Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Upprättande och karakterisering av UTI och CAUTI i en musmodell

Published: June 23, 2015 doi: 10.3791/52892
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Microbiology and Center for Women's Infectious Disease Research, Washington University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Abstract

Urinvägsinfektioner (UVI) är mycket vanliga, en viktig orsak till sjuklighet och blir alltmer resistenta mot behandling med antibiotika. Kvinnor är oproportionerligt drabbas av urinvägsinfektion: 50% av alla kvinnor kommer att ha en urinvägsinfektion under sin livstid. Dessutom 20-40% av dessa kvinnor som har en initial UVI kommer att drabbas av återfall med vissa lider täta återfall med allvarlig försämring av livskvaliteten, smärta och obehag, störningar i den dagliga verksamheten, ökade sjukvårdskostnader, och några behandlingsalternativ andra än långtidsantibiotikaprofylax. Uropatogena Escherichia coli (UPEC) är den primära smittämnen av samhällsförvärvad UVI. Kateter-associerad UTI (CAUTI) är den vanligaste vårdrelaterade infektioner står för en miljon förekomster i USA årligen och dramatiska sjukvårdskostnader. Medan UPEC är också den främsta orsaken till CAUTI, andra orsakande medel är av ökad betydelse inklusive Enterococcusfaecalis. Här använder vi två väletablerade musmodeller som rekapitulera många av de kliniska egenskaperna hos dessa mänskliga sjukdomar. För UTI, rekapitulerar en C3H / HeN modell många av funktionerna i UPEC virulens observerats hos människor inklusive värdsvar, IBC formation och filamentation. För CAUTI, en modell med C57BL / 6-möss, som behåller kateter blåsa implantat, har visat sig vara känsliga för E. faecalis urinvägsinfektion. Dessa representativa modeller som används för att få slående nya insikter i patogenesen av UTI sjukdom, vilket leder till utveckling av nya läkemedel och hantering eller förebyggande strategier.

Introduction

Urinvägsinfektioner (UVI) är en av de vanligaste bakteriella infektioner och kan delas in i två kategorier baserat på mekanismen för förvärvet, gemenskap och sjukhus förvärvade UVI. Samhällsförvärvad UTIs förekommer ofta i övrigt friska kvinnor och studier har visat att cirka 50% av kvinnorna kommer att ha minst en UTI under sin livstid 1. Dessutom är återkommande ett stort problem. En kvinna som har en initial akut infektion har en chans 25-40% av att ha en andra infektion inom sex månader trots lämplig antibiotikabehandling och många kvinnor fortsätter att ha täta återfall 2. De bakterier som orsakar dessa infektioner blir också allt antibiotikaresistenta ytterligare störande behandlingsprotokoll 3-6. UTI påverkar miljontals människor varje år kostar omkring 2,5 miljarder dollar i vårdrelaterade kostnader i USA, vilket understryker effekten och förekomsten av sjukdomen1,7 .Nosocomial förvärvade urinvägsinfektioner är främst förknippade med förekomsten av främmande partiklar som kvarliggande katetrar. Kateter-associerad UVI (CAUTI) förblir den vanligaste sjukhus förvärvade UTI står för ~ 70-80% av sådana infektioner 8. Vidare är CAUTI associerad med ökad sjuklighet och dödlighet, och det är den vanligaste orsaken till sekundära blodinfektioner 9.

UPEC tillhörande samhällsförvärvad urinvägsinfektioner tros vara orsakad av införandet av bakterier i urinblåsan från reservoarer i mag-tarmkanalen via mekanisk manipulation under samlag, dålig hygien eller andra mikrobiella populationsdynamik mellan olika värd Nischer 10. Väl inne i urinblåsan, UPEC anställa många virulensfaktorer, inklusive kapsel, järn förvärvssystem, toxiner, en virulensplasmiden, tRNA, patogenicitet öar och koloniseringsfaktorer som har visat sig spela en roll i patogenesen <sup> 11-14. Avgörande för fastställandet av UPEC kolonisering, UPEC kodar också flera typer av lim förkläde vaktmästare vägen (CUP) pili som känner igen receptorer med stereo specificitet 15. Typ 1 pili, tippas med FimH adhesin, uttrycks av UPEC och binda mannosylated uroplakins 16 och α-1, β-3 integriner 17, som uttrycks på den luminala ytan av både mänskliga och mus blåsor 18. Dessa FimH-förmedlade interaktioner underlättar bakteriell kolonisering och invasionen av ytliga epitelceller 19,20. Väl inne i cellen kan UPEC fly in i cytoplasman där en enda bakterie snabbt kan dela sig för att bilda en intracellulär bakteriesamhället (IBC), som vid mognad, kan innehålla ~ 10 4 bakterier 21. IBC bildning har visats i minst sex olika musstammar, C3H / HeN, C3H / HeJ, C57BL / 6, CBA, FVB / NJ och BALB / c, och med ett brett utbud av olika UPEC-stammar och andra Enterobacteriaceae 22-24. Emellertid temporala och spatiala skillnader i IBC bildning kan variera beroende på den mus bakgrunden och den infekterande UPEC stammen. I C3H / HeN-möss infekterade med den prototypiska UPEC stammar UTI89 eller CFT073, IBC bildning kan visualiseras som små biomassor av bakterier så tidigt som 3 hpi (timmar efter infektion). Denna gemenskap fortsätter att expandera och når en "mittpunkt" utveckling cirka 6 hpi när stavformade bakterier upptar en stor del av den cytoplasmiska utrymmet terminalt differentierade ytliga paraplyceller Dessa tidiga IBC form i ett relativt synkroniserat sätt med de flesta visar liknande dimensioner och morfologier. ~ 8 HPI bakterierna i IBC förändringen från ett baciller till kocker morfologi. IBC-behållare är av övergående natur. Således IBC mognad 12-18 HPI resulterar i fortsatt expansion av bakteriepopulationen, följt av deras filamentation och spridning ut ur cellen with efterföljande spridning till angränsande celler 23. Således tillåter IBC nisch för snabb bakterietillväxt i en miljö som är skyddad från värdens immunsvar och antibiotika 25. De olika stadierna av UPEC infektion som syns i möss också observerats hos människa, såsom IBC-behållare och filamentering, stödja musmodell av UVI som ett fördelaktigt verktyg som kan användas för att modellera UTI hos människor 22,26-28.

Medan en majoritet av kvinnor upplever en UTI under sin livstid, kan resultatet av dessa infektioner allt från akut självbegränsande infektion utan återfall, att täta återkommande blåskatarr. Vidare har studier visat en stark familjär förekomst av UTI, vilket tyder på en genetisk komponent bidrar till UTI känslighet 29. Vi har funnit att de olika UTI resultat sett i kliniker kan speglas av de olika resultaten av experimentell UPEC infektion bland inavlade musstammar 30. Till exempel, C3H / höna, CBA, DBA och C3H / HeOuJ möss är mottagliga, i en smittsam dosberoende sätt, till långvarig, kronisk cystit karaktäriseras av ihållande höga titer bakterier (> 10 4 kolonibildande enheter (CFU) / ml), hög titer bakterie blås bördor på offer> 4 veckor efter infektion (WPI), kronisk inflammation och uroteliala nekros. Dessa möss uppvisar också förhöjda serumnivåer av IL-6, G-CSF, KC, och IL-5 i den första 24 hpi som fungerar som biomarkörer för utveckling av kronisk cystit. Detta kan noggrant representera det naturliga förloppet av UTI hos vissa kvinnor, som placebo studier har visat att en stor andel av kvinnor upplever UVI kommer att behålla höga nivåer av bakterier i urinen i flera veckor efter de första symptomen på cystit om det inte ges antibiotikabehandling 31 , 32. Vidare använder C3H / HeN möss, fann vi att en historia av kronisk cystit är en betydande riskfaktor för senare allvarliga återkommande infektioner. Återkommande UTI är det mest significant klinisk manifestation av UTI och C3H / höna mus är för närvarande den enda studerade modellen som rekapitulerar en ökad benägenhet efter tidigare exponering. En andra UVI utfall rekapituleras i C57BL / 6 möss, där akut UPEC infektion är självbegränsande, med upplösning på inflammation i urinblåsan och bakteriuri inom cirka en vecka. Intressant i denna modell, UPEC bildar lätt vilande intracellulära reservoarer inom blåsvävnad från vilken UPEC har förmåga att fram från ett vilande tillstånd att återinitiera en aktiv UVI, potentiellt förklara en mekanism för samma stam återkommande UTI hos människor 33, 34.

Förutom genetiska påverkan på UTI känslighet ökar införandet av en kateter i urinblåsan kraftigt sannolikheten för att ha en infektion samt öka utbudet av bakterier som kan orsaka en infektion. Det har visats att mänsklig urin kateterisering orsakar histologiska ochimmunologiska förändringar i urinblåsan på grund av mekaniska påkänningar som resulterar i en robust inflammatoriskt svar, peeling, ödem i lamina propria och submucusa, uroteliala gallring och mucosal skada av urotelium och njure 35,36. Dessutom ger katetern en yta för bakteriell vidhäftning och därigenom skapa en miljö utnyttjas av flera arter för att orsaka CAUTI. Medan UPEC är fortfarande en viktig bidragsgivare, svarar Enterococcus faecalis för 15% av dessa CAUTI 37. E. faecalis blir alltmer resistenta mot antibiotika med resistens mot vancomycin uppkomst, utgör ett allvarligt hälsoproblem 38. E. faecalis har många virulensfaktorer inklusive toxiner och adhesiner som krävs för anslutning till både katetern och epitel 38. Under urin kateterisering, är utsatta för mikrobiell adhesion, förökning och spridning i urinvägarna 39,40 värden. E. faecalis bildar en biofilm på katetern som en del av en mekanism för att framhärda i urinblåsan och sprida till njurarna, som återges i en mus CAUTI modell 41. Nyligen har det visat vid urin kateterisering, fibrinogen (Fg) som släpps in i blåsan som en del av det inflammatoriska svaret. Fg ackumuleras i blåsan, rockar katetern och är väsentlig för E. faecalis biofilmsbildning, som fungerar som en bilaga schavotten. I en C57BL / 6 musmodell av CAUTI, upptäckte vi att E. faecalis biofilmbildning på katetern, och sålunda persistens i blåsan, var beroende av EBP pilus, speciellt dess spets adhesin EBPA. Vi fann att den N-terminala domänen av EBPA specifikt binder till FG beläggning av katetern. Dessutom konstaterades det att E. faecalis använder Fg som metabolit källan under infektion, vilket ökar biofilm formation 42.

Musmodeller har visat avgörande för understanding samt att förutsäga kliniska manifestationer av UTI och CAUTI 41. I den här artikeln visar vi inokulat beredning av cystit UPEC isolera UTI89 och transuretral ympning av C3H / HeN möss. Dessutom visar vi ett protokoll för katetrar i C57BL / 6-möss och inokulering av E. faecalis OG1RF stam. Båda dessa tekniker leder till en konsekvent och pålitlig UVI eller CAUTI i möss. Vi visar också tekniker som används för att observera IBC formation under akut cystit och urinsamling för analys av kronisk eller återkommande blåskatarr. C3H / HeN-möss har använts för att studera aspekter av UPEC patogenes inklusive inledande bakteriell invasion, IBC bildning, filamentering och utveckling av kronisk cystit 23,33,43. Dessa virulens parametrar har också undersökts i en rad andra mus bakgrunder 22,33. För CAUTI tillåter C57BL / 6 modell för främmande kropp implantation i urinblåsan med efterföljande bakteriell samarbetelonization, som kan hållas i 7 dagar efter infektion 41. Dessa modeller har varit användbar för att bedöma bakteriell virulens mekanismer, värd svar på UVI och mekanismer för att undergräva värdsvar, som till stor del har därefter sammanfattat eller observerats i kliniska befolkningsgrupper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik uttalande: Washington University Animal Studies Utskottet godkände alla mus infektioner och förfaranden som en del av protokoll nummer 20120216, som godkändes 2013/01/11 och löper 2016/01/11. Övergripande hand om djuren överensstämde med Guiden för vård och användning av försöksdjur från National Research Council och USDA Animal Care Resource Guide. Dödshjälp förfaranden är förenliga med "AVMA riktlinjer för avlivning av djur 2013 utgåva."

1. UPEC UTI protokollet Inokulering Needle Förberedelser (figur S1)

  1. Ta bort locket av 30 G-nål. Tråd approximativt en tum av PE10 slangen på axeln av nålen. UV sterilisera nålmonteringar över natten. Kateter nålar kan lagras på obestämd tid i sterila petriskålar.

2. UPEC Bakteriell Inokulat Framställning

  1. Förbered UTI89 inokulum (start 72 timmar före inoculaning dag)
    1. Streak UTI89 på en LB (Luria-Bertani) agarplatta från en frusen lager. Inkubera över natten vid 37 ° C. Välj en koloni och ympa den i 10 ml LB i en 125 ml kolv. Inkubera vid 37 ° C under 24 timmar, statiskt.
    2. Inokulera 10 pl natten kultur i 10 ml LB i en ny 125 ml kolv under ytterligare 24 timmar vid 37 ° C, statiskt.
    3. Överför 3 ml (varierar beroende på stam och önskad inokulat storlek) till sterila 1,5 ml rör och centrifugera vid 7000 xg under 3 min och suspendera pelleten i 1x PBS och centrifugera en andra gång. Resuspendera den bakteriella pelleten i 1 ml 1 x PBS.
  2. Mät bakteriell optisk densitet och justera koncentrationen till önskad inokulat tätheten. Standardkoncentrationen av inokulatet som används är 10 7 bakterier; dock kan detta variera på grund av utformningen av studien.

3. Bakteriell Inokulation

  1. Rengör arbetsstation med 70% etanol och cöver området med absorberande papper (eller använd steril flöde huva).
  2. Rita upp till 0,9 ml av den framställda bakteriella ympen i en 1 ml (TB) spruta (ta bort luftbubblor). Bifoga en förberedd steril ympning nål med PE10 slang, på sprutan innehållande inokulatet, då sterilt trimma slangen polyeten.
    OBS: Lämna ett mm slang ovanför spetsen på nålen för att undvika punktering av blåsan.
  3. Skär en 1 tums fyrkant bit parafilm och sätta en klick kirurgisk smörjmedel (ungefär lika stor som en krona) ovanpå.
  4. Söva kvinnliga C3H / HeN möss genom att placera dem i en 32 ounce glasburk innehållande en te-infusions boll med bomullstussar indränkt med 3 ml isofluran eller förångningskammare (efter tillverkar protokoll) tills medvetslös men fortfarande andas normalt (1 andetag / sek) .
    OBS: Vissa IACUC kommittéer godkänner inte användning av en burk eller förångaren. Följ indikation på IACUC kommitté institutionen.
    OBS: Om glasburkmed te-ball och / eller noskon med isofluran-soakd bomullstussar används, måste djuret följas noga för att undvika bedövningsmedel överdos och död. Fördelen med att använda en förångare och anestesi kammaren är att det ger kontrollerad isofluran administration som undviker oavsiktlig överdosering. VARNING: Isofluran är ett inhalationsanestetikum. Används på väl ventilerad plats och minimera inandning.
  5. Ta bort musen från burken / förångaren och placera den på rygg på en pappershandduk och sprida benen.
  6. Täck näsan på musen med en noskon (ett rör anslutet till förångaren som ger en kontrollerad isoflurance dos som är utrustad på vissa vaporizer enheter) eller 50 ml koniska rör med en bomullstuss innehållande en liten mängd (ca 1-2 ml ) av isofluran.
  7. Klappa försiktigt blåsan för att inducera urinering och säkerställa en annullerade blåsa. Torka periuretrala område med 100% etanol torka. Badda ympning nålen / sprutan, punkt först ikirurgisk smörjmedel.
  8. Inokulera varje mus med 50 ul av lösningen bakterier genom att föra in ympning nålen transurethrally, ca 12 mm, och trycka ned sprutkolven försiktigt för att fördela inokulatet i blåsan försiktigt (10 ul / sek). Ta bort ympning nålen från mus.
    OBS: Omedelbar avkastning av inokulat på urinrörsmynningen när du börjar att ympa indikerar felaktig eller ofullständig insättning av nålen.
  9. Ta bort musen från noskonen och återlämna den till sin bur. Upprepa steg 3,3-3,8 för varje mus. När / om växling inokulatnivåer villkor / stammar, kassera sprutan och ympning nål i en godkänd avfallsbehållare och börja om igen steg 3.2.
    OBS: Ympning med uropatogena organismer i allmänhet inte orsaka allvarliga smärtsymptom. Men i sällsynta fall, att administrera stora doser av patogener kan orsaka feber, minskning av mat och vatten intag och onormalt beteende. ENNimal hälsa bör övervakas under hela experimentet. Om uppenbara smärta symtom är meddelande, en smärtstillande, såsom buprenorfin (0,05-0,1 mg / kg ges subkutant), kan tillämpas. Rutiner bör ske i enlighet med varje institutions IACUC.

4. Bestämning av Bacterial bördor

  1. Bered separata 5 ml rör för varje blåsa och njurar par som ska skördas. Tillsätt 1 ml 1 x PBS / rör / mus blåsan att skördas. Lägg 0,8 ml 1x PBS / rör / par mus njurar som ska skördas. Märk varje rör för att motsvara en given mus. Bered en 96-brunnars platta innehållande 180 ^ il 1 x PBS i varje brunn under 1:10 seriespädningar.
  2. Rengör arbetsområdet med 70% etanol och täcka området med ett absorberande omslag eller pappershandduk.
  3. Bedöva musen med isofluran (se steg 3.4) tills musen slutar andas i ca 1 minut, sedan placera den på absorberande omslag eller pappershandduk. Andra metoder för euthanasia accepteras också av IACUC kommittéer, såsom koldioxid, och kan användas i stället för isofluran överdos.
  4. Offra musen genom snabb halsdislokation som består av fasthållande halsen vid basen av huvudet och dra svansen horisontellt bort från kroppen till dess att störningen uppträder.
    OBS: De flesta IACUC utskott kräver ett sekundärt sätt att dödshjälp och halsdislokation är en vanlig metod. Emellertid kan andra metoder användas om de godkänns av IACUC kommitté.
  5. Placera döda musen på rygg och spraya 70% etanol på buken. Dissekera mus, skörd blåsan och njurarna, i den ordningen för att minimera potentiell förorening från blodet efter njuren dissektion. Placera organ oberoende i de preparerade 5 ml rör innehållande 1x PBS (se steg 4.1).
    OBS: Använd olika sax för externa dissekering och för organstölder för att minimera kontaminering.
  6. Tryck på röret för att säkerställa att organ är i than 1x PBS. Upprepa steg 4,3-4,5 för varje mus. Rena sax och pincett i 70% etanol efter varje mus.

5. Bakteriell återhämtning

  1. Homogenisera Skördad urinblåsa och njurar i 5 ml rör med en vävnadshomogenisator, 15 sek per njure och 30 sekunder per blåsan. Skölj homogeniseringsanordning sekventiellt i 1 x PBS, 70% etanol och 1 x PBS mellan proven.
  2. Gör serie 1:10 utspädningar ut till 10 -8 och platta varje utspädning för CFU (kolonibildande enheter) på LB-agarplattor. Inkubera plattorna vid 37 ° C över natten och räkna kolonier nästa dag.

6. IBC Räkning

  1. Aseptiskt avlägsna blåsan och placera den i 1 x PBS i en 6-brunnsplatta med en silikon botten. Plattorna kan framställas med användning av en silikonelastomer kit och hälla ungefär 1 cm av silikon i varje brunn, se tillverkarens instruktioner. Skär blåsan i hälften med sax.
  2. Med små metallstift försiktigt splay den bladder så att blåsan lumen är vänd uppåt. Var noga med att placera stiften vid de yttersta kanterna av urinblåsan delar för att säkerställa maximal mängd urothelium exponeras.
  3. Efter splaying försiktigt tvätta blåsa en gång med 1x PBS. Ta bort 1x PBS med pipett. Fäst blåsan genom att tillsätta tillräckligt 3% paraformaldehyd för att täcka hela splayed blåsan. VARNING: Paraformaldehyd är cancerframkallande. Lämplig skyddsutrustning, inklusive handskar, ska bäras vid alla tillfällen. Avfallshantering bör följa institutionens riktlinjer.
  4. Inkubera vid rumstemperatur under 1 timme. Avlägsna paraformaldehydlösning. Tvätta en gång med 1 x PBS.
  5. Tvätta med LacZ-tvättlösning (2 mM MgCl2, 0,01% natriumdeoxikolat och 0,02% Nonidet-p40in 1x PBS) tre gånger under 5 min per tvätt.
  6. Avlägsna tvättlösningen och tillsätt tillräckligt LacZ fläck (9,5 ml LacZ tvättlösning, 0,4 ml 25 mg / ml X-gal och 0,1 ml 100 mM K-ferrocyanid / K-ferricyanid) för att täcka blåsoma. Inkubera vid 30 ° C overniGHT skyddas från ljus.
  7. Ta utspärrade blåsor från inkubatorn och iaktta IBC-behållare, som visas som blå puncta som visualiseras med en dissekera omfattning, 40-60X förstoring.
    OBS: Ibland kan en mus kan urinera före placering av röret under urinröret. I det här fallet, vänta 15-20 minuter innan du försöker att samla urin igen.

7. Urin Insamling för bakteriuri CFU Uppräkning (Ej tillämplig för CAUTI)

  1. För att samla urin före eller efter infektion försiktigt hålla musen genom att hålla svansen och placera den på en plan upphöjd yta (övre delen av mus bur).
  2. Håll ett sterilt 1,5 ml rör under musen urinröret. Tryck försiktigt nedåt på baksidan av musen nära svansen att utöva påtryckningar på blåsan. Fånga urinen i 1,5 ml rör.
  3. Gör serie 1:10 späd ut till 10 -7 och plattan varje utspädning på lämpligt LB. Inkubera plattorna vid 37 ° C över natten och räkna kolonier nästa dag.

8. CAUTI Modell protokollet Kateter Needle Förberedelse för CAUTI Modell (Figur S2)

  1. Ta bort locket av 30 G-nål. Skär en 7 mm bit PE10 slangen och 5 mm bit silikonslang som RenaSIL. Trä nålen med PE10 slangen tills slangen vidrör basen av nålen.
  2. Sedan mata 5 mm bit på PE10 innehållande nål. UV sterilisera nålar församlingar natten.
    OBS: När du laddar silikonslang, lämna ca 1 mm av slangen som sträcker sig förbi nålspetsen.

9. E. faecalis OG1RF Bakteriell Inokulat Framställning

  1. Förbered OG1RF inokulum börjar 48 timmar före ympning dag. Streak OG1RF på en BHI (Brain Heart Infusion) plattan från en frusen lager.
  2. Välj en koloni och ympa den i 10 ml BHI och växer det statiskt under 18 timmar vid 37 ° C. Centrifugera kultur och tvätta pelleten (3 gånger) i en ml volymer av steril 1 x PBS.
  3. Resuspendera den bakteriella pelleten i 1 x PBS. Mät bakteriell optisk densitet och justera koncentrationen till önskad inokulatets storlek. Standardkoncentrationen av inokulum som används är 10 7; dock kan detta variera på grund av utformningen av studien

10. Kateter Implantation

  1. Rengör arbetsstationen med 70% etanol och täcka området med ett absorberande omslag (eller använd steril flöde huva).
  2. Fäst kateter nålen till en tom 1 ml (TB) spruta. Skär en 1 tums fyrkant bit parafilm och sätta en klick kirurgisk smörjmedel (ungefär lika stor som en krona) ovanpå.
    OBS: Två olika nålar används för avsättning av katetern och för inokulatet till minimeras oavsiktlig ympning grund av den mekaniska manipulering nödvändig för kateter implantering. Detta möjliggör också för att underlätta att förbereda färre ympning nålar.
  3. Söva C57BL / 6 möss genom att placera dem i en 32 ounce glasburk innehållande en te-infuser boll med bomullstussar indränkt i 3 ml isofluran eller förångningskammare (efter tillverkar protokoll) tills medvetslös men fortfarande andas normalt (1 andetag / sek).
  4. Lägg sedan musen på rygg på en pappershandduk och sprida benen. Täck näsan av musen med en noskon eller 50 ml koniska rör med bomullstussar som innehåller en liten mängd (ca 1-2 ml) av isofluran.
    VARNING: Isofluran är ett inhalationsanestetikum. Används på väl ventilerad plats och minimera inandning av forskaren.
  5. Klappa försiktigt blåsan för att inducera urinering och säkerställa en annullerade blåsa. Torka periuretral område med en 100% etanol torka.
  6. Desinficera periuretrala området med 10% povidon-jod-lösning under användning av en bomullsspets applikator. Dab inokuleringen nål / spruta, punkt först, i den kirurgiska smörjmedel.
    OBS: Povidine-jod används för kateter implantering, som är en starkare aseptisk lösning än alkohol. Kateter implantering krävermer mekanisk manipulation för att föra in katetern och sålunda en större potential för kontaminering.
  7. Föra in katetern in i urinrörsöppningen. En gång, för att använda pincett skjuta (7 mm PE10) lång bit mot urinblåsan, därför att trycka på (5 mm silikon) liten kateter och sätta in den i urinblåsan. Ta bort kanylen, med 7 mm slang fortfarande fäst omedelbart.

11. Bakteriell Inokulering

  1. Följ bakterie ympning protokollet i avsnitt 3, med hjälp av det beredda ymppreparat från avsnitt 9. Ta bort musen från noskonen och återlämna den till sin bur

12. vid varje tidpunkt av Sacrifice

  1. Förbered 5 ml rör för urinblåsa och njurar (För organ följa steg 4,1) och 1,5 ml Eppendorf-rör för katetrar. Tillsätt 1 ml 1 x PBS i 1,5 ml Eppendorf-rör för kateter prover
  2. Följ steg 4,3-4,5. Dissekera mus, skörd av urinblåsa, njurar och kateter, placing vävnaderna oberoende in i 5 ml rör innehållande 1 x PBS och katetern in i 1,5 ml Eppendorf (se steg 12.1).
    OBS: Använd olika sax för externa dissekering och för organstölderna och kateter hämtning för att minimera kontaminering
  3. Följ sedan steg 4.6.

13. Bakteriell återhämtning

  1. För organ, följ steg 5.1 och 5.2. För bakteriell återhämtning från katetrar, virvel vid maximal hastighet under 30 sekunder, sonikera kateter prover för 5 min med hjälp av en badsonikator, och sedan virveln vid maximal hastighet under ytterligare 30 sekunder.
  2. Gör serie 1:10 späd ut till 10 -8 och plåt varje utspädning för CFU uppräkning på BHI-plattor. Inkubera plattorna vid 37 ° C över natten och räkna kolonier nästa dag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De intravesikala modeller av okomplicerad och kateter i samband UVI erbjuder flexibla plattformar för att belysa de molekylära mekanismerna av bakteriell patogenes, effekterna av dessa sjukdomar på värdvävnaden, samt utveckling och testning av nya metoder för att hantera dessa gemensamma och kostsamma infektioner. Beroende på musstam och patogen kan intravesikal ympning kan användas för att studera värd-patogen interaktioner att belysa faktorer som krävs för att initiera eller modulerande akut (Figur 1 och 3), kronisk eller återkommande (Figur 2) cystit. De data som visas i Figur 1 är representativa för akuta stadiet (24 hpi) urinvägarna kolonisering av den prototypiska UPEC cystit isolera UTI89 44. Efter ympning, är infektionerna fick utvecklas under 24 h vid vilken punkt avlivas mössen och urinblåsan och njurvävnad homogeniserades. De vävnadshomogenat är seriellt diluted och ströks för räkning av koloniserande bakterier. Kronisk UPEC kolonisering och inflammation i urinblåsan kan etableras och upprätthållas i vissa muslinjer (särskilt C3H / HeN) i en smittsam dos och urinvägspatogen beroende sätt. Kronisk cystit definieras som ihållande hög titer bakteriuri (> 10 4 CFU / ml), inflammation i urinblåsan och hög titer bakterie blåsa bördor (> 10 4 CFU / urinblåsan) hos offer 33. De data som visas i figur 2 är representativa CFU inträffar fyra veckor efter ympning av C3H / HeN möss med 2 x 10 7 CFU av UTI89. Under dessa experimentella betingelser, 20-50% av infekterade möss utvecklar kronisk cystit medan resterande 50-80% av möss lösa infektionen. Denna dubbelhet av utfall är beroende av en värdpatogen kontrollpunkt som beslutas inom de första 24 HPI. Aktivering (eller inte) av checkpoint resulterar i den observerade bimodal fördelning av bakteriella titrar, som börjar att manifestera iurinen vid 3 dpi (dagar efter infektion) och i urinblåsan vid offret 28 dpi (figur 2) 33. Möss med en historia av kronisk cystit är betydligt benägna att återkommande kronisk cystit vid utmaning efter den första infektionen rensas med antibiotikabehandling 33. På samma sätt är en historia av UTI en känd riskfaktor för återkommande UTI hos människa. Således är detta den enda kända modell som används för att studera patogenesen av återkommande UTI. När experimentellt modellering UTI i alternerande mus bakgrunder, är det viktigt att avgöra om den musstam är mottaglig för UTI, återkommande UTI eller CAUTI, med tanke på att vissa stammar är mer eller mindre motståndskraftiga mot att utveckla dessa syndrom 33.

En extra mätning av akut cystit är IBC uppräkning. IBC formation är begränsad till de terminalt differentierade ytliga paraplyceller. IBC kvantifiering är en informativ mått på bakteriell belastning under akut cystaitis och höga nivåer av IBC-behållare korrelerar med risken för att utveckla kronisk cystit 21. IBC formation förekommer endast i akuta sjukdomsstadier. Efter peeling av ytliga paraplyceller, IBC-behållare är inte längre följs. I C3H / HeN-UTI modell kan IBC-behållare mätas 6 timmar efter inokulering ~ 1 x 10 7 CFU UTI89 in i urinblåsan transurethrally. Blåsor utspärrade med metallstift på silikon-plattor och färgades för expression av LacZ. LacZ, β-galaktosidas, är en allmänt uttryckt bakteriellt enzym som klyver β bindningen mellan galaktos och andra sockerarter. Detta enzym kan användas för att detektera bakterier genom tillförsel av X-gal, en β-galaktosid-analog, vilken producerar en blå färg vid klyvning. Efter färgning, är blåsorna avbildas under ett dissektionsmikroskop med IBC-behållare visas som punctae blå / lila prickar på urotelium och IBC-behållare kan räknas upp genom att räkna de punkter (figur 3A). Medan antalet jagKand bildas per djur varierar i C3H / hen bakgrund i genomsnitt ~ 50 IBC ses per blåsan (Figur 3B). IBC-behållare ökning på ett dosberoende sätt. Antalet IBC-behållare som bildar varierar mellan UPEC och mus bakgrunds stammar. Till exempel i C57BL / 6, ett inokulum av ~ 1 x 10 7 UTI89 resulterar i bildning av flera hundra IBC-behållare per blåsan.

Bortom okomplicerad samhällsförvärvad UVI modelleras ovan, hed-vård i samband UVI utgör en betydande börda för hälso- och sjukvården. UVI representerar cirka 40% av alla vårdrelaterade infektioner och upp till 95% av all hälso- och sjukvård i samband UVI är kateter i samband 45. Här visar vi en blåsa implantat musmodell av CAUTI som representerar ett kraftfullt system för experimentell analys av denna svåra kliniskt problem. De data som presenteras i Figur 4 är representativa för 24 tim infektioner med modellen E. faecalis s utbilda OG1RF. När 1 x 10 7 CFU OG1RF är intravesikalt ympas in i en unimplanted blåsa börjar infektionen till klart med 24 HPI (Figur 4A) och 3 dpi infektionen har löst 41. Omvänt, ympning av OG1RF i en implanterad blåsresulterar i koloniseringen av både katetern och urinblåsan, med 10 gånger högre blås kolonisering nivåer på 24 hpi än de som observerades i unimplanted blåsor (Figur 4A och 4B). Dessutom är denna infektion hölls vid> 10 6 CFU i urinblåsan tills kateter förlust cirka 7 dpi 41. Alla de beskrivna experimentella modeller är mottagliga för en hög grad av experimentell flexibilitet, inklusive men inte uteslutande till olika metoder för den makroskopiska och mikroskopiska avbildning av de infekterade vävnader och ytor, förändrade inokulatnivåer storlekar och sjukdomstider, konkurrenskraftiga infektioner, och värdimmunologiska analyser .

ve_content "> Figur 1
Figur 1:. 24 tim urinvägarna kolonisering Kvinna, 7-8 veckor gamla C3H / HeN-möss transurethrally ympades med ~ 2 x 10 7 CFU av den proto UPEC cystit isolera UTI89 under 24 h. Representativa CFU återhämtat sig från de skördade urinblåsan och njurvävnad visas, n = 5. Streckad linje markerar den nedre detektionsgränsen (20 CFU).

Figur 2
Figur 2:. 28 dagars urinvägarna kolonisering Kvinna, 7-8 veckor gamla C3H / HeN möss transurethrally ympades med ~ 2 x 10 7 CFU UTI89. Urin var samla på angivna dagar efter infektion (dpi) och ströks för CFU uppräkning. Representativa 28 dag i urinblåsa eller njurar titrar visas också, n = 8. Urin CFU lägre detektionsgränsen (1000 CFU / ml) betecknas med den streckade linjen. Prickade linjer reprets vävnaden lägre detektionsgränsen, 20 CFU / vävnad.

Figur 3
Figur 3:. IBC uppräkning Kvinna, 7-8 veckor gamla C3H / HeN möss transurethrally ympades med ~ 1 x 10 7 CFU UTI89. Blåsor skördades 6 HPI och utspärrade för IBC färgning. (A) Bild av utspärrade urinblåsan efter LacZ färgning. IBC-behållare representeras som blå prickar. Den infällda bilden är en digital förstoring av den del av bilden i den svarta lådan. (B) Representativa antal IBC-behållare som bildats i C3H / HeN möss 6 hpi, n = 10.

Figur 4
Figur 4: E. faecalis kateterassocierade UVI. C57BL / 6-möss inokulerades med eller utan katetrar med ~ 1 x 10 7 CFU av (A) E. faecalis blåsa kolonisering i närvaro eller frånvaro av kateter. (B) E. faecalis kateter kolonisering. Mann-Whitney U-testet användes för mus experiment p <0,05 anses statistiskt signifikant. **, P <0,005.

Figur S1
Figur S1:. UTI ympning nål förberedelse Diagram visar ympning nål förberedelse steg inklusive material som behövs (1), gängning av katetern på nålen (2) och trimning slangen före ympning (3).

Figur S2
Figur S2. CAUTI ympning nål förberedelse Diagram visar ympning nål förberedelse material som behövs (1), trädning av ympning kateter (2) och implantation kateter påtill nålen (3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Okomplicerad samhällsförvärvad UTI är en vanlig och kostsam infektion står för flera miljoner primärvårdsbesök varje år 46. Dessutom Cautis är en vanlig vård förvärvad infektion som har blivit mycket kostsamt att vårdgivare som centran för Medicare och Medicaid Services inte längre ersätter leverantörer för den extra kostnaden för behandling till följd av vårdrelaterade CAUTI 45. De musmodeller av UTI, både okomplicerad cystit och CAUTI, som beskrivs i dessa protokoll ger ovärderliga verktyg för att förstå den molekylära grunden för värd- och patogen interaktioner som behövs för att initiera, underhålla och modulera resultatet av flera former av UVI. Dessa modeller gör det möjligt att tillämpa kraftfulla bakterie- och mus genetik, immunologiska, mikroskopiska, biokemiska och kemiska genetiska verktyg för analys av UTI 23,47-49. Dessutom protokollen som beskrivs här har gett en plattformför utveckling och testning av nya terapeutiska och förebyggande strategier inklusive småmolekylinhibitorer av bakteriell virulens och nya vaccinations mål och strategier 50-55.

Det finns flera viktiga villkor som måste upprätthållas för en framgångsrik tillämpning av okomplicerad cystit modellen. Som med alla mus anesthetization förfaranden, måste man vara försiktig för att förebygga dödlighet musen på grund av över bedövning. Vid utarbetandet av ympning katetern måste silikonslangar vara tillräckligt lång för att täcka nålspetsen men inte så länge att skada väggen i urinblåsan på kateterisering. Dessutom, på grund av närheten och storleken av slidöppningen, försiktighet måste vidtas för att infoga inokulering katetern in i urinröret och inte slidan. Under blås splaying för IBC uppräkning, är det viktigt att blåsorna att utspärrade så snabbt som möjligt efter dissekering och vävnaden fastställas för förekommandeximately 1 h, men inte över en natt. För IBC uppräkning av LacZ färgning, är det också nödvändigt att bakterien i fråga producerar LacZ under uroteliala cell kolonisering. När du använder stammar där LacZ enzymet inte produceras, är det fortfarande möjligt att räkna IBC använder immunofluorescensmikroskopi med anti E. coli-antikroppar eller GFP-uttryckande bakterier. En speciell egenskap hos denna modell är de olika mönster av sjukdomsprogression och svårighetsgrad presenteras av olika inavlade muslinjer och varierande sjukdomsframkallande potential proto UPEC stammar 33,56. Dessa skillnader är både en styrka och begränsning av denna teknik eftersom de sammanfatta den naturliga variationen av värd känslighet och patogen mångfald som har observerats i kliniska och fenotypiska studier samtidigt som komplicerar experimentell design och tolkning 57,58. Dessa variationer ger källor jämförelse möjliggör klarlägga värd och bakteriell mechanismer modulera patogenesen för okomplicerad UVI 33,56. Men de också innebära att, på grund av varierande grad av mus linje UTI känslighet, måste största möjliga försiktighet iakttas i valet av rätt mus linjen och UPEC stam för att ta itu med den speciella frågan en utredare frågar. Till exempel, C57BL / 6-möss är en utmärkt modell för akut infektion, uppvisar höga bakteriella titrar och stora antal av IBC-behållare vid tidiga tidpunkter. Denna stam sedan snabbt löser infektionen mellan 3 och 7 dpi med den enda ihållande koloniseringen till följd av allvarliga njurinfektioner och vilande intracellulära reservoarer 33,34. C57BL / 6-modellen kan noggrant representera den vanligaste utfallet för många UTI patienter där symtomen och sedan lösa. Omvänt uppvisar C3H / HeN mus bakgrund en hög grad av känslighet för kronisk cystit vilket gör dem till en idealisk stam för att studera återkommande urinvägsinfektioner. Andra UTI modeller har också etableratsi CBA, DBA och C3H / HeJ möss bakgrund visat sig användbara för att studera särskilda aspekter av UTI 33,59. Den primära experimentella nackdel som uppvisas av okomplicerad cystit modellen är förekomsten av flera infektionsflaskhalsar som begränsar tillämpningen av storskaliga genetisk screening metoder för upptäckten av nya bakteriella faktorer som krävs för akut, kronisk och återkommande cystit 60.

De kritiska faktorer för okomplicerad cystit modellen alla gäller implantatet baserat CAUTI modell med ytterligare två problem. Först måste försiktighet iakttas för att säkerställa att insättning av implantatet sker på ett sterilt sätt, på grund av den ökade känsligheten för infektion i urinblåsan som följer av implantatet. För det andra är det viktigt att katetern hållas på plats under avlägsnande av den implanterande nålen. De huvudsakliga begränsningarna hos CAUTI modellen är att den har en minskad rad tillgängliga värd genetiska bakgrunder, propensity för kateterförlust med tiden och oförmåga att samla urin på grund av blåsdysfunktion till följd av implantation. För att kompensera för implantatförlust och oförmåga att övervaka infektionen via längdurinanalys, denna modell kräver generellt högre antal kateter möss för senare tidpunkter och grupper av möss måste offras vid varje önskad tidpunkt. De begränsade värd genetiska bakgrunder resultat från oöverkomliga frekvens där vissa musstammar, såsom C3H / höna, förlorar implantatet (P. Guiton, personlig kommunikation 2010). Som ett resultat har de CAUTI protokoll som beskrivs ovan endast optimerats i C57BL / 6 musstam. Även begränsningen av tillgängliga musstammar för CAUTI är olyckligt, många iska variationer har etablerats i C57BL / 6 bakgrund och CAUTI modellen expanderar den bakteriologiska mångfald som finns för studier under UTI genom att förändra blåsan miljön för att underlätta kolonisering av organismer som ärannars icke-patogen i musmodellen av UTI. Ett exempel på detta är den senaste upptäckten av den roll som Fg frigörs vid kateter inflammation i urinblåsan i E. faecalis tillväxt, biofilmbildning och uthållighet under CAUTI 42. Detta exempel illustrerar effekten hos implantatmodell av CAUTI att belysa inte endast bakteriell molekylära mekanismer för patogenes, utan även betydelsen av värdfaktorer under infektionen. Alla dessa funktioner bidrar till att förstå detta relevant klinisk infektion, som tidigare har understudied.

Förutom de experimentella metoder som beskrivs ovan, de musmodeller av okomplicerad cystit och CAUTI är mottagliga för ett stort antal metodologiska förändringar. I fallet med den okomplicerad cystit modellen kan dessa modifieringar inkluderar reduktion av inokulering volymen och den kraft som anbringas under instillation av inokulum för att minska antalet bakterierinförs i njurarna 61, att variera varaktigheten av infektionen, offra vid tidpunkter så tidigt som 1 HPI och användning av gentamicin analyser skydd för att bedöma i vilken grad den urinvägspatogen har invaderat blåsan epitelceller 62. De utspärrade blåsor från möss avlivades mellan 6 och 24 hpi kan även snittades och färgades med antikroppar mot olika värden och / eller bakterie epitoper och observerades under fluorescerande eller konfokalmikroskopi att observera IBC struktur, bakteriellt flussmedel och filamente och värdvävnadstillståndet 25,33 , 63,64. Effekten av urinvägspatogen infektion och / eller implantation på lokala och systemiska immunsvar hos värden kan bedömas med hjälp av BioPlex cytometrisk pärla system eller ELISA-baserade analyser för att bestämma cytokinnivåer i urin eller serum respektive 33,65. Slutligen tillståndet hos blåsvävnad, plats och morfologi av koloniserande bakterier och strukturen hos biofilmen avsatt påkatetern kan bedömas av olika avbildningstekniker, inklusive elektronmikroskopi 25,41.

Dessa grundläggande modeller av infektion kan också anpassas för att efterlikna andra kliniskt relevanta fenomen inklusive återkommande UTI och utvecklingen av ett adaptivt immunsvar via flera infektioner. I detta sammanhang upprepade infektioner av C57BL / 6 möss resulterar i ökat motstånd mot akut cystit medan i C3H / HeN modell, den tidigare utvecklingen av kronisk cystit följt av godkännande av infektionen via administrering av antimikrobiella sensibiliserar dessa möss för att utveckla kronisk cystit på efterföljande ympningar 66. Dessutom de molekylära mekanismerna för riskfaktorer för utveckling av UTI kan undersökas. Diabetes och fetma har båda visat sig öka frekvensen och svårighetsgraden av urinvägsinfektioner. Typ 2-diabetes kan genetiskt modelleras i möss i FVB / NJ bakgrund och en kemiskt inducerad modell av typ 1-diabetes har already visats öka svårighetsgraden av urinvägsinfektioner orsakade av både UPEC och K. pneumophila 67,68.

Slutligen, dessa modellsystem utgör en grund idealisk bevisa för utveckling och optimering av terapeutiska metoder som syftar till att behandla eller förebygga urinvägsinfektioner och Cautis. Den molekylära förståelse av värd patogen interaktioner som dessa modeller har redan underlättat utvecklingen av effektiva vaccinationsstrategier som syftar till att rikta viktigt virulensfaktorer 51-55. Dessutom har små molekylhämmare av UPEC vidhäftning visats vara effektiva vid behandling av okomplicerad akut och kronisk UVI samt Cautis orsakad av UPEC 12,69,70. Både okomplicerad UVI och CAUTI modeller som beskrivs i dessa protokoll ger de experimentella verktyg för att dissekera de molekylära detaljerna i värd-patogen interaktioner i urinvägarna. Dessa verktyg kan tas tillvara på många sätt att utöka vår understanding av denna komplexa uppsättning villkor och underlätta utvecklingen av mer effektiva terapeutiska ingrepp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Finansieringen av detta arbete lämnades av ORWH SCOR P50 DK064540, RO1 DK 051.406, RO1 AI 108.749-01, F32 DK 101.171, och F32 DK 104.516-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material for catheter and needle preparation:
30 G needles BD Precision Glide 305106 30 G x ½ (0.3 mm x 13 mm)
PE10 polyethylene tubing BD 427400 Inside diameter -0.011 in (0.28 mm); outside diameter – 0.024 in (0.61 mm)
RenaSIL 025 platinum cured silicon tubing Braintree Scientific, Inc SIL 025 inside diameter-0.012 x outside diameter 0.025, 25 ft coil
Material for infections:
Isoflourane – Isothesia Butler Schein 29405 250 ml
Clear Glass Straight-Sided Jar Kimble Chase 5413289V 21
Stainless Steel Tea Infuser Schefs-Amazon Premium Loose Leaf Tea Infuser By Schefs - Stainless Steel - Large Capacity -
Non-sterile cotton balls Fisherbrand 22-456-880
50 ml Falcon tubes VWR 89039-660
Isotec 3 -vaporizer Ohmeda 1224478
Ear punch Fisher Scientific 13-812-201 (when necessary)
Betadine solution Betadine solution 10% Povidie-iodine topical solution
Q-tips Fisher Scientific 22-037-924 6 inches
Diapers for bench Fisherbrand 14206 63 Absorbent Underpads (20”X36”mats)
Surgical lubricant Surgilube 0281-0205-36
Dissecting scissor Fine Science tools, INC 14084-08
Micro-Adson Forceps Fine Science tools, INC 11018-12
1 ml syringe BD 309659 Tuberculin slip tip
Parafilm Bemis PM996 4 inches x 125 FT
Eppendorf rack Fisherbrand 05-541-1
Eppendorf tubes MIDSCI AVX-T-17-C
Harvesting catheters, bladders and kidneys:
Homogenizer PRO Scientific INC Bio-Gen Pro 200
5 ml polypropylene round-bottom tube BD 352063 for organ homogenization
Paper towel Georgia-Pacific
Ethanol Pharmco-AAPER 11100020S 200 proof
Costar™ Clear Polystyrene 96-Well Plates Corning 3788
1x Phosphate sodium saline Sigma-Aldrich P3813
BRANSONIC Ultrasonic cleaner 1210 Branson Ultrasonics Corporation 1210
IBC materials:
6-well tissue culture test plate Techno Plastic Products 92006
Pins Fine Science Tools 26002-20
Sylgard 184 Dow Corning 3097358-1004 Silicone Elastomer Kit
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside) Invitrogen 15520-034 Ultrapure
N, N-Dimethylformamide Sigma Aldrich D4551
MgCl2 (Magnesium chloride) Sigma Aldrich M8266
Sodium deoxycholate Sigma Aldrich D6750
Nonidet-P40 Roche 11754599001 Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate (K-ferrOcyanide) Sigma Aldrich P3289
Potassium hexacyanoferrate(III) (K-ferrIcyanide) Sigma Aldrich 60299

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. Dis Mon. 49, 53-70 (2003).
  2. Foxman, B., et al. Risk factors for second urinary tract infection among college women. American journal of epidemiology. 151, 1194-1205 (2000).
  3. Gupta, K., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Increasing antimicrobial resistance and the management of uncomplicated community-acquired urinary tract infections. Annals of internal medicine. 135, 41-50 (2001).
  4. Gupta, K., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Isolation of fluoroquinolone-resistant rectal Escherichia coli. after treatment of acute uncomplicated cystitis. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 56, 243-246 (2005).
  5. Gupta, K., Sahm, D. F., Mayfield, D., Stamm, W. E. Antimicrobial resistance among uropathogens that cause community-acquired urinary tract infections in women: a nationwide analysis. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 89-94 (2001).
  6. Gupta, K., Scholes, D., Stamm, W. E. Increasing prevalence of antimicrobial resistance among uropathogens causing acute uncomplicated cystitis in women. Jama. 281, 736-738 (1999).
  7. Jarvis, W. R. Selected aspects of the socioeconomic impact of nosocomial infections: morbidity, mortality, cost, and prevention. Infect Control Hosp Epidemiol. 17, 552-557 (1996).
  8. Lo, E., et al. Strategies to prevent catheter-associated urinary tract infections in acute care hospitals: 2014 update. Infection control and hospital epidemiology : the official journal of the Society of Hospital Epidemiologists of America. 35, 464-479 (2014).
  9. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature reviews Urology. 7, 653-660 (2010).
  10. Hooton, T. M., Stamm, W. E. Diagnosis and treatment of uncomplicated urinary tract infection. Infect Dis Clin North Am. 11, 551-581 (1997).
  11. Hannan, T. J., et al. LeuX tRNA-dependent and -independent mechanisms of Escherichia coli. pathogenesis in acute cystitis. Molecular microbiology. 67, 116-128 (2008).
  12. Cusumano, C. K., Hung, C. S., Chen, S. L., Hultgren, S. J. Virulence plasmid harbored by uropathogenic Escherichia coli. functions in acute stages of pathogenesis. Infection and immunity. 78, 1457-1467 (2010).
  13. Dhakal, B. K., Mulvey, M. A. The UPEC pore-forming toxin alpha-hemolysin triggers proteolysis of host proteins to disrupt cell adhesion, inflammatory, and survival pathways. Cell host & microbe. 11, 58-69 (2012).
  14. Garcia, E. C., Brumbaugh, A. R., Mobley, H. L. Redundancy and specificity of Escherichia coli. iron acquisition systems during urinary tract infection. Infection and immunity. 79, 1225-1235 (2011).
  15. Bergsten, G., Wullt, B., Svanborg, C. Escherichia coli., fimbriae, bacterial persistence and host response induction in the human urinary tract. International journal of medical microbiology : IJMM. 295, 487-502 (2005).
  16. Zhou, G., et al. Uroplakin Ia is the urothelial receptor for uropathogenic Escherichia coli.: evidence from in vitro FimH binding. J Cell Sci. 114, 4095-4103 (2001).
  17. Eto, D. S., Jones, T. A., Sundsbak, J. L., Mulvey, M. A. Integrin-mediated host cell invasion by type 1-piliated uropathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 3, e100 (2007).
  18. Taganna, J., de Boer, A. R., Wuhrer, M., Bouckaert, J. Glycosylation changes as important factors for the susceptibility to urinary tract infection. Biochemical Society transactions. 39, 349-354 (2011).
  19. Mulvey, M. A., et al. Induction and evasion of host defenses by type 1-piliated uropathogenic Escherichia coli. Science. 282, 1494-1497 (1998).
  20. Mysorekar, I. U., Mulvey, M. A., Hultgren, S. J., Gordon, J. I. Molecular regulation of urothelial renewal and host defenses during infection with uropathogenic Escherichia coli. The Journal of biological chemistry. 277, 7412-7419 (2002).
  21. Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population Dynamics and Niche Distribution of Uropathogenic Escherichia coli. during Acute and Chronic Urinary Tract Infection. Infect. Immun. 79, 4250-4259 (2011).
  22. Garofalo, C. K., et al. Escherichia coli. from urine of female patients with urinary tract infections is competent for intracellular bacterial community formation. Infection and immunity. 75, 52-60 (2007).
  23. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli. in urinary tract pathogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 1333-1338 (2004).
  24. Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae. urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infection and immunity. 76, 3337-3345 (2008).
  25. Anderson, G. G., et al. Intracellular bacterial biofilm-like pods in urinary tract infections. Science. 301, 105-107 (2003).
  26. Robino, L., et al. Detection of intracellular bacterial communities in a child with Escherichia coli. recurrent urinary tract infections. Pathogens and disease. 68, 78-81 (2013).
  27. Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4, e329 (2007).
  28. Horsley, H., et al. Enterococcus faecalis subverts and invades the host urothelium in patients with chronic urinary tract infection. PloS one. 8, e83637 (2013).
  29. Hopkins, W. J., Uehling, D. T., Wargowski, D. S. Evaluation of a familial predisposition to recurrent urinary tract infections in women. American Journal of Medical Genetics. 83, 422-424 (1999).
  30. Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli. urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infection and immunity. 66, 2798-2802 (1998).
  31. Mabeck, C. E. Treatment of uncomplicated urinary tract infection in non-pregnant women. Postgraduate medical journal. 48, 69-75 (1972).
  32. Ferry, S., Holm, S., Stenlund, H., Lundholm, R., Monsen, T. The natural course of uncomplicated lower urinary tract infection in women illustrated by a randomized placebo controlled study. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 36, 296-301 (2004).
  33. Hannan, T. J., Mysorekar, I. U., Hung, C. S., Isaacson-Schmid, M. L., Hultgren, S. J. Early severe inflammatory responses to uropathogenic E. coli. predispose to chronic and recurrent urinary tract infection. PLoS Pathog. 6, (2010).
  34. Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli. persistence and eradication from the urinary tract. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 14170-14175 (2006).
  35. Glahn, B. E., Braendstrup, O., Olesen, H. P. Influence of drainage conditions on mucosal bladder damage by indwelling catheters. II. Histological study. Scandinavian journal of urology and nephrology. 22, 93-99 (1988).
  36. Goble, N. M., Clarke, T., Hammonds, J. C. Histological changes in the urinary bladder secondary to urethral catheterisation. British journal of urology. 63, 354-357 (1989).
  37. Ronald, A. The etiology of urinary tract infection: traditional and emerging pathogens. Dis Mon. 49, 71-82 (2003).
  38. Arias, C. A., Murray, B. E. The rise of the Enterococcus.: beyond vancomycin resistance. Nature reviews. Microbiology. 10, 266-278 (2012).
  39. Garibaldi, R. A., Burke, J. P., Dickman, M. L., Smith, C. B. Factors predisposing to bacteriuria during indwelling urethral catheterization. The New England journal of medicine. 291, 215-219 (1974).
  40. Warren, J. W. Catheter-associated urinary tract infections. Infect Dis Clin North Am. 11, 609-622 (1997).
  41. Guiton, P. S., Hung, C. S., Hancock, L., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. Enterococcal biofilm formation and virulence in an optimized murine model of foreign body-associated urinary tract infections. Infection and immunity. 78, 4166-4175 (2010).
  42. Flores-Mireles, A. L., Pinkner, J. S., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. EbpA vaccine antibodies block binding of Enterococcus faecalis. to fibrinogen to prevent catheter-associated bladder infection in mice. Science translational medicine. 6, 254ra127 (2014).
  43. Martinez, J. J., Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Pinkner, J. S., Hultgren, S. J. Type 1 pilus-mediated bacterial invasion of bladder epithelial cells. The EMBO Journal. 19, 2803-2812 (2000).
  44. Hultgren, S. J., Schwan, W. R., Schaeffer, A. J., Duncan, J. L. Regulation of production of type 1 pili among urinary tract isolates of Escherichia coli. Infection and immunity. 54, 613-620 (1986).
  45. Chenoweth, C. E., Gould, C. V., Saint, S. Diagnosis, Management, and Prevention of Catheter-Associated Urinary Tract Infections. Infect. Dis. Clin. North Am. 28, 105-+ (2014).
  46. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7, 653-660 (2002).
  47. Justice, S. S., Hunstad, D. A., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Filamentation by Escherichia coli. subverts innate defenses during urinary tract infection. Proc Natl Acad Sci USA. 103, (1988).
  48. Song, J., et al. TLR4-mediated expulsion of bacteria from infected bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14966-14971 (2009).
  49. Wang, H., Min, G., Glockshuber, R., Sun, T., Kong, X. P. Uropathogenic E. coli. adhesin-induced host cell receptor conformational changes: implications in transmembrane signaling transduction. Journal of molecular biology. 392, 352-361 (2009).
  50. Cusumano, C. K., et al. Treatment and prevention of urinary tract infection with orally active FimH inhibitors. Science translational medicine. 3, 109-115 (2011).
  51. Langermann, S., Ballou, W. R. Vaccination utilizing the FimCH complex as a strategy to prevent Escherichia coli. urinary tract infections. J Infect Dis. 183, S84-S86 (2001).
  52. Langermann, S., et al. Vaccination with FimH adhesin protects cynomolgus monkeys from colonization and infection by uropathogenic Escherichia coli. J Infect Dis. 181, 774-778 (2000).
  53. Langermann, S., et al. Prevention of mucosal Escherichia coli. infection by FimH-adhesin-based systemic vaccination. Science. 276, 607-611 (1997).
  54. Alteri, C. J., Hagan, E. C., Sivick, K. E., Smith, S. N., Mobley, H. L. T. Mucosal Immunization with Iron Receptor Antigens Protects against Urinary Tract Infection. Plos Pathogens. 5, (2009).
  55. Russo, T. A., et al. The siderophore receptor IroN of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. is a potential vaccine candidate. Infect. Immun. 71, 7164-7169 (2003).
  56. Schwartz, D. J., et al. Positively selected FimH residues enhance virulence during urinary tract infection by altering FimH conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15530-15537 (2013).
  57. Czaja, C. A., et al. Prospective cohort study of microbial and inflammatory events immediately preceding Escherichia coli. recurrent urinary tract infection in women. J Infect Dis. 200, 528-536 (2009).
  58. Chen, S. L., et al. Genomic Diversity and Fitness of E. coli. Strains Recovered from the Intestinal and Urinary Tracts of Women with Recurrent Urinary Tract Infection. Science Translational Medicine. 5, 2013 (2013).
  59. Schilling, J. D., Mulvey, M. A., Vincent, C. D., Lorenz, R. G., Hultgren, S. J. Bacterial invasion augments epithelial cytokine responses to Escherichia coli. through a lipopolysaccharide-dependent mechanism. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 166, 1148-1155 (2001).
  60. Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population Dynamics and Niche Distribution of Uropathogenic Escherichia coli. during Acute and Chronic Urinary Tract Infection. Infect. Immun. 79, 4250-4259 (2011).
  61. Chan, C. Y., St John,, L, A., Abraham, S. N. Mast Cell Interleukin-10 Drives Localized Tolerance in Chronic Bladder Infection. Immunity. 38, 349-359 (2013).
  62. Justice, S. S., Lauer, S. R., Hultgren, S. J., Hunstad, D. A. Maturation of intracellular Escherichia coli. communities requires SurA. Infect. Immun. 74, 4793-4800 (2006).
  63. Justice, S. S., Hunstad, D. A., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Filamentation by Escherichia coli. subverts innate defenses during urinary tract infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19884-19889 (2006).
  64. Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli. in urinary tract pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 1333-1338 (2004).
  65. Guiton, P. S., Hannan, T. J., Ford, B., Caparon, M. G., Hultgren, S. J. Enterococcus faecalis. Overcomes Foreign Body-Mediated Inflammation To Establish Urinary Tract Infections. Infect. Immun. 81, 329-339 (2013).
  66. Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder. Journal of Immunology. 176, 3080-3086 (2006).
  67. Rosen, D. A., Hung, C. -S., Kline, K. A., Hultgren, S. J. Streptozocin-induced diabetic mouse model of urinary tract infection. Infect. Immun. 76, 4290-4298 (2008).
  68. Daneshgari, F., Leiter, E. H., Liu, G., Reeder, J. Animal Models of Diabetic Uropathy. Journal of Urology. 182, S8-S13 (2009).
  69. Guiton, P. S., et al. Combinatorial Small-Molecule Therapy Prevents Uropathogenic Escherichia coli. Catheter-Associated Urinary Tract Infections in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56, 4738-4745 (2012).
  70. Totsika, M., et al. A FimH Inhibitor Prevents Acute Bladder Infection and Treats Chronic Cystitis Caused by Multidrug-Resistant Uropathogenic Escherichia coli. ST131. Journal of Infectious Diseases. 208, 921-928 (2013).

Tags

Medicin , UPEC, Uropatogen kateter urinvägsinfektion IBC kronisk cystit

Erratum

Formal Correction: Erratum: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model
Posted by JoVE Editors on 08/18/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. The Protocol section has been updated.

The ethics statement has been updated from:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20120216, which was approved 01/11/2013 and expires 01/11/2016. Overall care of the animals was consistent with The guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

to:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20150226, which expires 12/10/2018. Overall care of the animals was consistent with The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

Step 3 has been updated from:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a 32 ounce glass jar containing a tea-infuser ball with cotton balls soaked with 3 ml of isoflurane or vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a jar or vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    NOTE: If glass jar with tea-ball and/or nose cone with isoflurane-soakd cotton balls are used, the animal must be carefully observed to avoid anesthetic overdose and death. The advantage of using a vaporizer and anesthesia chamber is that it provides controlled isoflurane administration that avoids accidental overdoses. CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the jar/vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) or 50 ml conical tube with a cotton ball containing a small amount (approximately 1-2 ml) of isoflurane.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.

to:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) to maintain anesthetization.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.
Upprättande och karakterisering av UTI och CAUTI i en musmodell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Conover, M. S., Flores-Mireles, A.… More

Conover, M. S., Flores-Mireles, A. L., Hibbing, M. E., Dodson, K., Hultgren, S. J. Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. J. Vis. Exp. (100), e52892, doi:10.3791/52892 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter