Introduction
心臓移植モデルは、頻繁にI / R傷害、同種移植片拒絶反応、移植後血管障害および免疫調節剤の効果を調査するために使用されます。マウスモデルは、既知の免疫学的および遺伝的背景、多くの近交系およびトランスジェニック株および比較的低い実験コストの可用性のような多くの利点を兼ね備えています。
1973年には、マウスでの腹部心臓移植の技術は、最初のコリーら 1で説明しました。このモデルでは移植片は、レシピエントの腹部大動脈へと下大静脈への主肺動脈の上行大動脈の端側吻合によって血管再生されます。 1991年には、マウスでの子宮頸心臓移植のための縫合技術は、Chenら2によって説明されました。このモデルでは、逆行性冠動脈灌流は、GRの上行大動脈に受信者の頸動脈の吻合によって確立されました後方。静脈血の右心房、右心室に冠状静脈洞を介したドレインとは、レシピエント外頚静脈（ 図1）への肺動脈を通って排出されます。腹部グラフト移植と比較して、子宮頸モデルは、低侵襲性であり、移植片の表面的な場所は、追加のフォローアップ検査（ 例えば、触診、心エコー検査、生体蛍光顕微鏡）3,4のために非常に容易にアクセスが可能になります。
技術改良5,6にもかかわらず、このモデルのより広範な使用は、吻合漏れや血栓症の発生率が高いと小血管の縫合吻合を実行するための技術的な難しさに限定されていました。 1991年に、松浦ら 。血管壁が大幅に子宮頸心臓移植7のモデルを容易に合成シリンダー、上で裏返されたカフ技術を導入しました。技術はFUましたrtherは腎8、膵臓9、手足10、肝11,12、肺13,14および血管移植15を含む様々な実験移植モデルに採用。縫合技術と比較して、吻合のための所要時間と、従って、暖かい虚血時間が短く、カフ法16を用いて、より少ない血管合併症が大幅にあります。また、高い成功率を使用して操作を実行するためにマイクロサージェリーに少しのトレーニングで外科医を可能にします。カフ技術の欠点は、脳灌流を変更することができる総頸動脈の前提条件ライゲーションです。
このビデオの論文では、マウスの子宮頸心臓移植のための改良されたと単純化されたカフ手法を提示します。
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Protocol
全ての実験は、ドイツのハートセンターミュンヘン、バイエルン、ドイツ（Gzを。55.2-1-54-2532.3-17-13）の政府によって承認されました。動物は、特定病原体フリーの施設に収容し、医学研究のための国民の協会と全米科学アカデミーが提供する「実験動物の管理と使用に関する指針」が策定した「実験動物管理の原則」に準拠した人の治療を受けました科学と国立衛生研究所（NIH出版番号86から23は、1985年改訂）で発表しました。
注：2つの湾曲鉗子と血管dilatators含む無菌の顕微機器の完全なセットは、手順（ 図2a）のために必要です。周術期の抗生物質による予防は、日常的に必要ではないが、免疫不全動物で示すことができます。動物をイソフルラン吸入端末を使用して屠殺しました。
ドナーの調製および移植片の収穫
<オール>2.受信者の準備
- 準備11番メスまたは顕微鏡下ではさみでポリイミドチューブを切断することにより吻合のための袖口。カフは、円筒状の本体と、血管クランプを配置するための拡張機能（円周の 1/3）、1ミリメートル（ 図2b）の各々の長さで構成されています。
- 動物を麻酔し、上記のように外科的寛容性を確認します。水分補給のための0.25ミリリットル温かい生理食塩水を皮下（SC）を注入します。
- 電気シェーバーを使用して、右頸部の毛を削除し、暖かいパッド上に仰臥位で動物を配置します。呼吸が損なわれる可能性がこのよう前肢を過延伸回避しながらテープのストランドと足を固定します。乾燥を防ぐために、眼軟膏を使用して、目を覆います。クロルヘキシジンで手術部位を3回消毒します。
- 頸静脈ノッチに右下顎角から横皮膚切開を行います。
- ぶっきらぼうに内線を動員ernal頸静脈。バイポーラ鉗子で側枝を焼灼し、それらを横断します。
- 顎下腺からの静脈との合流点のレベルで合字の間に外頸静脈を分割します。
- カフを介して外部頸静脈を引いて、カフの延長上に血管クランプを配置することによって、近位血管を閉塞。合字を削除し、1時10分、ヘパリン化生理食塩水で血管内腔を灌漑。
- カフの上に血管壁をエバート、プリセット周8-0絹糸結紮で固定します。
- 胸鎖乳突筋の表面的な部分を削除します。
- 右総頸動脈を動員し、頸動脈分岐下の合字間の血管を横断。
- カフを介して頸動脈を引いて、カフの延長上にYasargilクランプを配置することによって、近位血管を閉塞。合字を削除し、1時10分、ヘパリン化生理食塩水で血管内腔を灌漑。
- ゆっくりDILAT電子血管dilatatorと動脈内腔は、カフの上に血管壁を裏返すと、プリセット周8-0絹糸結紮で固定します。
- グラフト移植のための十分なスペースを得るために、顎下腺の右葉を削除します。
- 移植まで湿った術野を保管してください。
3.グラフト移植
- 逆さまに内側に向い大動脈と横方向に肺動脈をレシピエント頸部におけるグラフトを配置します。
- 頸動脈カフの上にグラフトの大動脈を引き、円周8-0シルク結紮で吻合を固定します。
- その前面に肺動脈幹を切開し、外頸静脈とカフの上に引き出します。再び周8-0絹糸結紮で吻合を固定します。
- 頸動脈のアンクランプすることにより、以下、外頸静脈にクランプを取り外します。心臓は血液ですぐにいっぱいに。 Rを強化するために、eperfusionは、移植片に37℃の温かい生理食塩水をドロップします。通常、心臓は1分以内に洞調律を開発しています。静脈サイトでカフの拡張子を削除します。
- 正しいグラフト位置を確認し、吻合は、ねじれのない緊張フリー、船でなければなりません。これは創傷治癒を損なう可能性があるため、皮膚の血管を焼灼しないでください。出血は通常、自然に停止します。シングル8-0連続縫合で皮膚を閉じます。
4.術後ケア
- 水分補給のための0.25ミリリットル温かい生理食塩水を皮下注射します。
- 麻薬は、ナロキソン（1.2ミリグラム/キログラム）、フルマゼニル（0.5ミリグラム/ kg）を、それが胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで暖かいパッドの上に動物を左SC atipamezol（2.5 mg / kg体重）を注入拮抗します。任意の異常行動を登録するには、少なくとも1つの付加的な時間のための動物を観察します。完全にリ・まで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返しません。赤。
- 処置後72時間の最小持続時間のためのローカルの制度のプロトコルに従ってブプレノルフィン（1日に3回皮下0.05ミリグラム/ kg）または代替鎮痛で先制鎮痛を提供します。
- 外科医と獣医師は動物を定期的に表示されるはずです。 > 15％の体重減少の場合、無関心では、膨潤または外科側感染動物は、イソフルラン吸入端末を使用して安楽死させます。
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Representative Results
私たちのチームは成功し、約20のトレーニング手術後に記載された技術を実行することができます。最も挑戦的な部分は、それが簡単にバックフリップと複数の試みが壁の引き裂きにつながる可能性があるため、カフの上に頸動脈の血管壁を裏返すことです。訓練期間の後、平均総手術時間は60±8分でした。 20分ごろ、ドナーの収穫のために、子宮頸部の血管と吻合し、皮膚閉鎖のための15分の調製のための25分を必要としています。
心筋I / R傷害の調査のために我々は92％の手術の成功率で様々な実験設定で、同系C57BL / 6マウスでは200以上の操作を行いました。早期の死亡は吻合を行う際に困難を引き起こした（n = 3）を、吻合部の漏れ（N = 2）、心肺障害（N = 10）しました。一つの動物は、神経学的障害に起因する回復後に安楽死させました。周術期の生存者の中では、移植片の生存がで> 95％でした7日（ 図4）。同系移植の受信者数は3ヶ月以上生き続けてきました。抗生物質の予防的投与を使用していないにも関わらず、我々は、任意の感染性合併症を観察しませんでした。
最初のシリーズでは、12同系C57BL / 6マウスは、病理組織学的検査（ 図3）のために移植しました。移植片は、移植前に4℃で氷上で保存することにより冷たい虚血の4時間に暴露しました。移植は、再灌流の7日後に採取し、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）およびシリウスレッドで染色しました。 Nontransplanted動物（N = 6）は、対照としました。組織浮腫、充血、白血球浸潤、微小血管の閉塞および間質性線維症との強い炎症反応へのI / Rリード。この初期のシリーズでは一匹の動物は、ケタミン/キシラジンの反復注射後に死亡しました。この合併症は、さらにミダゾラム、medetomodineとフェンタニルを含む完全antagonizable麻酔を使用することによって回避することができます。< / P>
図1：異子宮頸心臓移植における血流の（a）の模式図。受信者の頸動脈からの血液は、心臓移植片を灌流する上行大動脈へと冠状動脈に逆行流れます。右心房への静脈血のドレインを冠状静脈洞を経由して、右心室を充填し、受信者の外頚静脈に肺動脈を通って排出されます。左心室は完全にバイパスされます。 （b）は吻合の術中ビュー。上行大動脈（2）は、頸動脈（1）および肺動脈幹とカフの上に引っ張られる（3）外頸静脈とカフの上に（4）。絵で静脈吻合はまだ完了していませんでした。JPG "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：（a）は、2つの湾曲鉗子と2血管dilatatorsを含む無菌の顕微機器の完全なセットが必要です。 （b）は吻合のために拡張し、微小血管クランプで19-24 Gから袖口が使用されています。
図3：同系C57BL / 6マウスにおける心筋のI / R傷害を発揮組織学的サンプル対照動物からの心のH＆E染色（20X倍率）（a）と動物からの4時間冷たい虚血および再灌流の7日後（B）。長時間のI / Rは組織編と強い炎症反応をもたらし絵馬、充血、浸潤白血球および微小血管閉塞。同じ実験設定シリウスレッド染色（40×倍率）で対照群（C）と比較して、I / R（d）の後に顕著な間質性コラーゲン沈着を示しました。
図4：心臓同種移植片生存のカプラン-マイヤープロット同系C57BL / 6マウスに移植片生存を表示します。動物は、病理組織学的検査のために術後7日目に安楽死させ土器。
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Discussion
我々は、様々な実験的な設定で、90％以上の成功率で200以上の心臓移植を完了しました。ここに記載された技術では、完全な手順は、経験豊富な外科医によって60分以内に行うことができます。臓器獲得の前に子宮頸部の容器を調製することにより、総グラフト虚血時間は20分に制限することができます。移植のための時間（ウォーム虚血時間）縫合技術16に比べカフ技術を使用して大幅に短くなっています。
代わりに、単に以前に5,17に記載されているように 、我々は臨床的に使用された心停止液で移植片を灌流によって、および低体温症により心停止を引き起こす心臓を切除します。晶質Custodiol HTK溶液は、10ミリモル/ lのカリウム、ナトリウム、カルシウム及びマグネシウムの低濃度を含有し、効果的に心臓を停止させます。添加剤のヒスチジン、トリプトファン及びケトグルタルは、アシドーシスを低減し、ATPを提供し、細胞膜を保護デュリング虚血。これは、心臓切開手術中に制御の心停止の臨床症状に似ており、心筋I / R傷害の調査のためのこのモデルに最適です。また、冷たい虚血の開始時に心停止液中の薬剤の適用を可能にします。 0-4℃での移植片の貯蔵は、4時間の最大時間間隔が可能です。長時間の虚血時間は右心室および出血の過伸展によって複雑心筋hypocontractilityにつながる可能性があります。
我々の経験では、いくつかの重要なキーポイントが成功した血管再生を促進します。完全な頸動脈の動員および吻合のためのロープロファイルYasargilクランプ最大vassel長を使用することにより保存することができます。血管攣縮は、動脈上に1:10に希釈パパベリンをドロップすることによって回避することができます。神経学的障害を回避するために頸動脈をtに側副循環を維持するために、分岐の下に連結されます彼内頸動脈。壁の断裂を回避しながら、血管内腔を注意深く超（0.2ミリメートル）の先端を有する血管dilatatorを拡張しています。我々の経験では、以前に7に記載されているように 、縫合糸を保持しているの配置は必須ではありません。カフのサイズの選択は成功した血管再生のために重要です。動脈吻合用インナーカフの直径は、移植片の大きい上行大動脈とのミスマッチを考慮して総頸動脈（250〜300ミクロン）の外径よりもやや大きくする必要があります。外頸静脈のために（0.724から0.912ミリメートルにカフ内径）19から21のGに頸動脈用（0.510から0.643ミリメートルにカフ内径）22から24、G 20〜25グラムの使用袖口を計量マウスと袖口のために。これは結び目を容易にするpolyfilament縫合材料（絹）を好みます。微小血管クランプをカフの延長上に配置されます。これは、容器を固定化し、壁の外転を容易にします。
それは回復を延長し、周術期死亡率の主要な原因であるため、 "ove_content>低体温を慎重に避けなければならない。Antagonizable神経遮断麻酔ミダゾラム、medetomodineを使用し、フェンタニルは、ケタミン/キシラジン18に比べて回復が良い外科的寛容性を提供し、固定します。子宮頸心臓移植モデルは、非生理学的、非負荷心臓モデルが原因心臓内の血流のユニークな方向性であるが、実験的心臓移植において不可欠なツールです。このビデオの論文に示されている技術的な詳細は、研究は、その研究室で比較的容易にこのモデルを確立できるようにする必要があります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps JFC-7.2 | S&T | P-00036 | Curved tip 0.20 mm |
| Vessel dilatator D-5a | S&T | S-00124 | |
| Adventita scissor | S&T | S-00102 | |
| Vascular clamp B-1V | S&T | S-00396 | |
| Yasargil Clip | Peter Lazic | 65,097 | 3.5 mm lenght |
| Bipolar forceps | Micromed | 148-100-011 | tip 0.25 mm |
| Polyimide tubes | River Tech Medical | 19-24 gauge | |
| 8.0 silk ligatures | Catgut | ||
| Custodiol HTK solution | Essential Pharmaceuticals |
References
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