Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Fare Modelinde Kuruluş ve İYE ve CAUTI Karakterizasyonu

Published: June 23, 2015 doi: 10.3791/52892
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Microbiology and Center for Women's Infectious Disease Research, Washington University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Abstract

İdrar yolu enfeksiyonları (İYE) son derece yaygın bir morbidite nedenidir ve antibiyotik tedavisine giderek dirençlidir. Dişiler orantısız İYE tarafından tutulmuş olan: Bütün kadınların% 50'si yaşamları boyunca bir İYE olacak. Ayrıca, ilk İYE yaşam, ağrı ve rahatsızlık, günlük faaliyetlerin bozulması kalitesinde ciddi bozulma bazı acı sık nüks ile nüks yaşayacaktır var bu kadınların% 20-40, sağlık maliyetleri artmıştır ve birkaç tedavi seçenekleri diğer uzun süreli antibiyotik profilaksisi daha. Üropatojenik Escherichia coli (UPEC) İYE edinilen toplumun temel etkenidir. Kateter ilişkili ÜSE (CAUTI) bir milyon yılda ABD'de olaylar ve dramatik sağlık masrafları için muhasebe en yaygın hastane kökenli bir enfeksiyondur. UPEC ayrıca CAUTI birincil nedeni iken, diğer etkenler de dahil olmak üzere Enterococcus artan öneme sahiptirfaecalis'in. İşte bu insan hastalıklarının klinik özellikleri birçok recapitulate iki köklü fare modellerini kullanmaktadır. İYE için, C3H / HeN modeli konak yanıtları, IBC oluşumu ve ipliklenmenin dahil insanlarda gözlenen UPEC virulans özellikleri birçok özetlediği. CAUTI, kateter, mesane implantlar korumak C57BL / 6 fareleri kullanan bir model için, E. duyarlı olduğu gösterilmiştir faecalis'in mesane enfeksiyonu. Bu temsili modeller yeni terapötik ve yönetim veya önleme stratejilerinin geliştirilmesine öncülük etmektedir İYE hastalığın patogenezinde içine çarpıcı yeni anlayışlar kazanmak için kullanılmaktadır.

Introduction

İdrar yolu enfeksiyonları (İYE) en sık görülen bakteriyel enfeksiyon hastalıklarından biridir ve İYE edinilen kazanım, toplum ve hastane kaynaklı mekanizmasına dayanan iki kategoriye ayrılabilir. Toplum kökenli İYE sık sık aksi takdirde sağlıklı kadın ve çalışmalarda meydana kadınların yaklaşık% 50'si yaşamları 1 en az bir İYE olacaktır göstermiştir. Ayrıca, nüks önemli bir sorundur. Bir başlangıç ​​akut enfeksiyon olan bir kadın antibiyotik tedavisi ve birçok kadın sık nüks 2 yaşamaya devam uygun olmasına rağmen altı ay içinde ikinci bir enfeksiyonu olan bir% 25-40 şansı var. Bu enfeksiyona neden olan bakteriler de giderek daha fazla antibiyotiğe dirençli karıştırıcı tedavi protokolleri 3-6 hale gelmektedir. İYE hastalığın etkilerini ve yaygınlığını vurgulayan ABD'de sağlık ile ilgili giderler yaklaşık 2,5 milyar dolara mal bireylerin milyonlara her yıl etkiler1,7 .Nosocomial esas olarak kalıcı kateter gibi yabancı cisimlerin varlığı ile ilişkilidir İYE satın almıştır. Kateter ilişkili İYE (CAUTI) bu tür enfeksiyonların 8% 70-80 ~ muhasebe, İYE edinilen en sık görülen hastane kalır. Ayrıca, CAUTI artmış morbidite ve mortalite ile ilişkili ve ikincil kan dolaşımı enfeksiyonlarının 9 en sık nedenidir olduğunu.

İYE edinilen UPEC ilişkili topluluk cinsel ilişki, kötü hijyen veya farklı konak arasındaki diğer mikrobik nüfus dinamikleri sırasında mekanik manipülasyonu yoluyla gastrointestinal sistemde rezervlerden mesane içine bakterilerin giriş kaynaklandığı 10'a nişler düşünülmektedir. Bir kez mesane içinde UPEC kapsül, demir toplama sistemleri, toksinler, bir virülans plazmid, tRNAs, patojenite adaları ve patogenezde rol oynadığı gösterilmiştir kolonizasyon faktörleri de dahil olmak üzere çok sayıda virülans faktörleri, istihdam <sup> 11-14. UPEC kolonizasyon kurulması için kritik, UPEC da stereokimyasal özgüllük 15 reseptörlerini tanıyan yapışkan hastabakıcı usher yolu (CUP) pili çok tip kodlar. FimH adezin uçlu tip 1 pili, UPEC ile ifade edilmektedir ve her ikisi de, insan ve fare keseli 18 lümen yüzeyi üzerinde ifade edilir uroplakins 16 ve α-1, β-3 integrinleri, 17 manosile bağlar. Bu FimH aracılı etkileşimler bakteri kolonizasyonu ve yüzeyel epitel hücrelerinin 19,20 işgali kolaylaştırmak. Tek bir bakteri hızla olgunlaşması üzerine, ~ 10 4 bakteri 21 içerebilir bir hücre içi bakteri topluluğu (IBC) oluşturmak için bölebilirsiniz nereye kez hücre içinde, UPEC sitoplazmaya kaçabilir. IBC formasyonu en az altı farklı fare soylarında gösterilmiştir, C3H / Hen, C3H / HeJ, C57BL / 6, FMA, FVB / NJ ve BALB / c ve farklı UPE bir çok çeşitliC suşları ve diğer Enterobacteriaceae 22-24. Ancak IBC formasyonunun zamansal ve uzamsal farklılıklar fare arka plan ve enfekte UPEC gerginlik bağlı olarak değişebilir. C3H Giriş / prototip UPEC ile enfekte HeN fareler UTI89 suşları veya CFT073, IBC formasyonu gibi erken 3 HPI (saat sonrası enfeksiyonu) gibi bakterilerin küçük biyokütlelerin olarak görüntülenebilir. Bu topluluk genişletmeye devam ediyor ve çubuk şekilli bakteriler terminal farklılaşmış yüzeysel şemsiye hücrelerinin sitoplazmik alan büyük bir yüzdesini işgal zaman kalkınma yaklaşık 6 HPI bir "orta noktası" ulaştığında benzer boyutları görüntüleyen çoğunluğu ile nispeten senkron bir şekilde bu erken IBC formu ve morfolojisi. ~ 8 hpi bir basilinin gelen IBC değişim bakteri morfolojisi koklar için. IBC doğada geçicidir. Böylece, bakteriyel nüfusunun sürekli genişleme 12-18 hpi sonuçlarından IBC olgunlaşma, hücre wi dışarı onların ipliklenmenin ve dağılma ardındankomşu hücreler 23 sonraki yayılmasını th. Bu nedenle, IBC hücresi konak bağışıklık tepkilerinin ve antibiyotikler 25 korunmuş bir ortamda hızlı bir bakteri büyümesi sağlar. farelerde görülür UPEC enfeksiyonun farklı aşama, aynı zamanda, insanlarda 22,26-28 İYE modellemek için kullanılabilecek yararlı bir araç olarak İYE fare modelini destekler, bu IBC ve ipliklenmenin olarak insanlarda görülür.

Kadınların çoğunluğu yaşamları boyunca bir İYE yaşarken, bu enfeksiyonların sonucu sık tekrarlayan sistit, hiçbir nüks akut kendini sınırlayan enfeksiyon uzanabilir. Dahası, çalışmalar genetik bir bileşeni İYE yatkınlık 29 katkıda düşündüren, İYE güçlü ailesel geçtiği gösterilmiştir. Biz kliniklerde görülen farklı İYE sonuçları kendilenmiş fare suşlarının 30 arasında deneysel UPEC enfeksiyonu farklı sonuçların tarafından yansıtılmış olabilir bulduk. Örneğin, C3H / HeN, FMADBA ve C3H / HeOuJ fare bulaşıcı bir doza bağlı bir şekilde, kalıcı, yüksek titre bakteriler (> 10 4 koloni oluşturan birim (CFU) / ml), yüksek titre bakteriyel özelliği uzun ömürlü, kronik sistit, duyarlı kurban mesane yükü> 4 hafta sonrası enfeksiyon (TEFE), kronik inflamasyon ve ürotelyal nekroz. Bu fareler de kronik sistit gelişimi için biyobelirteçleri olarak hizmet ilk 24 HPI içinde IL-6, G-CSF, KC ve IL-5 serum seviyelerini gösterir. Plasebo çalışmaları İYE sistit ilk belirtiler sonra birkaç hafta boyunca kendi idrarda bakteri yüksek düzeyde tutacaktır karşılaşan kadınların büyük bir yüzdesi antibiyotik tedavisi 31 verilmediği takdirde göstermiştir ki gibi bu doğru, bazı kadınlarda İYE doğal seyrini temsil edebilir , 32. Dahası, C3H / HeN fareleri kullanılarak, kronik sistit öyküsü sonraki şiddetli tekrarlayan enfeksiyonlar için önemli bir risk faktörü olduğunu gördük. Tekrarlayan İYE çoğu si iseİYE ve C3H / HeN fare gnificant klinik bulgusu şu anda önceki maruz kaldıktan sonra artan yatkınlık özetlediği tek okudu modeldir. İkinci İYE sonuç Akut UPEC enfeksiyonu yaklaşık bir hafta içinde mesane iltihabı ve bakteriüri çözünürlüğe sahip, kendini sınırlayan nerede C57Bl / 6 fareler değinmeyecek. İlginç olarak, bu modelde, UPEC kolaylıkla UPEC potansiyel insanlarda 33 aynı suşu tekrarlayan İYE dair bir yöntemi, 34 açıklayan bir aktif İYE yeniden başlatmak için atıl bir durumda ortaya çıkan yeteneğine sahip olan mesane dokusu içinde hareketsiz hücre içi rezervuarlar oluştururlar.

İYE duyarlılık genetik etkilere ek olarak, mesane içine bir kateter giriş büyük bir enfeksiyona sahip olarak bir enfeksiyon neden olabilecek bakteri dizi artan olasılığını artırır. Bu insan idrar kateterizasyon histolojik neden olduğu gösterilmiştir venedeniyle mekanik sağlam bir inflamatuvar yanıt ile sonuçlanan stres, pul pul dökülme, lamina propria ve submucusa, ürotelyal incelme ödem ve ürotelyum ve böbrek 35,36 mukozal lezyon mesanede immünolojik değişiklikler. Buna ek olarak, kateter ve böylece CAUTI neden çeşitli türleri tarafından kullanılan bir ortam yaratmak bakteriyel bağlanması için bir yüzey temin eder. UPEC hala büyük bir katkı olmakla birlikte, Enterococcus faecalis bu CAUTI 37% 15 oluşturmaktadır. E. faecalis ciddi bir sağlık sorunu 38 poz, direnç ortaya çıkması vankomisin ile antibiyotiklere dirençli giderek hale geliyor. E. faecalis toksinler ve kateter ve epiteline 38 hem tutturmak için gerekli adezinler dahil olmak üzere birçok virülans faktörleri sahiptirler. Üriner kateterizasyon sırasında, ev sahibi idrar yolu 39,40 mikrobiyal yapışma, çarpma ve yayılması savunmasızdır. E. faecabir mekanizmanın parçası mesane inat ve bir fare CAUTI modelinde 41 çoğaltılamaz böbrekler için yaymak olarak lis kateter üzerinde bir biyofilm oluşturmaktadır. Son zamanlarda, üriner kateter içinde gösterilmiştir, fibrinojen (FG) enflamatuar yanıtın bir parçası olarak mesane içine salınır. Fg mont kateter mesanede birikir ve E. için önemlidir faecalis biyofilm oluşumu, bir ek iskele olarak işleyen. CAUTI bir C57BL / 6 fare modelinde, o keşfettik E. faecalis biyofilm kateter üzerinde oluşumu ve mesane böylece sebat, özellikle ucu adhesin EbpA EBP pilus bağlıydı. Biz EbpA N-terminal alanı, özellikle kateter kaplama FG bağlanır olduğu bulunmuştur. Buna ek olarak, tespit E. faecalis enfeksiyon sırasında metaboliti kaynağı, böylece biyofilm oluşumunu 42 artırılması olarak FG kullanır.

Fare model under kritik kanıtlanmıştırzanmıştır yanı sıra idrar yolu enfeksiyonu ve CAUTI 41 klinik belirtilerini tahmin. Bu yazıda sistit UPEC inokulum hazırlanması göstermek UTI89 ve C3H / HeN farelerin transüretral aşılama izole. Ayrıca, E. kateter C57BL / 6 farelerinde yerleştirilmesi ve aşılama için bir protokol göstermektedir faecalis'in OG1RF süzün. Bu tekniklerin her ikisi de farelerde tutarlı ve güvenilir üriner veya CAUTI yol açar. Biz de kronik veya tekrarlayan sistit analizi için akut sistit ve idrar toplama sırasında IBC oluşumunu gözlemlemek için kullanılan teknikleri gösterilecek. C3H / HeN fareler ilk bakteri istilası, IBC formasyonu, ipliklenmenin ve kronik sistit 23,33,43 geliştirilmesi dahil olmak üzere UPEC patogenezinde yönlerini incelemek için kullanılmıştır. Bu hastalık oluşturma parametreleri de diğer fare arka 22,33 çeşitli çalışmalar yapılmıştır. CAUTI için C57BL / 6 modeli müteakip bakteriyel işbirliği ile mesane içine yabancı cisim implantasyonu için izin verir7 gün boyunca muhafaza edilebilir lonization, enfeksiyon sonrası 41. Bu modeller daha sonra değinmeyecek veya klinik insan popülasyonlarında gözlenmiştir çok olan konak yanıtları, yıkmak için bakteriyel hastalık mekanizmaları, İYE ev sahipliği yanıtları ve mekanizmaların değerlendirilmesi için yararlı olmuştur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik bildirimi: Washington Üniversitesi Hayvan Çalışmaları Komitesi 2013/01/11 onaylanmış ve 2016/01/11 sona eriyor oldu protokol numarası 20120216, bir parçası olarak, tüm fare enfeksiyonları ve prosedürleri onayladı. Hayvanların genel bakım Ulusal Araştırma Konseyi ve USDA Hayvan Bakım Kaynak Kılavuzu Laboratuvar Hayvanları Bakım için rehber ve Kullanım ile uyumlu idi. Ötenazi prosedürleri ile tutarlı "Hayvanlar 2013 sürümü için Ötenazi için AVMA kurallarına".

1. UPEC İYE Protokolü, Aşılanması İğne Hazırlama (Şekil S1)

  1. 30 G iğne kapağını çıkarın. Iğne miline PI10 boru yaklaşık 1 inç geçirin. Gecede iğne meclisleri sterilize, UV. Kateterize iğneler steril petri tabaklarında süresiz olarak saklanabilir.

2. UPEC bakteriyel inokulum hazırlanması

  1. UTI89 inokulum hazırlayın (aşı öncesinde 72 saat başlatmakyon gün)
    1. Dondurulmuş stoktan LB (Luria-Bertani) agar plaka üzerine Streak UTI89. 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin. Bir koloni seçin ve 125 ml'lik bir flask içinde, 10 ml LB içine inoküle. Statik, 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
    2. Statik, 37 ° C'de ilave bir 24 saat boyunca yeni 125 ml'lik bir flask içinde LB 10 ml, gece boyunca kültürün 10 ul inoküle.
    3. Transferi 3 ml 3 dakika boyunca 7.000 xg'de steril 1.5 ml tüplere ve santrifüj (zorlanma ve istenen inokulum boyutuna göre değişir) ve 1x PBS pelet ve santrifüj ikinci kez tekrar süspansiyon. PBS 1x 1 ml bakteri pelletini.
  2. Bakteriyel optik yoğunluk ölçün ve istenen inokulum yoğunluğu konsantrasyon ayarlayın. kullanılan inokulum standart konsantrasyonu 10 7 bakteri; Ancak, bu çalışmanın tasarımı sayesinde değişebilir.

3. Bakteriyel Aşılama

  1. % 70 etanol ve c iş istasyonu temizleyin(steril akış kaputu kullanın veya) emici kağıt ile alana.
  2. 1 ml (TB) şırıngaya hazırlanan bakteri inokulum 0.9 ml kadar çizin (hava kabarcıkları). Sonra steril polietilen boru döşeme, inokulum içeren şırınga üzerine, PI10 boru ile bir hazırlanan steril aşılama iğne takın.
    NOT: mesane delinmesiyle önlemek için iğne ucu yukarıda boru 1 mm bırakın.
  3. Parafilm 1 inç kare parça kesin ve üstüne cerrahi kayganlaştırıcı bir dab (bir kuruş yaklaşık boyutu) koyun.
  4. Kadar (protokol üretmektedir takiben) izofluran veya buharlaştırıcı odasının 3 ml ile ıslatılmış pamuk topları ile bir çay demlik topu içeren 32 onsluk cam kavanoz koyarak dişi C3H / HeN fareler anestezi bilinçsiz ama hala normal nefes (1 nefes / sn) .
    NOT: Bazı IACUC komiteleri bir kavanoz ya da buharlaştırıcı kullanımını tasvip etmiyoruz. Kurumunuzun IACUC komitesinin göstergesini takip ediniz.
    NOT: Eğer cam kavanozizofluran-soakd pamuk topları kullanıldığı çay-top ve / veya burun konisi ile hayvan dikkatlice anestezik doz aşımı ve ölümleri önlemek için dikkat edilmelidir. Bir buharlaştırıcı ve anestezi odasına kullanmanın avantajı yanlışlıkla aşırı doz önler kontrollü izofluran yönetimini sağlamasıdır. DİKKAT: İsofluranın bir inhalasyon anestezik. İyi havalandırılan bir alanda kullanın ve inhalasyon en aza indirmek.
  5. Kavanoz / buharlaştırıcı fareyi çıkarın ve bir kağıt havlu üzerine sırtında üzerine yerleştirin ve bacaklarını yayıldı.
  6. Bir burun konisi olan fare burun küçük bir miktar ihtiva eden bir pamuk (yaklaşık 1-2 ml veya 50 ml konik tüp (kontrollü isoflurance bir buharlaştırma birimleri donatılmıştır doz sunar buharlaştıncıya bağlı bir tüp) Kapak ) izofluran.
  7. Yavaşça idrar neden ve işeme mesane sağlamak için mesane palpitate. % 100 etanol silin ile periüretral alanı silin. Içine, ilk aşılama iğne / şırınga gelin dabCerrahi yağlayıcı.
  8. , Transüretral aşılama iğne takmadan yaklaşık 12 mm, ve mesane yavaşça (10 ul / sn) içine inokulum dağıtmak için hafifçe şırınga pistonu bastırarak bakteri solüsyonu 50 ul her fare inoküle edin. Fare aşılama iğne çıkarın.
    NOT: aşılamak başlayan üretral açılışında inokulum derhal iade iğnenin yanlış veya eksik ekleme gösterir.
  9. Burun konisi fareyi çıkarın ve kafesine geri. Yineleyin her fare için 3,3-3,8 adımları. Inokulum koşulları / suşları anahtarlama eğer / ne zaman, onaylanmış bir kesici kapta şırınga ve iğne aşılama imha ve yeniden 3.2 adım başlar.
    NOT: üropatojenik organizmalarla aşılama genellikle şiddetli ağrı belirtilerine neden olmaz. Ancak nadir durumlarda, patojenlerin yüksek dozlarda tatbik ateş, gıda ve su alımı ve anormal davranışları azalmaya neden olabilir. BirNimal sağlık deney boyunca izlenmelidir. Aşikar ağrı semptomları bildirimi, örneğin Buprenorfin (0.05-0.1 mg / kg verilen deri altına) olarak, bir ağrı kesici, varsa, uygulanabilir. Prosedürler her kurumun IACUC uygun olmalıdır.

Bakteriyel Yüklerin 4. Belirlenmesi

  1. Her mesane ve böbrekler çifti hasat edilmesi için ayrı 5 ml tüpler hazırlayın. 1x PBS / tüp / fare mesane 1ml ekleyin hasat edilecek. 1x PBS / tüp 0.8 ml ilave edilir / fare böbrek çifti hasat edilmesi. Belirli bir fareye karşılık her tüp etiketleyin. 1:10 seri dilüsyonları için her bir oyuğa 1x PBS 180 ul ihtiva eden bir 96-çukurlu plaka hazırlanması.
  2. % 70 etanol ile çalışma alanını temizleyin ve emici bir kapak veya kağıt havlu ile alanı kapsayacak.
  3. Fare, yaklaşık 1 dakika boyunca nefes duruncaya kadar izofluran ile fare anestezisi sonra emici kapağı veya kağıt havlu üzerine koyun, (adım 3.4). Euthana diğer yöntemlersia aynı zamanda, karbon dioksit gibi IACUC komite tarafından kabul edilir, ve izofluran doz aşımı için ikame edilebilir.
  4. Baş üssünde boyun kısıtlama ve yatay vücuttan çıkık oluşana kadar kuyruk çekme oluşur hızlı servikal dislokasyon ile fare Kurban.
    NOT: Çoğu IACUC komiteleri ötanazi ve servikal dislokasyon ikincil aracı gerektiren yaygın bir yöntemdir. IACUC komitesi tarafından onaylandı Ancak, diğer yöntemler de kullanılabilir.
  5. Sırtında ölü fare yerleştirin ve karın% 70 etanol sprey. Fareyi teşrih, böbrek diseksiyonu aşağıdaki kandan potansiyel kontaminasyonu en aza indirmek için bu sırayla, mesane ve böbreklerde hasat. 1x PBS içeren hazırlanmış 5 ml tüpler içine bağımsız organlar yerleştirin (adım 4.1).
    NOT: Harici diseksiyon ve organ toplama kontaminasyonu minimize etmek için farklı makas kullanın.
  6. Organlar t sağlamak için tüp dokununO PBS 1x. Her fare için yineleyin 4,3-4,5. Temiz makas ve her bir farenin sonra% 70 etanol içinde forseps.

5. Bakterilerin Kurtarma

  1. , Bir doku homojenleştirici ile böbrek başına 15 saniye ve mesane 30 saniye 5 ml tüpler hasat kesesi ve böbrek homojenize edilir. 1x PBS,% 70 etanol ve örnekler arasında 1x PBS homojenizer sekans durulayın.
  2. 10 -8 dışarı seri 01:10 dilüsyonları yapın ve LB agar plakaları üzerinde CFU için her seyreltme (koloni oluşturan birim) plaka. 37 ° C'de plakaları gece inkübe ve koloniler ertesi gün saymak.

6. IBC numaralandırma

  1. Aseptik mesane çıkarın ve bir silikon alt kısma sahip bir 6-yuvalı plaka içindeki 1 x PBS içinde yerleştirin. Plakalar, bir silikon elastomer kiti kullanılarak ve de her biri yaklaşık olarak silikon 1 cm dökme hazırlanabilir, bkz talimatları üretmektedir. Makas kullanılarak yarısında mesane kesin.
  2. Küçük metal işaretçilerine kullanma hafifçe blad splayder, böylece mesane lümen yukarı bakacak. Ürotelyumun maksimum miktarda maruz sağlamak için mesane bölümlerinin dış kenarlarında işaretçilerine yerleştirmek için emin olun.
  3. Yayvanlaşmasıyla sonra, yavaşça 1x kez PBS ile mesane yıkayın. Pipet ile 1x PBS çıkarın. Tüm yayvan mesane karşılamak için yeterli% 3 paraformaldehid ekleyerek mesane sabitleyin. DİKKAT: Paraformaldehyde kanserojen olduğunu. Eldiven içeren uygun koruyucu donanım, her zaman giyilmelidir. Bertaraf kurumsal kurallara uymalıdır.
  4. 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. Paraformaldehit çözüm çıkarın. 1x bir kez PBS ile yıkayın.
  5. (PBS 1X 2 mM MgCl2,% 0.01 sodyum deoksikolat ve% 0.02 Nonidet-p40in) LacZ yıkama çözeltisi, yıkama başına 5 dakika için üç kez yıkayın.
  6. Yeterince LacZ leke yıkama solüsyonu çıkarın ve ekleme (9.5 mi LacZ yıkama çözeltisi, 0.4 mi 25 mg / ml X-gal ve 100 mM K-ferrosiyanür / K-ferrisiyanür 0.1 mi) mesane kapsayacak. 30 ° C overni inkübeışıktan koruyarak GHT.
  7. Inkübatör yayvan mesane çıkarın ve diseksiyon kapsamı, 40-60X büyütme ile görüntülendi gibi mavi puncta görünür IBC, gözlemlemek.
    NOT: Bazen fare üretranın altında tüpün yerleştirilmesi öncesinde idrar olabilir. Bu durumda, yeniden idrar toplamak için denemeden önce 15-20 dakika bekleyin.

7. İdrar Bakteriüri CFU Sayımı İçin Toplama (CAUTI için Uygulanamaz)

  1. İdrar öncesi toplamak veya enfeksiyonu yayınlamak için yavaşça (fare kafesinin üst) kuyruğunu tutan ve düz bir yüzeye yükseltilmiş üzerine yerleştirerek fare dizginlemek.
  2. Fare üretranın altında steril 1.5 ml tüp tutun. Yavaşça mesaneye baskı uygulamak için kuyruk yakın farenin arkasına bastırın. 1.5 ml tüp idrar yakalayın.
  3. 10 -7 dışarı seri 1:10 dilüsyonları yapın ve uygun LB her seyreltme plaka 37 ° C'de plakaları gece inkübe ve koloniler ertesi gün saymak.

8. CAUTI Modeli Protokol, CAUTI Modeli için Kateter İğne Hazırlık (Şekil S2)

  1. 30 G iğne kapağını çıkarın. PE10 boru ve RenaSIL gibi silikon boru 5 mm büyüklüğündeki bir 7 mm parça kesin. Boru iğne tabanını dokunana kadar PI10 boru ile iğne geçirin.
  2. Daha sonra PE10 içeren iğne üzerine 5 mm parça besleme. Gecede iğneler derlemeleri sterilize, UV.
    NOT: silikon tüp yüklerken, iğne ucu geçmiş uzanan boru yaklaşık 1 mm bırakın.

9. E. faecalis OG1RF bakteriyel inokulum hazırlanması

  1. Aşılama gün önce 48 saat başlangıç ​​OG1RF inokulum hazırlayın. Donmuş stoktan bir BHI (Beyin Kalp infüzyonu) plakası üzerine Şerit OG1RF.
  2. Bir koloni seçin ve BHI 10 ml içine aşılamak ve 37 ° C'de 18 saat süreyle statik büyümek. Kültür santrifüj ve steril 1 x PBS içinde 1 ml hacim pelet (3 kez) yıkama.
  3. 1x PBS içine bakteri pelletini. Bakteriyel optik yoğunluk ölçün ve istenen inokulum boyutuna konsantrasyonunu ayarlayın. kullanılan inokulum standart konsantrasyonu 10 7; Ancak, bu çalışmanın tasarımı nedeniyle değişebilir

10. Kateter Yerleştirilmesi

  1. % 70 etanol ile iş istasyonu temizleyin ve bir emici kapak alanı ile kapak (ya da steril akış kapağı kullanın).
  2. Boş 1 ml (TB) şırınga kateter iğne takın. Parafilm 1 inç kare parça kesin ve üstüne cerrahi kayganlaştırıcı bir dab (bir kuruş yaklaşık boyutu) koyun.
    Not: iki farklı iğneler katetere bağlı implantasyonu için gerekli olan mekanik manipülasyon kateterin biriktirme ve minimize yanlışlıkla aşılama için aşı için kullanılmıştır. Bu aynı zamanda daha az aşılama iğneleri hazırlama kolaylık sağlar.
  3. Bir çay içeren 32 onsluk cam kavanozda koyarak C57BL / 6 fareler anesteziizofluran veya buharlaştırıcı odasının 3 ml batırılmış pamuk topları ile -infuser top bilinçsiz ama hala normal nefes (1 nefes / sn) kadar (aşağıdaki protokol üretmektedir).
  4. Sonra bir kağıt havlu üzerine sırtında fare koymak ve bacaklarını yayıldı. Küçük bir miktar izofluran (yaklaşık 1-2 ml) içeren pamuk topları ile bir burun konisi veya 50 ml konik tüp ile fare burun örtün.
    DİKKAT: İsofluranın bir inhalasyon anestezik. İyi havalandırılan bir alanda kullanın ve araştırmacı tarafından solunmasını en aza indirmek.
  5. Yavaşça idrar neden ve işeme mesane sağlamak için mesane palpitate. % 100 etanol silin ile periüretral alanı silin.
  6. Bir pamuk uçlu aplikatör kullanarak% 10 povidon-iyot çözeltisi ile periüretral alan dezenfekte edin. Cerrahi yağlayıcı içine ilk aşılama iğne / şırınga gelin hafifçe sürün.
    Not: Povidine-iyot alkol daha kuvvetli bir aseptik çözelti, kateter yerleştirilmesi için kullanılır. Kateter implantasyonu gerektirirdaha fazla mekanik manipülasyon kateter ve kirlenme dolayısıyla daha büyük bir potansiyele eklemek için.
  7. Üretral kateter deliğe yerleştirin. Bir kez, cımbız kullanın dolayısıyla (5 mm silikon), küçük kateter itme ve mesane içine yatırılması, mesane doğru (7 mm PI10) uzun bir parça itmek için. Hemen hala bağlı 7 mm boru ile, iğne çıkarın.

11. Bakteriyel Aşılama

  1. Burun konisi fareyi çıkarın ve kafesine geri bölüm 9. itibaren hazırlanan inokulum kullanarak, bölüm 3 bakteriyel aşılama protokolü takip

Kurban Her Zaman Noktasında 12.

  1. Mesane ve böbrek 5 ml tüpler (organlar adım 4.1 izleyin için) ve kateter 1.5 ml Eppendorf tüp hazırlayın. Kateter numune için 1.5 ml'lik Eppendorf tüpü içine 1 x PBS içinde 1 ml ilave edilir
  2. Adımları 4,3-4,5 izleyin. Mesane, böbrek ve kateter hasat, fare teşrih, pla1x PBS ve 1.5 ml Eppendorf içine kateter (adım 12.1 bakınız) ihtiva eden 5 ml tüpler içine, bağımsız bir doku dans ediyorum.
    NOT: Harici diseksiyon ve kirlenmeyi en aza indirmek için organ toplama ve kateter alımı için farklı bir makas kullanın
  3. Sonra adım 4.6 izleyin.

13. Bakteriyel Kurtarma

  1. Organları için adımları 5.1 ve 5.2 izleyin. 30 saniye boyunca maksimum hızda bakteri kateterler kurtarma, vorteks için 5 dakika ilave bir 30 saniye boyunca maksimum hızda sonra vorteks banyo sonikatör kullanarak ve kateter örnekleri sonikasyon.
  2. 10 -8 dışarı seri 01:10 dilüsyonları yapın ve BHI plakaları üzerinde CFU sayımı için her seyreltme plaka. Gece boyunca 37 ºC inkübe ve koloniler ertesi gün saymak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

komplikasyonsuz ve kateter ilişkili İYE intravezikal modelleri bu ortak ve pahalı enfeksiyonları yönetmek bakteriyel patogenezi, konak dokusunda bu hastalıkların etkisi, ve geliştirme ve yeni yaklaşımların test moleküler mekanizmaların için esnek platformlar sunmak. Fare zorlanma ve patojene bağlı olarak, intravezikal aşılama akut başlatmak veya modüle edilmesi için gerekli faktörleri (Şekil 1 ve 3), kronik veya tekrarlayan (Şekil 2) sistiti aydınlatmak için konak-patojen etkileşimleri çalışmak için kullanılabilir. Şekil 1 'de gösterilen veriler, prototipik UPEC sistit akut aşamasında (24 HPI), üriner sistemin kolonizasyonunu temsilcisi UTI89 44 izole eder. Aşılama sonrası, enfeksiyonlar 24 fareler kurban edilir ve bu noktada en sıcak ve homojenize kesesi ve böbrek dokusu için gelişmeye bırakıldı. Doku homojenatları seri olduğu zaman dilüe olabilme vardıred ve kolonize bakterilerin sayımı için kaplama. Kronik UPEC kolonizasyonu ve mesane iltihabı kurulmuş ve enfeksiyöz doz ve Üropatojen bağlı bir şekilde, bazı fare hatları (özellikle C3H / HeN) 'de muhafaza edilebilir. Kronik sistit kalıcı yüksek titre bakteriüri olarak tanımlanmaktadır (> 10 4 CFU / ml), mesane iltihabı ve yüksek titre bakteri mesane yükü (> 10 4 CFU / mesane) kurban 33.. Şekil 2'de gösterilen veriler UTI89 2 x 10 7 CFU ile C3H / HeN fare aşılamadan 4 hafta sonra ortaya çıkan Örnek CFU bulunmaktadır. Farelerin geri kalan% 50-80 enfeksiyonu gidermek için ise, bu deney koşulları altında, enfekte edilmiş farelerin% 20-50, kronik sistit geliştirir. Sonucun Bu ikilik ilk 24 HPI içinde karar verilir, bir konak-patojen kontrol noktasında bağlıdır. Tezahür etmeye başlar bakteriyel titreleri gözlenen bimodal dağılımı, denetim noktası sonuçların aktivasyonu (veya değil)kurban 28 dpi çözünürlükte 3 dpi (gün sonrası enfeksiyon) ve mesane de idrar (Şekil 2) 33. Ilk enfeksiyon antibiyotik tedavisinin 33 ile temizlendikten sonra kronik sistit öyküsü olan fareler önemli ölçüde meydan üzerine tekrarlayan kronik sistit yatkındırlar. Benzer şekilde, İYE öyküsü insanlarda tekrarlayan idrar yolu enfeksiyonu için bilinen bir risk faktörüdür. Böylece, bu tekrarlayan İYE patogenezi incelemek için kullanılan bilinen tek modeldir. Deneysel alternatif fare geçmişlerindeki İYE modelleme, bu fare suşu bazı suşlar daha fazla veya daha az dirençli bu sendromların 33 gelişmekte olduğu göz önüne alındığında, İYE, tekrarlayan üriner veya CAUTI duyarlı olup olmadığını belirlemek için önemlidir.

Akut sistit ek bir ölçüm IBC numaralandırma olduğunu. IBC formasyonu terminal açıdan farklılaşmış yüzeysel şemsiye hücrelerine sınırlandırılmıştır. IBC miktar Akut kist sırasında bakteriyel yükü bilgilendirici bir ölçüsüdüritis ve IBC yüksek düzeylerde kronik sistit 21 gelişme riski ile ilişkilidir. IBC formasyonu sadece hastalığın akut evrelerinde ortaya çıkar. Yüzeysel şemsiye hücrelerinin pul pul dökülme ardından, IBC gözlenen artık. C3H / HeN İYE modelinde, IBC transüretral mesaneye UTI89 ~ 1 x 10 7 CFU inoküle 6 saat sonra ölçülebilir. Mesane silikon levha metal pim ile açılır ve LacZ ifadesi için boyanır. LacZ, β-galaktosidaz, bölen sık ifade edilen bakteriyel enzim galaktoz ve diğer şekerler arasında β bağlantısı. Bu enzim yarılma üzerine mavi bir renk üretmektedir X-gal, bir β-galaktosid benzeri, tedarik bakterilerin tespit etmek için kullanılabilir. Boyanma ardından, mesaneler çizgilerle (Şekil 3A) sayarak numaralandırılan olabilir IBC ürotelyum ve IBC üzerinde punctae mavi / mor noktalar olarak görünen bir mikroskop altında görüntülenmiş. Iken I sayısıHayvan başına oluşturulan BC ler mesane (Şekil 3B) başına görülür C3H / HeN arka planda, ~ 50 IBC ortalama değişir. Doza bağlı bir şekilde IBC artış. oluşturan IBC'lerin sayısının UPEC ve fare arka plan suşları arasında değişir. Örneğin, C57BL / 6, mesane başına birkaç yüz IBC oluşumunda ~ 1 x 10 7 UTI89 sonuçların bir aşı maddesi.

İYE edinilen komplikasyonsuz topluluk yukarıda modellenmiş ötesinde, sağlık-bakım ilişkili İYE'ler sağlık sisteminin önemli bir yükünü temsil etmektedir. İYE tüm sağlık ilişkili enfeksiyonların yaklaşık% 40'ını temsil eden ve tüm sağlık ilişkili İYE% 95'e kadar kateter 45 ilişkilidir. İşte biz bu zor klinik problemin deneysel analizi için güçlü bir sistemi temsil CAUTI bir mesane implant fare modeli göstermektedir. Şekil 4'de sunulan veriler, bir model E ile 24 saat ön enfeksiyonlarının temsilcisi faecalis s OG1RF tren. 1 x 10 7 OG1RF CFU intravezikal bir unimplanted mesane içine inoküle edildiğinde, enfeksiyon 24 HPI (Şekil 4A) tarafından açık başlar ve 3 dpi ile enfeksiyon 41 karar vermiştir. Tersine, bir implante mesane unimplanted mesanelerdeki gözlenenden daha 24 HPI 10 kat daha yüksek, mesane kolonizasyon seviyeleri ile kateter ve mesane hem kolonizasyonu sonuçları içine OG1RF aşılama (Şekil 4A ve 4B). Buna ek olarak, bu enfeksiyon kateter kaybı yaklaşık 7 dpi 41 kadar, mesanede> 10 6 CFU muhafaza edilmektedir. Açıklanan deneysel tüm modeller de dahil olmak üzere, ancak enfekte doku ve yüzeylerinin makroskopik ve mikroskopik görüntülemesi için çeşitli yaklaşımlar, değiştirilmiş aşı boyutları ve hastalık süresi, rekabetçi enfeksiyonlar için özel değildir, deney esneklik yüksek derecede uygundurlar ve imünolojik analizler ev .

ve_content "> Şekil 1
Şekil 1:. 24 saat idrar yolu kolonizasyonu Kadın, 7-8 haftalık C3H / HeN fareler transüretral prototip UPEC sistit ~ 2 x 10 7 CFU ile 24 saat UTI89 izole aşılandı. Hasat mesane ve böbrek dokuları elde Temsilcisi CFU n gösterilir = 5. Kesikli çizgi algılama (20 CFU) alt limitini gösterir.

Şekil 2,
Şekil 2:. 28 günlük üriner sistem kolonizasyonu Kadın, 7-8 haftalık C3H / HeN fareleri transüretral olarak ~ 2 x 10 7 CFU UTI89 ile aşılanmıştır. İdrar belirtilen gün sonrası enfeksiyon (dpi) olarak toplanmak ve CFU sayımı için kaplama. Temsilci 28 gün mesane ve böbrek titreleri de görüntülenir, n tespiti = 8 İdrar CFU alt limiti (1.000 CFU / ml) kesikli çizgi ile gösterilir. Noktalı çizgi Temsilci Vekilialgılama ts doku alt sınırı, 20 CFU / doku.

Şekil 3,
Şekil 3:. IBC numaralandırma Kadın, 7-8 haftalık C3H / HeN fareleri transüretral olarak yaklaşık 1 x 10 7 CFU UTI89 ile aşılanmıştır. Mesane 6 HPI hasat edildi ve IBC boyama için açılır edildi. LacZ boyandıktan sonra yayvan mesane (A) Görüntü. IBC mavi noktalar olarak temsil edilir. içerlek görüntü siyah kutu içinde görüntü bölümünün bir dijital büyütme olduğunu. (B) 6 HPI C3H / Hen farelerinde oluşan IBC Örnek numaraları, n = 10.

Şekil 4,
Şekil 4: E. faecalis kateter ilişkili İYE. C57BL / 6 fareleri ya da ~ 1 x 10 7 CFU kateterlerin olmayan aşılanmıştır (A), E. faecalis varlığı veya kateter yokluğunda mesane kolonizasyon. (B) E. faecalis'in Kateter kolonizasyonu. Mann-Whitney U testi, fare deneyleri için kullanılan, p <0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. ** P <0.005.

Şekil S1
Şekil S1:. İYE aşılama iğne hazırlık Şeması iğne üzerine kateterin (1), diş gerekli malzemeleri de dahil olmak üzere aşılama iğne hazırlık adımlarını görüntüler (2) ve aşılamadan önce tüp kesme (3).

Şekil S2
Şekil S2:. CAUTI aşılama iğne hazırlık Şeması aşılama kateterin (1), diş gerekli aşılama iğne hazırlık malzemeleri görüntüler (2) ve implantasyon kateter üzerindeiğne (3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Komplike olmayan topluluk İYE birkaç milyon birinci basamak ziyaretleri her yıl 46 için muhasebe yaygın ve masraflı enfeksiyonudur satın aldı. Buna ek olarak, Cautis artık CAUTI 45 edinilen hastaneden kaynaklanan tedavi eklenen maliyet sağlayıcıları tazmin Medicare ve Medicaid Hizmetleri Merkezleri gibi sağlık sağlayıcıları için son derece pahalı hale gelmiştir ortak sağlık edinilen enfeksiyon vardır. Bu protokollerin açıklandığı İYE, hem komplike olmayan sistit ve CAUTI fare modelleri, başlatma bakımı ve İYE çeşitli biçimlerinin sonuçlarını modüle için gerekli host ve patojen etkileşimleri moleküler temelini anlamak için paha biçilmez araçlar sağlar. Bu modeller İYE 23,47-49 analizi için güçlü bir bakteri ve fare genetik, immünolojik, mikroskopi, biyokimyasal ve kimyasal genetik araçlar uygulama için izin verir. Ayrıca, protokoller burada özetlenen bir platform sağladıgelişme ve bakteriyel hastalık oluşturma küçük molekül önleyicileri ve yeni aşılama hedefleri ve stratejileri 50-55 dahil, yeni tedavi edici ve önleyici stratejilerin test.

Komplikasyonsuz sistit modelinin başarılı bir uygulama için muhafaza edilmelidir birçok kritik koşullar vardır. Tüm fare Anesthetization prosedürleri gibi, bakım nedeniyle aşırı anesthetization fare ölümlerini önlemek için alınmalıdır. Aşılama kateter hazırlarken, silikon tüp çok uzun kateter üzerine mesane duvarı zarar verecek yeterli iğne ucu kapak uzun değil olmalıdır. Buna ek olarak, vajinal açıklığın yakınlık ve büyüklüğü nedeniyle, bakım üretra olup, vajina içine aşılama kateter yerleştirmek için dikkat edilmelidir. IBC numaralandırma mesane yayvanlaşmasıyla sırasında, mesaneler beğenme için sabit olması mümkündür, aşağıdaki diseksiyon ve doku olarak hızlı bir şekilde açılır esastırximately 1 saat değil, gece boyunca karıştırıldı. LacZ boyama ile IBC numaralandırma için, söz konusu bakteri ürotelyal hücreli kolonizasyonu sırasında LacZ üretmek de gereklidir. LacZ enzim üretilen değil suşları kullanırken, IBC anti E. immunofloresan mikroskopi kullanılarak numaralandırmak için hala mümkün E. coli antikorlar veya GFP ifade eden bakteriler. Bu modelin bir özelliği, hastalığın ilerlemesi ve farklı akraba fare hatları tarafından sunulan şiddeti farklı şekilleri ve UPEC 33,56 suşları prototip değişen patojen potansiyelidir. Onlar deneysel tasarım ve yorumlama 57,58 komplike ise klinik ve fenotipik çalışmalarda gözlenmiştir konak yatkınlık ve patojen çeşitliliğin doğal varyasyon özetlemek gibi bu farklılıklar bir gücü ve bu tekniğin sınırlama hem de. Bu varyasyonlar ev sahibi ve bakteriyel mechan aydınlatılması için izin karşılaştırma kaynakları sağlamakizm komplike ÜSE 33,56 patogenezi modüle. Ancak, onlar da fare hattı İYE duyarlılık değişen derecelerde nedeniyle son derece dikkatli bir araştırmacı soruyor belirli soruyu ele almak için doğru fare hattı ve UPEC gerginlik seçiminde alınmalıdır, anlamına gelir. Örneğin, C57BL / 6 fareleri, erken zaman noktalarında, yüksek bakteriyel titreler ve IBC, çok sayıda gösteren akut enfeksiyonun mükemmel bir model vardır. Bu suş sonra hızla şiddetli böbrek enfeksiyonları ve hareketsiz hücre içi rezervuarların 33,34 kaynaklanan tek kalıcı kolonizasyonu ile 3 ve 7 dpi arasında enfeksiyon giderir. C57BL / 6 modeli doğru bir sonra mevcut ve belirtiler çözmek hangi birçok İYE hastalarında en sık sonucu temsil edebilir. Tersine, C3H / HeN fare arka olanağına tekrarlayan İYE çalışmak için bir ideal gerginlik alma, kronik sistit duyarlılık yüksek derecede sergiler. Diğer İYE modelleri de kurulmuşturCBA içinde, DBA ve C3H / HeJ fareleri arka İYE 33,59 belirli yönlerini incelemek için yararlı kanıtlamaktadır. komplikasyonsuz sistit modeli tarafından sergilenen birincil deneysel dezavantajı, akut, kronik ve tekrarlayan sistit 60 için gerekli olan yeni bakteri faktörlerin ortaya çıkarılması için büyük ölçekli genetik tarama yöntemlerinin uygulanmasını sınırlayan çoklu enfeksiyon darboğazların varlığıdır.

komplikasyonsuz sistit model için kritik değerlendirmeler, tüm iki ek kaygılarla implant tabanlı CAUTI modeline uygulanır. Birincisi, bakım implantın yerleştirilmesi nedeniyle implant tarafından verilen mesane enfeksiyonu yatkınlığın artmasıyla, steril bir şekilde gerçekleşmesini sağlamak için alınmalıdır. İkinci olarak, bu kateter implantasyonu iğnesinin çıkarılması sırasında yerinde tutulabilir esastır. CAUTI modelinin önemli sınırlamalar mevcut konak genetik kökenden azalma yelpazesine sahip olduğunu, pr vardırKateter zamanla kaybı ve yetersizlik için opensity nedeniyle implantasyon kaynaklanan mesane disfonksiyonu idrar toplamak için. İmplant kaybı ve boyuna idrar yoluyla enfeksiyonu izlemek için yetersizlik telafi etmek için, bu model genellikle her istenilen zaman noktasında kurban gereken sonraki zaman noktalarında ve fare gruplarında kateterize farelerin yüksek sayıda gerektirir. Böyle C3H / tavuk gibi bazı fare suşları, implant kaybetmek hangi engelleyici frekanstan sınırlı konak genetik kökenden sonuçları (P. GUITON, Kişisel İletişim 2010). Bunun bir sonucu olarak, yukarıda tarif edilen CAUTI protokolleri, sadece, C57BL / 6 fare türünde optimize edilmiştir. CAUTI için kullanılabilir fare suşlarının sınırlama talihsiz Bununla birlikte, birçok genomik varyasyonlar C57BL / 6 arka kurulmuştur ve CAUTI model organizmalar tarafından kolonizasyonu kolaylaştırmak için mesane ortamı değiştirerek İYE sırasında çalışma için mevcut bakteriyolojik çeşitliliği genişler vardırİYE sıçangil modelinde, aksi patojenik olmayan. Bunun bir örneği, E. mesane kateter indüklenen enflamasyon sırasında ortaya çıkan FG rolü yeni bir keşiftir CAUTI 42 sırasında faecalis büyüme, biyofilm oluşumu ve sebat. Bu örnek, bakteriyel moleküler patogenez mekanizmaları değil, aynı zamanda enfeksiyon sırasında konak faktörlerinin rolü sadece durulaştırmada CAUTI implant modelinin gücünü göstermektedir. Tüm bu özellikler önceden understudied olan bu ilgili klinik enfeksiyon, anlamaya katkıda bulunur.

Yukarıda tarif edilen deney yaklaşımlara ek olarak, bir ilaç olarak ve CAUTI fare modelleri metodolojik değişiklikler çok sayıda uygundurlar. Komplike olmayan sistit modelinde halinde, bu değişiklikler bakteri sayısını azaltmak için aşılama hacmi ve inokulum damlatma sırasında uygulanan kuvvet azaltma içerebilirenfeksiyon süresinin değişen gibi erken 1 HPI olarak zaman noktalarında ödün ve derecesini değerlendirmek için gentamisin koruma deneyleri kullanılarak, böbrekler 61 içine hangi üropatojen mesane epitel hücreleri 62 işgal etmiştir için. Ayrıca kesit ve çeşitli ev sahibi ve / veya bakteriyel epitoplara karşı antikorlar ile boyanmış ve floresan veya konfokal mikroskobu altında gözlemlenebilir HPI 6 ila 24 fareden açılır mesaneler IBC yapısı, bakteriyel akılı ve ipliklerin ve ana doku durum 25,33 gözlemlemek için kurban , 63,64. ev sahibi lokal ve sistemik bağışıklık tepkilerinin ilgili üropatojen enfeksiyon ve / veya implantasyon etkisi, sırasıyla 33,65 idrar veya serumda sitokin seviyelerini belirlemek için Bioplex sitometrik boncuk sistemi veya ELISA bazlı tahliller kullanılarak değerlendirilebilir. Son olarak, mesane dokusu, yer ve kolonize bakteri morfolojisi ve biyofilm yapısı koşulu birikenKateter elektron mikroskobu 25,41 dahil olmak üzere çeşitli görüntüleme teknikleri ile değerlendirilebilir.

Enfeksiyonun Bu temel modeller de tekrarlayan üriner ve çoklu enfeksiyonlar ile edinilmiş bağışıklık tepkisi geliştirilmesi dahil olmak üzere, diğer klinik olarak ilgili olayları taklit etmek için adapte edilebilir. C3H / HeN modelinde, antimikrobik madde tatbikatı ile enfeksiyonun temizlenmesi ve ardından kronik sistit önceden gelişimi kronik sistit geliştirmek için bu farelerin karşı duyarlı ise, bu bağlamda, akut sistit artan dirençte C57BL / 6 fareleri sonuçlarının enfeksiyonu tekrarlanır sonraki aşılar 66. Ayrıca İYE gelişimi için risk faktörlerinin moleküler mekanizmalar incelenebilir. Diyabet ve obezite hem de İYE sıklığını ve şiddetini artırmak için gösterilmiştir. Tip 2 diyabet genetik FVB / NJ arka farelerde modellenebilir ve tip 1 diyabet, kimyasal olarak bağlı bir model alread olany UPEC ve K. hem neden İYE şiddetini artırdığı gösterilmiştir pneumophila 67,68.

Son olarak, bu model sistemler tedavi edilmesi veya İYE ve Cautis önlemeye yönelik tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi ve optimizasyonu için ideal bir ispatı zemin oluşturmaktadır. Bu modellerin tarafından sağlanan konak patojen etkileşimleri moleküler anlaşılması zaten 51-55 faktörleri önemli virülans hedef amaçlayan etkin aşılama stratejilerinin geliştirilmesini kolaylaştırmıştır. Buna ek olarak, UPEC yapışma küçük molekül inhibitörleri, komplike olmayan akut ve kronik İYE tedavisinde etkili hem de Cautis olarak UPEC 12,69,70 neden olduğu gösterilmiştir. Her iki protokoller açıklanan komplikasyonsuz İYE ve CAUTI modelleri idrar yollarında konak-patojen etkileşimleri moleküler ayrıntıları incelemek için deneysel araçları sağlar. Bu araçlar, bizim understandin genişletmek için birçok yönden kaldıraçlı olabilirkoşullar bu karmaşık dizi g ve daha etkili terapötik müdahalelerin gelişimi kolaylaştırmak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

Acknowledgments

Bu iş için finansman, ORWH SCOR P50 DK064540 tarafından RO1 DK 051406, RO1 AI 108749-01, F32 DK 101171, ve F32 DK 104516-01 sağlandı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material for catheter and needle preparation:
30 G needles BD Precision Glide 305106 30 G x ½ (0.3 mm x 13 mm)
PE10 polyethylene tubing BD 427400 Inside diameter -0.011 in (0.28 mm); outside diameter – 0.024 in (0.61 mm)
RenaSIL 025 platinum cured silicon tubing Braintree Scientific, Inc SIL 025 inside diameter-0.012 x outside diameter 0.025, 25 ft coil
Material for infections:
Isoflourane – Isothesia Butler Schein 29405 250 ml
Clear Glass Straight-Sided Jar Kimble Chase 5413289V 21
Stainless Steel Tea Infuser Schefs-Amazon Premium Loose Leaf Tea Infuser By Schefs - Stainless Steel - Large Capacity -
Non-sterile cotton balls Fisherbrand 22-456-880
50 ml Falcon tubes VWR 89039-660
Isotec 3 -vaporizer Ohmeda 1224478
Ear punch Fisher Scientific 13-812-201 (when necessary)
Betadine solution Betadine solution 10% Povidie-iodine topical solution
Q-tips Fisher Scientific 22-037-924 6 inches
Diapers for bench Fisherbrand 14206 63 Absorbent Underpads (20”X36”mats)
Surgical lubricant Surgilube 0281-0205-36
Dissecting scissor Fine Science tools, INC 14084-08
Micro-Adson Forceps Fine Science tools, INC 11018-12
1 ml syringe BD 309659 Tuberculin slip tip
Parafilm Bemis PM996 4 inches x 125 FT
Eppendorf rack Fisherbrand 05-541-1
Eppendorf tubes MIDSCI AVX-T-17-C
Harvesting catheters, bladders and kidneys:
Homogenizer PRO Scientific INC Bio-Gen Pro 200
5 ml polypropylene round-bottom tube BD 352063 for organ homogenization
Paper towel Georgia-Pacific
Ethanol Pharmco-AAPER 11100020S 200 proof
Costar™ Clear Polystyrene 96-Well Plates Corning 3788
1x Phosphate sodium saline Sigma-Aldrich P3813
BRANSONIC Ultrasonic cleaner 1210 Branson Ultrasonics Corporation 1210
IBC materials:
6-well tissue culture test plate Techno Plastic Products 92006
Pins Fine Science Tools 26002-20
Sylgard 184 Dow Corning 3097358-1004 Silicone Elastomer Kit
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside) Invitrogen 15520-034 Ultrapure
N, N-Dimethylformamide Sigma Aldrich D4551
MgCl2 (Magnesium chloride) Sigma Aldrich M8266
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich D6750
Nonidet-P40 Roche 11754599001 Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate (K-ferrOcyanide) Sigma Aldrich P3289
Potassium hexacyanoferrate(III) (K-ferrIcyanide) Sigma Aldrich 60299

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. Dis Mon. 49, 53-70 (2003).
  2. Foxman, B., et al. Risk factors for second urinary tract infection among college women. American journal of epidemiology. 151, 1194-1205 (2000).
  3. Gupta, K., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Increasing antimicrobial resistance and the management of uncomplicated community-acquired urinary tract infections. Annals of internal medicine. 135, 41-50 (2001).
  4. Gupta, K., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Isolation of fluoroquinolone-resistant rectal Escherichia coli. after treatment of acute uncomplicated cystitis. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 56, 243-246 (2005).
  5. Gupta, K., Sahm, D. F., Mayfield, D., Stamm, W. E. Antimicrobial resistance among uropathogens that cause community-acquired urinary tract infections in women: a nationwide analysis. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 89-94 (2001).
  6. Gupta, K., Scholes, D., Stamm, W. E. Increasing prevalence of antimicrobial resistance among uropathogens causing acute uncomplicated cystitis in women. Jama. 281, 736-738 (1999).
  7. Jarvis, W. R. Selected aspects of the socioeconomic impact of nosocomial infections: morbidity, mortality, cost, and prevention. Infect Control Hosp Epidemiol. 17, 552-557 (1996).
  8. Lo, E., et al. Strategies to prevent catheter-associated urinary tract infections in acute care hospitals: 2014 update. Infection control and hospital epidemiology : the official journal of the Society of Hospital Epidemiologists of America. 35, 464-479 (2014).
  9. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature reviews Urology. 7, 653-660 (2010).
  10. Hooton, T. M., Stamm, W. E. Diagnosis and treatment of uncomplicated urinary tract infection. Infect Dis Clin North Am. 11, 551-581 (1997).
  11. Hannan, T. J., et al. LeuX tRNA-dependent and -independent mechanisms of Escherichia coli. pathogenesis in acute cystitis. Molecular microbiology. 67, 116-128 (2008).
  12. Cusumano, C. K., Hung, C. S., Chen, S. L., Hultgren, S. J. Virulence plasmid harbored by uropathogenic Escherichia coli. functions in acute stages of pathogenesis. Infection and immunity. 78, 1457-1467 (2010).
  13. Dhakal, B. K., Mulvey, M. A. The UPEC pore-forming toxin alpha-hemolysin triggers proteolysis of host proteins to disrupt cell adhesion, inflammatory, and survival pathways. Cell host & microbe. 11, 58-69 (2012).
  14. Garcia, E. C., Brumbaugh, A. R., Mobley, H. L. Redundancy and specificity of Escherichia coli. iron acquisition systems during urinary tract infection. Infection and immunity. 79, 1225-1235 (2011).
  15. Bergsten, G., Wullt, B., Svanborg, C. Escherichia coli., fimbriae, bacterial persistence and host response induction in the human urinary tract. International journal of medical microbiology : IJMM. 295, 487-502 (2005).
  16. Zhou, G., et al. Uroplakin Ia is the urothelial receptor for uropathogenic Escherichia coli.: evidence from in vitro FimH binding. J Cell Sci. 114, 4095-4103 (2001).
  17. Eto, D. S., Jones, T. A., Sundsbak, J. L., Mulvey, M. A. Integrin-mediated host cell invasion by type 1-piliated uropathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 3, e100 (2007).
  18. Taganna, J., de Boer, A. R., Wuhrer, M., Bouckaert, J. Glycosylation changes as important factors for the susceptibility to urinary tract infection. Biochemical Society transactions. 39, 349-354 (2011).
  19. Mulvey, M. A., et al. Induction and evasion of host defenses by type 1-piliated uropathogenic Escherichia coli. Science. 282, 1494-1497 (1998).
  20. Mysorekar, I. U., Mulvey, M. A., Hultgren, S. J., Gordon, J. I. Molecular regulation of urothelial renewal and host defenses during infection with uropathogenic Escherichia coli. The Journal of biological chemistry. 277, 7412-7419 (2002).
  21. Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population Dynamics and Niche Distribution of Uropathogenic Escherichia coli. during Acute and Chronic Urinary Tract Infection. Infect. Immun. 79, 4250-4259 (2011).
  22. Garofalo, C. K., et al. Escherichia coli. from urine of female patients with urinary tract infections is competent for intracellular bacterial community formation. Infection and immunity. 75, 52-60 (2007).
  23. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli. in urinary tract pathogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 1333-1338 (2004).
  24. Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae. urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infection and immunity. 76, 3337-3345 (2008).
  25. Anderson, G. G., et al. Intracellular bacterial biofilm-like pods in urinary tract infections. Science. 301, 105-107 (2003).
  26. Robino, L., et al. Detection of intracellular bacterial communities in a child with Escherichia coli. recurrent urinary tract infections. Pathogens and disease. 68, 78-81 (2013).
  27. Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4, e329 (2007).
  28. Horsley, H., et al. Enterococcus faecalis subverts and invades the host urothelium in patients with chronic urinary tract infection. PloS one. 8, e83637 (2013).
  29. Hopkins, W. J., Uehling, D. T., Wargowski, D. S. Evaluation of a familial predisposition to recurrent urinary tract infections in women. American Journal of Medical Genetics. 83, 422-424 (1999).
  30. Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli. urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infection and immunity. 66, 2798-2802 (1998).
  31. Mabeck, C. E. Treatment of uncomplicated urinary tract infection in non-pregnant women. Postgraduate medical journal. 48, 69-75 (1972).
  32. Ferry, S., Holm, S., Stenlund, H., Lundholm, R., Monsen, T. The natural course of uncomplicated lower urinary tract infection in women illustrated by a randomized placebo controlled study. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 36, 296-301 (2004).
  33. Hannan, T. J., Mysorekar, I. U., Hung, C. S., Isaacson-Schmid, M. L., Hultgren, S. J. Early severe inflammatory responses to uropathogenic E. coli. predispose to chronic and recurrent urinary tract infection. PLoS Pathog. 6, (2010).
  34. Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli. persistence and eradication from the urinary tract. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 14170-14175 (2006).
  35. Glahn, B. E., Braendstrup, O., Olesen, H. P. Influence of drainage conditions on mucosal bladder damage by indwelling catheters. II. Histological study. Scandinavian journal of urology and nephrology. 22, 93-99 (1988).
  36. Goble, N. M., Clarke, T., Hammonds, J. C. Histological changes in the urinary bladder secondary to urethral catheterisation. British journal of urology. 63, 354-357 (1989).
  37. Ronald, A. The etiology of urinary tract infection: traditional and emerging pathogens. Dis Mon. 49, 71-82 (2003).
  38. Arias, C. A., Murray, B. E. The rise of the Enterococcus.: beyond vancomycin resistance. Nature reviews. Microbiology. 10, 266-278 (2012).
  39. Garibaldi, R. A., Burke, J. P., Dickman, M. L., Smith, C. B. Factors predisposing to bacteriuria during indwelling urethral catheterization. The New England journal of medicine. 291, 215-219 (1974).
  40. Warren, J. W. Catheter-associated urinary tract infections. Infect Dis Clin North Am. 11, 609-622 (1997).
  41. Guiton, P. S., Hung, C. S., Hancock, L., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. Enterococcal biofilm formation and virulence in an optimized murine model of foreign body-associated urinary tract infections. Infection and immunity. 78, 4166-4175 (2010).
  42. Flores-Mireles, A. L., Pinkner, J. S., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. EbpA vaccine antibodies block binding of Enterococcus faecalis. to fibrinogen to prevent catheter-associated bladder infection in mice. Science translational medicine. 6, 254ra127 (2014).
  43. Martinez, J. J., Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Pinkner, J. S., Hultgren, S. J. Type 1 pilus-mediated bacterial invasion of bladder epithelial cells. The EMBO Journal. 19, 2803-2812 (2000).
  44. Hultgren, S. J., Schwan, W. R., Schaeffer, A. J., Duncan, J. L. Regulation of production of type 1 pili among urinary tract isolates of Escherichia coli. Infection and immunity. 54, 613-620 (1986).
  45. Chenoweth, C. E., Gould, C. V., Saint, S. Diagnosis, Management, and Prevention of Catheter-Associated Urinary Tract Infections. Infect. Dis. Clin. North Am. 28, 105-+ (2014).
  46. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7, 653-660 (2002).
  47. Justice, S. S., Hunstad, D. A., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Filamentation by Escherichia coli. subverts innate defenses during urinary tract infection. Proc Natl Acad Sci USA. 103, (1988).
  48. Song, J., et al. TLR4-mediated expulsion of bacteria from infected bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14966-14971 (2009).
  49. Wang, H., Min, G., Glockshuber, R., Sun, T., Kong, X. P. Uropathogenic E. coli. adhesin-induced host cell receptor conformational changes: implications in transmembrane signaling transduction. Journal of molecular biology. 392, 352-361 (2009).
  50. Cusumano, C. K., et al. Treatment and prevention of urinary tract infection with orally active FimH inhibitors. Science translational medicine. 3, 109-115 (2011).
  51. Langermann, S., Ballou, W. R. Vaccination utilizing the FimCH complex as a strategy to prevent Escherichia coli. urinary tract infections. J Infect Dis. 183, S84-S86 (2001).
  52. Langermann, S., et al. Vaccination with FimH adhesin protects cynomolgus monkeys from colonization and infection by uropathogenic Escherichia coli. J Infect Dis. 181, 774-778 (2000).
  53. Langermann, S., et al. Prevention of mucosal Escherichia coli. infection by FimH-adhesin-based systemic vaccination. Science. 276, 607-611 (1997).
  54. Alteri, C. J., Hagan, E. C., Sivick, K. E., Smith, S. N., Mobley, H. L. T. Mucosal Immunization with Iron Receptor Antigens Protects against Urinary Tract Infection. Plos Pathogens. 5, (2009).
  55. Russo, T. A., et al. The siderophore receptor IroN of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. is a potential vaccine candidate. Infect. Immun. 71, 7164-7169 (2003).
  56. Schwartz, D. J., et al. Positively selected FimH residues enhance virulence during urinary tract infection by altering FimH conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15530-15537 (2013).
  57. Czaja, C. A., et al. Prospective cohort study of microbial and inflammatory events immediately preceding Escherichia coli. recurrent urinary tract infection in women. J Infect Dis. 200, 528-536 (2009).
  58. Chen, S. L., et al. Genomic Diversity and Fitness of E. coli. Strains Recovered from the Intestinal and Urinary Tracts of Women with Recurrent Urinary Tract Infection. Science Translational Medicine. 5, 2013 (2013).
  59. Schilling, J. D., Mulvey, M. A., Vincent, C. D., Lorenz, R. G., Hultgren, S. J. Bacterial invasion augments epithelial cytokine responses to Escherichia coli. through a lipopolysaccharide-dependent mechanism. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 166, 1148-1155 (2001).
  60. Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population Dynamics and Niche Distribution of Uropathogenic Escherichia coli. during Acute and Chronic Urinary Tract Infection. Infect. Immun. 79, 4250-4259 (2011).
  61. Chan, C. Y., St John,, L, A., Abraham, S. N. Mast Cell Interleukin-10 Drives Localized Tolerance in Chronic Bladder Infection. Immunity. 38, 349-359 (2013).
  62. Justice, S. S., Lauer, S. R., Hultgren, S. J., Hunstad, D. A. Maturation of intracellular Escherichia coli. communities requires SurA. Infect. Immun. 74, 4793-4800 (2006).
  63. Justice, S. S., Hunstad, D. A., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Filamentation by Escherichia coli. subverts innate defenses during urinary tract infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19884-19889 (2006).
  64. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli. in urinary tract pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 1333-1338 (2004).
  65. Guiton, P. S., Hannan, T. J., Ford, B., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. Enterococcus faecalis. Overcomes Foreign Body-Mediated Inflammation To Establish Urinary Tract Infections. Infect. Immun. 81, 329-339 (2013).
  66. Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder. Journal of Immunology. 176, 3080-3086 (2006).
  67. Rosen, D. A., Hung, C. -S., Kline, K. A., Hultgren, S. J. Streptozocin-induced diabetic mouse model of urinary tract infection. Infect. Immun. 76, 4290-4298 (2008).
  68. Daneshgari, F., Leiter, E. H., Liu, G., Reeder, J. Animal Models of Diabetic Uropathy. Journal of Urology. 182, S8-S13 (2009).
  69. Guiton, P. S., et al. Combinatorial Small-Molecule Therapy Prevents Uropathogenic Escherichia coli. Catheter-Associated Urinary Tract Infections in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56, 4738-4745 (2012).
  70. Totsika, M., et al. A FimH Inhibitor Prevents Acute Bladder Infection and Treats Chronic Cystitis Caused by Multidrug-Resistant Uropathogenic Escherichia coli. ST131. Journal of Infectious Diseases. 208, 921-928 (2013).

Tags

Tıp Sayı 100, kateter idrar yolu enfeksiyonu IBC kronik sistit

Erratum

Formal Correction: Erratum: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model
Posted by JoVE Editors on 08/18/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. The Protocol section has been updated.

The ethics statement has been updated from:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20120216, which was approved 01/11/2013 and expires 01/11/2016. Overall care of the animals was consistent with The guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

to:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20150226, which expires 12/10/2018. Overall care of the animals was consistent with The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

Step 3 has been updated from:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a 32 ounce glass jar containing a tea-infuser ball with cotton balls soaked with 3 ml of isoflurane or vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a jar or vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    NOTE: If glass jar with tea-ball and/or nose cone with isoflurane-soakd cotton balls are used, the animal must be carefully observed to avoid anesthetic overdose and death. The advantage of using a vaporizer and anesthesia chamber is that it provides controlled isoflurane administration that avoids accidental overdoses. CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the jar/vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) or 50 ml conical tube with a cotton ball containing a small amount (approximately 1-2 ml) of isoflurane.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.

to:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) to maintain anesthetization.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.
Fare Modelinde Kuruluş ve İYE ve CAUTI Karakterizasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Conover, M. S., Flores-Mireles, A.… More

Conover, M. S., Flores-Mireles, A. L., Hibbing, M. E., Dodson, K., Hultgren, S. J. Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. J. Vis. Exp. (100), e52892, doi:10.3791/52892 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter