Introduction
Die Herztransplantationsmodell wird häufig verwendet, um I / R-Verletzung, Allotransplantatabstoßung nach Transplantation Vaskulopathie und die Effizienz der immunmodulierende Mittel zu untersuchen. Mausmodelle kombinieren viele Vorteile wie die bekannten immunologischen und genetischen Hintergründen, die Verfügbarkeit von vielen Inzucht und transgenen Linien und der relativ geringen experimentellen Kosten.
Im Jahr 1973 wurde eine Technik der Bauchherztransplantation bei Mäusen zuerst von Corry et al. 1 beschrieben In diesem Modell Transplantate werden von Ende-zu-Seite-Anastomosen der aufsteigenden Aorta zu abdominalen Aorta des Empfängers und des Hauptlungenarterie zu der unteren Hohlvene revaskularisiert. 1991 wurde ein Nahttechnik für zervikale Herztransplantation bei Mäusen durch Chen et al. 2 beschrieben In diesem Modell wird ein Rück koronare Herzdurchblutung wird durch Anastomose der A. carotis des Empfängers zu den aufsteigenden Aorta des gr gegründetachtern. Das venöse Blut Drains über den Koronarsinus in das rechte Atrium, den rechten Ventrikel und durch die Lungenarterie in den Empfänger äußere Jugularvene (Figur 1) ausgestoßen wird. Im Vergleich zu der Bauch Graft-Implantation der zervikale Modell ist weniger invasiv und die oberflächliche Lage des Transplantats ermöglicht eine sehr gute Zugänglichkeit für zusätzliche Kontrolluntersuchungen (zB Palpation, Echokardiographie, Intravitalfluoreszenzmikroskopie) 3,4.
Trotz technische Verbesserungen 5,6, wurde eine weitere Verbreitung dieses Modells aufgrund technischer Probleme beschränkt genäht Anastomosen von kleinen Schiffen mit einer hohen Inzidenz von Anastomosen Leckagen und Thrombosen führen. 1991, Matsuura et al. erläutert den Manschettenverfahren, bei dem die Gefäßwand über eine synthetische Zylinder, der das Modell des zervikalen Herztransplantationen 7 erleichtert stülpt. Die Technik war fueitere angenommen für verschiedene experimentelle Transplantationsmodellen einschließlich Nieren 8, Bauchspeicheldrüsen 9, des Körpers 10, Leber 11,12, 13,14 und Lungengefäßtransplantation 15. Im Vergleich zu der Nahttechnik die erforderliche Zeit für Anastomosen und somit ist das warme Ischämie Zeit kürzer, und es sind deutlich weniger vaskulären Komplikationen mit der Manschette Technik 16. Darüber hinaus ermöglicht es Chirurgen, mit wenig Ausbildung in der Mikrochirurgie, um den Betrieb mit einer hohen Erfolgsquote durchzuführen. Ein Nachteil der Manschette Technik ist Voraussetzung Ligatur der Arteria carotis, der zerebralen Durchblutung verändern können.
In diesem Video-Papier stellen wir ein verbessertes und vereinfachtes Manschettentechnik für zervikale Herztransplantation bei Mäusen.
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Protocol
Alle Experimente wurden vom Deutschen Herzzentrum München und der Regierung von Bayern, Deutschland (Gz. 55.2-1-54-2532.3-17-13) zugelassen. Die Tiere wurden in einer speziellen pathogenfreien Einrichtung untergebracht und erhielten menschlicher Obhut in Übereinstimmung mit den "Principles of Laboratory Animal Care" von der Nationalen Gesellschaft für Medizinische Forschung und dem "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren" durch die National Academy bereitgestellt formuliert der Wissenschaften und von den National Institutes of Health (NIH Publikation Nr. 86-23, überarbeitet 1985) veröffentlicht.
HINWEIS: Ein kompletter Satz von sterilen mikrochirurgischen Instrumenten, darunter zwei gebogenen Pinzette und Gefäß Dilatatoren, ist notwendig für das Verfahren (Abbildung 2a). Perioperative Antibiotikaprophylaxe nicht routinemäßig notwendig, kann aber bei immungeschwächten Tiere angegeben werden. Die Tiere wurden unter Verwendung von terminaler Isofluran Inhalation geopfert.
Spender Vorbereitung und Graft-Ernte
<ol>2. Empfänger Vorbereitung
- Bereitendie Manschetten für Anastomosen durch Schneiden des Polyimid-Schlauch mit einem No. 11 Skalpell oder einer Schere unter dem Mikroskop. Die Manschette besteht aus einem zylindrischen Körper und einer Verlängerung (1/3 des Umfangs) für die Platzierung des Gefäßklemme, die jeweils mit einer Länge von 1 mm (Abbildung 2b).
- Betäuben das Tier und bestätigen chirurgische Toleranz, wie oben beschrieben. Injizieren 0,25 ml warmen Kochsalzlösung subkutan (sc) für Flüssigkeitsersatz.
- Entfernen Sie die Haare von der rechten Halsbereich mit einem elektrischen Rasierer und legen Sie das Tier in Rückenlage auf einer warmen Unterlage. Sichern Sie sich die Beine mit Strängen der Band unter Vermeidung von Überdehnung der vorderen Gliedmaßen, da dies die Atmung beeinträchtigen. Decken Sie die Augen mit Augensalbe, um Trockenheit zu verhindern. Desinfizieren Sie die Operationsstelle dreimal mit Chlorhexidin.
- Einen Querhautschnitt von der rechten Kieferwinkel, um die Halsschlagkerbe.
- Unverblümt zu mobilisieren, die external Halsschlagader. Cauterize Seitenäste mit einer bipolaren Pinzette und durchschneiden sie.
- Teilen Sie die äußere Jugularvene zwischen Ligaturen auf der Ebene der Einmündung in die Vene von der Unterkieferspeicheldrüse.
- Ziehen Sie die äußere Jugularvene durch die Manschette und verschließt das Gefäß proximal durch Platzieren einer Gefäßklemme an der Verlängerung der Manschette. Entfernen Sie die Blattschraube und zu bewässern das Gefäßlumen mit 1:10 heparinisierter Kochsalzlösung.
- Evert die Gefäßwand über der Manschette und fixieren Sie es mit einem voreingestellten Umfangs 8-0 Seidenligatur.
- Entfernen Sie den oberflächlichen Teil des M. sternocleidomastoideus.
- Mobilisieren die rechte Arteria carotis communis und durchschneiden das Gefäß zwischen Ligaturen unter dem Karotisbifurkation.
- Ziehen der Halsschlagader durch die Manschette und verschließt den Behälter proximal durch Platzieren eines Yasargil Klemme an der Verlängerung der Manschette. Entfernen Sie die Blattschraube und zu bewässern das Gefäßlumen mit 1:10 heparinisierter Kochsalzlösung.
- Gently dilate das arterielle Lumen mit einem Schiff Dilatator, umzustülpen die Gefäßwand über der Manschette und fixieren Sie es mit einem voreingestellten Umfangs 8-0 Seidenligatur.
- Um ausreichend Platz für Graft-Implantation zu gewinnen, nehmen Sie den rechten Lappen der Unterkieferspeicheldrüse.
- Halten Sie das Operationsfeld feucht bis zur Implantation.
3. Graft-Implantation
- Legen Sie das Transplantat in den Empfänger Halsbereich auf den Kopf mit der Aorta medial orientiert und die Pulmonalarterie seitlich.
- Ziehen Sie die Aorta des Transplantats über der Manschette mit der Halsschlagader und sichern Sie die Anastomose mit einer umlaufenden 8-0 Seidenligatur.
- Einzuschneiden den Truncus pulmonalis auf seiner vorderen Seite und ziehen Sie sie über die Manschette mit der äußeren Halsschlagader. Auch hier sichern die Anastomose mit einer umlaufenden 8-0 Seidenligatur.
- Entfernen Sie die Klemme an der äußeren Halsschlagader, gefolgt von Lösen der Halsschlagader. Die Herzen füllt sofort mit Blut. Um r verbesserneperfusion fallen 37 ° C warmen Kochsalzlösung auf das Transplantat. Normalerweise entwickelt sich die Herzsinusrhythmus innerhalb einer Minute. Entfernen Sie die Manschette Verlängerung bei der venösen Seite.
- Stellen Sie sicher, korrekte Transplantatposition muss Anastomosen spannungsfrei und Gefäße ohne Torsion sein. Nicht kauterisiert Gefäße der Haut, da dies die Wundheilung beeinträchtigen. Blutungen in der Regel stoppt spontan. Schließen Sie die Haut mit einem einzigen 8-0 fortlaufende Naht.
4. Nachsorge
- Injizieren 0,25 ml warmen Kochsalzlösung sc zum Flüssigkeitsersatz.
- Um antagonisieren Drogen injizieren Naloxon (1,2 mg / kg), Flumazenil (0,5 mg / kg) und atipamezol (2,5 mg / kg Körpergewicht) SC das Tier Linke auf dem warmen Unterlage, bis es ausreichend, das Bewusstsein wiedererlangt, um Brustlage zu halten. Beobachten Sie das Tier für mindestens eine weitere Stunde, um eine abnormale Verhalten registrieren. Sie ein Tier, das der Operation an die Firma von anderen Tieren, bis sie vollständig Recove unterzogen wurde nicht zurückred.
- Bereitzustellen preemptive Analgesie mit Buprenorphin (0,05 mg / kg sc dreimal täglich) oder eine alternative Analgesie nach einem lokalen institutionellen Protokoll für eine Mindestdauer von 72 Stunden nach dem Eingriff.
- Der Chirurg und ein Tierarzt sollten die Tiere regelmäßig zu sehen. Im Falle der Gewichtsverlust> 15%, Apathie, Schwellungen oder chirurgische Seiten Infektion Tiere werden unter Verwendung von terminaler Isofluran Einatmen euthanasiert.
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Representative Results
Unser Team konnte die beschriebene Technik nach ca. 20 Trainings Operationen erfolgreich durchzuführen. Die größte Herausforderung ist es, die Gefäßwand der Halsschlagader über die Manschette umzustülpen, weil es leicht kippt zurück und mehrere Versuche können zum Reißen der Wand führen. Nach der Ausbildungszeit, die mittlere Gesamtoperationszeit betrug 60 ± 8 min. Rund 20 min sind für Spender der Ernte, 25 min zur Herstellung der Halsgefäße und 15 Minuten für die Anastomosen und Hautverschluss erforderlich.
Für die Untersuchung von Herz I / R-Verletzungen führten wir über 200 Operationen in syngenen C57BL / 6-Mäusen in verschiedenen experimentellen Bedingungen mit einem chirurgischen Erfolgsrate von 92%. Frühen Tod wurde durch Schwierigkeiten bei der Durchführung der Anastomosen verursachte (n = 3), Anastomosenlekage (n = 2) und Herz Fehler (n = 10). Ein Tier wurde nach der Rückstellung aufgrund von neurologischen Störungen eingeschläfert. Unter perioperative Lebenden war das Transplantatüberleben> 95% bei7 Tagen (Abbildung 4). Eine Reihe von syngenen Transplantat-Empfängern wurden lebendig für mehr als 3 Monate haltbar. Trotz Verzicht auf Antibiotika-Prophylaxe, haben wir nicht beobachten, keine infektiösen Komplikationen.
In einer ersten Serie wurden 12 syngenen C57BL / 6-Mäuse histopathologische Untersuchungen (Abbildung 3) verpflanzt. Transplantate wurden 4 h einer kalten Ischämie durch Lagerung auf Eis bei 4 ° C vor der Implantation ausgesetzt ist. Transplantate wurden nach 7 Tagen Reperfusion geerntet und in Hämatoxylin und Eosin (H & E) und Sirius Rot angefärbt. Nontransplanted Tieren (n = 6) dienten als Kontrollen. I / R führen zu einer starken Entzündungsreaktion mit Gewebe-Ödem, Hyperämie infiltrierenden Leukozyten, mikrovaskuläre Okklusion und einer interstitiellen Fibrose. In dieser frühen Serie starb ein Tier nach einer wiederholten Injektion von Ketamin / Xylazin. Diese Komplikation könnte weiter durch eine vollständige Anästhesie antagonizable einschließlich Midazolam und Fentanyl medetomodine vermieden werden. < / p>
Abbildung 1: (a) Schematische Darstellung des Blutflusses während Heterotope Cervical Herztransplantation. Blut von Karotis Ströme des Empfängers retrograd in die aufsteigende Aorta und in die Koronararterien, um das Herz-Transplantat perfundieren. Das venöse Blut fließt in den rechten Vorhof über den Koronarsinus, füllt die rechte Herzkammer und wird durch die Lungenarterie in die externe Jugularvene des Empfängers ausgestoßen wird. Der linke Ventrikel vollständig umgangen. (B) Intraoperative Ansicht der Anastomosen. Die aufsteigenden Aorta (2) über den Bund mit der Halsschlagader (1) und dem Truncus pulmonalis gezogen (3) über der Manschette mit der externen Jugularvene (4). Im Bild die venöse Anastomose noch nicht abgeschlossen sind.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: (a) Ein kompletter Satz von sterilen mikrochirurgischen Instrumenten, darunter zwei gebogenen Pinzette und zwei Behälter Dilatatoren ist erforderlich. (B) Für Anastomosen Bündchen 19-24 G mit einer Verlängerung und mikrovaskuläre Schellen verwendet.
Abbildung 3: Die histologische Proben demonstrieren Myocardial I / R-Verletzung in Syngene C57BL / 6-Mäuse, H & E-Färbung (20-facher Vergrößerung) der Herzen, Kontrolltiere (a) und von Tieren, die nach 4 Stunden kalte Ischämie und 7 Tagen nach der Reperfusion (b).. Längerer I / R führte zu einer starken Entzündungsreaktion mit Gewebe edema, Hyperämie, infiltrieren Leukozyten und mikrovaskuläre Okklusion. In derselben Versuchseinstellung Sirius-Rot-Färbung (40-fache Vergrßerung) zeigten deutliche interstitielle Kollagenablagerung nach I / R (d) im Vergleich zu der Kontrollgruppe (C).
Abb. 4: Cardiac Allograft Überleben Kaplan-Meier-Plot Darstellung das Transplantatüberleben in syngene C57BL / 6 Mäusen. Tiere ware auf postoperativen Tag 7 für eine histopathologische Untersuchung euthanasiert.
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Discussion
Wir haben mehr als 200 Herztransplantationen mit einer Erfolgsquote von über 90% in verschiedenen experimentellen Einstellungen vorgenommen. Mit dem hier beschriebenen Verfahren kann das gesamte Verfahren innerhalb von 60 min durch einen erfahrenen Chirurgen durchgeführt werden. Durch die Herstellung der Halsgefäße vor der Organbeschaffung kann insgesamt Transplantat Ischämie Zeit auf 20 min begrenzt werden. Zeit für Implantation (warme Ischämie Zeit) wesentlich kürzer ist mit der Manschette Technik im Vergleich zu der Nahttechnik 16.
Statt einfach Ausschneiden des Herzens, wie zuvor beschrieben 5,17, wir veranHerzStillStand durch Perfusion des Transplantats mit einer klinisch verwendeten kardioplegischen Lösung und durch Unterkühlung. Die kristalloiden Custodiol HTK Lösung enthält 10 mmol / l Kalium und niedrigen Konzentrationen an Natrium, Calcium und Magnesium, und das Herz wirksam arretiert. Die Additive Histidin, Tryptophan und a-Ketoglutarat zu reduzieren Azidose, bieten ATP und schützt die Zellmembranen duRing Ischämie. Dies ähnelt der klinische Zustand einer kontrollierten Herzstillstand während der Operation am offenen Herzen und macht dieses Modell ideal für die Untersuchung der myokardialen I / R-Verletzung. Darüber hinaus ermöglicht es Anwendung pharmakologischer Mittel innerhalb der kardioplegischen Lösung zu Beginn der kalten Ischämie. Lagerung von Transplantaten bei 0-4 ° C ist für ein maximales Zeitintervall von 4 Stunden möglich. Eine verlängerte Ischämie Zeit kann die myokardiale Hypokontraktilität durch Überdehnung der rechten Herzkammern und Blutungen kompliziert zu führen.
Nach unserer Erfahrung wird ein paar kritische Schlüsselpunkte erfolgreiche Revaskularisierung zu erleichtern. Durch vollständige Inanspruchnahme der Halsschlagader und die Verwendung eines flachen Yasargil Klemm maximale vassel Länge für Anastomose erhalten werden kann. Vasospasmus kann durch Löschen 1:10 Papaverin auf der Arterie zu vermeiden. Um neurologische Beeinträchtigung zu vermeiden, die Halsschlagader wird unterhalb der Bifurkation ligiert, um Kollateralkreislauf bewahren bis t er A. carotis interna. Das Gefäßlumen wird vorsichtig mit einem Gefäß Dilatator mit einem superfeinen (0,2 mm) Spitze unter Vermeidung Reißen der Wand erweitert. Nach unserer Erfahrung, wie zuvor beschrieben die Platzierung der Haltenähte 7 ist nicht zwingend. Die Auswahl der Manschettengröße ist entscheidend für eine erfolgreiche Revaskularisierung. Der innere Manschettendurchmesser für die arterielle Anastomose sollte etwas grßer als der Außendurchmesser der Halsschlagader (250-300 um), um die Nichtübereinstimmung mit dem größeren aufsteigende Aorta des Transplantats zu berücksichtigen. Bei Mäusen mit einem Gewicht von 20-25 g Verwendung Bündchen 22-24 G (Innenmanschettendurchmesser von 0,510 bis 0,643 mm) für die Halsschlagader und Manschetten 19-21 G (Innenmanschettendurchmesser von 0,724 bis 0,912 mm) für die externe Halsschlagader . Wir bevorzugen polyfilen Nahtmaterial (Seide), da dies erleichtert Verknoten. Die mikrovaskulären Klemme auf der Verlängerung der Manschette angeordnet. Dies immobilisiert das Gefäß und erleichtert das Umstülpen der Wand.
ove_content "> Unterkühlung muss sorgfältig vermieden werden, da es verlängert die Rückgewinnung und ist eine der Hauptursachen für perioperative Mortalität werden. Antagonizable Neuroleptanalgesie mit Midazolam, Fentanyl medetomodine und bietet gute chirurgische Toleranz und befestigt Erholung im Vergleich zu Ketamin / Xylazin 18.Obwohl der zervikalen Herztransplantationsmodell ist eine nicht-physiologischen, unbelasteten Herzmodell aufgrund der einzigartigen Bündelung intrakardialer Blutfluss, es ist ein unverzichtbares Werkzeug in der experimentellen Herztransplantation. Die technischen Details in diesem Video Papier gezeigt ermöglichen sollten Forschungen dieses Modell in ihren Laboratorien relativ einfach herzustellen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps JFC-7.2 | S&T | P-00036 | Curved tip 0.20 mm |
| Vessel dilatator D-5a | S&T | S-00124 | |
| Adventita scissor | S&T | S-00102 | |
| Vascular clamp B-1V | S&T | S-00396 | |
| Yasargil Clip | Peter Lazic | 65,097 | 3.5 mm lenght |
| Bipolar forceps | Micromed | 148-100-011 | tip 0.25 mm |
| Polyimide tubes | River Tech Medical | 19-24 gauge | |
| 8.0 silk ligatures | Catgut | ||
| Custodiol HTK solution | Essential Pharmaceuticals |
References
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