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Medicine

마우스 모델의 설립 및 요로 감염 및 CAUTI의 특성

Published: June 23, 2015 doi: 10.3791/52892
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Microbiology and Center for Women's Infectious Disease Research, Washington University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Abstract

요로 감염 (UTI)는 매우 널리 사망률의 중요한 원인 및 항생제 치료에 점점 내성. 여성은 불​​균형 요로 감염에 의해 고통된다 : 모든 여성의 50 %가 일생에 요로 감염이있을 것이다. 또한, 초기 요로 감염 삶, 고통과 불편, 일상 활동의 중단의 질에 심각한 손상 몇 가지 고통 잦은 재발과 재발을 겪게 될 것이다이이 여자 20-40 %가 의료 비용이 증가하고, 몇 치료 옵션 다른 장기 예방 적 항생제보다. Uropathogenic 대장균 (UPEC)는 취득한 UTI 사회의 주요 원인균이다. 카테터 관련 요로 감염 (CAUTI)는 만 매년 미국에서 발생 극적인 의료 비용에 대한 회계 가장 일반적인 병원 획득 감염이다. UPEC도 CAUTI의 주요 원인이지만, 다른 원인이 에이전트는 엔테로 포함 증가 중요하다패 칼리스. 여기에서 우리는 이러한 인간의 질병의 임상 적 특성의 많은 요점을 되풀이이 잘 구축 된 마우스 모델을 사용한다. 요로 감염의 경우, C3H / 암탉 모델은 호스트 응답, IBC 형성과 filamentation을 포함하여 인간에서 관찰 UPEC의 독성의 많은 기능을 되풀이되었습니다. CAUTI, 방광 카테터 임플란트를 유지 C57BL / 6 마우스를 이용 모델의 경우, E.에 민감한 것으로 밝혀졌다 칼리스 방광 감염. 이러한 대표적인 모델은 신규 한 치료제 및 관리 또는 예방 전략의 개발을 주도하고 UTI 질환의 병인으로 현저한 새로운 통찰력을 얻기 위해 사용되고있다.

Introduction

요로 감염 (요로 감염)은 가장 흔한 박테리아 감염 중 하나와 UTI 취득한 취득, 사회와 원내의 메커니즘을 기반으로 두 개의 카테고리로 나눌 수있다. 지역 사회 획득 요로 감염은 종종 건강한 여성과 연구에서 발생하는 여성의 약 50 %가 평생 한 적어도 하나의 요로 감염이있을 것이다 보여 주었다. 또한 재발 주요 문제이다. 초기 급성 감염이있는 여성은 항생제 치료와 많은 여성들이 자주 재발이가 계속 적절한에도 불구하고 6 개월 이내에 두 번째 감염을 갖는 25-40%의 기회가있다. 이러한 감염을 일으키는 박테리아는 항생제 내성이 점점 더 혼란 치료 프로토콜 3-6가되고있다. 요로 감염은 질병의 영향과 보급을 강조, 미국에서 의료 관련 비용 약 25 억 달러의 비용이 수백만의 개인 매년에 영향을 미칠1,7 .Nosocomial는 주로 내주 카테터 등의 이물질의 존재와 관련된 요로 감염을 인수했다. 카테터 관련 요로 감염 (CAUTI)은 이러한 감염 8 70 ~ 80 % -를 차지, 요로 감염 획득 한 가장 일반적인 원내 남아있다. 또한, CAUTI은 이환율 및 사망률 증가와 관련 지을 수있어 이차 혈류 감염 (9)의 가장 흔한 원인이다.

요로 감염 인수 UPEC 관련 커뮤니티 성교, 빈약 한 위생 또는 다른 호스트 사이에 다른 미생물 집단 역학 동안 기계적인 조작을 통해 위장관에서 저수지에서 방광에 세균의 도입에 의해 발생하는 열을 틈새 생각된다. 일단 방광 내부 UPEC 캡슐, 철 수집 시스템, 독소, 병원성 플라스미드의 tRNA, 병원성 아일랜드 및 발병 기전에 중요한 역할을하는 것으로 나타났다 집락 인자 등 다양한 독성 인자를 채용 <SUP> 11-14. UPEC 식민지의 설립에 중요한은 UPEC는 입체 특이성 (15)와 수용체를 인식 접착제 보호자 안내 통로 (CUP) 필리 여러 유형의 인코딩. FimH의 어드와 팁 타입 1 필리는 UPEC로 표현하고 모두 인간과 마우스 방광 (18)의 내강 표면에 발현되어 uroplakins 16, α-1, β-3 인테그린 (17), mannosylated 바인딩합니다. 이 FimH 매개 상호 작용은 세균 식민지와 표면 상피 세포 (19, 20)의 침략을 용이하게한다. 하나의 세균이 빠르게 성숙시 ~ 10 4 박테리아 (21)를 포함 할 수있는 세포 내 세균 커뮤니티 (IBC)를 형성하기 위해 나눌 수있는 일단 세포 내부, UPEC는 세포질에 탈출 할 수 있습니다. IBC 형성은 적어도 6 다른 마우스 변종에서 증명되었다, C3H / 암탉, C3H / HEJ, C57BL / 6, CBA, FVB / 뉴저지와 BALB / c 및 다른 UPE의 다양한으로C 균주와 다른 장내 세균 22-24. 그러나 IBC 형성의 공간적 차이 마우스 배경 및 감염 UPEC 균주에 따라 다양 할 수있다. C3H에서 / 프로토 타입 UPEC에 감염된 암탉 마우스는 UTI89 종자 또는 CFT073, IBC 형성은 빠르면 3 HPI (시간 게시물 감염) 박테리아의 작은 바이오 매스로 시각화 할 수 있습니다. 이 커뮤니티는 확장을 계속하고 막대 모양의 세균이 말기 차별화 된 피상적 인 우산 세포의 세포질 공간의 큰 비율을 차지할 때 개발 약 6 HPI의 "중간 점"에 도달 비슷한 크기를 표시하는 대부분 비교적 동기 방식으로 이러한 초기 ibcs를 양식 및 형태학. ~ 8 HPI 간균에서 IBC 변화의 박테리아는 형태를 구균합니다. ibcs를 자연에서 일시적이다. 따라서, 세균 집단의 지속적인 확장에 12-18 HPI 결과에서 IBC 성숙, 세포 WI 받음으로써 filamentation 및 분산 뒤에인접 셀 (23) 이후의 확산을 토륨. 따라서, IBC 틈새 호스트 면역 반응과 항생제 (25)으로부터 보호하는 환경에서 빠른 세균의 성장을 허용한다. 마우스에서 보이는 UPEC 감염 구별 단계는 또한 인간에서 22,26-28 UTI를 모델링하기 위해 사용될 수있는 도구로서 유용 UTI의 마우스 모델을 지원하고 이러한 ibcs를 filamentation로서 인간에서 관찰된다.

여성의 대부분은 자신의 일생에 요로 감염을 경험하지만, 이러한 감염의 결과는 자주 재발 성 방광염에, 아니 재발 급성 자기 제한 감염에 이르기까지 다양 할 수 있습니다. 또한, 연구는 유전 적 요소가 요로 감염의 감수성 (29)에 기여 제안, 요로 감염의 강한 가족 발생을 보여 주었다. 우리는 병원에서 볼 수있는 다른 요로 감염의 결과가 근친 마우스 변종 (30) 사이의 실험 UPEC 감염의 다른 결과가 반영 될 수 있음을 발견했다. 예를 들어, C3H / 암탉, CBA, DBA 및 C3H / HeOuJ 생쥐 감염성 투여 량 의존적으로 지속적인, 높은 역가 박테리아 (> 104 콜로니 형성 단위 (CFU) / ㎖) 고역가 세균 특징으로 긴 지속, 만성 방광염에 취약 희생 방광 부담> 사주 후 감염 (WPI), 만성 염증 및 괴사 urothelial. 이러한 마우스는 만성 방광염의 개발을위한 바이오 마커로서 기능 제 24 HPI 내의 IL-6, G-CSF, KC, 및 IL-5의 높은 혈중 농도를 표시. 위약 연구는 요로 감염은 방광염의 첫 증상 후 몇 주 동안 소변에서 박테리아의 높은 수준을 유지합니다 경험 여성의 큰 비율은 항생제 치료 (31)을 부여하지 않을 경우 것으로 나타났습니다 이것은 정확하게, 일부 여성의 요로 감염의 자연 경과를 나타낼 수있다 32. 또한, C3H / 암탉 마우스를 사용하여, 우리는 만성 방광염의 역사는 이후 심한 재발 성 감염의 중요한 위험 인자 인 것으로 나타났다. 재발 성 요로 감염은 대부분의시입니다요로 감염 및 C3H / 암탉 마우스의 gnificant 임상 양상은 현재 이전 노출 후 증가 된 경향을 되풀이되었습니다 만 연구 모델이다. 두 번째 요로 감염의 결과는 급성 UPEC 감염 약 일주일 내 방광 염증과 세균의 해상도로, 자기 제한입니다 C57BL / 6 마​​우스에 효과적으로 요약된다. 흥미롭게도,이 모델에서, UPEC 쉽게 UPEC 잠재적으로 인간 (33)에 같은 변형 재발 성 요로 감염에 대해 하나의 메커니즘 (34)을 설명, 활성 요로 감염을 재개하기 위해 휴면 상태에서 신흥 할 수있는있는 방광 조직 내에서 대기 세포 내 저수지를 형성한다.

UTI에 감수성 유전자의 영향에 더하여, 방광 내로 카테터의 도입이 크게 감염을 갖는뿐만 아니라 감염을 일으킬 수있는 박테리아의 범위가 증가 할 가능성을 증가시킨다. 그것은 인간의 요도 카테터는 조직 학적 원인 것을 증명되었으며기계적인 강력한 염증 반응을 초래 스트레스, 각질 제거, 점막 고유 층과 submucusa, urothelial 얇아의 부종 및 요로 상피 및 신장 35, 36의 점막 병변에 방광의 면역 학적 변화. 또한, 카테터함으로써 CAUTI을 일으키는 여러 종에 의해 이용 환경을 만드는 세균 부착면을 제공한다. UPEC 여전히 주요 원인이지만, 엔테로 코커스 패 칼리스이 CAUTI (37)의 15 %를 차지한다. E.을 칼리스는 심각한 건강 문제 (38) 포즈, 저항의 출현을 반코마이신과 항생제에 점점 내성이되고있다. E.을 칼리스는 독소와 카테터 및 상피 (38) 모두에 부착에 필요한 adhesins 등 다양한 독성 요소를 가지고있다. 요도 카테터 동안 호스트는 요로 (39, 40)에 미생물 부착, 증식 및 보급에 취약합니다. E. faeca기구의 일부가 방광 및 지속 마우스 CAUTI 모델 (41)에 재생된다 신장에 보급하도록 LIS는 카테터에 생물막을 형성한다. 최근, 그것이 뇨 도관 중에 도시 한, 피브리노겐 (FG)는 염증 반응의 일부로서 방광 내로 방출된다. FG를 코팅 카테터, 방광에 축적와 E를 위해 필수적이다 칼리스 biofilm 형성, 첨부 파일의 발판 역할을. CAUTI의 C57BL / 6 마우스 모델에서는 발견 E. 칼리스의 생물막 카테터에 형성하고, 방광에 따라서 지속성, 특히 그 팁 어드의 EbpA EBP의 pilus에 의존했다. 우리는 EbpA의 N- 말단 도메인이 구체적으로 카테터를 코팅 FG에 결합 것을 발견했다. 또한,는 것을 알 수 있었다 E. 칼리스는 감염시 대사 소스, 따라서 biofilm 형성 (42)을 향상로 FG를 사 사용합니다.

마우스 모델은 언더에 중요한 입증tanding뿐만 아니라 요로 감염 및 CAUTI (41)의 임상 양상을 예측. 이 문서에서 우리는 방광염 UPEC의 접종 준비를 보여 UTI89와 C3H / 암탉 쥐의 요도 접종을 격리 할 것. 또한, 우리는 E.의 카테터 C57BL / 6 마우스에 삽입 및 접종을위한 프로토콜을 보여 칼리스 OG1RF 변형. 이러한 기술은 모두 마우스에서 일관성과 신뢰성을 요로 감염 또는 CAUTI로 이어집니다. 우리는 만성 또는 재발 성 방광염의 분석 급성 방광염과 소변 수집하는 동안 IBC 형성을 관찰하기 위해 사용되는 기술을 표시합니다. C3H / 암탉 마우스가 초기 세균 침입, IBC 형성, filamentation 및 만성 방광염 23,33,43의 개발 등 UPEC의 발병 기전의 양상을 연구하는 데 사용되었다. 이러한 독성은 다른 파라미터 마우스 배경 22,33 다양한 연구되어왔다. CAUTI 위해, C57BL / 6 모델 후속 세균 CO와 방광 내로 이물질 주입을 허용7 일간 유지 될 수 lonization는, 감염 (41)을 게시합니다. 이러한 모델은 이후에 효과적으로 요약 임상​​ 인구에서 관찰 된 많이있는 호스트 응답을 파괴하는 세균 독성 메커니즘, 요로 감염에 대한 숙주 반응과 메커니즘을 평가하는 데 유용합니다.

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Protocol

윤리 문 : 워싱턴 대학 동물 연구위원회는 2013년 1월 11일을 승인 2016년 1월 11일 만료 된 프로토콜 번호 20120216,의 일환으로 모든 마우스 감염과 절차를 승인했다. 동물의 전반적인 관리는 국가 연구위원회 및 미국 농무부 동물 관리 리소스 가이드에서 실험 동물의 관리에 대한 가이드 및 사용과 일치했다. 안락사 절차와 일치한다 "동물 2013 판의 안락사에 대한 AVMA 지침."

1. UPEC 요로 감염 프로토콜, 접종 바늘 준비 (그림 S1)

  1. 30 G 바늘의 뚜껑을 제거합니다. 바늘의 샤프트에 PE10 튜브의 약 1 인치 스레드. 밤새 바늘 조립체 UV 살균. 카테터 바늘은 멸균 페트리 접시에 무기한 저장 될 수 있습니다.

2. UPEC 세균 접종 준비

  1. UTI89 접종을 준비 (접종하기 전에 72 시간을 시작합니다기 일)
    1. 냉동 재고 LB (루리아 - 베르 타니) 한천 판에 킬 UTI89. 37 ° C에서 밤새 품어. 식민지를 선택하고 125 mL의 플라스크에 LB 10 ㎖로 접종. 정적으로, 24 시간 동안 37 ° C에서 품어.
    2. 정적으로, 37 ° C에서 추가로 24 시간 동안 새로운 125 mL의 플라스크에 LB 10 ㎖로 하룻밤 문화의 10 μl를 접종한다.
    3. 이전 3 ml의 3 분 7,000 XG에 멸균 1.5 ml의 튜브와 원심 분리기 (주 원하는 접종의 크기에 따라 달라집니다) 및 1X PBS의 펠렛 및 원심 분리기 두 번째로 재현 탁. 1X PBS 1 ㎖에 박테리아 펠렛을 재현 탁.
  2. 세균 광학 밀도를 측정하고 원하는 접종 밀도 농도를 조정합니다. 사용 접종원 표준 농도는 10 7 박테리아이고; 그러나,이 연구의 디자인으로 인해 변할 수있다.

3. 세균 접종

  1. 70 % 에탄올과 C와 워크 스테이션을 청소(멸균 흐름 후드를 사용하거나) 흡수 용지 면적에.
  2. 1 ㎖ (TB) 주사기에 준비된 박테리아 접종원 0.9 ㎖의 최대 그리기 (기포 제거). 다음 무균 폴리에틸렌 튜브를 트림, 접종을 포함하는 주사기에, PE10 튜브와 준비 멸균 접종 바늘을 연결합니다.
    참고 : 방광 천공 방지하기 위해 바늘의 끝 위에 튜브의 1mm를 남겨주세요.
  3. 파라 필름의 1 인치 정사각형 조각을 잘라 위에 수술 윤활유의 소량 (한푼의 약 크기)를 넣습니다.
  4. 까지 (프로토콜 제조 다음) 이소 플루 란 또는 기화기 챔버의 3 ㎖로 적셔면 공 차 주입기의 공을 포함 32 온스 유리 항아리를 넣어 여성 C3H / 암탉 쥐를 마취 의식이 여전히 정상적으로 호흡 (1 숨 / 초) .
    참고 : 일부 IACUC위원회는 항아리 또는 기화기의 사용을 승인하지 않습니다. 교육 기관의 IACUC위원회의 지시를 따르십시오.
    참고 : 만약 유리 항아리이소 플루 란-soakd면 공을 사용하는 차 공 및 / 또는 코 콘, 동물 신중 마취제 과다 복용과 사망을 방지하기 위해 준수해야합니다. 기화기 마취 실 사용의 장점은 우발적 과량 이소 플루 란을 회피 제어 관리를 제공한다는 것이다. 주의 :이 아이소 플루 란 흡입 마취제이다. 통풍이 잘되는 장소에서 사용하고 흡입을 최소화 할 수 있습니다.
  5. 항아리 / 기화기에서 마우스를 제거하고 종이 타월에의 뒷면에 배치하고, 다리를 확산.
  6. 노우즈 콘 마우스 코 소량 함유 코튼 볼 (약 1-2 ㎖로 또는 50 ㎖ 원뿔형 튜브 (제어 isoflurance의 일부 증발기 유닛에 장착되어 용량을 제공 증발기 접속 관)을 커버 ) 이소 플루 란의.
  7. 가볍게 배뇨를 유도하고 무효화 방광을 보장하기 위해 방광 두근 거리다. 100 % 에탄올을 닦아 요도 주위 부위를 닦아주십시오. 에 먼저 접종 바늘 / 주사기, 포인트를 DAB수술 윤활제.
  8. , transurethrally 접종 바늘을 삽입하는 약 12​​mm, 방광 부드럽게 (10 μL / 초)에 접종을 분배 부드럽게 주사기 플런저를 아래로 눌러 박테리아 용액 50 ㎕를 각 마우스를 접종한다. 마우스에서 접종 바늘을 제거합니다.
    참고 : 접종하기 시작 요도 구멍에서 접종의 즉시 반환 바늘의 부적절하거나 불완전한 삽입을 나타냅니다.
  9. 코 콘에서 마우스를 제거하고 그 케이지로 돌아갑니다. 반복 각 마우스에 대한 3.3-3.8 단계를 반복합니다. 접종 조건 / 균주를 전환하는 경우시 / 승인 된 날카로운 물건 용기에 주사기와 접종 바늘 폐기하고 다시 3.2 단계를 시작합니다.
    참고 : uropathogenic 생물 접종 일반적으로 심한 통증 증상을 유발하지 않습니다. 그러나, 드문 경우에, 병원체의 많은 양을 투여하면 발열, 음식과 물을 섭취하고 비정상적인 행동의 감소의 원인이 될 수 있습니다.nimal 건강은 실험을하는 동안 모니터링해야한다. 명백한 통증 증상이 통지, 같은 부 프레 놀핀 (0.05-0.1 ㎎ / ㎏ 주어진 피하)과 같은 진통제, 경우에 적용 할 수 있습니다. 절차는 각 기관의 IACUC에 따라야한다.

세균 부담 4. 결정

  1. 각 방광과 신장 쌍의 수확을 위해 별도의 5 ml의 튜브를 준비합니다. 1X PBS / 튜브 / 마우스 방광의 1ml를 추가하는 수확한다. 1X PBS / 튜브의 0.8 ML을 추가 / 마우스 신장의 쌍은 수확한다. 주어진 마우스에 해당하는 각각의 튜브 레이블. 1시 10분 계열 희석 각 웰에 1X PBS 180 ㎕를 함유하는 96 웰 플레이트를 준비한다.
  2. 70 % 에탄올로 작업 영역을 청소하고 흡수성 커버 또는 종이 타월로 영역을 커버한다.
  3. 마우스가 약 1 분간 호흡을 멈출 때까지 이소 플루 란으로 마우스를 마취 한 후 흡수 커버 또는 종이 수건에 배치, (단계 3.4 참조). euthana의 다른 방법SIA는 이산화탄소와 같은 IACUC위원회에 의해 승인되고, 이소 플루 란과 과량으로 대체 될 수있다.
  4. 머리의 기지에서 목을 억제하고 수평으로 떨어져 몸에서 탈구가 발생할 때까지 꼬리를 당겨으로 구성되어 빠른 자궁 전위에 의해 마우스를 희생.
    주 : 대부분의 IACUC위원회는 안락사와 자궁 경부 전위의 보조 수단을 필요는 일반적인 방법입니다. IACUC위원회에 의해 승인 된 경우에는 다른 방법이 사용될 수있다.
  5. 그 뒷면에있는 죽은 마우스를 놓고 복부에 70 % 에탄올을 스프레이. 마우스를 해부, 신장 해부 다음 혈액 잠재적 오염을 최소화하기 위해 순서대로, 방광과 신장을 수확. 1X PBS를 함유하는 준비된 5 ㎖ 튜브에 독립적 기관을 배치한다 (단계 4.1 참조).
    참고 : 외부 해부과 장기 적출이 오염을 최소화하기 위해 다른 가위를 사용합니다.
  6. 장기 T에 보장하기 위해 관을 누릅니다그는 PBS를 1 배. 각 마우스 단계를 반복 4.3-4.5. 청소 위 및 각 마우스 후 70 % 에탄올에 집게.

5. 세균 복구

  1. , 조직 균질와 신장 당 15 초 방광 당 30 초를 5 ml의 튜브에 수확 방광과 신장을 균질화. 1X PBS, 70 % 에탄올과 샘플 사이의 1X PBS로 균질화 순차적 헹군다.
  2. 10-8 밖으로 시리얼 1시 10분 희석을 확인하고 LB 아가 플레이트에 CFU 각 희석 (콜로니 형성 단위) 판. 37 ° C에서 접시를 밤새 품어과 식민지 다음날을 계산합니다.

6. IBC 열거

  1. 무균 방광을 제거하고 실리콘 바닥 6 웰 플레이트에 1X PBS에 넣습니다. 플레이트를 실리콘 엘라스토머 키트를 사용하고 각 웰에서 약 1cm 실리콘 쏟아지는 제조 할 수 있고, 참조는 지시를 제조한다. 가위를 사용하여 반으로 방광을 잘라.
  2. 작은 금속 핀을 사용하여 부드럽게 BLAD 스플레이데르되도록 블래 루멘은 위를 향하고있다. 요로 상피의 최대 양이 노출 보장하기 위해 방광 섹션의 가장 바깥 쪽 가장자리에 핀을 배치해야합니다.
  3. 플레잉 후, 부드럽게 1X PBS로 한 번 방광을 세척한다. 피펫으로 1X PBS를 제거합니다. 전체 스플레이 방광을 커버하기에 충분한 3 % 파라 포름 알데히드를 첨가하여 방광을 수정. 주의 : 파라 포름 알데히드는 발암 물질입니다. 장갑을 포함하여 적절한 보호 장비는 항상 착용해야합니다. 폐기 기관 지침을 따라야합니다.
  4. 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션. 파라 포름 알데히드 용액을 제거합니다. 1X PBS로 한 번 씻는다.
  5. (PBS 1X 2 mM의의 MgCl 2, 0.01 % 나트륨 데 옥시 콜레이트와 0.02 %의 nonidet-p40in) LacZ를 세척 용액 세척 당 5 분간 3 회 세척 할 것.
  6. 충분히 LacZ를 얼룩을 세척 용액을 제거하고 추가 (9.5 ml의 LacZ를 세척 용액, 0.4 ㎖의 25 ㎎ / ㎖ X-여자 100 mM의 K-페로 / K-페리 시안화 0.1 ㎖)을 방광을 포함한다. 30 ° C의 overni에서 품어빛으로부터 보호 GHT.
  7. 인큐베이터에서 벌어져 방광을 제거하고 해부 범위, 40-60X 확대와 시각뿐만 푸른 puncta에 나타납니다 ibcs를을 관찰합니다.
    참고 : 때때로 마우스가 요도에서 튜브를 배치하기 전에 소변을 수 있습니다. 이 경우, 다시 소변을 수집하기 전에 15 ~ 20 분 정도 기다린.

7. 소변 세균 CFU 열거 컬렉션 (CAUTI 해당 사항이 없습니다)

  1. 소변 사전을 수집하거나 감염을 게시 부드럽게 (마우스 케이지의 위) 꼬리를 잡고 평평한 높은 표면에 배치하여 마우스를 억제.
  2. 마우스 요도에서 멸균 1.5 ML 튜브를 잡고. 부드럽게 방광에 압력을 적용 꼬리 근처 마우스의 뒷면에 누르십시오. 1.5 ML 튜브에 소변을 잡아라.
  3. 10 -7 밖으로 시리얼 1시 10분 희석을 확인하고 적절한 (LB)에 각 희석 판 37 ° C에서 접시를 밤새 품어과 식민지 다음날을 계산합니다.

8. CAUTI 모델 프로토콜, CAUTI 모델 카테터 바늘 준비 (그림 S2)

  1. 30 G 바늘의 뚜껑을 제거합니다. PE10 튜브 및 RenaSIL 같은 실리콘 튜브의 5mm 조각의 7mm 조각을 잘라. 튜브는 바늘의 기초에 닿을 때까지 PE10 튜브와 바늘을 스레드.
  2. 그런 다음 PE10 함유 바늘에 5mm 조각을 공급. 하룻밤 바늘 어셈블리를 살균 UV.
    참고 : 실리콘 튜브를로드 할 때 바늘 끝을지나 확장 튜브의 약 1mm를 둡니다.

9. E. 패 칼리스 OG1RF 세균 접종 준비

  1. 접종 일 이전에 48 시간을 시작 OG1RF 접종을 준비합니다. 냉동 재고 비에이치 아이 (뇌 심장 주입) 판에 킬 OG1RF.
  2. 식민지를 선택하고 BHI 10 ㎖로 접종하고 37 ℃에서 18 시간 동안 정적으로 성장합니다. 문화를 원심 분리기 및 멸균 1X PBS 1 ml의 볼륨에 펠렛 (3 회)을 씻는다.
  3. 1X PBS에 박테리아 펠렛을 재현 탁. 세균의 광학 밀도를 측정하고, 원하는 크기로 접종 농도를 조정한다. 사용 접종원 표준 농도는 107이고; 그러나,이 연구의 설계에 따라 다를 수

(10) 카테터 주입

  1. 70 % 에탄올로 워크 스테이션을 청소하고 흡수 커버 영역을 커버 (또는 멸균 흐름 후드를 사용).
  2. 빈 1 ㎖ (TB) 주사기에 카테터 바늘을 연결합니다. 파라 필름의 1 인치 정사각형 조각을 잘라 위에 수술 윤활유의 소량 (한푼의 약 크기)를 넣습니다.
    주 : 두 개의 다른 바늘 인해 카테터 주입에 필요한 기계적 조작에 카테터의 증착을 위해 최소화 우발적으로 접종 접종에 사용된다. 이것은 또한 더 적은 접종 바늘의 제조의 편의를 위해 허용한다.
  3. 차를 포함 32 온스 유리 항아리를 넣어 C57BL / 6 마​​우스를 마취이소 플루 란 또는 기화기 챔버의 3 ㎖에 배어 목화 공 -infuser 볼 의식이 여전히 정상적으로 호흡 (1 숨 / 초)까지 (다음은 프로토콜을 제조).
  4. 그런 다음 종이 타월에 그 뒷면에 마우스를 놓고 다리를 확산. 소량의 이소 플루 란의 (약 1 ~ 2 ml)에 포함 된 목화 공 코 콘 50 ML 원뿔 튜브와 마우스의 코를 커버.
    주의 :이 아이소 플루 란 흡입 마취제이다. 통풍이 잘되는 장소에서 사용 및 연구자에 의해 흡입을 최소화 할 수 있습니다.
  5. 가볍게 배뇨를 유도하고 무효화 방광을 보장하기 위해 방광 두근 거리다. 100 % 에탄올로 닦아 요도 주위 부위를 닦아주십시오.
  6. 면 팁 어플리케이터를 사용하여 10 % 포비돈 요오드 용액으로 요도 주위 영역을 소독. 수술 윤활제로, 우선 접종 바늘 / 주사기, 포인트를 DAB.
    참고 : Povidine 요오드 알코올보다 더 강한 무균 솔루션 카테터 주입에 사용됩니다. 카테터 주입이 필요더 기계 조작 카테터 및 오염 때문에 더 큰 잠재력을 삽입합니다.
  7. 요도 개구부에 카테터를 삽입합니다. 한 번에 사용 핀셋 결과적으로 (5mm 실리콘) 작은 카테터를 밀어 방광으로 증착, 방광쪽으로 (7mm의 PE10) 긴 조각을 밀어. 바로, 여전히 부착 된 7mm 튜브와, 바늘을 제거합니다.

11. 세균 접종

  1. 코 콘에서 마우스를 제거하고 그 케이지에게 반환 9.에서 준비 접종을 사용하여, 제 3의 세균 접종 프로토콜을 따라

희생의 각 시간 시점에서 (12)

  1. 방광과 신장 5 ml의 튜브 (장기 단계 4.1에 따라 용) 및 카테터 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브를 준비합니다. 카테터 시료 1.5 mL의 에펜 도르프 튜브로 1X PBS 1ml를 추가
  2. 단계 4.5에 4.3을 따릅니다. 방광, 신장과 카테터를 수확, 마우스를 해부, PLA1X PBS 및 1.5 mL의 에펜 도르프에 카테터 (단계 12.1 참조)를 함유하는 5 ㎖ 튜브에 독립적 조직을 향하도록.
    참고 : 외부 해부과 오염을 최소화하기 위해 장기 적출 및 카테터 검색을 위해 다른 가위를 사용하여
  3. 단계 4.6를 따릅니다.

13. 세균 복구

  1. 기관의 경우, 단계 5.1 및 5.2을 따릅니다. 30 초 동안 최대 속도로 세균 카테터 회복, 소용돌이를 들어, 5 분을 추가로 30 초 동안 최대 속도로 후 소용돌이 욕조 초음파 처리기를 사용하고 대한 카테터 샘플을 초음파 처리.
  2. 10-8 밖으로 시리얼 1시 10분 희석을 확인하고 비에이치 아이의 접시에 CFU 열거 각 희석 접시. 하룻밤 37 ºC에서 접시를 품어과 식민지 다음날을 계산합니다.

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Representative Results

복잡하고 카테터 관련된 요로 방광 모델은 이러한 일반적인 비싼 감염을 관리하는 세균성 병인, 숙주 조직에이 질병의 영향 및 개발 및 신규 한 접근법의 테스트 분자 메커니즘을 밝히기위한 유연한 플랫폼을 제공한다. 마우스 변형 및 병원체에 따라, 방광 접종 급성 시작 또는 변조에 필요한 요소 (그림 1, 3), 만성 또는 재발 성 (그림 2) 방광염을 규명하기 위해 호스트 병원체 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 1에 표시된 데이터는 전형적인 UPEC 방광염에 의한 급성 단계 (24 HPI) 요로 식민지의 대표 UTI89 (44)을 격리 할 것. 접종 후, 감염은 24 생쥐가 희생되는 시점에서 시간과 균질화 방광 및 신장 조직 개발을 위해 사용할 수 있습니다. 조직 균질 직렬 dilut 아르발기 부전과 식민지 박테리아의 열거 도금. 만성 UPEC 정착과 방광 염증 설립 및 감염 량 및 uropathogen 의존적으로 일부 마우스 라인 (특히 C3H / 편)에서 유지 될 수있다. 만성 방광염은 지속적인 높은 역가의 세균으로 정의된다 (> 10 4 CFU / ㎖), 방광 염증과 ​​높은 역가 세균 방광 부담 (> 10 4 CFU / 방광)의 희생 (33)에서. 도 2에 도시 된 데이터는 UTI89 2 X 107 CFUs와 C3H / 암탉 마우스의 접종 후 4 주 일어나는 대표적인 CFUs이다. 마우스의 나머지 50-80%가 감염을 해결하면서 이들 실험 조건하에 감염된 쥐 20 ~ 50 %가 만성 방광염을 개발한다. 결과의이 이중성은 처음 24 HPI 내에서 결정된다 호스트 병원체 검사 점에 따라 달라집니다. 에 명시하기 시작 세균 역가의 관찰 바이 모달 분포의 체크 포인트 결과의 활성화 (또는하지 않음)희생 28 dpi 해상도에서 3 dpi의 (일 게시물 감염)과 방광에서 소변 (그림 2) (33). 초기 감염은 항생제 치료 (33) 클리어 후 만성 방광염의 역사를 가진 마우스는 상당히 도전에 재발하는 만성 방광염에 걸리기된다. 마찬가지로 UTI의 역사는 인간 재발 UTI에 대한 공지 된 위험 인자이다. 따라서,이 재발 UTI의 발병 기전을 연구하는 데 유일하게 알려진 모델이다. 실험적으로 대체 마우스 배경에 UTI를 모델링 할 때, 마우스 균주 일부 균주 다소 저항성 증후군이 33을 개발하는 것을 감안 UTI, 재발 또는 CAUTI UTI에 감염 여부를 결정하는 것이 중요하다.

급성 방광염의 추가 측정은 IBC 열거입니다. IBC 형성은 말기 차별화 된 피상적 인 우산 세포로 제한됩니다. IBC 정량 급성 낭종 동안 세균 부담의 정보를 측정ITIS 및 ibcs를 높은 수준의 만성 방광염 21 발병 위험과 연관. IBC 형성은 질병의 급성 단계에서 발생한다. 피상적 인 우산 세포의 각질 제거 후, ​​ibcs를 관찰 더 이상 없습니다. C3H / 암탉 요로 감염 모델에서, ibcs를가 transurethrally 방광에 UTI89의 ~ 1 × 10 7 CFU를 접종 한 후 6 시간 측정 할 수있다. 방광은 실리콘 판에 금속 핀 스플레이와 LacZ를의 표현 염색. LacZ를, β - 갈 락토시다 아제, 즉 절단 일반적으로 표현 박테리아 효소 갈락토스와 다른 당 사이의 β 결합. 이 효소 절단에 청색을 생성 X-GAL, β - 갈 락토 시드 유사체를 공급함으로써 박테리아를 검출하는데 사용될 수있다. 염색 후, 방광이 점을 (그림 3A)를 계산하여 열거 할 수 ibcs를가 요로 상피와 ibcs를에 punctae 파란색 / 보라색 점으로 표시와 해부 현미경으로 몇 군데 있습니다. 하는 동안의 수동물마다 형성 수익 증권은 방광 (그림 3B)별로 볼 수 있습니다 C3H / 암탉 배경에, ~ 50 ibcs를 평균 다릅니다. 용량 의존적으로 ibcs를 증가. 형성 ibcs를 수는 UPEC 및 마우스 배경 균주 사이에 다릅니다. 예컨대, C57BL / 6, 방광 당 수백 ibcs를 형성에서 ~ 1 × 10 7 UTI89 결과 접종한다.

요로 감염 인수 복잡하지 않은 사회가 위의 모델 외에도, 히스 케어 관련 요로 감염은 의료 시스템에 상당한 부담을 나타냅니다. 요로 감염은 모든 의료 관련 감염의 약 40 %를 대표하고 모든 의료 관련 요로 감염의 최대 95 %는 카테터 (45)을 연결되어 있습니다. 여기에서 우리는이 어려운 임상 문제의 실험 분석을위한 강력한 시스템을 나타냅니다 CAUTI의 방광 이식 마우스 모델을 보여줍니다. 도 4에 제시된 데이터는 모델 E. 24 시간 감염 대표 패 칼리스의 OG1RF을 훈련. 1 × 10 7 OG1RF의 CFU가 intravesically unimplanted 방광에 접종하는 경우, 감염이 24 HPI (그림 4A)에 의해 삭제하려면 시작 3 dpi로하여 감염 (41) 해결했다. 반대로, 주입 방광 unimplanted 블래 관찰보다 24 HPI 10 배 높은 방광 정착 수준 카테터 및 방광 모두 집락 결과로 OG1RF 접종 (도 4a 및도 4b). 또한이 감염은 카테터 손실 약 41 dpi의 7까지 방광> 106 CFU로 유지된다. 설명 된 실험 모델은 모두 포함하지만 감염된 조직 및 표면의 육안과 현미경 화상에 대한 다양한 접근 방법이 변경 접종 크기 및 질병 배, 경쟁력 감염 배타적이지 실험 고도의 유연성에 순종하며, 면역 학적 분석을 호스팅 .

ve_content "> 그림 1
그림 1 :. 24 시간 요로 식민지 여성은 7 ~ 8 주령의 C3H / 암탉 마우스 transurethrally 원형 UPEC의 방광염의 ~ 2 × 10 7 CFU 24 시간 동안 UTI89을 분리 접종 하였다. 수확 된 방광 및 신장 조직으로부터 회수 주제 CFUs는 N, 도시 = 5. 점선은 검출 (20 CFU)의 하한을 나타낸다.

그림 2
그림 2 :. 이십팔일 요로 식민지 여성은 7 ~ 8 주령의 C3H는 / 암탉 마우스 transurethrally ~ 2 × 10 7 CFU UTI89 접종 하였다. 소변은 지정된 일 포스트 감염 (dpi)로에서 수집했고 CFU 열거를 위해 도금. 주제 이십팔일 방광 및 신장 역가도 표시되어, N = 8의 검출 소변 CFU 하한 (1000 CFU / ml)을 점선으로 표기된다. 점선 represen검출 TS 조직 하한, 20 CFU / 조직.

그림 3
그림 3 :. IBC 열거 여성이 7 ~ 8 주령의 C3H이 / 암탉 마우스가 transurethrally ~ 1 × 10 7 CFU UTI89 접종 하였다. 방광은 6 HPI 수확 및 IBC 염색에 대한 벌어져 있었다. LacZ를 염색 후 벌어져 방광의 (A) 이미지. ibcs를 파란색 점으로 표시됩니다. 삽입 된 이미지는 블랙 박스에서 이미지의 디지털 섹션의 배율이다. (B) 6 HPI C3H / 암탉 마우스 형성 ibcs를 대표 번호, N = 10.

그림 4
그림 4 : E. 칼리스 카테터 관련 요로 감염. C57BL / 6 마우스 또는의 ~ 1 × 10 7 CFU와 카테터없이 접종 (A) E. 패 칼리스 존재 또는 카테터의 부재에서 방광 식민지. (B) E. 칼리스 카테터 식민지. 맨 - 휘트니 U 테스트는 마우스 실험에 사용 된, P <0.05는 통계적으로 유의 한 것으로 간주 하였다. **, P <0.005.

그림 (S1)
도 S1 :. UTI 접종 바늘 준비 다이어그램 바늘에 카테터 (1), 쓰레딩 필요한 물질을 포함 접종 니들 준비 단계를 디스플레이 (2)에 접종하기 전에 튜브를 트리밍 (3).

그림 (S2)
그림 (S2) :. CAUTI 접종 바늘 준비 다이어그램 접종 카테터 (1), 스레딩 필요한 접종 바늘 준비 자료를 표시합니다 (2) 주입 카테터에바늘 (3).

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Discussion

복잡하지 않은 사회는 요로 감염은 수백만 일차 진료 방문 매년 46를 차지 일반적이고 비용이 많이 드는 감염 인수했다. 또한, CAUTIs 더 이상 CAUTI 45 획득 한 병원에서 결과 처리의 추가 비용을 공급자를 상환 메디 케어와 메디 케이드 서비스 센터 등의 건강 관리 서비스 공급자에 매우 비용이 많이 드는 될 수 없다 일반적인 의료 획득 감염이다. 이러한 프로토콜에 설명 UTI 모두 단순한 방광염 및 CAUTI의 마우스 모델은, 개시, 유지 관리 및 UTI의 여러 형태의 결과를 변조하는데 필요한 호스트 및 병원체의 상호 작용 분자 기초를 이해하는데 귀중한 도구를 제공한다. 이러한 모델은 UTI 23,47-49의 분석에 강력한 박테리아 및 마우스 유전학, 면역학, 현미경, 생화학 적 및 유전 적 화학 도구 애플리케이션에 허용한다. 또한, 프로토콜은 여기에 설명 된 플랫폼을 제공하고 있습니다개발 및 세균 독성의 작은 분자 억제제 및 새로운 예방 접종 대상 및 전략 50-55을 포함한 새로운 치료 및 예방 전략의 테스트.

단순한 방광염 모델의 성공적인 적용을 위해 유지되어야 여러 중요한 조건이있다. 모든 마우스를 마취 절차와 마찬가지로, 케어 인한 오버 마취 마우스 사망을 방지하기 위해주의해야한다. 접종 카테터를 준비 할 때, 실리콘 튜브는 너무 오래 카테터에 방광의 벽을 손상에 관해서는 충분히 바늘의 끝 부분을 커버하는 긴하지만해야합니다. 또한, 질구 부근과 크기로 인해, 치료는 요도 아닌 질로 접종 카테터를 삽입하도록주의해야한다. IBC 열거 대한 방광 플레잉 동안, 블래 더는 아프로 대해 고정 될 수있다 다음 해부 조직 빨리 스플레이 것이 필수적ximately 1 시간 아니지만 밤새. LacZ를 염색으로 IBC 열거 들어, 당해 세균 urothelial 세포 콜로니 중 LacZ를 생산하는 것이 필요하다. LacZ를 효소가 생산되지 않는 균주를 사용하면,이 항 ibcs를 E.으로 면역 형광 현미경을 사용하여 열거하는 것이 여전히 가능하다 대장균 항체 또는 GFP 표현 박테리아. 이 모델의 하나의 특정 기능은 질병의 진행 및 다른 근친 마우스 라인 제시 정도의 서로 다른 패턴과 UPEC는 33,56 균주 원형의 다양한 병원성 가능성이다. 그들은 실험 설계 및 해석 57, 58을 복잡하게하면서 임상 적 및 표현형 연구에서 관찰 된 호스트 감수성과 병원균 다양성의 자연 변화를 요점을 되풀이 이러한 차이는 강도와이 기술의 제한을 둘 수 있습니다. 이러한 변화는 호스트와 세균 mechan의 해명을 허용 비교의 원인을 제공ISMS는 단순한 요로 감염 33,56의 발병을 조절. 그러나, 그들은 또한 마우스 라인 요로 감염 감수성의 변화도 때문에, 최대한의주의가 조사가 요구되는 특정 문제를 해결하기위한 올바른 마우스 라인과 UPEC의 피로를 선택할 때주의해야, 것을 의미한다. 예컨대, C57BL / 6 마​​우스는 초기 시간 지점에서 높은 세균 역가 및 ibcs를 다수 제시하는 급성 감염의 우수한 모델이다. 이 균주는 빠르게 심각한 신장 감염과 대기 세포 내 저수지 33, 34의 결과 만 지속적 식민지와 3과 7 dpi의 사이의 감염을 해결합니다. C57BL / 6 모델은 정확하게 한 후 현재와 증상이 해결되는 많은 요로 감염 환자에 대한 가장 일반적인 결과를 나타낼 수있다. 반대로, C3H / 암탉 마우스 배경 그들에게 재발 성 요로 감염 연구를위한 이상적인 변형을 만성 방광염에 대한 감수성의 높은 수준을 나타낸다. 기타 요로 감염 모델은 설립되어CBA에서, DBA 및 C3H / HEJ 마우스 배경 요로 감염 33,59의 특정 측면을 연구하는 데 유용 증명. 단순한 방광염 모델에 의해 전시 된 차 실험 단점은, 급성 만성 재발 성 방광염 (60)에 필요한 새로운 세균 요인의 발견을위한 대규모 유전자 검사 방법의 적용을 제한하는 여러 감염 병목 현상의 존재입니다.

단순한 방광염 모델에 대한 중요한 고려 사항은 모두 두 개의 추가 우려 임플란트 기반 CAUTI 모델에 적용됩니다. 우선, 케어 임플란트의 삽입으로 인해 임플란트에 의해 부여 방광 감염에 대한 감수성 증가로 살균 방식으로 일어나는 것을 보장하기 위해주의해야한다. 둘째, 카테터는 주입 바늘의 제거 동안 제 위치에 유지되는 것이 필수적이다. CAUTI 모델의 주요 제한은 사용 가능한 호스트 유전 적 배경의 감소 범위를 가지고, 홍보입니다카테터 시간이 지남에 따라 손실과 무능력에 대한 opensity 인해 주입으로 인한 방광 기능 장애에 소변을 수집합니다. 임플란트 손실 길이 소변 검사를 통해 감염을 모니터링 할 수없는 보상하기 위하여,이 모델은 일반적으로 원하는 각 시점에서 희생되어야 나중 시점과 쥐 그룹 쥐 카테터의 더 높은 번호를 필요로한다. 이러한 C3H / 암탉 같은 일부 마우스 변종, 임플란트를 잃게되는 금지 주파수에서 제한된 호스트 유전 적 배경 결과 (P. Guiton, 개인 통신 2010). 결과적으로, 상술 CAUTI 프로토콜들은 전적으로 C57BL / 6 마​​우스 균주에 최적화되었다. CAUTI 가능한 마우스 균주 제한 불행 동안 그러나, 많은 유전자 변형 C57BL / 6 배경에서 설립되었고 CAUTI 모델 유기체 집락을 용이하게하기 위해 방광 환경을 변경하여 UTI 동안 연구 가능한 세균의 다양성을 확대하는 아르요로 감염의 쥐 모델에서 다른 비 병원성. 이것의 예는, E.에서 방광의 카테터 유도 염증 동안 방출 Fg 상기의 역할 최근 발견이다 CAUTI 42시 칼리스 성장, biofilm 형성 및 지속. 이 예는 세균 분자 기전의 메커니즘뿐만 아니라, 감염 동안 숙주 인자의 역할뿐만 아니라 아는데 CAUTI의 이식 모델의 능력을 나타낸다. 이러한 모든 기능은 이전에 파악 하였다 된이 관련 임상 감염, 이해에 기여한다.

전술 한 실험 방법 외에 단순한 방광염 및 CAUTI의 마우스 모델은 방법 론적 변형 다수 의무가있다. 단순한 방광염 모델의 경우에, 이러한 수정은 박테리아의 수를 줄이기 위해 접종 부피 접종원 점안시에 가해지는 힘을 감소 포함 할상기 감염의 변하는 지속 시간에 이르면 한 HPI 같은 시점에서 희생 및 정도를 평가하기 위해 겐타 마이신 보호 분석을 사용하여, 신장 (61) 내로 도입은 uropathogen 방광 상피 세포 (62)를 침범한다. 또한 절단 및 다양한 호스트 및 / 또는 세균의 항원에 대한 항체로 염색하고 형광 공 초점 현미경으로 관찰 할 수 HPI (6) 사이에 24 생쥐에서 벌어져 방광은 IBC 구조, 박테리아 플럭스 및 filamentation 및 호스트 조직 상태 25,33을 관찰하기 위해 희생 , 63, 64. 호스트의 로컬 및 전신성 면역 반응에 uropathogen 감염 및 / 또는 주입의 효과는 각각 33,65 소변이나 혈청 사이토 카인 수준을 결정하기 위해 Bioplex 유세포 비드 시스템 또는 ELISA 기초 분석을 이용하여 평가 될 수있다. 마지막으로, 방광 조직, 위치 및 식민지화 박테리아의 형태학 및 생물막의 구성 조건에 증착카테터 전자 현미경 25,41 등 다양한 이미징 기술에 의해 평가 될 수있다.

감염이 기본적인 모델은 또한 재발 UTI 복수 감염을 통해 적응성 면역 반응의 발달을 포함하는 다른 임상 적 현상을 모방하도록 구성 될 수있다. C3H / 암탉 모델에서 항 미생물제의 투여를 통해 감염의 클리어런스이어서 만성 방광염의 종래 개발 만성 방광염을 개발하기 위해 이들 마우스를 민감하게하면서 이런 맥락에서, 급성 방광염에 저항을 증가 C57BL / 6 마​​우스 결과 감염을 반복 이후의 예방 접종 (66)에. 또한 UTI의 위험 인자의 분자 메커니즘은 조사 할 수있다. 당뇨병 및 비만 모두 요로 감염의 빈도 및 심각도를 증가시키는 것으로 나타났다. 2 형 당뇨병은 유전 FVB / 뉴저지 배경 생쥐에서 모델링 할 수 있으며, 제 1 형 당뇨병의 화학적으로 유도 된 모델을 벌써하고있다Y는 UPEC 및 K. 모두에 의한 요로 감염의 심각성이 증가하는 것으로 나타났다 뉴모 필라 (67, 68).

마지막으로,이 모델 시스템은 요로 감염의 치료 또는 예방과 CAUTIs 목표 치료 양식의 개발 및 최적화를위한 이상적인 증명 접지를 나타낸다. 이들 모델에 의해 제공되는 호스트 병원체 상호 작용 분자 이해 이미 51-55 중요한 독성 인자를 표적 겨냥 효과적인 백신 전략의 개발을 촉진했다. 또한 UPEC 밀착성 소분자 억제제 합병증 급성 및 만성 요로 감염의 치료에 효과적뿐만 아니라 CAUTIs UPEC 12,69,70에 의한 것으로 밝혀졌다. 이 두 프로토콜에 설명 된 단순한 요로 감염 및 CAUTI 모델은 요로에 호스트 병원체 상호 작용의 분자 세부 사항을 해부 실험 도구를 제공합니다. 이러한 도구는 우리의 understandin을 확장하는 방법은 여러 가지로 활용할 수 있습니다조건이 복잡한 g의 더 효과적인 치료법이 개발을 용이하게한다.

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Disclosures

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgments

이 작품에 대한 자금은, ORWH SCOR의 P50의 DK064540에 의해 RO1 DK 051406, RO1 AI 108749-01, F32 DK 101171, 및 F32 DK 104516-01을 제공되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material for catheter and needle preparation:
30 G needles BD Precision Glide 305106 30 G x ½ (0.3 mm x 13 mm)
PE10 polyethylene tubing BD 427400 Inside diameter -0.011 in (0.28 mm); outside diameter – 0.024 in (0.61 mm)
RenaSIL 025 platinum cured silicon tubing Braintree Scientific, Inc SIL 025 inside diameter-0.012 x outside diameter 0.025, 25 ft coil
Material for infections:
Isoflourane – Isothesia Butler Schein 29405 250 ml
Clear Glass Straight-Sided Jar Kimble Chase 5413289V 21
Stainless Steel Tea Infuser Schefs-Amazon Premium Loose Leaf Tea Infuser By Schefs - Stainless Steel - Large Capacity -
Non-sterile cotton balls Fisherbrand 22-456-880
50 ml Falcon tubes VWR 89039-660
Isotec 3 -vaporizer Ohmeda 1224478
Ear punch Fisher Scientific 13-812-201 (when necessary)
Betadine solution Betadine solution 10% Povidie-iodine topical solution
Q-tips Fisher Scientific 22-037-924 6 inches
Diapers for bench Fisherbrand 14206 63 Absorbent Underpads (20”X36”mats)
Surgical lubricant Surgilube 0281-0205-36
Dissecting scissor Fine Science tools, INC 14084-08
Micro-Adson Forceps Fine Science tools, INC 11018-12
1 ml syringe BD 309659 Tuberculin slip tip
Parafilm Bemis PM996 4 inches x 125 FT
Eppendorf rack Fisherbrand 05-541-1
Eppendorf tubes MIDSCI AVX-T-17-C
Harvesting catheters, bladders and kidneys:
Homogenizer PRO Scientific INC Bio-Gen Pro 200
5 ml polypropylene round-bottom tube BD 352063 for organ homogenization
Paper towel Georgia-Pacific
Ethanol Pharmco-AAPER 11100020S 200 proof
Costar™ Clear Polystyrene 96-Well Plates Corning 3788
1x Phosphate sodium saline Sigma-Aldrich P3813
BRANSONIC Ultrasonic cleaner 1210 Branson Ultrasonics Corporation 1210
IBC materials:
6-well tissue culture test plate Techno Plastic Products 92006
Pins Fine Science Tools 26002-20
Sylgard 184 Dow Corning 3097358-1004 Silicone Elastomer Kit
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside) Invitrogen 15520-034 Ultrapure
N, N-Dimethylformamide Sigma Aldrich D4551
MgCl2 (Magnesium chloride) Sigma Aldrich M8266
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich D6750
Nonidet-P40 Roche 11754599001 Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate (K-ferrOcyanide) Sigma Aldrich P3289
Potassium hexacyanoferrate(III) (K-ferrIcyanide) Sigma Aldrich 60299

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References

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의학 문제 (100) 카테터 요로 감염 IBC 만성 방광염

Erratum

Formal Correction: Erratum: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model
Posted by JoVE Editors on 08/18/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. The Protocol section has been updated.

The ethics statement has been updated from:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20120216, which was approved 01/11/2013 and expires 01/11/2016. Overall care of the animals was consistent with The guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

to:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20150226, which expires 12/10/2018. Overall care of the animals was consistent with The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

Step 3 has been updated from:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a 32 ounce glass jar containing a tea-infuser ball with cotton balls soaked with 3 ml of isoflurane or vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a jar or vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    NOTE: If glass jar with tea-ball and/or nose cone with isoflurane-soakd cotton balls are used, the animal must be carefully observed to avoid anesthetic overdose and death. The advantage of using a vaporizer and anesthesia chamber is that it provides controlled isoflurane administration that avoids accidental overdoses. CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the jar/vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) or 50 ml conical tube with a cotton ball containing a small amount (approximately 1-2 ml) of isoflurane.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.

to:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) to maintain anesthetization.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.
마우스 모델의 설립 및 요로 감염 및 CAUTI의 특성
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Conover, M. S., Flores-Mireles, A.… More

Conover, M. S., Flores-Mireles, A. L., Hibbing, M. E., Dodson, K., Hultgren, S. J. Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. J. Vis. Exp. (100), e52892, doi:10.3791/52892 (2015).

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