Introduction
كثيرا ما يستخدم نموذج زرع القلب للتحقيق I / R-الإصابة، رفض المزروع، في مرحلة ما بعد الزرع اعتلال وعائي وكفاءة وكلاء الجهاز المناعي. نماذج الماوس تجمع بين العديد من المزايا مثل المناعية المعروفة وخلفيات وراثية، وتوافر العديد من السلالات الفطرية والمعدلة وراثيا وتكاليف التجريبية منخفضة نسبيا.
في عام 1973، وقد وصفت تقنية زرع القلب في البطن في الفئران أول من كوري وآخرون 1. في هذا النموذج يتم revascularized الطعوم بنهاية إلى جنب anastomoses من الأبهر الصاعد إلى الشريان الأورطي البطني المستلم والشريان الرئوي الرئيسي إلى الوريد الأجوف السفلي. في عام 1991، وقد وصفت تقنية خياطة لزرع القلب عنق الرحم في الفئران عن طريق تشن وآخرون (2). في هذا النموذج يتم تأسيس الوراء الشريان التاجي نضح من قبل مفاغرة من الشريان السباتي المستلم إلى الأبهر الصاعد للغرامالخلف. يتم إخراج مصارف الدم الوريدي عبر الجيب التاجي في الأذين الأيمن، والبطين الأيمن والشريان الرئوي عبر إلى المستلم الوريد الوداجي الخارجي (الشكل 1). بالمقارنة مع الكسب غير المشروع غرس البطن نموذج عنق الرحم أقل الغازية وموقع سطحي من الكسب غير المشروع تمكن الوصول السهل جدا للامتحانات المتابعة إضافية (مثل الجس، القلب، حيوي داخلي المجهري مضان) 3،4.
على الرغم من التحسينات الفنية 5،6، واستخدام أوسع لهذا النموذج كان محدودا بسبب الصعوبات التقنية لأداء anastomoses خياطة الأوعية الصغيرة مع وجود نسبة عالية من التسرب مفاغرة وتجلط الدم. في عام 1991، ماتسورا وآخرون. أدخلت هذه التقنية الكفة التي يتم فيها مقلوبة جدار الوعاء الدموي على اسطوانة الاصطناعية، مما يسهل كثيرا من نموذج زرع القلب عنق الرحم 7. وكانت هذه التقنية فواعتمد rther لمختلف النماذج التجريبية من بينها زرع الكلى 8، 9 البنكرياس، أطرافهم 10، 11،12 الكبد والرئة والأوعية الدموية 13،14 زرع 15. وبالمقارنة مع تقنية خياطة الوقت اللازم لanastomoses، وبالتالي، فإن الوقت نقص التروية الدافئ هو أقصر، وهناك مضاعفات أقل بكثير الأوعية الدموية باستخدام تقنية صفعة 16. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن الجراحين مع قليل من التدريب في جراحة لتنفيذ العملية مع نسبة نجاح عالية. عيوب تقنية صفعة هو ربط المتطلبات المسبقة من الشريان السباتي المشترك، الأمر الذي قد يغير التروية الدماغية.
في هذه الورقة الفيديو نقدم محسنة ومبسطة تقنية صفعة لعملية زرع قلب عنق الرحم في الفئران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتمت الموافقة على جميع التجارب من قبل مركز القلب الألماني ميونيخ وحكومة بافاريا، ألمانيا (جي زد. 55.2-1-54-2532.3-17-13). وتم إيواء الحيوانات في منشأة معينة الممرض الحر وتلقى رعاية الإنسان في الامتثال مع "مبادئ مختبر رعاية الحيوان" التي وضعتها الجمعية الوطنية للطب والبحوث "دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية" التي تقدمها الأكاديمية الوطنية العلوم ونشرها من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH النشر رقم 86-23، نقح 1985).
ملاحظة: وهناك مجموعة كاملة من أدوات المجهرية العقيمة، من بينهم اثنان من ملقط المنحنية وdilatators السفينة، ضرورية لإجراء العملية (الشكل 2A). العلاج الوقائي بالمضادات الحيوية المحيطة بالجراحة ليست ضرورية بشكل روتيني ولكن يجوز أن يبين في الحيوانات المناعة. تمت التضحية الحيوانات باستخدام استنشاق الأيزوفلورين المحطة.
إعداد المانحة والكسب غير المشروع الحصاد
<رأ>2. إعداد مستلم
- إعدادالأصفاد لanastomoses عن طريق قطع أنابيب بوليميد مع مشرط رقم 11 أو مقص تحت المجهر. تتكون الكفة من جسم اسطواني وملحق (1/3 من محيط) لوضع المشبك الأوعية الدموية، ولكل من يبلغ طوله 1 مم (الشكل 2B).
- تخدير الحيوان وتأكيد التسامح الجراحية كما هو موضح أعلاه. حقن 0.25 مل المالحة الدافئة الحل تحت الجلد (SC) لاستبدال السوائل.
- إزالة الشعر من منطقة عنق الرحم الصحيحة باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية، ووضع الحيوان في موقف ضعيف على وسادة دافئة. تأمين الساقين مع خيوط الشريط مع تجنب الإفراط في أطرافه الأمامية وهذا يمكن أن تضر التنفس. تغطية العيون باستخدام مرهم للعين لمنع جفاف. تطهير موقع الجراحية ثلاث مرات مع الكلورهيكسيدين.
- جعل شق الجلد عرضية من زاوية الفك السفلي الأيمن إلى الشق الوداجي.
- تعبئة بصراحة تحويلةحبل الوريد ernal. يكوي فروع جنب مع ملقط القطبين والمسح الشامل لهم.
- تقسيم الوريد الوداجي الخارجي بين الحروف المركبة على مستوى التقاء مع الوريد من الغدة تحت الفك السفلي.
- سحب الوريد الوداجي الخارجي من خلال الكفة وتسد الأوعية قريب عن طريق وضع المشبك الأوعية الدموية على تمديد الكفة. إزالة ضمد وري التجويف السفينة مع 1:10 المالحة heparinized.
- إيفرت جدار الوعاء الدموي على الكفة واصلاحها مع مسبقا كفافي 8-0 الحرير ربطة.
- إزالة الجزء السطحي للعضلة القصية الترقوية الخشائية.
- تعبئة الأيمن الشريان السباتي المشترك والمسح الشامل السفينة بين الحروف المركبة دون التشعب الشريان السباتي.
- سحب الشريان السباتي عن طريق الكفة وتسد الأوعية قريب عن طريق وضع المشبك Yasargil بشأن تمديد الكفة. إزالة ضمد وري التجويف السفينة مع 1:10 المالحة heparinized.
- dilat بلطفالبريد التجويف الشرياني مع dilatator السفينة، إيفرت جدار الوعاء الدموي على الكفة واصلاحها مع مسبقا كفافي 8-0 الحرير ربطة.
- للحصول على مساحة كافية لزرع الكسب غير المشروع، وإزالة الفص الأيمن من الغدة تحت الفك السفلي.
- الحفاظ على المجال العملي رطبة حتى الزرع.
3. زرع الكسب غير المشروع
- وضع الكسب غير المشروع في منطقة عنق الرحم المتلقي رأسا على عقب مع الشريان الأورطي الموجه إعلامي والشريان الرئوي أفقيا.
- سحب الشريان الأورطي من الكسب غير المشروع على الكفة مع الشريان السباتي وتأمين مفاغرة مع كفافي ضمد 8-0 الحرير.
- شق الجذع الرئوي على جانبها الأمامي وتسحبه على الكفة مع الوريد الوداجي الخارجي. تأمين مرة أخرى مفاغرة مع كفافي ضمد 8-0 الحرير.
- إزالة المشبك على حبل الوريد الخارجي، وبعد بواسطة unclamping من الشريان السباتي. قلوب تملأ فورا مع الدم. لتعزيز صeperfusion إسقاط 37 درجة مئوية محلول ملحي دافئ على الكسب غير المشروع. عادة قلب يتطور الجيبي خلال دقيقة واحدة. إزالة الملحق صفعة في موقع الوريدي.
- ضمان موقف الكسب غير المشروع الصحيح، يجب أن تكون خالية من التوتر anastomoses والسفن دون التواء. لا الأوعية أكتوي من الجلد لأن ذلك قد يؤدي إلى ضعف التئام الجروح. النزيف عادة ما يتوقف من تلقاء أنفسهم. إغلاق الجلد مع واحدة 8-0 خياطة مستمرة.
4. بعد العملية الجراحية العناية
- حقن 0.25 مل دافئ الشوري محلول ملحي لاستبدال السوائل.
- استعداء المخدرات حقن النالوكسون (1.2 ملغ / كلغ)، فلومازينيل (0.5 ملغ / كلغ) وatipamezol (2.5 ملغم / كغم من وزن الجسم) الشوري اليسار الحيوان على وسادة دافئة حتى استعاد وعيه أنه كاف للحفاظ على الاستلقاء القصية. مراقبة الحيوانات لمدة ساعة إضافية واحدة على الأقل لتسجيل أي سلوك غير طبيعي. لا يعودون الحيوان الذي خضع لعملية جراحية للشركة من الحيوانات الأخرى حتى يتعافى تماماالأحمر.
- توفير تسكين وقائية مع البوبرينورفين (0.05 ملغ / كغ الشوري ثلاث مرات في اليوم) أو تسكين البديل وفقا لبروتوكول المؤسسات المحلية لمدة لا تقل عن 72 ساعة بعد العملية.
- الجراح وطبيب بيطري يجب أن نرى الحيوانات بانتظام. في حالة فقدان الوزن> 15٪، واللامبالاة، وتورم أو الجراحية الحيوانات عدوى الجانب يصرح باستخدامها باستخدام استنشاق الأيزوفلورين المحطة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
فريق العمل لدينا يمكن أن تؤدي بنجاح تقنية الموضحة بعد ما يقرب من 20 عملية جراحية التدريب. أصعب جزء هو إيفرت جدار الوعاء الدموي في الشريان السباتي على الكفة، لأنها تقلب بسهولة مرة أخرى ويمكن أن تؤدي محاولات متعددة لتمزق من الجدار. بعد فترة التدريب، كان متوسط إجمالي الوقت المنطوق 60 ± 8 دقيقة. ويلزم حوالي 20 دقيقة للحصاد المانحة، 25 دقيقة لإعداد سفن عنق الرحم و 15 دقيقة لanastomoses وإغلاق الجلد.
للتحقيق في عضلة القلب I / R-إصابة أجرينا أكثر من 200 عملية في مسانج C57BL / 6 الفئران في مختلف البيئات التجريبية مع نسبة نجاح العمليات الجراحية من 92٪. وكان سبب الوفاة المبكرة بسبب الصعوبات في أداء anastomoses (ن = 3)، تسرب تفاغري (ن = 2) وفشل القلب (ن = 10). كان الموت الرحيم واحد الحيوانات بعد الشفاء بسبب إعاقة للجهاز العصبي. بين الناجين المحيطة بالجراحة، وبقاء الكسب غير المشروع> 95٪ في7 أيام (الشكل 4). وقد أبقى عدد من المتلقين مسانج الكسب غير المشروع على قيد الحياة لأكثر من 3 أشهر. على الرغم من عدم استخدام الوقاية باستخدام المضادات الحيوية، ونحن لم نلاحظ أي مضاعفات معدية.
في المجموعة الأولى، تم زرع 12 مسانج C57BL / 6 الفئران لاجراء فحوص لأمراض أنسجة الجسم (الشكل 3). تعرضت الطعوم إلى 4 ساعات من نقص التروية بارد من قبل التخزين على الجليد في 4 درجات مئوية قبل الزرع. تم حصاد الزرع بعد 7 أيام من ضخه وملطخة في الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) وسيريوس الأحمر. الحيوانات Nontransplanted (ن = 6) بمثابة الضوابط. I / R تؤدي إلى رد فعل التهابي قوي مع وذمة الأنسجة، واحتقان، الكريات البيض التسلل، الاوعية الدموية الدقيقة انسداد والتليف الخلالي. في هذه السلسلة في وقت مبكر قتل حيوان واحد بعد الحقن المتكررة من الكيتامين / زيلازين. هذه المضاعفات يمكن تجنب مزيد باستخدام التخدير antagonizable بالكامل بما في ذلك ميدازولام، medetomodine والفنتانيل. < / P>
الشكل 1: (أ) توضيح تخطيطي من تدفق الدم في منتبذ عنق الرحم القلب زرع. الدم من التدفقات الشريان السباتي المستلم إلى الوراء في الأبهر الصاعد وداخل الشرايين التاجية ليروي الكسب غير المشروع القلبية. المصارف الدم الوريدي إلى الأذين الأيمن عن طريق الجيب التاجي، يملأ البطين الأيمن ويتم إخراج من خلال الشريان الرئوي إلى الخارجي حبل الوريد المستلم. يتم تجاوز البطين الأيسر تماما. (ب) جراحة داخلية منظر Anastomoses. يتم سحبها الأبهر الصاعد (2) على الكفة مع الشريان السباتي (1) والجذع الرئوي (3) على الكفة مع الوريد الوداجي الخارجي (4). في الصورة لم يتم بعد الانتهاء من مفاغرة وريدية.JPG "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: (أ) مطلوب مجموعة كاملة من الأدوات المجهرية العقيمة من بينهم اثنان من ملقط المنحنية واثنين dilatators السفينة. (ب) بالنسبة للanastomoses الأصفاد 19-24 G مع ملحق والاوعية الدموية الدقيقة المشابك تستخدم.
الرقم 3: النسيجي العينات إظهار عضلة I / R-الاصابة في مسانج C57BL / 6 الفئران H & E تلطيخ (20X التكبير) من قلوب من الحيوانات التحكم (أ) و من الحيوانات بعد 4 ساعة نقص التروية الباردة و7 أيام من ضخه (ب). / R أدى لفترات طويلة وأنا في رد فعل للالتهابات قوية مع الأنسجة إدEMA، تبيغ، التسلل الكريات البيض والاوعية الدموية الدقيقة انسداد. في نفس الإعداد التجريبية سيريوس تلطيخ الأحمر (40X التكبير) أظهرت تميز ترسب الكولاجين خلالي بعد I / R (د) مقارنة مع مجموعة التحكم (ج).
الرقم 4: القلب المزروع البقاء على قيد الحياة كابلان ماير المؤامرة التي تظهر بقاء الكسب غير المشروع في مسانج C57BL / 6 الفئران. الحيوانات وير الموت الرحيم في يوم ما بعد الجراحة (7) لفحص الأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد أنجزنا أكثر من 200 عملية زرع القلب مع نسبة نجاح أكثر من 90٪ في مختلف البيئات التجريبية. مع تقنية الموضحة هنا، يمكن أن يتم الإجراء الكامل في غضون 60 دقيقة بواسطة جراح من ذوي الخبرة. من خلال إعداد الأوعية عنق الرحم قبل الشراء الجهاز، ومجموع وقت الكسب غير المشروع نقص التروية يمكن أن تقتصر على 20 دقيقة. الوقت لزرع (دافئ الوقت نقص التروية) هو أقصر بكثير باستخدام تقنية صفعة مقارنة مع تقنية خياطة 16.
بدلا من مجرد استئصال قلب كما هو موضح سابقا 5،17، ونحن لحث على السكتة القلبية التي كتبها perfusing الكسب غير المشروع مع حل شلل القلب المستخدمة سريريا وانخفاض حرارة الجسم. الحل Custodiol HTK شبه البلوري يحتوي على 10 مليمول / لتر والبوتاسيوم بتركيزات منخفضة من الصوديوم والكالسيوم والمغنيسيوم، والاعتقالات بشكل فعال في القلب. المضافات الحامض الاميني، التربتوفان وكيتوغلوتارات لحد من الحماض، وتوفير ATP وحماية أغشية الخلايا دوحلقة نقص التروية. هذا يشبه حالة سريرية من السكتة القلبية التي تسيطر عليها أثناء جراحة القلب المفتوح، ويجعل هذا المثل الأعلى نموذج للتحقيق في عضلة القلب I / R-الاصابة. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح تطبيق كلاء الدوائية في حل شلل القلب في بداية نقص التروية الباردة. تخزين الطعوم في 0-4 ° C ممكن لفترة زمنية الأقصى من 4 ساعات. زمن نقص التروية لفترة طويلة قد يؤدي إلى hypocontractility عضلة القلب تعقدت المفرط من حجرات القلب اليمنى ونزيف.
في تجربتنا، وبضع نقاط رئيسية الحرجة تسهيل عودة التوعي ناجحة. من خلال تعبئة كاملة من الشريان السباتي واستخدام الانظار Yasargil المشبك أقصى طول vassel لمفاغرة يمكن الحفاظ عليها. بالتشنج يمكن تجنبها من خلال إسقاط 01:10 بابافيرين المخفف على الشريان. لتجنب إعاقة للجهاز العصبي هو ligated الشريان السباتي دون التشعب للحفاظ على دوران رادف لر انه الشريان السباتي الداخلي. والمتوسعة التجويف سفينة بعناية مع dilatator السفينة مع رقيق (0.2 مم) طرف مع تجنب تمزق من الجدار. في تجربتنا موضع الغرز عقد كما هو موضح سابقا 7 ليست إلزامية. اختيار حجم الكفة أمر حاسم لإعادة التوعي ناجحة. يجب أن يكون قطر صفعة الداخلي للمفاغرة شريانية أكبر إلى حد ما من خارج القطر من الشريان السباتي المشترك (250-300 ميكرون) لحساب عدم تطابق مع الأبهر الصاعد أكبر من الكسب غير المشروع. بالنسبة للفئران وزنها 20-25 غ استخدام الأصفاد 22-24 G (داخل القطر الكفة 0،510-0،643 مم) لالشريان السباتي والأصفاد 19-21 G (داخل القطر الكفة 0،724-0،912 مم) لحبل الوريد الخارجي . نحن نفضل مواد خياطة الجروح polyfilament (الحرير)، وهذا يسهل الغزل. يتم وضع المشبك الاوعية الدموية الدقيقة على تمديد الكفة. هذا يشل السفينة ويسهل انقلاب للخارج الجدار.
ove_content "> انخفاض حرارة الجسم ويجب تجنب بعناية لأنه يطيل التعافي ويشكل سببا رئيسيا للوفيات المحيطة بالجراحة. تسكين تطميني Antagonizable باستخدام ميدازولام، medetomodine ويوفر الفنتانيل التسامح الجراحي الجيد وتسمر الانتعاش مقارنة مع الكيتامين / زيلازين 18.على الرغم من أن عنق الرحم نموذج زرع القلب هو غير فيزيولوجي، نموذج غير محملة القلب بسبب اتجاهها فريد من تدفق الدم داخل القلب، هو أداة لا غنى عنها في زرع القلب التجريبية. التفاصيل الفنية هو مبين في هذه الورقة الفيديو يجب أن تسمح الأبحاث لإنشاء هذا النموذج من السهل نسبيا في مختبراتهم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps JFC-7.2 | S&T | P-00036 | Curved tip 0.20 mm |
| Vessel dilatator D-5a | S&T | S-00124 | |
| Adventita scissor | S&T | S-00102 | |
| Vascular clamp B-1V | S&T | S-00396 | |
| Yasargil Clip | Peter Lazic | 65,097 | 3.5 mm lenght |
| Bipolar forceps | Micromed | 148-100-011 | tip 0.25 mm |
| Polyimide tubes | River Tech Medical | 19-24 gauge | |
| 8.0 silk ligatures | Catgut | ||
| Custodiol HTK solution | Essential Pharmaceuticals |
References
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transplant Proc. 5, 733-735 (1973).
- Chen, Z. H. A technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice. Transplantation. 52, 1099-1101 (1991).
- Martins, P. N. Assessment of graft function in rodent models of heart transplantation. Microsurgery. 28, 565-570 (2008).
- Schramm, R., et al. The subepicardial microcirculation in heterotopically transplanted mouse hearts: an intravital multifluorescence microscopy study. J Thorac Cardiovasc Surg. 134, 210-217 (2007).
- Liu, F., Kang, S. M.
- Gong, W., et al. Introduction of modified cervical cardiac transplant model in mice. Exp Clin Transplant. 10, 158-162 (2012).
- Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. 51, 896-898 (1991).
- Chen, H., Zhang, Y., Zheng, D., Praseedom, R. K., Dong, J. Orthotopic kidney transplantation in mice: technique using cuff for renal vein anastomosis. PloS one. 8, e77278 (2013).
- Maglione, M., et al. A novel technique for heterotopic vascularized pancreas transplantation in mice to assess ischemia reperfusion injury and graft pancreatitis. Surgery. 141, 682-689 (2007).
- Sucher, R., et al.
- Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28, 47-50 (1979).
- Oldani, G., Lacotte, S., Morel, P., Mentha, G., Toso, C.
- Okazaki, M., et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 7, 1672-1679 (2007).
- Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation. J Vis Exp : JoVE. , (2012).
- Zou, Y., et al. Mouse model of venous bypass graft arteriosclerosis. Am J Pathol. 153, 1301-1310 (1998).
- Zhou, Y., Gu, X., Xiang, J., Qian, S., Chen, Z. A comparative study on suture versus cuff anastomosis in mouse cervical cardiac transplant. Exp Clin Transplant. 8, 245-249 (2010).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3000 operations by one surgeon. J Heart Lung Transplant. 20, 1123-1128 (2001).
- Arras, M., Autenried, P., Rettich, A., Spaeni, D., Rulicke, T. Optimization of intraperitoneal injection anesthesia in mice: drugs, dosages, adverse effects, and anesthesia depth. Comp Med. 51, 443-456 (2001).
