによって、C57BL / 6マウスを麻酔イソフルランまたは気化室3mlに浸した綿ボールで-infuserボール無意識が、まだ正常に呼吸（1呼吸/秒）まで（以下、プロトコルを製造して）。
- その後、ペーパータオルの上に仰向けにマウスを入れて、足を広げ。イソフルランの少量（約1〜2 ml）を含有する綿のボールとノーズコーンまたは50mlコニカルチューブをマウスの鼻を覆います。
注意：イソフルランは吸入麻酔薬です。換気の良い場所で使用して、研究者による吸入を最小限に抑えます。 - 静かに排尿を誘導し、ボイド膀胱を確保するために膀胱をドキドキ。 100％エタノールで尿道周囲領域を拭き拭き。
- 綿チップアプリケーターを用いて、10％ポビドンヨード溶液で尿道周囲領域を消毒。接種針/注射器をDAB、手術用の潤滑剤に、最初のポイント。
注：Povidine - ヨウ素は、アルコールよりも強い無菌性溶液であるカテーテルの移植に使用されます。カテーテル注入が必要ですカテーテルしたがって、汚染の大きな可能性を挿入するために、より機械的操作。 - 尿道口にカテーテルを挿入します。一度で、ピンセットを使用し、その結果（5ミリメートルシリコーン）小さなカテーテルを押すと膀胱にそれを堆積させる、膀胱に向けて（7ミリメートルのPE10）の長い部分をプッシュします。すぐに、まだ取り付け7ミリメートルチューブを、針を外します。
11.細菌接種
- ノーズコーンからマウスを削除し、そのケージに戻す部9から調製した接種材料を使用して、セクション3で細菌接種プロトコルに従ってください
犠牲の各時間点で12
- カテーテルのために膀胱と腎臓5 mlチューブ（臓器はステップ4.1に従うため）および1.5mlのエッペンドルフチューブを準備します。カテーテルサンプルの1.5mlのエッペンドルフチューブに1×PBS 1 mlを加え
- フォローは4.5に4.3を繰り返します。膀胱、腎臓、カテーテルを回収、マウスを解剖、ナンプラー独立して1.5mlのエッペンドルフ（ステップ12.1を参照）に1×PBSおよびカテーテルを含む5 mlチューブに組織をcing。
注：外部の解剖用と臓器収穫と汚染を最小限に抑えるために、カテーテルの検索のために使用するさまざまなハサミ - 次に、ステップ4.6に従ってください。
13.細菌の回復
- 臓器については、ステップ5.1および5.2に従ってください。カテーテルからの細菌の回復のために、30秒間最大速度でボルテックス、浴超音波処理器を用いて5分間のカテーテルサンプルを超音波処理し、その後さらに30秒間最大速度でボルテックス。
- 10 -8のうち連続1時10分希釈液を作成し、BHIプレート上のCFU計数のための各希釈をプレート。一晩、37ºCでプレートをインキュベートし、翌日コロニーをカウントします。
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Representative Results
単純およびカテーテル関連UTIの膀胱内のモデルは、これらの共通および高価な感染症を管理するために、細菌の病原性、宿主組織上のこれらの疾患の影響、および開発および新規のアプローチのテストの分子機構を解明するための柔軟なプラットフォームを提供します。マウス系統および病原体に応じて、膀胱内接種（ 図1及び3）、慢性または再発性（ 図2）膀胱炎の開始または急性調節するために必要な因子を解明するために、宿主-病原体相互作用を研究するために使用することができます。 図1に示したデータは、原型UPEC膀胱炎による急性期（24 HPI）尿路植民地の代表であるUTI89 44を分離します。接種後、感染がマウスを屠殺し、膀胱と腎臓の組織が均質化された時点で24時間成長させています。組織ホモジネートを連続しているdilutEDとコロニー形成細菌の計数のためにプレーティングしました。慢性UPECのコロニー形成と膀胱炎は、感染量とuropathogen依存的にいくつかのマウス系統（特にC3H / HEN）で確立し、維持することができます。慢性膀胱炎は、持続的な高力価の細菌と定義される（> 10 4 CFU / ml）を、膀胱炎および高力価の細菌膀胱負担（> 10 4 CFU /袋）犠牲33時。 図2に示したデータは、UTI89の2×10 7 CFUを持つC3H / HeNマウスの接種後4週間に発生する代表的なのCFUです。マウスの残りの50〜80％が感染を解決しながら、これらの実験条件の下では、感染したマウスの20〜50％は慢性膀胱炎を発症します。結果のこの二重性は、最初の24 HPI内に決定された宿主病原体のチェックポイントに依存しています。で現れ始める細菌力価の観察された二峰性分布、チェックポイントの結果の活性化（またはしません）犠牲28 dpiで3解像度（日感染後）と膀胱内で尿（ 図2）33。最初の感染は抗生物質療法33でクリアされた後、慢性膀胱炎の病歴を有するマウスは、かなりチャレンジの際に、再発性の慢性膀胱炎にかかりやすいです。同様に、UTIの歴史は、ヒトにおける再発性尿路感染症のための既知の危険因子です。したがって、これは、再発性UTIの病因を研究するために使用される唯一の既知のモデルです。実験的に、代替マウスの背景にUTIをモデル化する場合は、マウス株はいくつかの株は、多かれ少なかれ耐性これらの症候群33の開発にされていることを考えると、UTI、再発性UTIやCAUTIの影響を受けやすいかどうかを判断することが重要です。
急性膀胱炎の追加測定は、IBCの列挙です。 IBCの形成は分化表在アンブレラ細胞に限定されます。 IBCの定量化は、急性嚢胞中の細菌負荷の有益な尺度でありますITISとIBCSの高レベルは、慢性膀胱炎21を発症するリスクと相関しています。 IBCの形成は、疾患の急性段階で起こります。表面的な傘細胞の剥離後、IBCSはもはや観察されません。 C3H / HEN UTIモデルでは、IBCSは6時間経尿道的膀胱にUTI89の〜1×10 7 CFUを接種した後に測定することができます。ブラダーは、シリコーンプレート上の金属ピンとスプレイおよびLacZの発現について染色されています。 LacZのは、βガラクトシダーゼ、ガラクトースおよび他の糖との間を切断するβ結合することを一般的に表現した細菌酵素です。この酵素は、切断時に青色を生成するX-galを、βガラクトシド類似体を供給することによって細菌を検出することができます。染色後、ブラダーをIBCSは、尿路上皮とIBCSのpunctae紫/青のドットとして現れると解剖顕微鏡下で撮像されたドット（ 図3A）をカウントすることによって列挙することができます。一方、私の数動物ごとに形成されたのBCは、膀胱（ 図3B）ごとに見られているC3H / HEN背景に、〜50 IBCSの平均値を変化させます。 IBCSは、用量依存的に増加します。形成IBCSの数はUPECとマウスの背景株との間で変化します。例えば、C57BL / 6、膀胱あたり数百IBCSの形成〜1×10 7 UTI89結果の接種材料で。
合併症のない社会を超えて、健康·介護関連のUTIを上記モデル化されたUTIを取得ヘルスケアシステムに大きな負担を表しています。尿路感染症は、すべての医療関連感染の約40％を占めているし、すべての医療関連のUTIの95％までは、カテーテル45に関連しています。ここでは、この困難な臨床的問題の実験的な分析のための強力なシステムを表すCAUTIの膀胱インプラントマウスモデルを実証します。 図4に示すデータは、モデルEで24時間の感染症の代表的なものですフェカリス S OG1RFを訓練します。 OG1RFの1×10 7 CFUを膀胱内に未注入膀胱に接種されると、感染が24 HPI（ 図4A）によって、感染が41を解決した3解像度によってクリアすることから始まります。逆に、移植膀胱未注入ブラダーで観察されたものよりも24 HPIで10倍高い膀胱植民地化レベルのカテーテルおよび膀胱の両方のコロニー形成をもたらし、へOG1RFの接種（ 図4Aおよび4B）。また、この感染症は、カテーテル損失約7解像度41まで膀胱に> 10 6 CFUに維持されます。記載された実験モデルのすべてが含むが感染組織と表面の巨視的および顕微鏡イメージングへの様々なアプローチ、変更された接種材料のサイズおよび疾患回、競争力のある感染症に排他的ではなく、実験的な高度の柔軟性に適している、および免疫学的分析を開催します。
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図1：24時間尿路の定着女性、7-8週齢のC3H / HeNマウスを経尿道的に原型UPEC膀胱炎の〜2×10 7 CFUを接種した24時間UTI89を分離します。収穫膀胱および腎臓組織から回収代表のCFUが示され、N = 5の破線は、検出下限（20 CFU）です。
図2：28日尿路の定着女性、7-8週齢のC3H / HeNマウスは、経尿道〜2×10 7 CFU UTI89を接種しました。尿は、指示された日の感染後（DPI）で収集し、CFUの計数のためにプレーティングしました。代表的な28日間の膀胱および腎臓の力価も表示され、n個の検出= 8.尿CFU下限（千CFU / ml）を破線で示しています。点線represen検出、20 CFU /組織の組織下限TS。
図3：IBC列挙女性、7-8週齢のC3H / HeNマウスは、経尿道〜1×10 7 CFU UTI89を接種しました。ブラダーは6 HPIを収穫し、IBC染色のために広がりました。 LacZ染色後に広がった膀胱の（A）画像。 IBCSは、青い点として表されます。はめ込み画像は、ブラックボックス内の画像の部分のデジタル倍率です。 （B）代表C3H / HeNマウス6 HPIに形成されたIBCSの数はn = 10。
図4：E。フェカリスカテーテル関連UTI。C57BL / 6マウスを、またはの〜1×10 7 CFUとカテーテルずに接種しました
図S1：UTI接種針の準備は、図は、針へのカテーテルの（1）、スレッド（2）必要な材料を含む接種針準備手順が表示され、（3）接種前にチューブをトリミング。
図S2：CAUTI接種針の準備図（1）は、接種カテーテルのスレッド（2）に注入カテーテルを必要と接種針準備材料を表示します針〜（3）。
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Discussion
合併症のない社会は、UTIは毎年46万人のいくつかのプライマリケアの訪問を占める一般的であり、コストのかかる感染症で取得しました。また、CAUTIsはもはやCAUTI 45院内に起因する治療の追加費用のためのプロバイダを払い戻すメディケアおよびメディケイド·サービスのセンターとしての医療サービス提供者に非常に高価ななっていない一般的なヘルスケア取得感染しています。これらのプロトコルに記載されUTIのマウスモデル、単純性膀胱炎とCAUTIの両方が、開始、維持、およびUTIのいくつかの形態の結果を調節するために必要なホストと病原体の相互作用の分子基盤を理解するための貴重なツールを提供します。これらのモデルは、UTI 23,47-49の分析に強力な細菌およびマウス遺伝学、免疫学、顕微鏡、生化学的および化学遺伝学的ツールの適用を可能にします。さらに、プロトコルは、ここで説明するプラットフォームを提供してきました細菌の病原性および新規なワクチン接種の目標と戦略50〜55の小分子阻害剤を含む新規な治療および予防戦略の開発とテストのために。
単純性膀胱炎モデルの成功のアプリケーションのために維持されなければならないいくつかの重要な条件があります。すべてのマウスの麻酔の手順と同じように、注意が過剰麻酔によるマウスの死亡を防ぐために注意しなければなりません。接種カテーテルを調製する場合、シリコンチューブは限りカテーテルで膀胱の壁を損傷するように針の先端をカバーするがないのに十分な長さでなければなりません。また、膣口の近接度及びサイズのため、注意が尿道ではなく、膣内に接種カテーテルを挿入するために注意しなければなりません。 IBC列挙のための膀胱扇形に開く中に、ブラダーはアプロ社のために固定することが可能な以下の解剖および組織限り迅速に広がったことが必須ですximately 1時間ではなく、一晩。 LacZ染色によりIBCの列挙のためには、問題の細菌が尿路上皮細胞のコロニー形成中にLacZを生成することも必要です。 LacZの酵素が生成されていない株を使用する場合は、IBCSは、抗E.で免疫蛍光顕微鏡を使用して列挙することが可能です大腸菌抗体またはGFP発現する細菌。このモデルの1つの特定の特徴は、異なる近交系マウス系統により提示される疾患の進行および重症度の異なるパターンであり、原型UPEC種々の病原性の可能性は、33,56の株。彼らは実験的なデザインと解釈57,58を複雑にしながら、臨床的および表現型の研究で観察された宿主の感受性と病原体の多様性の自然な変化を再現するように、これらの違いは強さと、この技術の限界の両方です。これらの変動は、ホストと細菌mechanの解明を可能にする、比較のソースを提供しますISMSは、合併症のないUTI 33,56の病因を調節します。しかし、彼らはまた、マウスのラインUTI感受性の様々な程度のために、細心の注意が調査者が求めている特定の質問に対処するための適切なマウス系統とUPEC株を選択する際に注意しなければならない、ということを意味します。例えば、C57BL / 6マウスは、初期の時点で高い細菌力価およびIBCSの多数を呈する、急性感染の優れたモデルです。この株は、その後、急速に重篤な腎感染症と静止細胞内のリザーバ33,34に起因するだけで永続的植民地で3と7 dpiの間で感染を解決します。 C57BL / 6モデルが正確に存在し、その後、症状が解消した多くのUTIの患者について最も一般的な結果を示すことができます。逆に、C3H / HENマウスの背景には、彼らに再発性UTIを研究するための理想的な歪みを作る慢性膀胱炎に対する感受性の高度を示します。他のUTIモデルも確立されていますCBA、DBAとUTI 33,59の特定の側面を研究するための有用な証明C3H / HeJマウスの背景にあります。単純性膀胱炎モデルで示した主な実験的な欠点は、急性、慢性および再発性膀胱炎60のために必要な新たな細菌因子の発見のための大規模な遺伝子スクリーニング方法論の適用を制限する複数の感染のボトルネックの存在です。
単純性膀胱炎モデルの重要な考慮事項は、すべての二つの追加の懸念を有するインプラントベースCAUTIモデルに適用されます。まず、ケアは、インプラントの挿入が原因でインプラントによって与え膀胱感染に対する感受性の増加に、無菌方式で行われることを保証するために注意する必要があります。第二に、カテーテルは、注入針の除去の際に所定の位置に保持することが必須です。 CAUTIモデルの主な制限は、それが利用可能なホストの遺伝的背景、PRの減少範囲を持っていることです時間と注入に起因する膀胱機能障害に起因する尿を採取することができない上のカテーテル損失のopensity。インプラント損失と縦尿検査を介して感染を監視することができないことを補償するために、このモデルは、一般的にマウスの後の時点およびグループのカテーテルを挿入マウスの高い数値を必要とする各所望の時点で犠牲にする必要があります。制限されたホストの遺伝的背景には、C3H / HENなどのいくつかのマウス系統は、インプラント（P. Guiton、パーソナルコミュニケーション2010）失われる法外な周波数に起因します。その結果、上述のCAUTIプロトコルは単にC57BL / 6マウス系統に最適化されています。 CAUTIのために利用可能なマウス系統の制限は残念であるがしかし、多くのゲノムのバリエーションがC57BL / 6バックグラウンドで確立されており、CAUTIモデルは、生物によるコロニー形成を促進するために、膀胱の環境を変更することによって、UTIの間に研究に利用できる細菌の多様性を拡大することありますそれ以外の場合は非病原性UTIのマウスモデルで。この例は、FGの役割の最近の発見は、Eにおける膀胱のカテーテル誘発性炎症時に放出されますCAUTI 42時のフェカリス成長 、バイオフィルム形成、および持続。この例では、細菌の分子病態のメカニズムだけでなく、感染の間の宿主因子の役割だけでなく解明にCAUTIのインプラントモデルのパワーを示しています。これらのすべての機能は、以前understudiedされました。この関連する臨床感染症を、理解に貢献しています。
上記の実験的アプローチに加えて、単純性膀胱炎とCAUTIのマウスモデルは、方法論の修正が多数に適しています。単純性膀胱炎モデルの場合には、これらの改変は、細菌の数を減らすために、接種量及び接種物の点滴注入の間に印加される力を低減含むことができ早ければ1 HPIとして時点で犠牲にし、uropathogen膀胱上皮細胞62に侵入している程度を評価するためにゲンタマイシン保護アッセイを使用して、感染の持続期間を変化させること、腎臓61に導入されます。また、切断し、様々な宿主および/ または細菌のエピトープに対する抗体で染色し、蛍光または共焦点顕微鏡下で観察することができHPI 6〜24匹のマウスから広がった膀胱をIBC構造、細菌フラックスやフィラメンテーションと宿主組織状態25,33を観察するために犠牲に、63,64。ホストの局所および全身性免疫応答にuropathogen感染および/ または移植の効果は、それぞれ33,65、尿または血清中のサイトカインレベルを決定するために、BioplexサイトメトリービーズシステムまたはELISAに基づくアッセイを用いて評価することができます。最後に、膀胱組織、場所およびコロニー形成細菌の形態およびバイオフィルムの構造の状態が上に堆積しますカテーテルは、電子顕微鏡25,41を含む様々なイメージング技術によって評価することができます。
感染のこれらの基本的なモデルは、再発性UTI、複数の感染を介して、適応的免疫応答の発生を含む、他の臨床的に関連する現象を模倣するように適合させることができます。 C3H / HENモデルでは、抗菌剤の投与を介して感染のクリアランスが続く慢性膀胱炎の前の開発は、慢性膀胱炎を開発するために、これらのマウスを感作しながら、これに関連して、急性膀胱炎に抵抗性の増大にC57BL / 6マウスの結果の感染を繰り返します66以降の接種に。さらに、UTIの発症の危険因子の分子機構を調べることができます。糖尿病と肥満の両方のUTIの頻度および重症度を増加させることが示されています。 2型糖尿病は、遺伝的にFVB / NJの背景をマウスでモデル化することができ、1型糖尿病の化学的に誘発モデルがalreadましたyはUPECおよびK.の両方に起因する尿路感染症の重症度を増加させることが示されニューモ 67,68。
最後に、これらのモデル系は、治療または尿路感染症とCAUTIsを防止することを目的と治療法の開発および最適化のための理想的な試験場を表します。これらのモデルが提供するホスト病原体の相互作用の分子的理解はすでに51-55因子重要な毒性を標的に向けた効果的なワクチン接種戦略の開発を促進してきました。さらに、UPEC接着の小分子阻害剤は、合併症のない急性および慢性のUTIの治療に有効であることが示されているだけでなく、CAUTIsはUPEC 12,69,70によって生じます。これらのプロトコルに記載さ単純UTIとCAUTIモデルの両方が尿路内のホスト - 病原体相互作用の分子の詳細を分析するための実験的なツールを提供しています。これらのツールは、私たちのunderstandinを拡大する多くの方法で活用することができますこの条件の複雑な一連のg、より効果的な治療的介入の開発を容易にします。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係がないことを宣言します。
Acknowledgments
この作業のための資金はORWH SCORのP50のDK064540、RO1 DK 051406、RO1 AI 108749から01、F32 DK 101171、およびF32 DK 104516から01によって提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for catheter and needle preparation: | |||
| 30 G needles | BD Precision Glide | 305106 | 30 G x ½ (0.3 mm x 13 mm) |
| PE10 polyethylene tubing | BD | 427400 | Inside diameter -0.011 in (0.28 mm); outside diameter – 0.024 in (0.61 mm) |
| RenaSIL 025 platinum cured silicon tubing | Braintree Scientific, Inc | SIL 025 | inside diameter-0.012 x outside diameter 0.025, 25 ft coil |
| Material for infections: | |||
| Isoflourane – Isothesia | Butler Schein | 29405 | 250 ml |
| Clear Glass Straight-Sided Jar | Kimble Chase | 5413289V 21 | |
| Stainless Steel Tea Infuser | Schefs-Amazon | Premium Loose Leaf Tea Infuser By Schefs - Stainless Steel - Large Capacity - | |
| Non-sterile cotton balls | Fisherbrand | 22-456-880 | |
| 50 ml Falcon tubes | VWR | 89039-660 | |
| Isotec 3 -vaporizer | Ohmeda | 1224478 | |
| Ear punch | Fisher Scientific | 13-812-201 | (when necessary) |
| Betadine solution | Betadine solution | 10% Povidie-iodine topical solution | |
| Q-tips | Fisher Scientific | 22-037-924 | 6 inches |
| Diapers for bench | Fisherbrand | 14206 63 | Absorbent Underpads (20”X36”mats) |
| Surgical lubricant | Surgilube | 0281-0205-36 | |
| Dissecting scissor | Fine Science tools, INC | 14084-08 | |
| Micro-Adson Forceps | Fine Science tools, INC | 11018-12 | |
| 1 ml syringe | BD | 309659 | Tuberculin slip tip |
| Parafilm | Bemis | PM996 | 4 inches x 125 FT |
| Eppendorf rack | Fisherbrand | 05-541-1 | |
| Eppendorf tubes | MIDSCI | AVX-T-17-C | |
| Harvesting catheters, bladders and kidneys: | |||
| Homogenizer | PRO Scientific INC | Bio-Gen Pro 200 | |
| 5 ml polypropylene round-bottom tube | BD | 352063 | for organ homogenization |
| Paper towel | Georgia-Pacific | ||
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 11100020S | 200 proof |
| Costar™ Clear Polystyrene 96-Well Plates | Corning | 3788 | |
| 1x Phosphate sodium saline | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| BRANSONIC Ultrasonic cleaner 1210 | Branson Ultrasonics Corporation | 1210 | |
| IBC materials: | |||
| 6-well tissue culture test plate | Techno Plastic Products | 92006 | |
| Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 3097358-1004 | Silicone Elastomer Kit |
| X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside) | Invitrogen | 15520-034 | Ultrapure |
| N, N-Dimethylformamide | Sigma Aldrich | D4551 | |
| MgCl2 (Magnesium chloride) | Sigma Aldrich | M8266 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750 | |
| Nonidet-P40 | Roche | 11754599001 | Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate (K-ferrOcyanide) | Sigma Aldrich | P3289 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) (K-ferrIcyanide) | Sigma Aldrich | 60299 | |
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医学、問題100、Erratum
Formal Correction: Erratum: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model
Posted by JoVE Editors on 08/18/2017.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. The Protocol section has been updated.
The ethics statement has been updated from:
Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20120216, which was approved 01/11/2013 and expires 01/11/2016. Overall care of the animals was consistent with The guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”
to:
Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20150226, which expires 12/10/2018. Overall care of the animals was consistent with The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”
Step 3 has been updated from:
3. Bacterial Inoculation
- Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
- Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder. - Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
- Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a 32 ounce glass jar containing a tea-infuser ball with cotton balls soaked with 3 ml of isoflurane or vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a jar or vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
NOTE: If glass jar with tea-ball and/or nose cone with isoflurane-soakd cotton balls are used, the animal must be carefully observed to avoid anesthetic overdose and death. The advantage of using a vaporizer and anesthesia chamber is that it provides controlled isoflurane administration that avoids accidental overdoses. CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation. - Remove the mouse from the jar/vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
- Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) or 50 ml conical tube with a cotton ball containing a small amount (approximately 1-2 ml) of isoflurane.
- Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
- Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle. - Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.
NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.
to:
3. Bacterial Inoculation
- Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
- Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder. - Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
- Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation. - Remove the mouse from the vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
- Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) to maintain anesthetization.
- Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
- Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle. - Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.
NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.
