Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Etablering og karakterisering av UTI og CAUTI i en musemodell

Published: June 23, 2015 doi: 10.3791/52892
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Microbiology and Center for Women's Infectious Disease Research, Washington University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Abstract

Urinveisinfeksjoner (UVI) er svært utbredt, en viktig årsak til sykelighet og blir stadig mer motstandsdyktige mot behandling med antibiotika. Kvinner blir uforholdsmessig rammet av UTI: 50% av alle kvinner vil ha en UTI i sin levetid. I tillegg 20-40% av disse kvinnene som har en innledende UTI vil lide et tilbakefall med noen som lider hyppige tilbakefall med alvorlig forverret livskvalitet, smerte og ubehag, forstyrrelse av daglige aktiviteter, økt helsekostnader, og få behandlingstilbud andre enn langsiktige antibiotikaprofylakse. Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) er den primære utløsende agent for samfunnet ervervet UTI. Kateterassosierte UVI (CAUTI) er den vanligste sykehus ervervet infeksjon sto for en million hendelsene i USA årlig og dramatiske helseutgifter. Mens UPEC er også den primære årsaken til CAUTI, andre forårsaker agenter er av økt betydning inkludert Enterococcusfaecalis. Her bruker vi to veletablerte musemodeller som rekapitulere mange av de kliniske kjennetegn ved disse menneskelige sykdommer. For UTI, rekapitulerer en C3H / høne modell mange av funksjonene i UPEC virulens observert hos mennesker, inkludert vertsresponser, IBC dannelse og fila. For CAUTI, en modell ved bruk av C57BL / 6-mus, som beholder kateter blære implantater, har vist seg å være utsatt for E. faecalis blære infeksjon. Disse representative modeller blir brukt til å få slående ny innsikt i patogenesen av UTI sykdom, som fører til utvikling av nye behandlingsformer og ledelse eller forebyggingsstrategier.

Introduction

Urinveisinfeksjoner (UVI) er en av de vanligste bakterielle infeksjoner og kan deles inn i to kategorier basert på mekanismen av oppkjøpet, samfunnet og nosokomial ervervet UTI. Community-ervervet UVI oppstår ofte hos ellers friske kvinner og studier har vist at omtrent 50% av kvinnene vil ha minst en UTI i livet en. I tillegg er gjentakelse et stort problem. En kvinne som har en innledende akutt infeksjon har en 25-40% sjanse for å ha en annen infeksjon i løpet av seks måneder til tross for riktig antibiotikabehandling og mange kvinner fortsetter å ha hyppige tilbakefall to. Bakteriene som forårsaker disse infeksjonene blir også stadig mer antibiotikaresistente ytterligere konfunderende behandlingsprotokoller 3-6. UTI påvirker millioner av mennesker hvert år koster cirka 2,5 milliarder dollar i helsevesenet relaterte utgifter i USA, understreker virkningen og utbredelsen av sykdommen1,7 .Nosocomial kjøpt UVI er i hovedsak knyttet til tilstedeværelse av fremmedlegemer som inneliggende kateter. Kateterassosierte UVI (CAUTI) er fortsatt den vanligste nosokomiale kjøpt UTI, sto for ~ 70-80% av slike infeksjoner 8. Videre er CAUTI assosiert med økt sykelighet og dødelighet, og det er den mest vanlige årsaken til sekundære blodet infeksjoner 9.

UPEC forbundet ervervet UVI er antatt å være forårsaket av innføringen av bakterier i blæren fra reservoarer i mage-tarmkanalen via mekanisk manipulasjon under samleie, dårlig hygiene eller andre mikrobielle populasjonsdynamikk mellom ulike verts nisjer 10. Når du er inne i blæren, UPEC ansette mange virulens faktorer, blant annet kapsel, jern oppkjøp systemer, giftstoffer, en virulensplasmid, tRNAs, patogenitet øyer og koloniserings faktorer som har vist seg å spille en rolle i patogenesen <sup> 11-14. Kritisk til etablering av UPEC kolonisering, UPEC også kode flere typer lim anstand innlede pathway (CUP) pili som gjenkjenner reseptorer med stereo spesifisitet 15. Type 1 pili, tippet med FimH adhesin, uttrykkes ved UPEC og binder mannosylated uroplakins 16 og α-1, 3 β-integriner 17, som uttrykkes på den luminale overflaten av både humane og museblærer 18. Disse FimH-mediert interaksjon lette bakteriell kolonisering og invasjon av den overfladiske epitelceller 19,20. Når du er inne i cellen, kan UPEC flykte inn i cytoplasma der en enkelt bakterie kan raskt dele for å danne en intracellulær bakterie samfunnet (IBC), som ved modning, kan inneholde ~ 10 4 bakterier 21. IBC formasjonen har blitt vist i minst seks forskjellige musestammer, C3H / HeN, C3H / HeJ, C57BL / 6, CBA, FVB / NJ og BALB / c, og med en rekke forskjellige UPEC stammer og andre Enterobacteriaceae 22-24. Men tidsmessige og romlige forskjeller i IBC formasjon kan variere avhengig av mus bakgrunnen og den infiserende UPEC belastning. I C3H / høne mus infisert med proto UPEC stammer UTI89 eller CFT073, IBC dannelse kan visualiseres som små biomasser av bakterier så tidlig som 3 HPI (timer etter infeksjon). Dette fellesskapet fortsetter å ekspandere og når en "midtpunkt" av utvikling ca. 6 HPI når stavformede bakterier opptar en stor andel av det cytoplasmatiske plass av terminalt differensierte overfladiske paraplyceller Disse tidlige IBC form i en forholdsvis synkron måte med flertallet viser tilsvarende dimensjoner og morfologi. ~ 8 HPI bakterier i IBC endring fra en basiller til kokker morfologi. IBCer er forbigående. Dermed IBC modning 12-18 HPI fører fortsatte utvidelsen av den bakterielle befolkningen, fulgt av sin fila og spredning ut av cellen with påfølgende spredning til nabocellene 23. Dermed kan IBC nisje for rask bakterievekst i et miljø beskyttet mot vertsimmunresponser og antibiotika 25. De forskjellige stadier av infeksjonen UPEC som er sett i mus er også observert hos mennesker, slik som IBCer og filamentering, som støtter musemodell for UTI som en gunstig verktøy som kan brukes til å modellere UTI hos mennesker 22,26-28.

Mens et flertall av kvinner opplever en UTI i livet, kan utfallet av disse infeksjonene varierer fra akutt selvbegrensende infeksjon uten tilbakefall, hyppig tilbakevendende blærekatarr. Videre har studier vist en sterk familiær forekomst av UVI, noe som tyder på en genetisk komponent bidrar til UTI mottakelighet 29. Vi har funnet ut at de ulike uti resultater sett i klinikker kan speiles av de ulike utfall av eksperimentell UPEC smitte blant innavlede musestammer 30. For eksempel C3H / høne, CBA, DBA, og C3H / HeOuJ mus er utsatt, i en infeksiøs dose-avhengig måte, for langvarige, kronisk cystitt, karakterisert ved vedvarende høy titer bakterier (> 10 4 kolonidannende enheter (CFU) / ml), høy titer bakterielle blære byrder på offer> 4 uker etter infeksjon (WPI), kronisk betennelse, og uroteliale nekrose. Disse musene viser også forhøyede serumnivåer av IL-6, G-CSF, KC, og IL-5 i de første 24 HPI som tjener som biomarkører for utvikling av kronisk cystitt. Dette kan nøyaktig representerer det naturlige UTI hos noen kvinner, som placebo studier har vist at en stor andel av kvinner opplever UTI vil beholde høye nivåer av bakterier i urinen i flere uker etter at de første symptomene på blærekatarr hvis ikke får antibiotikabehandling 31 , 32. Videre bruker C3H / høne mus, fant vi ut at en historie med kronisk cystitt er en betydelig risikofaktor for senere alvorlige tilbakevendende infeksjoner. Residiverende UVI er den mest sibetydelige materielle klinisk manifestasjon av UTI og C3H / høne mus er foreløpig den eneste studerte modell som sammenfatter en økt disposisjon etter tidligere eksponering. En annen UTI utfallet rekapitulert i C57Bl / 6 mus hvor akutt UPEC infeksjon er selvbegrensende, med oppløsning på blærebetennelse og bakteriuri innen ca en uke. Interessant i denne modellen, UPEC lett danne hvil intracellulære reservoarer i blæren vev som UPEC er i stand til dukker opp fra en sovende tilstand å gjenoppta en aktiv UTI en mulig forklaring på en mekanisme for samme belastning residiverende UVI hos mennesker 33, 34.

I tillegg til genetiske påvirkninger på UTI følsomhet, innføring av et kateter inn i blæren i stor grad øker sannsynligheten for å ha en infeksjon så vel som å øke omfanget av bakterier i stand til å forårsake en infeksjon. Det har blitt demonstrert at human urin kateterisering forårsaker histologiske ogimmunologiske forandringer i blæren på grunn av mekanisk påkjenning som resulterer i en robust inflammatorisk respons, peeling, ødem i lamina propria og submucusa, urothelial tynning, og mucosal lesjon av urothelium og nyre 35,36. I tillegg gir kateteret en overflate for bakteriell feste for derved å skape et miljø som benyttes av flere arter for å forårsake CAUTI. Mens UPEC er fortsatt en stor bidragsyter, står Enterococcus faecalis for 15% av disse CAUTI 37. E. faecalis blir stadig mer motstandsdyktige mot antibiotika med vancomycin motstand veksten, utgjør en alvorlig helseproblem 38. E. faecalis besitter mange virulensfaktorer inkludert toksiner og adhesiner som er nødvendige for feste til både kateteret og epitelet 38. Under urin kateterisering, verten er utsatt for mikrobiell adhesjon, formering og spredning i urinveiene 39,40. E. faecalis danner en biofilm på kateteret som en del av en mekanisme for å vedvare i blæren og spre seg til nyrene, som er gjengitt i en muse CAUTI modell 41. Nylig har det vist seg i løpet av urin kateterisering, er fibrinogen (Fg) slippes inn i blæren som del av den inflammatoriske respons. Fg akkumuleres i blæren, frakker kateteret og er avgjørende for E. faecalis biofilmdannelse, fungerer som et vedlegg stillaset. I en C57BL / 6 mus modell av CAUTI, oppdaget vi at E. faecalis biofilmdannelse på kateteret, og således utholdenhet i blæren, var avhengig av EBP pilus, spesielt dens spiss adhesin EbpA. Vi har funnet at det N-terminale domenet av EbpA spesifikt bindes til fg belegning av kateteret. I tillegg ble det funnet at E. faecalis benytter Fg som metabolitt kilden under infeksjon, og dermed forsterke biofilmdannelse 42.

Musemodeller har vist seg kritisk til understanding samt forutsi kliniske manifestasjoner av UTI og CAUTI 41. I denne artikkelen viser vi inoculum utarbeidelse av blærekatarr UPEC isolere UTI89 og transuretral inokulering av C3H / høne mus. I tillegg viser vi en protokoll for kateterinnleggelse i C57BL / 6 mus og inokulasjon av E. faecalis OG1RF belastning. Begge disse teknikker fører til konsekvent og pålitelig UTI eller CAUTI i mus. Vi viser også teknikker som brukes til å observere IBC formasjon under akutt cystitt og urinoppsamling for analyse av kroniske eller tilbakevendende cystitt. C3H / høne mus har blitt brukt til å studere aspekter av UPEC patogenesen inkludert innledende bakteriell invasjon, IBC formasjon, fila og utvikling av kronisk blærekatarr 23,33,43. Disse virulens parametrene har også blitt studert i en rekke andre muse bakgrunn 22,33. For CAUTI, tillater C57BL / 6-modellen for fremmedlegemer implantering inn i blæren med påfølgende bakterie colonization, som kan opprettholdes i 7 dager etter infeksjon 41. Disse modellene har vært nyttig for å vurdere bakteriell virulensmekanismer, verts svar på UTI og mekanismer for å styrte verts responser, hvorav mye har blitt videre rekapitulert eller observert i kliniske menneskelige befolkninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etikk uttalelse: The Washington University Animal Studies Komiteen godkjente alle muse infeksjoner og rutiner som en del av protokollnummer 20120216, som ble godkjent 01/11/2013 og utløper 01/11/2016. Samlet seg av dyrene var i samsvar med guiden for omsorg og bruk av forsøksdyr fra National Research Council og USDA Animal Care Guide Resource. Eutanasi prosedyrer er i samsvar med de "AVMA retningslinjer for Avliving av dyr 2013 edition."

1. UPEC UTI Protocol, Inoculation Needle Forberedelse (figur S1)

  1. Ta av lokket på 30 G nål. Tråd omtrent en tomme av PE10 slange på akselen av nålen. UV sterilisere nålen forsamlinger over natten. Kateteriseres nåler kan lagres på ubestemt tid i sterile petriplater.

2. UPEC bakterieinokulum Forberedelse

  1. Forbered UTI89 inoculum (starter 72 timer før inoculasjon dag)
    1. Streak UTI89 på en LB (Luria-Bertani) agar plate fra en frossen lager. Inkuber over natten ved 37 ° C. Plukk en koloni og inokulere det inn i 10 ml LB i en 125 ml kolbe. Inkuber ved 37 ° C i 24 timer, statisk.
    2. Inokuler 10 ul natten kultur i 10 ml av LB i en ny 125 ml kolbe i ytterligere 24 timer ved 37 ° C, statisk.
    3. Transfer 3 ml (vil variere basert på belastning og ønsket inoculum størrelse) til sterile 1,5 ml rør og sentrifuger ved 7000 xg i 3 min og resuspender pelleten i 1x PBS og sentrifuger for andre gang. Resuspender den bakterielle pellet i 1 ml 1 x PBS.
  2. Mål bakterielle optisk tetthet og justere konsentrasjonen til den ønskede densitet inokulum. Standarden Konsentrasjonen av inokulum som benyttes er 10 7 bakterier; Dette kan imidlertid variere på grunn av utformingen av studien.

3. Bakteriell Inoculation

  1. Rengjør arbeidsstasjon med 70% etanol og cløpet område med absorberende papir (eller bruk sterile Flow hette).
  2. Tegn opp til 0,9 ml av den fremstilte bakteriepodestoff inn i en 1 ml (TB) sprøyte (fjerne luftbobler). Fest en fremstilt steril nål inokulering med PE10 slange, på sprøyten inneholdende inokulum, deretter sterilt trim polyetylenrør.
    MERK: La 1 mm slange ovenfor spissen av nålen for å unngå punktering av blæren.
  3. Skjær en 1 tommers square stykke Parafilm og sette en skvett av kirurgisk smøremiddel (omtrent på størrelse med en krone) på toppen.
  4. Bedøve kvinnelige C3H / høne mus ved å sette dem i en 32 unse glasskrukke som inneholder en te-infuser ball med bomull baller dynket med 3 ml isofluran eller vaporizer kammer (etter produserer protocol) til bevisstløs, men fortsatt puster normalt (1 pust / sek) .
    MERK: Noen IACUC komiteer ikke godkjenne bruk av en krukke eller fordamper. Vennligst følg indikasjon på IACUC komiteen av institusjonen.
    MERK: Hvis glasskrukkemed te-ball og / eller nesen membran med isofluran-soakd bomull baller brukes, skal dyret følges nøye for å unngå bedøvelse overdose og død. Fordelen med å bruke en vaporizer og anestesi kammeret er at det gir kontrollert isofluran administrasjon som unngår utilsiktede overdoser. FORSIKTIG: Isofluran er en inhalasjon bedøvelse. Bruk i et godt ventilert område og minimere innånding.
  5. Fjern musen fra glasset / vaporizer og plassere den på ryggen på et papirhåndkle og spre bena.
  6. Dekk nesen av musen med en nesekonus (et rør som er koblet til den fordamper som gir en kontrollert isoflurance dose som er utstyrt på enkelte fordamper enheter) eller 50 ml konisk rør med en bomullsdott inneholdende en liten mengde (ca. 1-2 ml ) av isofluran.
  7. Forsiktig palpitate blæren for å indusere vannlating og sikre en annullert blæren. Tørk periuretral område med 100% etanol tørk. DAB vaksinasjonen nål / sprøyte, poenget først, inn ikirurgisk smøremiddel.
  8. Inokuler hver mus med 50 ul av bakterier oppløsning ved å sette inn inokulering nålen transurethrally, omtrent 12 mm, og trykke ned på sprøytestemplet forsiktig for å dispensere podestoffet inn i blæren forsiktig (10 ul / sek). Fjern vaksinasjonen nålen fra musen.
    MERK: Umiddelbar retur av inokulum til urinrørsåpningen når du begynner å vaksinere indikerer uriktig eller ufullstendig innsetting av nålen.
  9. Fjern musen fra nesen membran og returnere det til buret sitt. Gjenta trinn 3,3-3,8 for hver mus. Når / hvis du bytter inokulum vilkår / stammer, kast sprøyten og inokulasjon nål i en godkjent beholder for skarpe gjenstander og starte på nytt trinn 3.2.
    MERK: Inoculation med uropathogenic organismer generelt ikke forårsaker alvorlige smerter symptomer. Men i sjeldne tilfeller kan administrere store doser av patogener forårsaker feber, reduksjon i mat og vanninntak og unormal oppførsel. ANimal helse bør overvåkes gjennom hele forsøket. Hvis utilslørt smerter symptomer er varsel, et smertestillende, for eksempel Buprenorfin (0,05-0,1 mg / kg gitt subkutant), kan brukes. Prosedyrer skal være i samsvar med hver institusjonens IACUC.

4. Fastsettelse av Bakterielle byrder

  1. Forbered separate 5 ml rør for hver blære og nyrer paret å bli høstet. Legg 1 ml 1x PBS / tube / mus blæren til å bli høstet. Legg 0,8 ml 1x PBS / tube / par muse nyrene til å høstes. Merk hvert rør for å svare til en gitt mus. Tilbered en 96-brønners plate inneholdende 180 ul av 1 x PBS i hver brønn for 01:10 seriefortynninger.
  2. Rengjør arbeidsområde med 70% etanol og dekke området med et absorberende dekselet eller papirhåndkle.
  3. Anesthetize mus med isofluran (se trinn 3.4) til musen slutter å puste i ca 1 min, deretter plassere den på absorberende dekselet eller papirhåndkle. Andre metoder for euthanasia er også godkjent av IACUC utvalg, for eksempel karbondioksid, og kan byttes ut med isofluran overdose.
  4. Ofre mus ved hurtig cervikal dislokasjon som består av innspenning av halsen ved bunnen av hodet og trekker halen horisontalt bort fra kroppen til forvridning oppstår.
    MERK: De fleste IACUC komiteene krever en sekundær hjelp av aktiv dødshjelp og halshugging er en vanlig metode. Imidlertid kan andre metoder brukes hvis godkjent av IACUC komiteen.
  5. Plasser død mus på ryggen og spray 70% etanol på magen. Dissekere mus, høste blæren og nyrene, ved at for å minimalisere potensiell forurensning fra blod etter nyrene disseksjon. Plasser organer uavhengig i forberedt 5 ml rør som inneholder 1x PBS (se trinn 4.1).
    MERK: Bruk forskjellige saks for den eksterne disseksjon og for organhøsting å redusere forurensning.
  6. Trykk på røret for å sikre organene er i tHan 1x PBS. Gjenta steg 4,3-4,5 for hver mus. Rene saks og pinsett i 70% etanol etter hver mus.

5. Bakteriell Recovery

  1. Homogenize slakte blære og nyrer i 5 ml rør med en vevshomogenisator, 15 sek per nyre og 30 sek per blæren. Skyll homogenisator sekvensielt i 1 x PBS, 70% etanol og 1 x PBS mellom prøver.
  2. Gjør serie 01:10 fortynninger ut til 10 -8 og plate hver fortynning for CFU (kolonidannende enheter) på LB agar plater. Inkuber platene ved 37 ° C over natten og telle koloniene neste dag.

6. IBC Enumeration

  1. Aseptisk fjerne blæren og plassere den i 1 x PBS i en 6-brønns plate med en silikon bunn. Platene kan tilberedes ved hjelp av en silikon elastomer kit og helle ca 1 cm av silikon i hver brønn, se produsentens anbefalinger. Skjær blæren i to med saks.
  2. Ved hjelp av små metallpinnene forsiktig spriker i bladder slik at blæren lumen vender oppover. Sørg for å plassere pinnene på de ytterste kantene av blære seksjoner for å sikre maksimal mengde urothelium er utsatt.
  3. Etter splaying, forsiktig vaske blæren gang med 1x PBS. Fjern 1x PBS med pipette. Fest blæren ved å tilsette tilstrekkelig 3% paraformaldehyd for å dekke hele utspredt blæren. FORSIKTIG: Paraformaldehyde er kreftfremkallende. Riktig verneutstyr, inkludert hansker, skal brukes til enhver tid. Deponering bør følge institusjonelle retningslinjer.
  4. Inkuber ved romtemperatur i 1 time. Fjern paraformaldehyde løsning. Vask en gang med 1x PBS.
  5. Vask med LacZ vaskeoppløsning (2 mM MgCl2, 0,01% natrium-deoksycholat, og 0,02% Nonidet-p40in 1 x PBS) tre ganger i 5 minutter per vask.
  6. Fjern skylleoppløsning og tilsett nok LacZ flekk (9,5 ml LacZ vaskeløsning, 0,4 ml 25 mg / ml X-gal, og 0,1 ml av 100 mM K-ferrocyanid / K-ferricyanid) for å dekke blærene. Inkuber ved 30 ° C overniGHT beskyttet mot lys.
  7. Fjern sprikende blærer fra inkubator og observere IBCer, som vises som blå puncta som visualiseres med en dissekere omfang, 40-60X forstørrelse.
    MERK: Noen ganger kan en mus kan urinere før plasseringen av røret i henhold til urinrøret. I dette tilfelle vente 15-20 min før forsøk på å samle opp urin igjen.

7. Urin Collection for bakteriuri CFU Enumeration (Gjelder ikke for CAUTI)

  1. Å samle urin før eller etter infeksjon forsiktig holde musa ved å holde halen og plassere den på et plant forhøyet overflate (toppen av musen bur).
  2. Hold en steril 1,5 ml tube under museurinrøret. Trykk forsiktig ned på baksiden av musen nær halen til å legge press på blæren. Catch urinen i 1,5 ml tube.
  3. Gjør serie 01:10 fortynninger ut til 10 -7 og plate hver fortynning egnet LB. Inkuber platene ved 37 ° C over natten og telle koloniene neste dag.

8. CAUTI Model Protocol, kateter Needle Forberedelse til CAUTI Modell (figur S2)

  1. Ta av lokket på 30 G nål. Skjær en 7 mm stykke PE10 rør og 5 mm stykke silikonslanger som RenaSIL. Tre nålen med PE10 slange til røret berører bunnen av nålen.
  2. Deretter mate 5 mm stykke på PE10 holdige nål. UV sterilisere nåler forsamlinger over natten.
    MERK: Når du legger silikonslangen, la ca 1 mm av slangen som strekker seg forbi nålespissen.

9. E. faecalis OG1RF bakterieinokulum Forberedelse

  1. Forbered OG1RF inoculum starter 48 timer før vaksinasjonen dag. Streak OG1RF på en BHI (hjerne hjerte infusjon) plate fra en frossen lager.
  2. Plukk en koloni og vaksinere den inn 10 ml BHI og vokse det statisk i 18 timer ved 37 ° C. Sentrifuger kulturen og vaske pelleten (3 ganger) i 1 ml volumer av sterilt 1 x PBS.
  3. Resuspender den bakterielle pellet i 1 x PBS. Mål bakterielle optisk tetthet og justere konsentrasjonen til podestørrelse. Standarden Konsentrasjonen av inokulum som benyttes er 10 7; Dette kan imidlertid variere på grunn av utformingen av studien

10. Kateter Implantasjon

  1. Rengjør arbeidsstasjon med 70% etanol og dekke området med en absorberende dekselet (eller bruk sterile Flow hette).
  2. Fest kateter nål til en tom 1 ml (TB) sprøyte. Skjær en 1 tommers square stykke Parafilm og sette en skvett av kirurgisk smøremiddel (omtrent på størrelse med en krone) på toppen.
    MERK: To forskjellige nåler brukes for avsetning av kateteret og for podestoff for å minimalisert utilsiktet inokulering på grunn av den mekaniske manipulering er nødvendig for kateter implantasjon. Dette gir også mulighet for bekvemmeligheten av å forberede færre inokulerings nåler.
  3. Bedøve C57BL / 6 mus ved å sette dem i en 32 unse glasskrukke som inneholder en te-infuser ball med bomull baller dynket i 3 ml isofluran eller vaporizer kammer (etter produserer protocol) til bevisstløs, men fortsatt puster normalt (1 pust / sek).
  4. Deretter satte musen på ryggen på et papirhåndkle og spre bena. Dekk nesen av musen med en nese kjegle eller 50 ml konisk rør med bomull baller som inneholder en liten mengde (ca. 1-2 ml) av isofluran.
    FORSIKTIG: Isofluran er en inhalasjon bedøvelse. Bruk i et godt ventilert område og minimere innånding av forsker.
  5. Forsiktig palpitate blæren for å indusere vannlating og sikre en annullert blæren. Tørk periuretral område med en 100% etanol tørk.
  6. Desinfisere periuretral området med 10% povidonjodid løsning med en bomulls-tip applikator. DAB vaksinasjonen nål / sprøyte, poenget først, inn i operasjons smøremiddel.
    MERK: Povidine-jod brukes for kateter implantering, noe som er en sterkere aseptisk løsning enn alkohol. Kateter implantasjon krevermer mekanisk manipulasjon for å sette inn kateteret og dermed et større potensial for forurensning.
  7. Sett kateter i urinrøret. En gang i, å bruke pinsett presse (7 mm PE10) langt stykke mot blæren, og dermed skyve (5 mm silikon) lite kateter og deponerer den inn i blæren. Fjern nålen, med 7 mm rør fortsatt festet, umiddelbart.

11. Bakteriell Inoculation

  1. Følg bakteriell inokulasjon protokollen i § 3, ved hjelp av forberedt inoculum fra seksjon 9. Ta musen fra nesen membran og returnere det til buret sitt

12. På hvert tidspunkt av Sacrifice

  1. Forbered 5 ml rør for blære og nyre (For organer følge trinn 4,1) og 1,5 ml Eppendorfrør for katetre. Tilsett 1 ml 1 x PBS i 1,5 ml Eppendorf-rør for kateterprøver
  2. Følg trinn 04.03 til 04.05. Dissekere mus, høsting av blære, nyrer og kateter, placing vev uavhengig av hverandre inn i 5 ml rør inneholdende 1 x PBS og kateteret inn i 1,5 ml Eppendorf (se trinn 12.1).
    MERK: Bruk forskjellige saks for den eksterne disseksjon og for organhøsting og kateter gjenfinning for å minimere forurensning
  3. Følg deretter trinn 4.6.

13. Bakteriell Recovery

  1. For organer, følger du trinn 5.1 og 5.2. For bakteriell utvinning fra katetere, vortex ved maksimal hastighet i 30 sek, sonikere kateter prøvene i 5 min ved anvendelse av en sonikator-bad, og deretter vortex ved maksimal hastighet i ytterligere 30 sek.
  2. Gjør serie 01:10 fortynninger ut til 10 -8 og plate hver fortynning for CFU telling på BHI plater. Inkuber platene ved 37 ° C over natten og telle koloniene neste dag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De intravesikal modeller av ukomplisert og kateter forbundet UTI tilby fleksible plattformer for å belyse de molekylære mekanismene for bakteriell patogenesen, virkningen av disse sykdommene på verten vev, samt utvikling og testing av nye tilnærminger for å håndtere disse vanlige og kostbare infeksjoner. Avhengig av musestamme og patogen, kan intravesikal inokulering brukes til å studere vert-patogen interaksjoner for å belyse faktorene som er nødvendige for å igangsette eller modulere spiss (figur 1 og 3), kronisk eller tilbakevendende (figur 2) cystitt. Resultatene vist i figur 1 data er representative for akutte stadium (24 hpi) urinveiene kolonisering av det prototypiske UPEC cystitt isolere UTI89 44. Etter inokulering blir infeksjoner lov til å utvikle seg i 24 timer på hvilket tidspunkt ble musene avlivet og blæren og nyrevevet homogenisert. De vevshomogenater er serielt diluted og belagt for opptellingen av koloniserende bakterier. Kronisk UPEC kolonisering og blærebetennelse kan etableres og vedlikeholdes i noen mus linjer (spesielt C3H / høne) i en smittsom dose og uropathogen avhengig måte. Kronisk blærekatarr er definert som vedvarende høyt titer bakteriuri (> 10 4 CFU / ml), blærebetennelse og høy titer bakterie blære byrder (> 10 4 CFU / blære) ved offer 33. Resultatene vist i figur 2 data er representative CFU forekommende 4 uker etter inokulering av C3H / HEN-mus med 2 x 10 7 CFU av UTI89. Under disse forsøksbetingelser, 20-50% av infiserte mus utvikler kronisk cystitt, mens de resterende 50-80% av musene løse infeksjonen. Denne dualiteten av utfallet er avhengig av en vert-patogen sjekkpunkt som er avgjort innen de første 24 HPI. Aktivering (eller ikke) av checkpoint resulterer i den observerte bimodal fordeling av bakterielle titer, som begynner å manifestere iurinen på tre dpi (dager etter infeksjon) og i blæren ved offer 28 dpi (figur 2) 33. Mus med en historie med kronisk cystitt er betydelig disponert for tilbakevendende kronisk blærekatarr på, men etter den første infeksjonen er klarert med antibiotikabehandling 33. Tilsvarende er en historie om UTI en kjent risikofaktor for residiverende UVI hos mennesker. Dermed er dette den eneste kjente modellen som brukes for å studere patogenesen av residiverende UVI. Når eksperimentelt modellering UTI i alternative mus bakgrunn, er det viktig å finne ut om musen belastningen er utsatt for UVI, residiverende UVI eller CAUTI, gitt at noen stammer er mer eller mindre motstandsdyktig mot å utvikle disse syndromene 33.

En ekstra måling av akutt cystitt er IBC opplisting. IBC formasjonen er begrenset til de terminalt differensierte overfladiske paraplyceller. IBC kvantifisering er en informativ mål på bakteriemengden under akutt cysteitis og høye nivåer av IBCer korrelerer med risiko for å utvikle kronisk blærekatarr 21. IBC formasjon bare oppstår i den akutte fasen av sykdommen. Etter peeling av overfladiske paraply celler, IBCer er ikke lenger observert. I C3H / høne UTI modellen, kan IBCer måles 6 timer etter inokulering ~ 1 x 10 7 CFU av UTI89 inn i blæren transurethrally. Blærer er sprikende med metallpinnene silikon plater og farget for uttrykket av LacZ. LacZ, β-galaktosidase, er en ofte uttrykt bakterielt enzym som spalter β sammenhengen mellom galaktose og andre sukkerarter. Dette enzym kan anvendes for å påvise bakterier ved å tilføre X-gal, en β-galaktosid-analog, som gir en blå farge etter spalting. Etter fargingen blir blærer avbildet under et disseksjonsmikroskop med IBCer vises som punctae blå / lilla prikker på urothelium og IBCer kan være nummerert ved å telle prikkene (figur 3A). Mens antallet IBCs dannet per dyr varierer, i C3H / høne bakgrunn i gjennomsnitt ~ 50 IBCer er sett per blære (figur 3B). IBCer økning på en doseavhengig måte. Antallet IBCer som danner varierer mellom UPEC og mus bakgrunn stammer. For eksempel, i C57BL / 6, et inokulum av ~ 1 x 10 7 UTI89 resulterer i dannelse av flere hundre IBCer pr blæren.

Utover ukomplisert ervervet UTI modellert ovenfor, heia-omsorg forbundet UVI representere en betydelig byrde for helsevesenet. UVI representerer ca 40% av alle helsevesenet knyttet infeksjoner og opptil 95% av all helsevesenet forbundet UVI er kateteret forbundet 45. Her viser vi en blære implantat musemodell for CAUTI som representerer et kraftig system for eksperimentell analyse av denne vanskelige kliniske problem. Dataene presentert i figur 4 er representative for 24 timers infeksjon med modellen E. faecalis s trene OG1RF. Når 1 x 10 7 er CFU av OG1RF intravesikalt podet inn i en unimplanted blæren begynner smitte til klart etter 24 HPI (Figur 4A) og etter tre dpi infeksjonen har vedtatt 41. Omvendt, inokulering av OG1RF til en implantert blære resulterer i koloniseringen av både kateteret og blæren, med 10 ganger høyere blære kolonisering nivåer ved 24 hpi enn de som ble observert i de unimplanted blærene (figur 4A og 4B). I tillegg er denne infeksjonen opprettholdt ved> 10 6 CFU i blæren inntil kateteret tap ca. 7 dpi 41. Alle de beskrevne eksperimentelle modeller er mottagelig for en høy grad av fleksibilitet eksperimentelt, inkludert, men ikke eksklusivt for ulike tilnærminger til den makroskopiske og mikroskopiske avbildning av den infiserte vev og overflater, endrede inokulum størrelse og sykdoms ganger, konkurransedyktige infeksjoner, og vert immunologiske analyser .

ve_content "> Figur 1
Figur 1:. 24-timers urinveis kolonisering Kvinne, 7-8 uker gamle C3H / høne mus ble transurethrally inokulert med ~ 2 x 10 7 CFU av proto UPEC blærekatarr isolere UTI89 i 24 timer. Representative CFU utvinnes fra de høstes blære og nyre vev er vist, n = 5. Stiplet linje angir nedre deteksjonsgrense (20 CFU).

Figur 2
Figur 2:. 28 dagers urinveis kolonisering Kvinne, 7-8 uker gamle C3H / høne mus ble transurethrally inokulert med ~ 2 x 10 7 CFU UTI89. Urin var collect på angitte dager etter infeksjon (dpi) og belagt for CFU telling. Representant 28 dagers blære- og nyre titers vises også, n = 8. Urin CFU nedre deteksjonsgrense (1000 CFU / ml) er merket med stiplet linje. Stiplede linjen representertts vevet nedre deteksjonsgrense, 20 CFU / vev.

Figur 3
Figur 3:. IBC opplisting Kvinne, 7-8 uker gamle C3H / høne mus ble transurethrally inokulert med ~ 1 x 10 7 CFU UTI89. Blærer ble høstet seks HPI og sprikende for IBC farging. (A) Bilde av sprikende blæren etter LacZ farging. IBCer er representert som blå prikker. Det innfelte bilde er en forstørrelse av den delen av bildet i den sorte boksen. (B) Representative antall IBCer dannet i C3H / høne mus 6 HPI, n = 10.

Figur 4
Figur 4: E. faecalis kateterassosierte uti. C57BL / 6-mus ble inokulert med eller uten kateter med 1 x 10 ~ 7 CFU av (A) E. faecalis blære kolonisering i nærvær eller fravær av kateteret. (B) E. faecalis kateterkolonisering. Mann-Whitney U-test ble anvendt for museforsøk, ble p <0,05 ansett som statistisk signifikant. **, P <0,005.

Figur S1
Figur S1:. UTI inokulering nål fremstillingen diagram viser inokulasjon nål fremstillingstrinn, inkludert materialer som trengs for (1), gjenging av kateteret til nålen (2), og trimming av røret før inokulering (3).

Figur S2
Figur S2:. CAUTI vaksinasjon nål forberedelse Diagram viser vaksinasjon nål forberedelse materialer som trengs (1), threading av vaksinen kateter (2) og implantasjon kateter påtil nålen (3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ukomplisert ervervet UTI er en vanlig og kostbare infeksjon regnskap for flere millioner primærhelsetjenesten besøk hvert år 46. I tillegg Cautis er et vanlig helse ervervet infeksjon som har blitt svært kostbart å helsepersonell som Centers for Medicare og Medicaid Services ikke lenger refunderer leverandører for den ekstra kostnaden for behandling som følge av sykehuset ervervet CAUTI 45. De musemodeller av UTI, både ukomplisert cystitt og CAUTI, som er beskrevet i protokollene tilveie uvurderlig verktøy for forståelsen av den molekylære basis til verten og patogen interaksjoner som er nødvendige for å initiere, vedlikeholde og å modulere resultatet av flere former for UTI. Disse modellene gir mulighet for bruk av kraftige bakterielle og mus genetikk, immunologiske, mikroskopiske, biokjemiske og kjemiske genetiske verktøy til analyse av UTI 23,47-49. I tillegg protokollene skissert her har gitt en plattformfor utvikling og testing av nye terapeutiske og forebyggende strategier inkludert små molekyl hemmere av bakteriell virulens og nye vaksinasjons mål og strategier 50-55.

Det er flere viktige forhold som må opprettholdes for vellykket bruk av ukomplisert cystitt modell. Som med alle mus anesthetization prosedyrer, må man sørge for å forhindre dødelighet musen på grunn av over-anesthetization. Ved fremstilling av vaksinen kateter, må silikonrøret være tilstrekkelig lang til å dekke tuppen av nålen, men ikke så lenge som å skade veggen av blæren på kateterisering. I tillegg, på grunn av nærheten og størrelsen av skjedeåpningen, man må passe på for å sette inokulering av kateteret i urinrøret og ikke vagina. Under blære splaying for IBC opplisting, er det viktig at blærene blir spredd i så raskt som mulig etter disseksjon og vevet bli løst for hensiktsximately 1 time, men ikke over natten. For IBC opplisting av LacZ flekker, er det også nødvendig at en bakterie som produserer LacZ under uroteliale celle kolonisering. Når du bruker stammer hvor LacZ enzymet ikke er produsert, er det fortsatt mulig å nummerere IBCer hjelp immunfluorescens mikroskopi med anti- E. coli-antistoffer eller GFP uttrykker bakterier. En spesiell funksjon i denne modellen er de ulike mønstre av sykdomsprogresjon og alvorlighetsgrad presentert av forskjellige innavlede mus linjer og varierende sykdomsfremkallende potensialet i proto UPEC stammer 33,56. Disse forskjellene er både en styrke og begrensning av denne teknikken som de rekapitulere den naturlige variasjonen av verts mottakelighet og patogen mangfold som har blitt observert i kliniske og fenotypiske studier mens kompliserer eksperimentell design og tolkning 57,58. Disse variasjonene gir kilder til sammenligning åpner for klarlegging av vert og bakterielle mechanismer moduler patogenesen av ukomplisert UVI 33,56. Men de også mener det, på grunn av varierende grad av mus linje UTI mottakelighet, må ytterste forsiktighet tas i å velge den riktige muselinjen og UPEC belastning for adressering bestemt spørsmål en etterforsker spør. For eksempel C57BL / 6 mus er en utmerket modell av akutt infeksjon, presentere med høye bakterie titre og et stort antall IBCer på tidlige tidspunkter. Denne belastningen så løser raskt smitte mellom 3 og 7 dpi med den eneste vedvarende kolonisering som følge av alvorlige nyreinfeksjoner og hvil intracellulære reservoarer 33,34. C57BL / 6-modellen kan nøyaktig representerer den vanligste utfallet for mange uti pasienter der symptomene er til stede og så løse. Motsatt viser den C3H / høne mus bakgrunn en høy grad av følsomhet for kronisk cystitt gjør dem til en ideell belastning for å studere residiverende UVI. Andre uti modeller har også etablerti CBA, DBA og C3H / HeJ mus bakgrunn beviser nyttig for å studere bestemte aspekter av UTI 33,59. Den primære ulempen eksperimentelle utvises av ukomplisert cystitt modellen er eksistensen av multiple infeksjoner flaskehalser å begrense anvendelsen av storskala genetisk screening-metoder for oppdagelse av nye bakterie faktorene som er nødvendige for akutte, kroniske og tilbakevendende cystitis 60.

De kritiske betraktninger for ukomplisert cystitt modellen alle gjelder implantatet basert CAUTI modell med to ekstra bekymringer. For det første må man sørge for å sikre at innsetting av implantatet foregår i en steril måte, på grunn av økt mottakelighet for infeksjon blæren gitt av implantatet. For det andre er det viktig at kateteret holdes på plass under fjerning av hårimplanteringsnålen. De viktigste begrensninger av CAUTI modell er at den har et redusert omfanget av tilgjengelig verts genetiske bakgrunner, PRopensity for kateter tap over tid, og den manglende evne til å samle urin på grunn av blæredysfunksjon som følge av implantasjonen. For å kompensere for implantat tap og manglende evne til å overvåke smitte via langsgående urinanalyse, denne modellen krever generelt høyere antall kateteriseres mus for senere tidspunkter og grupper av mus må ofres på hver ønsket tidspunkt. De begrensede verts genetiske bakgrunn resultater fra uoverkommelige frekvensen som noen musestammer som C3H / høne, mister implantatet (P. Guiton, personlig kommunikasjon 2010). Som et resultat har CAUTI protokollene beskrevet ovenfor utelukkende er optimalisert i C57BL / 6 mus-stamme. Men mens begrensning av tilgjengelige musestammer for CAUTI er uheldig, mange genomiske varianter er etablert i C57BL / 6 bakgrunnen og CAUTI modellen utvider den bakteriologiske mangfold tilgjengelig for studier under UTI ved å endre blæren miljø for å lette kolonisering av organismer som erellers ikke-patogent i den murine modellen av UTI. Et eksempel på dette, er den nylige oppdagelsen av rollen av Fs frigis under kateter indusert betennelse i blæren i E. faecalis vekst, biofilmdannelse og utholdenhet under CAUTI 42. Dette eksemplet illustrerer effekt av implantatet modell av CAUTI i belyse ikke bare bakteriell molekylære mekanismer for patogenesen, men også rollen som vertsfaktorer under infeksjonen. Alle disse egenskapene bidrar til forståelsen av denne relevant klinisk infeksjon, som har blitt tidligere studerte.

I tillegg til de eksperimentelle tilnærminger som er beskrevet ovenfor, er musemodeller av ukomplisert cystitt og CAUTI er mottagelig for et stort antall metodiske modifikasjoner. I tilfelle av ukomplisert cystitt modellen, kan disse modifikasjoner innbefatter reduksjon av inokulering volum og den kraft som utøves under instillasjon av inokulumet å redusere antallet bakterierinnføres i nyrene 61, å variere varigheten av infeksjonen, ofre ved tidspunkter så tidlig som 1 hpi og ved hjelp av gentamicin beskyttelsesanalyser for å evaluere i hvilken grad den uropathogen har invadert blæren epitelceller 62. De sprikende blærer fra mus ofret mellom 6 og 24 hpi kan også bli seksjonert og farget med antistoffer mot ulike vert og / eller bakteriell epitoper og observert under fluorescerende eller konfokalmikroskopi å observere IBC struktur, bakteriell fluxing og fila og vert vev tilstand 25,33 , 63,64. Effekten av uropathogen infeksjon og / eller implantasjon på den lokale og systemiske immunresponser i verts kan vurderes ved hjelp av Bioplex cytometrisk perle system eller ELISA baserte analyser for å fastslå cytokin nivåer i urin eller serum henholdsvis 33,65. Til slutt, tilstanden til blærevevet, plassering og morfologi av koloniserende bakterier og strukturen av biofilm avsatt påkateteret kan vurderes ved hjelp av forskjellige bildeteknikker, inkludert elektronmikroskopi 25,41.

Disse grunnleggende modeller av infeksjon kan også tilpasses til å etterligne andre klinisk relevante fenomener inkludert residiverende UVI og utvikling av en adaptiv immunrespons via flere infeksjoner. I denne sammenheng, infeksjoner av C57BL / 6 mus resulterer i økt motstandsdyktighet mot akutt cystitt, mens i C3H / HeN-modell, den tidligere utvikling av kronisk cystitt, fulgt av utskillelse av infeksjon via administrering av antimikrobielle stoffer sensitizes disse mus for å utvikle kronisk cystitt på etterfølgende inoculations 66. I tillegg de molekylære mekanismene for risikofaktorer for utvikling av UVI kan undersøkes. Diabetes og fedme har begge vist seg å øke hyppigheten og alvorlighetsgraden av UVI. Type 2-diabetes kan være genetisk modellert i mus i FVB / NJ bakgrunn og en kjemisk indusert modell av type 1 diabetes already er vist å øke graden av urinveisinfeksjoner forårsaket av både UPEC og K. pneumophila 67,68.

Til slutt, disse modellsystemer representerer en ideell forsøksområde for utvikling og optimalisering av terapeutiske metoder som tar sikte på å behandle eller forebygge urinveisinfeksjon og Cautis. Den molekylære forståelse av verts patogen interaksjoner som tilbys av disse modellene har allerede muliggjort utvikling av effektive vaksinasjonsstrategier som tar sikte på å målrette viktig virulens faktorer 51-55. I tillegg er lavmolekylære inhibitorer av adhesjon UPEC blitt vist å være effektiv i behandlingen av ukomplisert akutt og kronisk UVI samt Cautis forårsaket av UPEC 12,69,70. Både ukomplisert UVI og CAUTI modellene som er beskrevet i disse protokollene gi eksperimentelle verktøy for å dissekere de molekylære detaljene i verts-patogen interaksjoner i urinveiene. Disse verktøyene kan utnyttes på mange måter å utvide vår understanding av dette komplekst sett av betingelser og tilrettelegge for utvikling av mer effektive terapeutiske intervensjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Midler til dette arbeidet ble gitt av ORWH SCOR P50 DK064540, RO1 DK 051 406, RO1 AI 108749-01, F32 DK 101 171, og F32 DK 104516-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material for catheter and needle preparation:
30 G needles BD Precision Glide 305106 30 G x ½ (0.3 mm x 13 mm)
PE10 polyethylene tubing BD 427400 Inside diameter -0.011 in (0.28 mm); outside diameter – 0.024 in (0.61 mm)
RenaSIL 025 platinum cured silicon tubing Braintree Scientific, Inc SIL 025 inside diameter-0.012 x outside diameter 0.025, 25 ft coil
Material for infections:
Isoflourane – Isothesia Butler Schein 29405 250 ml
Clear Glass Straight-Sided Jar Kimble Chase 5413289V 21
Stainless Steel Tea Infuser Schefs-Amazon Premium Loose Leaf Tea Infuser By Schefs - Stainless Steel - Large Capacity -
Non-sterile cotton balls Fisherbrand 22-456-880
50 ml Falcon tubes VWR 89039-660
Isotec 3 -vaporizer Ohmeda 1224478
Ear punch Fisher Scientific 13-812-201 (when necessary)
Betadine solution Betadine solution 10% Povidie-iodine topical solution
Q-tips Fisher Scientific 22-037-924 6 inches
Diapers for bench Fisherbrand 14206 63 Absorbent Underpads (20”X36”mats)
Surgical lubricant Surgilube 0281-0205-36
Dissecting scissor Fine Science tools, INC 14084-08
Micro-Adson Forceps Fine Science tools, INC 11018-12
1 ml syringe BD 309659 Tuberculin slip tip
Parafilm Bemis PM996 4 inches x 125 FT
Eppendorf rack Fisherbrand 05-541-1
Eppendorf tubes MIDSCI AVX-T-17-C
Harvesting catheters, bladders and kidneys:
Homogenizer PRO Scientific INC Bio-Gen Pro 200
5 ml polypropylene round-bottom tube BD 352063 for organ homogenization
Paper towel Georgia-Pacific
Ethanol Pharmco-AAPER 11100020S 200 proof
Costar™ Clear Polystyrene 96-Well Plates Corning 3788
1x Phosphate sodium saline Sigma-Aldrich P3813
BRANSONIC Ultrasonic cleaner 1210 Branson Ultrasonics Corporation 1210
IBC materials:
6-well tissue culture test plate Techno Plastic Products 92006
Pins Fine Science Tools 26002-20
Sylgard 184 Dow Corning 3097358-1004 Silicone Elastomer Kit
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside) Invitrogen 15520-034 Ultrapure
N, N-Dimethylformamide Sigma Aldrich D4551
MgCl2 (Magnesium chloride) Sigma Aldrich M8266
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich D6750
Nonidet-P40 Roche 11754599001 Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate (K-ferrOcyanide) Sigma Aldrich P3289
Potassium hexacyanoferrate(III) (K-ferrIcyanide) Sigma Aldrich 60299

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. Dis Mon. 49, 53-70 (2003).
  2. Foxman, B., et al. Risk factors for second urinary tract infection among college women. American journal of epidemiology. 151, 1194-1205 (2000).
  3. Gupta, K., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Increasing antimicrobial resistance and the management of uncomplicated community-acquired urinary tract infections. Annals of internal medicine. 135, 41-50 (2001).
  4. Gupta, K., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Isolation of fluoroquinolone-resistant rectal Escherichia coli. after treatment of acute uncomplicated cystitis. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 56, 243-246 (2005).
  5. Gupta, K., Sahm, D. F., Mayfield, D., Stamm, W. E. Antimicrobial resistance among uropathogens that cause community-acquired urinary tract infections in women: a nationwide analysis. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 89-94 (2001).
  6. Gupta, K., Scholes, D., Stamm, W. E. Increasing prevalence of antimicrobial resistance among uropathogens causing acute uncomplicated cystitis in women. Jama. 281, 736-738 (1999).
  7. Jarvis, W. R. Selected aspects of the socioeconomic impact of nosocomial infections: morbidity, mortality, cost, and prevention. Infect Control Hosp Epidemiol. 17, 552-557 (1996).
  8. Lo, E., et al. Strategies to prevent catheter-associated urinary tract infections in acute care hospitals: 2014 update. Infection control and hospital epidemiology : the official journal of the Society of Hospital Epidemiologists of America. 35, 464-479 (2014).
  9. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature reviews Urology. 7, 653-660 (2010).
  10. Hooton, T. M., Stamm, W. E. Diagnosis and treatment of uncomplicated urinary tract infection. Infect Dis Clin North Am. 11, 551-581 (1997).
  11. Hannan, T. J., et al. LeuX tRNA-dependent and -independent mechanisms of Escherichia coli. pathogenesis in acute cystitis. Molecular microbiology. 67, 116-128 (2008).
  12. Cusumano, C. K., Hung, C. S., Chen, S. L., Hultgren, S. J. Virulence plasmid harbored by uropathogenic Escherichia coli. functions in acute stages of pathogenesis. Infection and immunity. 78, 1457-1467 (2010).
  13. Dhakal, B. K., Mulvey, M. A. The UPEC pore-forming toxin alpha-hemolysin triggers proteolysis of host proteins to disrupt cell adhesion, inflammatory, and survival pathways. Cell host & microbe. 11, 58-69 (2012).
  14. Garcia, E. C., Brumbaugh, A. R., Mobley, H. L. Redundancy and specificity of Escherichia coli. iron acquisition systems during urinary tract infection. Infection and immunity. 79, 1225-1235 (2011).
  15. Bergsten, G., Wullt, B., Svanborg, C. Escherichia coli., fimbriae, bacterial persistence and host response induction in the human urinary tract. International journal of medical microbiology : IJMM. 295, 487-502 (2005).
  16. Zhou, G., et al. Uroplakin Ia is the urothelial receptor for uropathogenic Escherichia coli.: evidence from in vitro FimH binding. J Cell Sci. 114, 4095-4103 (2001).
  17. Eto, D. S., Jones, T. A., Sundsbak, J. L., Mulvey, M. A. Integrin-mediated host cell invasion by type 1-piliated uropathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 3, e100 (2007).
  18. Taganna, J., de Boer, A. R., Wuhrer, M., Bouckaert, J. Glycosylation changes as important factors for the susceptibility to urinary tract infection. Biochemical Society transactions. 39, 349-354 (2011).
  19. Mulvey, M. A., et al. Induction and evasion of host defenses by type 1-piliated uropathogenic Escherichia coli. Science. 282, 1494-1497 (1998).
  20. Mysorekar, I. U., Mulvey, M. A., Hultgren, S. J., Gordon, J. I. Molecular regulation of urothelial renewal and host defenses during infection with uropathogenic Escherichia coli. The Journal of biological chemistry. 277, 7412-7419 (2002).
  21. Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population Dynamics and Niche Distribution of Uropathogenic Escherichia coli. during Acute and Chronic Urinary Tract Infection. Infect. Immun. 79, 4250-4259 (2011).
  22. Garofalo, C. K., et al. Escherichia coli. from urine of female patients with urinary tract infections is competent for intracellular bacterial community formation. Infection and immunity. 75, 52-60 (2007).
  23. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli. in urinary tract pathogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 1333-1338 (2004).
  24. Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae. urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infection and immunity. 76, 3337-3345 (2008).
  25. Anderson, G. G., et al. Intracellular bacterial biofilm-like pods in urinary tract infections. Science. 301, 105-107 (2003).
  26. Robino, L., et al. Detection of intracellular bacterial communities in a child with Escherichia coli. recurrent urinary tract infections. Pathogens and disease. 68, 78-81 (2013).
  27. Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4, e329 (2007).
  28. Horsley, H., et al. Enterococcus faecalis subverts and invades the host urothelium in patients with chronic urinary tract infection. PloS one. 8, e83637 (2013).
  29. Hopkins, W. J., Uehling, D. T., Wargowski, D. S. Evaluation of a familial predisposition to recurrent urinary tract infections in women. American Journal of Medical Genetics. 83, 422-424 (1999).
  30. Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli. urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infection and immunity. 66, 2798-2802 (1998).
  31. Mabeck, C. E. Treatment of uncomplicated urinary tract infection in non-pregnant women. Postgraduate medical journal. 48, 69-75 (1972).
  32. Ferry, S., Holm, S., Stenlund, H., Lundholm, R., Monsen, T. The natural course of uncomplicated lower urinary tract infection in women illustrated by a randomized placebo controlled study. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 36, 296-301 (2004).
  33. Hannan, T. J., Mysorekar, I. U., Hung, C. S., Isaacson-Schmid, M. L., Hultgren, S. J. Early severe inflammatory responses to uropathogenic E. coli. predispose to chronic and recurrent urinary tract infection. PLoS Pathog. 6, (2010).
  34. Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli. persistence and eradication from the urinary tract. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 14170-14175 (2006).
  35. Glahn, B. E., Braendstrup, O., Olesen, H. P. Influence of drainage conditions on mucosal bladder damage by indwelling catheters. II. Histological study. Scandinavian journal of urology and nephrology. 22, 93-99 (1988).
  36. Goble, N. M., Clarke, T., Hammonds, J. C. Histological changes in the urinary bladder secondary to urethral catheterisation. British journal of urology. 63, 354-357 (1989).
  37. Ronald, A. The etiology of urinary tract infection: traditional and emerging pathogens. Dis Mon. 49, 71-82 (2003).
  38. Arias, C. A., Murray, B. E. The rise of the Enterococcus.: beyond vancomycin resistance. Nature reviews. Microbiology. 10, 266-278 (2012).
  39. Garibaldi, R. A., Burke, J. P., Dickman, M. L., Smith, C. B. Factors predisposing to bacteriuria during indwelling urethral catheterization. The New England journal of medicine. 291, 215-219 (1974).
  40. Warren, J. W. Catheter-associated urinary tract infections. Infect Dis Clin North Am. 11, 609-622 (1997).
  41. Guiton, P. S., Hung, C. S., Hancock, L., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. Enterococcal biofilm formation and virulence in an optimized murine model of foreign body-associated urinary tract infections. Infection and immunity. 78, 4166-4175 (2010).
  42. Flores-Mireles, A. L., Pinkner, J. S., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. EbpA vaccine antibodies block binding of Enterococcus faecalis. to fibrinogen to prevent catheter-associated bladder infection in mice. Science translational medicine. 6, 254ra127 (2014).
  43. Martinez, J. J., Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Pinkner, J. S., Hultgren, S. J. Type 1 pilus-mediated bacterial invasion of bladder epithelial cells. The EMBO Journal. 19, 2803-2812 (2000).
  44. Hultgren, S. J., Schwan, W. R., Schaeffer, A. J., Duncan, J. L. Regulation of production of type 1 pili among urinary tract isolates of Escherichia coli. Infection and immunity. 54, 613-620 (1986).
  45. Chenoweth, C. E., Gould, C. V., Saint, S. Diagnosis, Management, and Prevention of Catheter-Associated Urinary Tract Infections. Infect. Dis. Clin. North Am. 28, 105-+ (2014).
  46. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7, 653-660 (2002).
  47. Justice, S. S., Hunstad, D. A., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Filamentation by Escherichia coli. subverts innate defenses during urinary tract infection. Proc Natl Acad Sci USA. 103, (1988).
  48. Song, J., et al. TLR4-mediated expulsion of bacteria from infected bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14966-14971 (2009).
  49. Wang, H., Min, G., Glockshuber, R., Sun, T., Kong, X. P. Uropathogenic E. coli. adhesin-induced host cell receptor conformational changes: implications in transmembrane signaling transduction. Journal of molecular biology. 392, 352-361 (2009).
  50. Cusumano, C. K., et al. Treatment and prevention of urinary tract infection with orally active FimH inhibitors. Science translational medicine. 3, 109-115 (2011).
  51. Langermann, S., Ballou, W. R. Vaccination utilizing the FimCH complex as a strategy to prevent Escherichia coli. urinary tract infections. J Infect Dis. 183, S84-S86 (2001).
  52. Langermann, S., et al. Vaccination with FimH adhesin protects cynomolgus monkeys from colonization and infection by uropathogenic Escherichia coli. J Infect Dis. 181, 774-778 (2000).
  53. Langermann, S., et al. Prevention of mucosal Escherichia coli. infection by FimH-adhesin-based systemic vaccination. Science. 276, 607-611 (1997).
  54. Alteri, C. J., Hagan, E. C., Sivick, K. E., Smith, S. N., Mobley, H. L. T. Mucosal Immunization with Iron Receptor Antigens Protects against Urinary Tract Infection. Plos Pathogens. 5, (2009).
  55. Russo, T. A., et al. The siderophore receptor IroN of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. is a potential vaccine candidate. Infect. Immun. 71, 7164-7169 (2003).
  56. Schwartz, D. J., et al. Positively selected FimH residues enhance virulence during urinary tract infection by altering FimH conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15530-15537 (2013).
  57. Czaja, C. A., et al. Prospective cohort study of microbial and inflammatory events immediately preceding Escherichia coli. recurrent urinary tract infection in women. J Infect Dis. 200, 528-536 (2009).
  58. Chen, S. L., et al. Genomic Diversity and Fitness of E. coli. Strains Recovered from the Intestinal and Urinary Tracts of Women with Recurrent Urinary Tract Infection. Science Translational Medicine. 5, 2013 (2013).
  59. Schilling, J. D., Mulvey, M. A., Vincent, C. D., Lorenz, R. G., Hultgren, S. J. Bacterial invasion augments epithelial cytokine responses to Escherichia coli. through a lipopolysaccharide-dependent mechanism. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 166, 1148-1155 (2001).
  60. Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population Dynamics and Niche Distribution of Uropathogenic Escherichia coli. during Acute and Chronic Urinary Tract Infection. Infect. Immun. 79, 4250-4259 (2011).
  61. Chan, C. Y., St John,, L, A., Abraham, S. N. Mast Cell Interleukin-10 Drives Localized Tolerance in Chronic Bladder Infection. Immunity. 38, 349-359 (2013).
  62. Justice, S. S., Lauer, S. R., Hultgren, S. J., Hunstad, D. A. Maturation of intracellular Escherichia coli. communities requires SurA. Infect. Immun. 74, 4793-4800 (2006).
  63. Justice, S. S., Hunstad, D. A., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Filamentation by Escherichia coli. subverts innate defenses during urinary tract infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19884-19889 (2006).
  64. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli. in urinary tract pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 1333-1338 (2004).
  65. Guiton, P. S., Hannan, T. J., Ford, B., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. Enterococcus faecalis. Overcomes Foreign Body-Mediated Inflammation To Establish Urinary Tract Infections. Infect. Immun. 81, 329-339 (2013).
  66. Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder. Journal of Immunology. 176, 3080-3086 (2006).
  67. Rosen, D. A., Hung, C. -S., Kline, K. A., Hultgren, S. J. Streptozocin-induced diabetic mouse model of urinary tract infection. Infect. Immun. 76, 4290-4298 (2008).
  68. Daneshgari, F., Leiter, E. H., Liu, G., Reeder, J. Animal Models of Diabetic Uropathy. Journal of Urology. 182, S8-S13 (2009).
  69. Guiton, P. S., et al. Combinatorial Small-Molecule Therapy Prevents Uropathogenic Escherichia coli. Catheter-Associated Urinary Tract Infections in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56, 4738-4745 (2012).
  70. Totsika, M., et al. A FimH Inhibitor Prevents Acute Bladder Infection and Treats Chronic Cystitis Caused by Multidrug-Resistant Uropathogenic Escherichia coli. ST131. Journal of Infectious Diseases. 208, 921-928 (2013).

Tags

Medisin , UPEC, Uropathogenic kateter urinveisinfeksjon IBC kronisk blærekatarr

Erratum

Formal Correction: Erratum: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model
Posted by JoVE Editors on 08/18/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. The Protocol section has been updated.

The ethics statement has been updated from:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20120216, which was approved 01/11/2013 and expires 01/11/2016. Overall care of the animals was consistent with The guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

to:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20150226, which expires 12/10/2018. Overall care of the animals was consistent with The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

Step 3 has been updated from:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a 32 ounce glass jar containing a tea-infuser ball with cotton balls soaked with 3 ml of isoflurane or vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a jar or vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    NOTE: If glass jar with tea-ball and/or nose cone with isoflurane-soakd cotton balls are used, the animal must be carefully observed to avoid anesthetic overdose and death. The advantage of using a vaporizer and anesthesia chamber is that it provides controlled isoflurane administration that avoids accidental overdoses. CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the jar/vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) or 50 ml conical tube with a cotton ball containing a small amount (approximately 1-2 ml) of isoflurane.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.

to:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) to maintain anesthetization.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.
Etablering og karakterisering av UTI og CAUTI i en musemodell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Conover, M. S., Flores-Mireles, A.… More

Conover, M. S., Flores-Mireles, A. L., Hibbing, M. E., Dodson, K., Hultgren, S. J. Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. J. Vis. Exp. (100), e52892, doi:10.3791/52892 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter