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Medicine

Création et caractérisation de l'UTI et Cauti dans un modèle de souris

Published: June 23, 2015 doi: 10.3791/52892
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Microbiology and Center for Women's Infectious Disease Research, Washington University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Abstract

Les infections des voies urinaires (IVU) sont très répandus, une cause importante de morbidité et sont plus résistantes aux traitements avec des antibiotiques. Les femmes sont beaucoup affligé par UTI: 50% de toutes les femmes auront une infection urinaire dans leur vie. En outre, 20-40% de ces femmes qui ont une première UTI subira une récidive avec certains souffrant de récidives fréquentes avec grave détérioration de la qualité de vie, la douleur et l'inconfort, la perturbation des activités quotidiennes, l'augmentation des coûts de soins de santé, et quelques options de traitement autres de prophylaxie antibiotique à long terme. Uropathogène Escherichia coli (UPEC) est l'agent causal primaire de la communauté acquise UTI. UTI du cathéter-associé (Cauti) est l'hôpital infection la plus fréquente acquis représente un million occurrences dans les États-Unis chaque année et les coûts de soins de santé dramatiques. Alors que UPEC est également la principale cause de Cauti, d'autres agents pathogènes sont d'une importance accrue, y compris Enterococcusfaecalis. Ici, nous utilisons deux modèles de souris bien établies qui récapitulent plusieurs des caractéristiques cliniques de ces maladies humaines. Pour UTI, un modèle C3H / HeN récapitule la plupart des caractéristiques de virulence UPEC observés chez les humains y compris les réponses de l'hôte, la formation IBC et filamentation. Pour Cauti, en utilisant un modèle souris C57BL / 6, qui conservent les implants cathéter de la vessie, a été montré pour être sensibles à E. faecalis infection de la vessie. Ces modèles représentatifs sont utilisés pour acquérir de nouvelles connaissances frappantes dans la pathogenèse de la maladie UTI, qui conduit à la mise au point de nouveaux traitements et stratégies de gestion ou de prévention.

Introduction

Infections des voies urinaires (IVU) sont l'une des infections bactériennes les plus courantes et peuvent être divisés en deux catégories basées sur le mécanisme d'acquisition, la communauté et nosocomiale acquise UTI. Les infections urinaires se produit souvent chez les femmes et des études, autrement sains acquis communautaire ont montré qu'environ 50% des femmes auront au moins une infection urinaire dans leur vie 1. En outre, la récidive est un problème majeur. Une femme qui a une infection aiguë initiale a une chance d'avoir une seconde infection dans les six mois malgré un traitement antibiotique approprié et de nombreuses femmes continuent à avoir de fréquentes récidives 2 25-40%. Les bactéries qui causent ces infections sont également de plus en plus de protocoles de traitement de plus en plus résistantes aux antibiotiques de confusion 3-6. UTI affectent des millions de personnes chaque année coûte environ 2,5 milliards de dollars en frais liés aux soins de santé aux États-Unis, soulignant l'impact et la prévalence de la maladie1,7 .Nosocomial acquis les infections urinaires sont principalement liés à la présence de corps étrangers tels que cathéters. les infections urinaires de cathéter associée (Cauti) restent la nosocomiale la plus fréquente acquise UTI, représentant ~ 70-80% de ces infections 8. En outre, Cauti est associée à une augmentation de la morbidité et de la mortalité et il est la cause la plus fréquente des infections sanguines secondaires 9.

Communauté associée UPEC acquis les infections urinaires sont pensés pour être causé par l'introduction de bactéries dans la vessie à partir de réservoirs dans le tractus gastro-intestinal par le biais d'une manipulation mécanique pendant les rapports sexuels, le manque d'hygiène ou d'autres dynamique des populations microbiennes entre l'hôte différentes niches 10. Une fois à l'intérieur de la vessie, UPEC emploient de nombreux facteurs de virulence, y compris la capsule, les systèmes d'acquisition du fer, des toxines, un plasmide de virulence, ARNt, îlots de pathogénicité et de facteurs de colonisation qui ont été montrés à jouer un rôle dans la pathogenèse <sup> 11-14. Critique à l'établissement de la colonisation UPEC, UPEC codent également plusieurs types de chaperon adhésif huissier voie (CUP) pili qui reconnaissent les récepteurs avec une spécificité stéréochimique 15. Pili de type 1, pointe avec l'adhésine FimH, sont exprimées par l'UPEC et lier uroplakins 16 et α-β-1, 3 intégrines 17, qui sont exprimés sur la surface luminale des deux vessies humaines et de souris 18 mannosylée. Ces interactions à médiation FimH faciliter la colonisation bactérienne et l'invasion des cellules epitheliales superficielles 19,20. Une fois à l'intérieur de la cellule, UPEC peut échapper dans le cytoplasme où une seule bactérie peut rapidement diviser pour former une communauté bactérienne intracellulaire (IBC), qui, lors de la maturation, peut contenir ~ 10 4 21 bactéries. Formation IBC a été démontrée dans au moins six différentes souches de souris, C3H / poule, C3H / HeJ, C57BL / 6, ABC, FVB / NJ et BALB / c, et avec une grande variété de différentes UPESouches de carbone et d'autres Enterobacteriaceae 22-24. Toutefois, des différences temporelles et spatiales de la formation IBC peuvent varier en fonction de l'arrière-plan de la souris et la souche UPEC infecter. Dans C3H / HeN infectées par le UPEC prototypique souches UTI89 ou la formation CFT073, IBC peuvent être visualisés sous forme de petites biomasses de bactéries dès 3 HPI (post-infection h). Cette communauté continue à se développer et atteint un "point médian" de développement d'environ 6 hpi lorsque les bactéries en forme de bâtonnets occupent un grand pourcentage de l'espace cytoplasmique de cellules parapluie superficielles différenciées Ces forme précoce GRV d'une manière relativement synchrone avec la majorité affichant des dimensions similaires et morphologies. ~ 8 hpi les bactéries dans le changement IBC d'une bacilles à Cocci morphologie. GRV sont de nature transitoire. Ainsi, le BAC maturation 12-18 résultats de HPI à l'expansion continue de la population bactérienne, suivi par leur filamentation et la dispersion de la wi cellulaireth propagation ultérieure à des cellules voisines 23. Ainsi, le créneau IBC permet une croissance bactérienne rapide dans un environnement à l'abri de réponses 25 immunitaires et des antibiotiques hôtes. Les étapes distinctes d'infection UPEC qui sont vus dans les souris sont également observées chez l'homme, tels que les GRV et filamentation, soutenant le modèle de la souris de l'UTI comme un outil bénéfique qui peut être utilisé pour modéliser UTI chez les humains 22,26-28.

Alors que la majorité des femmes ressentent une infection urinaire dans leur vie, le résultat de ces infections peut varier de l'infection de l'auto-limitation aiguë sans récidive, à la cystite récidivante fréquente. En outre, des études ont montré une forte survenue familiale de l'UTI, ce qui suggère une composante génétique contribue à la susceptibilité 29 UTI. Nous avons constaté que les résultats UTI différentes dans les cliniques peuvent être reflétés par les résultats différents de l'infection expérimentale UPEC entre souches consanguines de souris 30. Par exemple, C3H / poule, l'ABC, Des souris DBA, et C3H / HeOuJ sont sensibles, de manière infectieux dépendante de la dose, de longue durée, la cystite chronique caractérisée par la persistance, les bactéries de titre élevé (> 10 4 unités formant des colonies (CFU) / ml), un titre élevé de bactéries charges de la vessie au sacrifice> 4 semaines post-infection (WPI), l'inflammation chronique, et la nécrose urothelial. Ces souris présentent également des taux sériques élevés de IL-6, G-CSF, KC, et IL-5 dans les 24 premières HPI qui servent de biomarqueurs pour le développement de la cystite chronique. Cela peut représenter fidèlement le cours naturel des infections urinaires chez certaines femmes, que des études contre placebo ont montré qu'un grand pourcentage de femmes victimes de UTI conservera des niveaux élevés de bactéries dans l'urine pendant plusieurs semaines après les premiers symptômes de la cystite si pas donné un traitement antibiotique 31 , 32. En outre, en utilisant des souris C3H / poule, nous avons constaté que des antécédents de cystite chronique est un facteur de risque important pour les infections récurrentes sévères ultérieures. Infection urinaire récidivante est le plus simanifestation clinique gnificant de l'UTI et la souris C3H / HeN est actuellement le seul modèle étudié qui récapitule une prédisposition accrue après l'exposition précédente. Un deuxième résultat UTI est récapitulée dans C57Bl / 6 souris où l'infection aiguë UPEC est auto-limitation, avec une résolution de l'inflammation de la vessie et bactériurie une semaine environ. Fait intéressant, dans ce modèle, UPEC former facilement des réservoirs intracellulaires de repos dans le tissu de la vessie à partir de laquelle UPEC sont capables de sortir d'un état ​​de dormance pour relancer une UTI actif, potentiellement expliquer un mécanisme de même souche UTI récurrent chez l'homme 33, 34.

En plus des influences génétiques sur UTI susceptibilité, l'introduction d'un cathéter dans la vessie augmente considérablement la probabilité d'avoir une infection ainsi que l'augmentation du nombre de bactéries capables de provoquer une infection. Il a été démontré que le cathétérisme urinaire humaine provoque histologique etchangements immunologiques dans la vessie dus au stress mécanique qui entraîne une réponse inflammatoire robuste, exfoliation, œdème de la lamina propria et submucusa, amincissement urothelial et lésion de la muqueuse urothélium et les reins 35,36. En outre, le cathéter offre une surface pour la fixation bactérienne créant ainsi un environnement utilisé par plusieurs espèces de provoquer Cauti. Alors que UPEC sont encore un contributeur majeur, Enterococcus faecalis représente 15% de ces Cauti 37. E. faecalis est de plus en plus résistantes aux antibiotiques avec résistance à la vancomycine émergence, posant un grave problème de santé 38. E. faecalis possèdent de nombreux facteurs de virulence y compris les toxines et adhésines nécessaires pour la fixation à la fois le cathéter et l'épithélium 38. Pendant sondage urinaire, l'hôte est vulnérable à l'adhésion microbienne, la multiplication et la diffusion dans le 39,40 urinaire. E. FAECAlis forme un biofilm sur le cathéter dans le cadre d'un mécanisme de persister dans la vessie et de diffuser vers les reins, qui est reproduite dans un modèle de souris Cauti 41. Récemment, il a été montré pendant un cathétérisme urinaire, fibrinogène (Fg) est libéré dans la vessie dans le cadre de la réponse inflammatoire. Fg accumule dans la vessie, le cathéter couches et est essentielle pour E. faecalis formation de biofilm, fonctionnant comme un échafaudage de fixation. Dans un modèle de souris C57BL / 6 de la souris de Cauti, nous avons découvert que E. faecalis formation de biofilm sur le cathéter, et donc la persistance dans la vessie, était à la charge sur le pili Ebp, spécifiquement son EBPA pointe d'adhésine. Nous avons constaté que le domaine N-terminal de EBPa se lie spécifiquement à FG revêtement du cathéter. En outre, il a été constaté que E. faecalis utilise Fg comme source de métabolite cours de l'infection, améliorant ainsi la formation de biofilm 42.

Des modèles de souris sont révélés indispensables à undertanding ainsi que la prévision des manifestations cliniques de l'UTI et Cauti 41. Dans cet article, nous démontrons la préparation de l'inoculum de la cystite UPEC isolons UTI89 et l'inoculation transurétrale de souris C3H / poule. En outre, nous démontrons un protocole pour l'insertion du cathéter dans des souris C57BL / 6 et de l'inoculation E. souche faecalis OG1RF. Ces deux techniques conduisent à UTI ou Cauti cohérente et fiable chez la souris. Nous affichons également des techniques utilisés pour observer la formation IBC au cours cystite aiguë et la collecte d'urine pour l'analyse de la cystite chronique ou récurrente. Souris C3H / HeN ont été utilisées pour étudier les aspects de la pathogenèse UPEC y compris invasion initiale bactérienne, la formation IBC, filamentation et le développement de la cystite chronique 23,33,43. Ces paramètres de virulence ont également été étudiés dans une variété d'autres milieux de souris 22,33. Pour Cauti, C57BL / 6 modèle permet pour l'implantation d'un corps étranger dans la vessie avec le co bactérienne ultérieureionisation, qui peut être maintenu pendant 7 jours après l'infection 41. Ces modèles ont été utiles pour évaluer les mécanismes de virulence bactérienne, les réponses de l'hôte aux infections urinaires et des mécanismes de subvertir réponses de l'hôte, dont une grande partie a été ensuite récapitulées ou observés dans les populations humaines cliniques.

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Protocol

Déclaration éthique: Le Comité des études animales Université de Washington a approuvé toutes les infections et les procédures souris dans le cadre de numéro de protocole 20120216, qui a été approuvé et expire 11/01/2013 11/01/2016. Prise en charge globale des animaux était compatible avec le guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire du Conseil national de recherches et le Guide des ressources Soins USDA animale. procédures d'euthanasie sont compatibles avec les "directives de l'AVMA pour l'euthanasie des animaux Edition 2013."

1. UPEC Protocole UTI, inoculation aiguille Préparation (Figure S1)

  1. Retirez le bouchon de l'aiguille 30 G. Fil d'environ 1 pouce de tube PE10 sur l'arbre de l'aiguille. UV stériliser les ensembles d'aiguille pendant la nuit. Cathétérisés aiguilles peuvent être stockés indéfiniment dans des boîtes de Pétri stériles.

2. UPEC inoculum bactérien Préparation

  1. Préparer UTI89 inoculum (début 72 h avant l'inoculumtion de jour)
    1. Streak UTI89 sur un milieu LB (Luria-Bertani) plaque de gélose à partir d'un stock congelé. Incuber une nuit à 37 ° C. Choisir une colonie et inoculer dans 10 ml de LB dans un ballon de 125 ml. Incuber à 37 ° C pendant 24 heures, de façon statique.
    2. Inoculer 10 pi de culture de nuit dans 10 ml de LB dans un nouveau flacon de 125 ml pour un 24 heures supplémentaires à 37 ° C, de manière statique.
    3. Transfert 3 ml (varient en fonction de la souche et la taille de l'inoculum désiré) à 1,5 ml tubes stériles et centrifuger à 7000 g pendant 3 min et remettre en suspension le culot dans 1x PBS et centrifuger une deuxième fois. Reprendre le culot bactérien dans 1 ml de PBS 1X.
  2. Mesurer la densité optique et ajuster la concentration bactérienne de l'inoculum de densité souhaitée. La concentration standard de l'inoculum utilisé est de 10 7 bactéries; Cependant, cela peut varier en raison de la conception de l'étude.

3. bactérienne inoculation

  1. Nettoyez le poste de travail avec 70% d'éthanol et csur la zone avec du papier absorbant (ou utiliser une hotte à flux stérile).
  2. Tirer jusqu'à 0,9 ml de l'inoculum bactérien préparé dans un 1 ml (TB) seringue (éliminer les bulles d'air). Fixez une aiguille d'inoculation stérile préparé avec PE10 tube, sur la seringue contenant l'inoculum, puis couper le tube stérile en polyéthylène.
    REMARQUE: Laissez 1 mm de tube dessus de la pointe de l'aiguille pour éviter la perforation de la vessie.
  3. Coupez un morceau carré de 1 pouce de parafilm et de mettre un peu de lubrifiant chirurgicale (environ la taille d'un centime) sur le dessus.
  4. Anesthésier les souris C3H / HeN femmes en les mettant dans un bocal en verre de 32 onces contenant une boule de thé-infusion avec des boules de coton imbibées de 3 ml d'isoflurane ou de la chambre de vaporisation (à la suite fabrique protocole) jusqu'à inconsciente mais respire encore normalement (1 respiration / sec) .
    NOTE: Certains comités IACUC ne pas approuver l'utilisation d'un pot ou un vaporisateur. S'il vous plaît suivre les indications du comité IACUC de votre institution.
    NOTE: Si bocal en verreavec du thé-ball et / ou cône de nez avec des boules de coton isoflurane soakd sont utilisés, l'animal doit être observé avec soin pour éviter surdose d'un anesthésique et de la mort. L'avantage d'utiliser une chambre de vaporisation et l'anesthésie est qu'elle permet l'administration de l'isoflurane contrôlée qui évite les surdoses accidentelles. ATTENTION: L'isoflurane est un anesthésique par inhalation. Utiliser dans un endroit bien ventilé et minimiser l'inhalation.
  5. Débranchez la souris de la jarre / vaporisateur et placez-le sur le dos sur une serviette en papier et de diffuser les jambes.
  6. Couvrir le nez de la souris avec un cône de nez (un tube relié à l'évaporateur qui fournit une dose contrôlée de isoflurance qui est équipé sur certaines unités vaporisateur) ou 50 ml tube conique avec une boule de coton contenant une petite quantité (environ 1-2 ml ) de l'isoflurane.
  7. Palpiter doucement la vessie pour induire la miction et d'assurer une vessie annulé. Essuyez la région de l'urètre avec 100% d'éthanol essuyer. Tamponnez l'aiguille d'inoculation / seringue, premier point, dans lelubrifiant chirurgical.
  8. Ensemencer chaque souris avec 50 ul de la solution de bactéries en insérant l'aiguille d'inoculation par voie transurétrale, environ 12 mm, et en appuyant vers le bas sur le piston de la seringue pour distribuer doucement l'inoculum dans la vessie doucement (10 ul / sec). Retirez l'aiguille d'inoculation de la souris.
    NOTE: retour immédiat de l'inoculum à l'ouverture de l'urètre en commençant à inoculer indique insertion incorrecte ou incomplète de l'aiguille.
  9. Débranchez la souris de cône de nez et de le retourner dans sa cage. Répétez les étapes 3.3 à 3.8 pour chaque souris. Lorsque / si commutation inoculum conditions / souches, disposer de la seringue et l'aiguille d'inoculation dans un récipient pour objets tranchants approuvé et recommencer l'étape 3.2.
    NOTE: L'inoculation avec les organismes uropathogènes ne cause généralement pas de symptômes de douleur sévère. Cependant, dans de rares cas, l'administration de fortes doses d'agents pathogènes peut causer de la fièvre, la réduction de l'apport alimentaire et de l'eau et un comportement anormal. UNEla santé Nimal doit être surveillée tout au long de l'expérience. Si les symptômes de la douleur sont manifestes préavis, un analgésique, comme la buprénorphine (0,05-0,1 mg / kg par voie sous cutanée donnée), peuvent être appliquées. Les procédures devraient être en conformité avec IACUC de chaque institution.

4. Détermination des charges bactériennes

  1. Préparer 5 ml des tubes séparés pour chaque paire de la vessie et des reins pour être récolté. Ajouter 1 ml de PBS / tubes / vessie 1x de la souris pour être récolté. Ajouter 0,8 ml de PBS 1x / tubes / paire de reins de souris pour être récolté. Étiqueter chaque tube pour correspondre à une souris donnée. Préparer une plaque de 96 puits contenant 180 pi de PBS 1x dans chaque puits pour 01h10 dilutions en série.
  2. Nettoyer la zone de travail avec 70% d'éthanol et couvrir la zone avec une couverture ou une serviette en papier absorbant.
  3. Anesthésier la souris avec l'isoflurane (voir l'étape 3.4) jusqu'à ce que la souris cesse de respirer pendant environ 1 min, puis placez-le sur la couverture ou une serviette en papier absorbant. D'autres méthodes de euthanasia sont également acceptés par les comités du IACUC, tels que le dioxyde de carbone, et peut être remplacé par overdose d'isoflurane.
  4. Sacrifice la souris par dislocation cervicale rapide qui consiste à retenir le cou à la base de la tête et la queue tirant horizontalement loin du corps jusqu'à dislocation se produit.
    REMARQUE: La plupart des comités IACUC exigent un moyen secondaire de l'euthanasie et la dislocation cervicale est une méthode courante. Cependant, d'autres méthodes peuvent être utilisées si elles sont approuvées par le comité IACUC.
  5. Placez la souris morte sur son dos et pulvériser éthanol à 70% sur l'abdomen. On dissèque la souris, la récolte de la vessie et des reins, en ce qu 'afin de minimiser les risques de contamination du sang suivant la dissection du rein. Placez les organes indépendamment préparés dans les tubes de 5 ml contenant 1x PBS (voir l'étape 4.1).
    NOTE: Utiliser différents ciseaux pour la dissection externe et pour le prélèvement d'organes à minimiser la contamination.
  6. Appuyez sur le tube pour assurer les organes sont en til 1x PBS. Répétez l'étape 4,3-4,5 pour chaque souris. Ciseaux propres et pince à 70% d'éthanol après chaque souris.

5. bactérienne Recovery

  1. Homogénéiser la vessie et des reins récoltée dans les tubes de 5 ml avec un homogénéiseur de tissu, par 15 sec 30 sec rein et par la vessie. Rincer homogénéiseur de façon séquentielle dans du PBS 1x, 70% d'éthanol et 1 x PBS entre les échantillons.
  2. Faire des dilutions en série à 1:10 à 10 -8 et la plaque pour chaque dilution UFC (unités formant colonie) sur des plaques de gélose LB. Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit et compter les colonies le lendemain.

6. IBC Enumeration

  1. Retirer de manière aseptique la vessie et le placer dans 1x PBS dans une plaque à 6 puits avec un fond de silicone. Les plaques peuvent être préparés en utilisant un kit d'élastomère de silicone et en versant d'environ 1 cm de silicone dans chaque puits, voir instructions du fabricant. Couper la vessie dans la moitié avec des ciseaux.
  2. En utilisant de petites broches métalliques évasement doucement le bladder de sorte que la lumière de la vessie est orientée vers le haut. Veillez à placer les broches sur les bords extérieurs des sections de la vessie pour assurer la quantité maximale de urothélium est exposée.
  3. Après évasement, laver délicatement la vessie une fois avec PBS 1x. Retirez le 1x PBS à la pipette. Fixer la vessie en ajoutant suffisamment de paraformaldehyde à 3% pour couvrir toute la vessie évasée. ATTENTION: Paraformaldéhyde est cancérigène. Équipement de protection approprié, y compris des gants, doit être porté en tout temps. L'élimination doit suivre les directives institutionnelles.
  4. Incuber à température ambiante pendant 1 heure. Enlever la solution de paraformaldéhyde. Laver une fois avec PBS 1x.
  5. Laver avec une solution de lavage de LacZ (MgCl2 2 mM, désoxycholate de sodium à 0,01% et 0,02% nonidet-p40in 1x PBS) trois fois pour 5 min par lavage.
  6. Enlever la solution de lavage et ajouter suffisamment LacZ tache (9,5 ml de solution de lavage LacZ, 0,4 ml 25 mg / ml de X-gal et 0,1 ml de 100 mM K-FERROCYANURE / K-FERRICYANURE) pour couvrir les vessies. Incuber à 30 ° C overniGHT abri de la lumière.
  7. Retirer vessies écartés de l'incubateur et observer GRV, qui apparaissent puncta bleu comme visualisées avec un microscope à dissection, 40-60X grossissement.
    REMARQUE: Parfois, une souris peut uriner avant le placement du tube sous l'urètre. Dans ce cas, attendre 15-20 minutes avant de tenter de recueillir à nouveau urine.

7. Collection d'urine pour Bactériurie CFU Enumeration (Non applicable pour Cauti)

  1. Pour recueillir l'urine avant ou après l'infection doucement retenir la souris en maintenant la queue et en le plaçant sur une surface plane élevée (en haut de la cage de la souris).
  2. Maintenir un tube de 1,5 ml stérile sous l'urètre de la souris. Appuyez doucement sur le dos de la souris près de la queue pour faire pression sur la vessie. Catch l'urine dans le tube de 1,5 ml.
  3. Assurez-série des dilutions 1:10 à 10 -7 et plaque chaque dilution sur LB. appropriée Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit et compter les colonies le lendemain.

8. Cauti Modèle de protocole, cathéter aiguille Préparation pour Cauti Modèle (Figure S2)

  1. Retirez le bouchon de l'aiguille 30 G. Couper un morceau de tube PE10 et 5 mm morceau de tube de silicone tel que RenaSIL 7 mm. Enfilez l'aiguille avec PE10 tube jusqu'à ce que le tube touche la base de l'aiguille.
  2. Puis nourrir la pièce de 5 mm sur l'aiguille contenant PE10. UV stériliser les aiguilles assemblées nuit.
    NOTE: En chargeant le tube de silicone, laissez environ 1 mm de la tubulure étendant au-delà de la pointe de l'aiguille.

9. E. faecalis OG1RF inoculum bactérien Préparation

  1. Préparer OG1RF inoculum à partir de 48 heures avant le jour de l'inoculation. Streak OG1RF sur une BHI (infusion de coeur de cerveau) plaque à partir d'un stock congelé.
  2. Choisissez une colonie et l'inoculer dans 10 ml de BHI et de croître de manière statique pendant 18 heures à 37 ° C. Centrifuger la culture et laver le culot (3 fois) en volumes de 1 ml de PBS stérile 1x.
  3. Reprendre le culot bactérien dans PBS 1x. Mesurer la densité optique bactérienne et ajuster la concentration de la taille de l'inoculum souhaité. La concentration standard de l'inoculum utilisé est de 10 7; Cependant, cela peut varier en raison de la conception de l'étude

10. cathéter Implantation

  1. Nettoyez le poste de travail avec 70% d'éthanol et couvrir la zone avec une couverture absorbante (ou utiliser une hotte à flux stérile).
  2. Fixez cathéter-aiguille à un vide de 1 ml (TB) seringue. Coupez un morceau carré de 1 pouce de parafilm et de mettre un peu de lubrifiant chirurgicale (environ la taille d'un centime) sur le dessus.
    REMARQUE: Deux aiguilles différentes sont utilisées pour le dépôt du cathéter et de l'inoculum à l'inoculation accidentelle minimisée en raison de la manipulation mécanique nécessaire pour cathéter implantation. Ceci permet aussi pour des raisons de commodité de préparation moins aiguilles d'inoculation.
  3. Anesthésier souris C57BL / 6 en les mettant dans un bocal en verre de 32 onces contenant un thé-infuser balle avec des boules de coton trempé dans 3 ml d'isoflurane ou de la chambre de vaporisation (à la suite fabrique protocole) jusqu'à inconsciente mais respire encore normalement (1 respiration / sec).
  4. Ensuite, placez la souris sur le dos sur une serviette en papier et de répandre les jambes. Couvrir le nez de la souris avec un cône de nez ou 50 ml tube conique avec des boules de coton contenant une petite quantité (environ 1-2 ml) de l'isoflurane.
    ATTENTION: L'isoflurane est un anesthésique par inhalation. Utiliser dans un endroit bien ventilé et minimiser l'inhalation par le chercheur.
  5. Palpiter doucement la vessie pour induire la miction et d'assurer une vessie annulé. Essuyez région de l'urètre avec un éthanol à 100% essuyer.
  6. Désinfectez la région de l'urètre avec une solution de povidone-iode à 10% en utilisant un applicateur coton-tige. Tamponnez l'aiguille d'inoculation / seringue, premier point, dans le lubrifiant chirurgicale.
    REMARQUE: Povidone-iode est utilisé pour l'implantation du cathéter, qui est une solution aseptique plus fort que l'alcool. Cathéter implantation nécessiteplus manipulation mécanique pour insérer le cathéter et donc un plus grand risque de contamination.
  7. Insérer le cathéter dans l'ouverture de l'urètre. Une fois dans, l'utilisation des pinces pour pousser le (PE10 7 mm) de long morceau vers la vessie, par conséquent, la poussée (5 mm silicone) petit cathéter et le déposer dans la vessie. Retirez l'aiguille, avec le tube de 7 mm encore attaché, immédiatement.

11. bactérienne inoculation

  1. Suivez le protocole d'inoculation bactérienne dans l'article 3, en utilisant l'inoculum préparé à partir de la section 9. Retirer la souris du cône de nez et de le retourner dans sa cage

12. A chaque point Temps de Sacrifice

  1. Préparer tubes de 5 ml pour la vessie et les reins (organes Pour suivre l'étape 4.1) et 1,5 ml tube Eppendorf pour les cathéters. Ajouter 1 ml de 1 x PBS à 1,5 ml pour des échantillons tube Eppendorf de cathéter
  2. Suivez les étapes 4.3 à 4.5. Disséquer la souris, la récolte de la vessie, les reins et le cathéter, plaCING les tissus indépendamment en 5 ml tubes contenant 1x PBS et le cathéter dans le Eppendorf de 1,5 ml (voir l'étape 12.1).
    NOTE: Utiliser différents ciseaux pour la dissection externe et pour le prélèvement d'organes et de récupération de cathéter pour minimiser la contamination
  3. Ensuite, suivez l'étape 4.6.

13. bactérienne Recovery

  1. Pour les organes, suivez les étapes 5.1 et 5.2. Pour la récupération des bactéries à partir de cathéters, vortex à la vitesse maximale pendant 30 s, sonication des échantillons de cathéter pendant 5 minutes en utilisant un sonicateur à bain, puis vortex à la vitesse maximale pendant encore 30 secondes.
  2. Assurez-série des dilutions 1:10 à 10 -8 et plaque chaque dilution pour UFC recensement sur ​​des plaques BHI. Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit et compter les colonies le lendemain.

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Representative Results

Les modèles intravésicale d'UTI associée simple et le cathéter fournissent des plates-formes flexibles pour élucider les mécanismes moléculaires de la pathogénie bactérienne, l'impact de ces maladies sur les tissus de l'hôte, et le développement et l'essai de nouvelles approches pour gérer ces infections courantes et coûteuses. Selon la souche de souris et pathogène, l'inoculation intravésicale peut être utilisée pour étudier les interactions hôte-pathogène à élucider les facteurs nécessaires pour l'ouverture ou la modulation aiguë (Figure 1 et 3), chronique ou récurrente (Figure 2) cystite. Les données de la figure 1 sont représentatifs de phase aiguë (24 HPI) la colonisation du tractus urinaire par la cystite UPEC prototypique isoler UTI89 44. Après l'inoculation, les infections peuvent se développer pendant 24 heures à quel point les souris sont sacrifiées et les tissus de la vessie et du rein homogénéisé. Les homogénats tissulaires sont en série diluted et plaqué pour le dénombrement des bactéries colonisant. La colonisation chronique UPEC et l'inflammation de la vessie peuvent être établies et maintenues dans certaines lignées de souris (notamment C3H / HeN) à une dose infectieuse et uropathogène manière dépendante. Cystite chronique est définie comme bacteriuria persistants de titre élevé (> 10 4 CFU / ml), inflammation de la vessie et de titre élevé des charges de la vessie bactériennes (> 10 4 CFU / vessie) au moment du sacrifice 33. Les données représentées sur la figure 2 sont représentatifs UFC survenant 4 semaines après l'inoculation des souris C3H / HeN avec 2 x 10 7 CFU de UTI89. Dans ces conditions expérimentales, de 20 à 50% des souris infectées développer cystite chronique tandis que le restant de 50 à 80% des souris résoudre l'infection. Cette dualité de résultat dépend d'un poste de contrôle hôte-pathogène qui est décidé dans le premier 24 HPI. L'activation (ou non) des résultats de point de contrôle de la distribution bimodale observé des titres bactériens, qui commence à se manifester dansl'urine à 3 dpi (post-infection jours) et dans la vessie au sacrifice 28 dpi (Figure 2) 33. Souris avec une histoire de la cystite chronique sont significativement prédisposé à la cystite chronique récurrente lors de l'épreuve après l'infection initiale est effacée avec une antibiothérapie 33. De même, une histoire de l'UTI est un facteur de risque connu pour UTI récurrent chez les humains. Ainsi, ce modèle est la seule connue utilisée pour étudier la pathogenèse de la infection urinaire récidivante. Lors de la modélisation expérimentale UTI dans les origines de la souris de remplacement, il est important de déterminer si la souche de souris est sensible à l'infection urinaire, infection urinaire récidivante ou Cauti, étant donné que certaines souches sont plus ou moins résistants à l'élaboration de ces syndromes 33.

Une mesure supplémentaire de la cystite aiguë est IBC énumération. Formation IBC est restreinte aux cellules parapluie superficielles différenciées en phase terminale. IBC quantification est une mesure informative de la charge bactérienne aiguë lors de kysteSITI et des niveaux élevés de GRV corrélation avec le risque de développer la cystite chronique 21. Formation IBC se produit seulement dans les phases aiguës de la maladie. Après l'exfoliation des cellules parapluie superficielles, GRV ne sont plus respectées. Dans le modèle d'infection urinaire C3H / HeN, GRV peut être mesurée 6 heures après l'inoculation de 1 x 10 ~ 7 CFU de UTI89 dans la vessie par voie transurétrale. Vessies sont évasées avec des broches métalliques sur des plaques de silicone et colorées pour l'expression de LacZ. LacZ, β-galactosidase, une enzyme bactérienne est communément exprimée qui clive la liaison β entre le galactose et d'autres sucres. Cette enzyme peut être utilisée pour détecter les bactéries en fournissant X-gal, un analogue de β-galactoside, ce qui produit une couleur bleue lors du clivage. Après la coloration, les vessies sont imagés sous un microscope de dissection avec le GRV apparaissant comme punctae points bleus / pourpres sur l'urothélium et GRV peut être énumérés par comptage des points (figure 3A). Alors que le nombre de IBC formés par animal varie, dans la C3H / HeN fond une moyenne de ~ 50 GRV sont vu par la vessie (figure 3B). Augmentation GRV d'une manière dépendant de la dose. Le nombre de GRV qui forment varie entre UPEC et les souches de fond de la souris. Par exemple, chez les souris C57BL / 6, un inoculum de 1 x 10 ~ 7 UTI89 conduit à la formation de plusieurs centaines de GRV par la vessie.

Au-delà de la communauté simple acquise UTI modélisée ci-dessus, la santé associées aux soins les infections urinaires représentent un lourd fardeau pour le système de soins de santé. Les infections urinaires représentent environ 40% de toutes les infections associées aux soins de santé et jusqu'à 95% de tous les soins de santé associée infections urinaires sont cathéter associée 45. Nous démontrons ici un modèle murin de l'implant de la vessie de Cauti qui représente un système puissant pour l'analyse expérimentale de ce problème clinique difficile. Les données présentées sur la figure 4 sont représentatives des 24 infections hr avec le modèle E. faecalis s former OG1RF. Lorsque 1 x 10 7 UFC de OG1RF sont intravésicale inoculé dans une vessie non implantés, l'infection commence à se dégager par 24 HPI (figure 4A) et de 3 dpi l'infection a résolu 41. Inversement, l'inoculation de OG1RF dans un implantés résultats de la vessie dans la colonisation à la fois du cathéter et la vessie, avec 10 fois plus élevés niveaux vessie de colonisation à 24 hpi que ceux observés dans les vessies non implantés (figure 4A et 4B). En outre, cette infection est maintenue à> 10 6 UFC dans la vessie jusqu'à ce que la perte de cathéter environ 7 dpi 41. Tous les modèles expérimentaux décrits sont prêtent à un haut degré de flexibilité expérimentale, y compris mais non exclusif de diverses approches de l'imagerie macroscopique et microscopique des tissus et des surfaces infectées, tailles d'inoculum modifiés et les temps de la maladie, les infections compétitifs, et l'hôte analyses immunologiques .

ve_content "> Figure 1
Figure 1:. 24 h urinaire colonisation des voies Femme, vieilles souris C3H / HeN 7-8 semaines ont été inoculés avec transurétrale ~ 2 x 10 7 UFC de la cystite UPEC prototypique isoler UTI89 pendant 24 heures. UFC représentatifs récupérés à partir des tissus de la vessie et des reins récoltés sont présentés, n = 5. La ligne pointillée dénote la limite inférieure de détection (20 UFC).

Figure 2
Figure 2:. 28 jours colonisation du tractus urinaire féminin, âgé de 7-8 semaines souris C3H / HeN ont été inoculées par voie transurétrale avec 2 x 10 ~ 7 CFU UTI89. L'urine a été collecté au indiqué infection jours de poste (ppp) et plaqué pour UFC énumération. Représentant la vessie de 28 jours et les reins des titres sont également affichés, n = 8. Urine CFU limite inférieure de détection (1000 UFC / ml) est indiquée par la ligne pointillée. Repré en pointillésts limite le tissu inférieure de détection, 20 UFC / tissu.

Figure 3
Figure 3:. IBC énumération Femme, 7-8 la semaine ancienne C3H / HeN ont été transurétrale inoculé avec ~ 1 x 10 7 CFU UTI89. Vessies ont été récoltés 6 HPI et évasées pour IBC coloration. (A) Image de la vessie évasée après coloration LacZ. GRV sont représentés sous forme de points bleus. L'image en médaillon est un grossissement numérique de la section de l'image dans la boîte noire. (B) les nombres représentatifs de GRV formés dans des souris C3H / HeN 6 HPI, n = 10.

Figure 4
Figure 4: E. faecalis cathéter associé UTI. souris C57BL / 6 ont été inoculées avec ou sans cathéters avec 1 x 10 ~ 7 CFU de la (A) E. faecalis vessie colonisation en présence ou en l'absence de cathéter. (B) E. faecalis colonisation du cathéter. Test de Mann-Whitney a été utilisé pour des expériences de souris, p <0,05 était considérée comme statistiquement significative. **, P <0,005.

Figure S1
Figure S1:. UTI préparation de l'aiguille d'inoculation Schéma affiche inoculation étapes de préparation de l'aiguille y compris les matériaux nécessaires (1), le filetage du cathéter à l'aiguille (2) et coupe le tube avant l'inoculation (3).

Figure S2
Figure S2:. Cauti préparation de l'aiguille d'inoculation Schéma affiche de préparation matériel aiguilles d'inoculation nécessaires (1), le filetage du cathéter d'inoculation (2) et l'implantation sur cathéterà l'aiguille (3).

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Discussion

Communauté simple acquis UTI est une infection courante et coûteuse qui représente plusieurs millions de visites de soins primaires chaque année 46. En outre, CAUTIS sont une infection acquise de santé commun qui est devenu extrêmement coûteux pour les fournisseurs de soins de santé que les Centres de services Medicare et Medicaid ne rembourse les fournisseurs pour le coût supplémentaire de traitement résultant de l'hôpital acquis Cauti 45. Les modèles de souris de l'UTI, tant cystite et Cauti, décrits dans ces protocoles fournissent des outils précieux pour la compréhension de la base moléculaire des interactions nécessaires pour l'ouverture, le maintien, et de moduler le résultat de plusieurs formes de UTI hôte et du pathogène. Ces modèles permettent à l'application de puissants génétique bactérienne et de la souris, immunologiques, microscopiques, biochimiques et génétiques outils chimiques pour l'analyse de l'UTI 23,47-49. En outre, les protocoles décrites ici ont fourni une plate-formepour le développement et le test de stratégies thérapeutiques et préventives, y compris de nouveaux inhibiteurs à petites molécules de la virulence bactérienne et de nouvelles cibles de vaccination et des stratégies 50-55.

Il ya plusieurs conditions critiques qui doivent être maintenus pour l'application réussie du modèle de cystite. Comme avec toutes les procédures d'anesthésie de la souris, des précautions doivent être prises pour prévenir la mortalité des souris en raison de sur-anesthésie. Lors de la préparation du cathéter d'inoculation, le tube de silicone doit être suffisamment longue pour couvrir la pointe de l'aiguille, mais pas tant que d'endommager la paroi de la vessie sur cathétérisme. En outre, en raison de la proximité et la taille de l'orifice vaginal, il faut prendre soin d'insérer le cathéter d'inoculation dans l'urètre et le vagin pas. Au cours de la vessie évasement pour IBC énumération, il est essentiel que les vessies être écartés aussi rapidement que possible suivant la dissection et le tissu fixé pour approximately 1 h, mais pas en une nuit. Pour IBC énumération par coloration LacZ, il est également nécessaire que la bactérie en question produire LacZ pendant la colonisation des cellules urothéliales. Lors de l'utilisation des souches où l'enzyme est LacZ pas produite, il est encore possible d'énumérer GRV en utilisant la microscopie par immunofluorescence avec anti- E. Anticorps coli ou des bactéries exprimant la GFP. Une particularité de ce modèle est les motifs différents de progression de la maladie et la gravité présenté par différentes lignées de souris consanguines et le potentiel pathogène variable du prototype souches UPEC 33,56. Ces différences sont à la fois une force et une limitation de cette technique comme ils récapitulent la variation naturelle de la susceptibilité de l'hôte et de la diversité de l'agent pathogène qui a été observé dans les études cliniques et phénotypiques tout en compliquant la conception et l'interprétation 57,58 expérimentale. Ces variations constituent des sources de comparaison permettant l'élucidation de l'hôte et mechan bactérienneismes moduler la pathogenèse de l'infection urinaire simple 33,56. Cependant, ils signifient également que, en raison du degré variable de la ligne de la souris UTI susceptibilité, plus grand soin doit être apporté au choix de la lignée de souris correcte et la souche UPEC pour aborder la question particulière un enquêteur demande. Par exemple, C57BL / 6 sont un excellent modèle de l'infection aiguë, présentant avec des titres élevés de bactéries et un grand nombre de GRV au début des points de temps. Cette souche résout alors rapidement l'infection entre 3 et 7 ppp avec la seule colonisation persistante résultant d'infections sévères du rein et des réservoirs intracellulaires repos 33,34. Le C57BL / 6 modèle peut représenter avec précision l'issue la plus courante pour de nombreux patients UTI dans laquelle les symptômes présents et résolvent. Inversement, le fond de la souris C3H / HeN présente un degré élevé de sensibilité à la cystite chronique qui les rend une souche idéale pour étudier les infections urinaires récurrentes. Autres modèles UTI ont également été établisdans ABC, DBA et C3H / HeJ souris fond prouver utile pour étudier des aspects particuliers de l'UTI 33,59. L'inconvénient primaire expérimentale présentée par le modèle de cystite est l'existence de multiples goulets d'infection limitant l'application de méthodes de dépistage génétique à grande échelle pour la découverte de nouveaux facteurs bactériennes nécessaires pour aiguë, chronique et récurrente cystite 60.

Les considérations critiques pour le modèle de cystite tous valables pour le modèle de base de l'implant Cauti avec deux préoccupations supplémentaires. Tout d'abord, il faut prendre soin d'assurer que l'insertion de l'implant se fait d'une manière stérile, en raison de la susceptibilité accrue à l'infection de la vessie conféré par l'implant. Deuxièmement, il est essentiel que le cathéter être maintenu en place pendant le retrait de l'aiguille d'implantation. Les principales limites du modèle de Cauti sont qu'il a une diminution de l'amplitude des origines génétiques de l'hôte disponible, le propensity pour la perte de cathéter au cours du temps et de l'impossibilité de collecter l'urine due à un dysfonctionnement de la vessie résultant de l'implantation. Pour compenser la perte de l'implant et l'incapacité à contrôler l'infection par l'analyse d'urine longitudinale, ce modèle nécessite généralement un plus grand nombre de souris cathétérisé pour les points et les groupes de souris temps plus tard, doit être sacrifié à chaque point de temps désiré. Les hôtes limitée génétiques milieux résultats de la fréquence à laquelle prohibitifs certaines souches de souris, tels que C3H / poule, perdent l'implant (P. Guiton, communication personnelle, 2010). En conséquence, les protocoles de Cauti décrits ci-dessus ont uniquement été optimisées dans la souche de souris C57BL / 6. Cependant, alors que la limitation des souches de souris disponibles pour Cauti est malheureux, de nombreuses variantes génomiques ont été établis dans le C57BL / 6 arrière-plan et le modèle de Cauti élargit la diversité bactériologiques disponibles pour étude au cours UTI en modifiant l'environnement de la vessie pour faciliter la colonisation par des organismes qui sontautrement non pathogène dans le modèle murin d'infection urinaire. Un exemple de ceci est la récente découverte du rôle de Fg libéré au cours de cathéter induite par l'inflammation de la vessie chez E. la croissance de la faecalis, la formation de biofilm, et la persistance pendant Cauti 42. Cet exemple illustre la puissance du modèle de Cauti de l'implant dans l'élucidation des mécanismes non seulement moléculaires de la pathogenèse bactérienne, mais aussi le rôle des facteurs de l'hôte au cours de l'infection. Toutes ces caractéristiques contribuent à la compréhension de cette infection clinique pertinente, qui a été préalablement understudied.

En plus des approches expérimentales décrites ci-dessus, les modèles de souris de cystite et Cauti se prêtent à un grand nombre de modifications méthodologiques. Dans le cas du modèle de cystite, ces modifications peuvent inclure la réduction du volume d'inoculation et la force appliquée au cours de l'instillation de l'inoculum de réduire le nombre de bactériesintroduit dans les reins 61, la variation de la durée de l'infection, en sacrifiant à des points de temps dès le 1er HPI et en utilisant des analyses de protection gentamicine pour évaluer la mesure dans laquelle le uropathogène a envahi la vessie cellules épithéliales 62. Les vessies écartés de souris sacrifiées entre 6 et 24 hpi peut également être sectionné et colorées avec des anticorps à divers hôte et / ou épitopes bactériennes et observé sous un éclairage fluorescent ou microscopie confocale à observer la structure IBC, fondant bactérienne et filamentation et tissus de l'hôte état ​​25,33 , 63,64. L'effet de l'infection par uropathogène et / ou l'implantation sur les réponses immunitaires locales et systémiques de l'hôte peut être évaluée en utilisant le système cytométrie de talon Bioplex ou des analyses basées ELISA pour déterminer les niveaux de cytokine dans le sérum ou l'urine, respectivement 33,65. Enfin, l'état du tissu de la vessie, l'emplacement et la morphologie des bactéries colonisant et la structure du biofilm déposé surle cathéter peut être évaluée par diverses techniques d'imagerie, notamment la microscopie électronique 25,41.

Ces modèles de base de l'infection peuvent également être adaptés à imiter d'autres phénomènes cliniquement pertinents, y compris infection urinaire récidivante et le développement d'une réponse immunitaire adaptative via de multiples infections. Dans ce contexte, répété infection de souris C57BL / 6 Résultats de la souris en une résistance accrue à la cystite aiguë tandis que dans le modèle de souris C3H / HeN, le développement préalable de la cystite chronique suivie par la clairance de l'infection par l'administration d'agents antimicrobiens sensibilise ces souris à développer la cystite chronique sur des vaccinations ultérieures 66. En outre, les mécanismes moléculaires de facteurs de risque pour le développement de l'UTI peuvent être examinées. Il a été démontré diabète et l'obésité à la fois d'augmenter la fréquence et la gravité des infections urinaires. Le diabète de type 2 peuvent être modélisées dans des souris génétiquement dans le fond FVB / NJ et un modèle induite chimiquement de diabète de type 1 a already été montré pour augmenter la sévérité des infections urinaires causées à la fois par l'UPEC et K. pneumophila 67,68.

Enfin, ces systèmes modèles représentent un terrain d'idéal pour le développement et l'optimisation des modalités thérapeutiques visant à traiter ou prévenir les infections urinaires et CAUTIS. La compréhension moléculaire des interactions hôte-pathogène fournies par ces modèles a déjà facilité l'élaboration de stratégies de vaccination efficaces visant à cibler les principaux facteurs de virulence 51-55. En outre, les petites molécules inhibitrices de UPEC adhérence ont été révélés efficaces dans le traitement des infections des voies urinaires sans complication aiguë et chronique ainsi que Cautis causée par UPEC 12,69,70. Les deux modèles simples UTI et Cauti décrits dans ces protocoles fournissent les outils expérimentaux à disséquer les détails moléculaires des interactions hôte-pathogène dans le tractus urinaire. Ces outils peuvent être mis à profit dans de nombreux moyens d'élargir notre understanding de cet ensemble complexe de conditions et de faciliter le développement d'interventions thérapeutiques plus efficaces.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Le financement de ce travail a été fourni par ORWH SCOR P50 DK064540, RO1 DK 051406, RO1 AI 108749-01, F32 DK 101171, et F32 DK 104516-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material for catheter and needle preparation:
30 G needles BD Precision Glide 305106 30 G x ½ (0.3 mm x 13 mm)
PE10 polyethylene tubing BD 427400 Inside diameter -0.011 in (0.28 mm); outside diameter – 0.024 in (0.61 mm)
RenaSIL 025 platinum cured silicon tubing Braintree Scientific, Inc SIL 025 inside diameter-0.012 x outside diameter 0.025, 25 ft coil
Material for infections:
Isoflourane – Isothesia Butler Schein 29405 250 ml
Clear Glass Straight-Sided Jar Kimble Chase 5413289V 21
Stainless Steel Tea Infuser Schefs-Amazon Premium Loose Leaf Tea Infuser By Schefs - Stainless Steel - Large Capacity -
Non-sterile cotton balls Fisherbrand 22-456-880
50 ml Falcon tubes VWR 89039-660
Isotec 3 -vaporizer Ohmeda 1224478
Ear punch Fisher Scientific 13-812-201 (when necessary)
Betadine solution Betadine solution 10% Povidie-iodine topical solution
Q-tips Fisher Scientific 22-037-924 6 inches
Diapers for bench Fisherbrand 14206 63 Absorbent Underpads (20”X36”mats)
Surgical lubricant Surgilube 0281-0205-36
Dissecting scissor Fine Science tools, INC 14084-08
Micro-Adson Forceps Fine Science tools, INC 11018-12
1 ml syringe BD 309659 Tuberculin slip tip
Parafilm Bemis PM996 4 inches x 125 FT
Eppendorf rack Fisherbrand 05-541-1
Eppendorf tubes MIDSCI AVX-T-17-C
Harvesting catheters, bladders and kidneys:
Homogenizer PRO Scientific INC Bio-Gen Pro 200
5 ml polypropylene round-bottom tube BD 352063 for organ homogenization
Paper towel Georgia-Pacific
Ethanol Pharmco-AAPER 11100020S 200 proof
Costar™ Clear Polystyrene 96-Well Plates Corning 3788
1x Phosphate sodium saline Sigma-Aldrich P3813
BRANSONIC Ultrasonic cleaner 1210 Branson Ultrasonics Corporation 1210
IBC materials:
6-well tissue culture test plate Techno Plastic Products 92006
Pins Fine Science Tools 26002-20
Sylgard 184 Dow Corning 3097358-1004 Silicone Elastomer Kit
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside) Invitrogen 15520-034 Ultrapure
N, N-Dimethylformamide Sigma Aldrich D4551
MgCl2 (Magnesium chloride) Sigma Aldrich M8266
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich D6750
Nonidet-P40 Roche 11754599001 Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate (K-ferrOcyanide) Sigma Aldrich P3289
Potassium hexacyanoferrate(III) (K-ferrIcyanide) Sigma Aldrich 60299

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Tags

Médecine émission 100, UPEC, Uropathogène cathéter infection des voies urinaires IBC la cystite chronique

Erratum

Formal Correction: Erratum: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model
Posted by JoVE Editors on 08/18/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. The Protocol section has been updated.

The ethics statement has been updated from:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20120216, which was approved 01/11/2013 and expires 01/11/2016. Overall care of the animals was consistent with The guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

to:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20150226, which expires 12/10/2018. Overall care of the animals was consistent with The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

Step 3 has been updated from:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a 32 ounce glass jar containing a tea-infuser ball with cotton balls soaked with 3 ml of isoflurane or vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a jar or vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    NOTE: If glass jar with tea-ball and/or nose cone with isoflurane-soakd cotton balls are used, the animal must be carefully observed to avoid anesthetic overdose and death. The advantage of using a vaporizer and anesthesia chamber is that it provides controlled isoflurane administration that avoids accidental overdoses. CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the jar/vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) or 50 ml conical tube with a cotton ball containing a small amount (approximately 1-2 ml) of isoflurane.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.

to:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) to maintain anesthetization.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.
Création et caractérisation de l&#39;UTI et Cauti dans un modèle de souris
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Conover, M. S., Flores-Mireles, A.… More

Conover, M. S., Flores-Mireles, A. L., Hibbing, M. E., Dodson, K., Hultgren, S. J. Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. J. Vis. Exp. (100), e52892, doi:10.3791/52892 (2015).

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