Introduction
Den hjertetransplantasjon modellen er ofte brukt for å undersøke I / R-skade, allotransplantatawisning, etter transplantasjonen vaskulopati og effektiviteten av immunmodulerende midler. Musemodeller kombinere mange fordeler som kjent immunologiske og genetiske bakgrunn, tilgjengeligheten av mange innavlede og transgene stammer og relativt lave eksperimentelle kostnader.
I 1973 ble en teknikk for abdominal hjertetransplantasjon hos mus først beskrevet av Corry et al en. I denne modellen grafts er revascularized av ende-til-side anastomoser av stigende aorta til mottakerens abdominal aorta og i hovedlungearterien til vena cava inferior. I 1991 ble en sutur teknikk for livmorhalshjertetransplantasjon hos mus beskrevet av Chen et al 2. I denne modellen en retrograd koronar perfusjon er etablert av anastomose av mottakerens halspulsåren til de stigende aorta av grakterut. Den venøse blod avløp via den koronare sinus til høyre forkammer, høyre ventrikkel og utstøtes gjennom lunge-arterien inn i mottakerens ytre halsvene (figur 1). I forhold til mage pode implantasjon i livmor modellen er mindre invasiv og overfladisk plasseringen av graft muliggjør en meget enkel tilgjengelighet for flere oppfølgingsundersøkelser (f.eks palpasjon, ekkokardiografi, intra fluorescens mikroskopi) 3,4.
Til tross for tekniske forbedringer 5,6, har en mer utbredt bruk av denne modellen vært begrenset på grunn av tekniske vanskeligheter med å utføre suturerte anastomoser av små fartøy med høy forekomst av anastomose lekkasje og trombose. I 1991 Matsuura et al. innføres mansjetten teknikk hvor karveggen vrenges over en syntetisk sylinder, som i stor grad forenkler modell av cervikal hjertetransplantasjon 7. Teknikken var further vedtatt av ulike eksperimentelle transplantasjons modeller, inkludert renal 8, bukspyttkjertel 9, lem 10, lever 11,12, lunge 13,14 og vaskulær transplantasjon 15. I forhold til suturen teknikk den nødvendige tid for anastomoser, og således er den varme iskemi tiden kortere, og det er betydelig mindre vaskulære komplikasjoner ved hjelp av mansjetten 16 teknikk. Videre, det gir kirurger med lite trening i mikrokirurgi for å utføre operasjonen med en høy suksessrate. En ulempe med mansjetten teknikken er forutsetningen ligering av arteria carotis communis, som kan endre cerebral perfusjon.
I denne videoen artikkelen presenterer vi en forbedret og forenklet mansjett teknikk for livmorhalshjertetransplantasjon hos mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøkene ble godkjent av den tyske Heart Center München og regjeringen i Bayern, Tyskland (Gz. 55.2-1-54-2532.3-17-13). Dyr ble plassert i en bestemt patogen gratis anlegget og fikk menneskelig omsorg i samsvar med "Principles of Laboratory Animal Care" formulert av National Society for Medical Research og "Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr" levert av National Academy of Sciences og publisert av National Institutes of Health (NIH Publikasjon nr. 86-23, revidert 1985).
MERK: Et komplett sett med sterile mikrokirurgiske instrumenter, inkludert to buede tang og fartøy dilatators, er nødvendig for prosedyren (figur 2a). Perioperative antibiotikaprofylakse er ikke rutinemessig nødvendig, men kan være indisert hos immunsupprimerte dyr. Dyrene ble avlivet ved hjelp av terminal isofluran innånding.
Donor Forberedelse og Graft Harvests
<ol>2. Mottaker Forberedelse
- Forberedemansjettene for anastomoser ved å kutte polyimidet slangen med en nr 11 skalpell eller en saks under mikroskopet. Mansjetten består av et sylindrisk legeme og en utvidelse (1/3 av omkretsen) for plassering av den vaskulære klemmen, hver av en lengde på 1 mm (figur 2b).
- Bedøve dyret og bekrefter kirurgisk toleranse som beskrevet ovenfor. Injiser 0,25 ml varm saltoppløsning subkutant (sc) for væskeerstatning.
- Fjerne hår fra høyre nakken ved hjelp av en barbermaskin og plassere dyret i liggende stilling på en varm pad. Fest bena med tråder av tape mens du unngår overstretching front lemmer som dette kan kompromittere åndedrett. Dekker øynene bruker oftalmisk salve for å hindre tørrhet. Desinfisere operasjonsstedet tre ganger med klorheksidin.
- Lag en tverrgående snitt i huden fra høyre kjevevinkelen til vena hakk.
- Rett ut mobilisere external jugularvenen. Cauterize sidegreiner med en bipolar tang og transekt dem.
- Fordel den ytre halsvene mellom ligaturer på nivået av sammenløpet med venen fra submandibularis.
- Trekk den ytre halsvene inn i mansjetten og okkludere karet proksimalt ved å plassere en vaskulær klemme på forlengelsen av mansjetten. Fjern ligatur og vanne årehulrommet med 01:10 heparinisert saltvann.
- Evert åreveggen over mansjetten og fikse det med en forhåndsinnstilt periferiske 8-0 silke ligatur.
- Fjern den overfladiske delen av sternocleidomastoideus muskelen.
- Mobilisere retten felles halspulsåren og skjære over fartøy mellom ligaturer under carotis delinger.
- Trekk halspulsåren gjennom mansjetten og tilstoppe fartøyet proximally ved å plassere en Yasargil klemme på forlengelse av mansjetten. Fjern ligatur og vanne årehulrommet med 01:10 heparinisert saltvann.
- Forsiktig dilate den arterielle lumen med et fartøy dilatator, vrenge åreveggen over mansjetten og fikse det med en forhåndsinnstilt periferiske 8-0 silke ligatur.
- For å få nok plass til pode implantering, fjerne høyre flik av submandibularis.
- Hold operative feltet fuktig inntil implantasjon.
3. Graft Implantasjon
- Plasser transplantat i resipienten cervikale region opp ned med aorta orientert medialt og lungearterien sideveis.
- Trekk aorta av graftet over mansjetten med halspulsåren og sikre anastomose med en omkrets 8-0 silke ligatur.
- Incise lungebagasjerommet på sin fremre del og trekk den over mansjetten med ytre halsvenen. Igjen sikre anastomose med en omkrets 8-0 silke ligatur.
- Fjern klemmen på ytre halsvenen, som følge av unclamping av halspulsåren. Hjertene fyller straks med blod. Å forbedre reperfusion slippe 37 ° C varm saltoppløsning på transplantatet. Normalt hjerte utvikler sinusrytme innen ett minutt. Fjern mansjetten forlengelse på vene nettstedet.
- Sikre korrekt pode posisjon, må anastomoser være spenning-fri og fartøy uten torsjon. Ikke cauterized årene i huden siden dette kan svekke sårtilheling. Blødning vanligvis stopper spontant. Lukk huden med en enkel 8-0 kontinuerlig sutur.
4. Postoperativ Care
- Injisere 0,25 ml varmt saltvann sc for væskeerstatning.
- For å motvirke narkotiske injisere nalokson (1,2 mg / kg), flumazenil (0,5 mg / kg) og atipamezol (2,5 mg / kg kroppsvekt) sc Venstre dyret på den varme puten før den har gjenvant bevisstheten tilstrekkelig til å opprettholde sternal recumbency. Observere dyret i minst en ytterligere time for å registrere noen unormal oppførsel. Ikke returner et dyr som har gjennomgått kirurgi til selskap med andre dyr før fullt Recoverød.
- Gi fortrinns analgesi med buprenorfin (0,05 mg / kg sc tre ganger per dag) eller en alternativ analgetika henhold til en lokal institusjonelle protokoll for en minimum varighet på 72 timer etter inngrepet.
- Kirurg og en veterinær bør se dyr regelmessig. Ved vekttap> 15%, apati, hevelse eller kirurgisk side infeksjon dyr avlives ved hjelp av terminal isofluran innånding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vårt team kunne lykkes utføre den beskrevne teknikken etter ca 20 trenings operasjoner. Den mest krevende delen er å vrenge beholderveggen av halspulsåren over mansjetten, fordi den lett kan vippes tilbake, og flere forsøk kan føre til riving av veggen. Etter opplæringsperioden, gjennomsnittlig total operative tid var 60 ± 8 min. Rundt 20 min er nødvendig for donor innhøsting, 25 min for utarbeidelse av livmorhals fartøy og 15 minutter for anastomoser og huden nedleggelse.
For undersøkelse av hjerteinfarkt I / R-skade utførte vi over 200 operasjoner i syngenisk C57BL / 6 mus i ulike eksperimentelle innstillinger med et kirurgisk suksessrate på 92%. Tidlig død ble forårsaket av vanskeligheter med å gjennomføre de anastomoser (n = 3), anastomotisk lekkasje (n = 2) og sirkulatorisk svikt (n = 10). Ett dyr ble avlivet etter utvinning på grunn av nevrologisk svekkelse. Blant perioperative overlevende, graft overlevelse var> 95% ved7 dager (figur 4). En rekke syngeniske pode mottakere har blitt holdt i live i over tre måneder. Til tross for ikke å bruke antibiotikaprofylakse, fikk vi ikke observere noen infeksjonskomplikasjoner.
I en første serie ble 12 syngene C57BL / 6 mus transplantert for histopatologiske undersøkelser (figur 3). Grafts ble utsatt for fire timer med kald ischemi ved lagring på is ved 4 ° C før implantasjon. Transplantasjoner ble innhøstet etter 7 dager etter reperfusjon og farget i hematoxylin og eosin (H & E) og Sirius rød. Nontransplanted dyr (n = 6) fungerte som kontroller. I / R føre til en sterk betennelsesreaksjon med vev ødem, hyperemia, infiltrere leukocytter, microvascular okklusjon og interstitiell fibrose. I denne tidlige serien ett dyr døde etter en gjentatt injeksjon av ketamin / xylazin. Denne komplikasjon kan bli ytterligere unngås ved å bruke en fullt antagonizable anestesi inkludert midazolam, medetomodine og fentanyl. < / p>
Figur 1: (a) Skjematisk illustrasjon av Blood Flow i Heterotop Livmorhalshjertetransplantasjon. Blod fra mottakerens halspulsåren strømmer retrograd i oppstigende aorta og inn i koronararteriene til perfuse hjerte pode. De venøse blod renner inn i høyre forkammer via koronar sinus, fyller høyre ventrikkel og mates ut gjennom lungearterien inn mottakerens ytre halsvenen. Venstre ventrikkel er fullstendig forbigått. (B) Intraoperativ View of anastomoser. Den stigende aorta (2) er trukket over mansjetten med halspulsåren (en) og lunge stammen (3) over mansjetten med den ytre halsvene (4). På bildet vene anastomose ennå ikke var avsluttet.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: (a) Et komplett sett av sterile mikrokirurgiske instrumenter, inkludert to buede tang og to fartøy dilatators er nødvendig. (B) For anastomoser mansjetter fra 19-24 G med en forlengelse og mikrovaskulære klemmer blir brukt.
Figur 3: Histologisk Prøver Demonstrere Myocardial I / R-skade i syngene C57BL / 6 mus H & E farging (20X forstørrelse) av hjerter fra kontrolldyr (a) og fra dyrene etter 4 timer kald ischemi og 7 dager etter reperfusjon (b).. Langvarig I / R resulterte i en sterk inflammatorisk reaksjon med vev edema, hyperemia, infiltrere leukocytter og microvascular okklusjon. I det samme forsøks innstilling Sirius rød farging (40X forstørrelse) viser en markert interstitielt kollagen avsetning etter I / R (d) sammenlignet med kontrollgruppen (c).
Figur 4:. Cardiac Allograft Survival Kaplan-Meier plott som viser graft overlevelse i syngeniske C57BL / 6 mus. Dyr ware avlives på postoperativ dag 7 for histopatologisk undersøkelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har gjennomført over 200 hjertetransplantasjoner med en suksessrate over 90% i ulike eksperimentelle innstillinger. Med den teknikk som er beskrevet her, kan hele fremgangsmåten utføres i løpet av 60 minutter av en erfaren kirurg. Ved utarbeidelse av livmorhals fartøyene før organ innkjøp, kan total pode iskemi tid være begrenset til 20 min. Tid for implantasjon (varm iskemi tid) er betydelig kortere ved hjelp av mansjetten teknikk sammenlignet med sutur teknikk 16.
I stedet for bare excising hjertet som tidligere beskrevet 5,17, vi indusere hjertestans ved perfusert pode med en klinisk brukt kardioplegiske løsning og ved nedkjøling. Den crystalloid Custodiol HTK oppløsning inneholder 10 mmol / l kalium og lave konsentrasjoner av natrium, kalsium og magnesium, og effektivt arresterer hjertet. Den tilsetningsstoffer histidin, tryptofan og a-ketoglutarat redusere acidose, gi ATP og beskytter cellemembraner DUring iskemi. Dette ligner den kliniske tilstanden til en kontrollert hjertestans under åpen hjertekirurgi og gjør denne modellen ideell for etterforskning av hjerteinfarkt I / R-skade. Dessuten blir anvendelsen av farmakologiske midler i den kardioplegiske oppløsning ved begynnelsen av kald ischemi. Lagring av transplantater ved 0-4 ° C er mulig for maksimalt tidsintervall på 4 timer. En langvarig iskemi tid kan føre til hjerteinfarkt hypocontractility komplisert av overextension av de riktige hjertekamrene og blødning.
I vår erfaring, vil noen kritiske nøkkelpunkter lette vellykket revaskularisering. Ved fullstendig mobilisering av halspulsåren og bruken av en lav profil Yasargil klem Vassel maksimal lengde for anastomose kan bevares. Vasospasme kan unngås ved å slippe 1:10 fortynnet papaverin på arterien. For å unngå nevrologisk svekkelse halspulsåren blir legert under bifurcation å bevare sikkerhet sirkulasjon til t han arteria carotis interna. Årehulrommet er nøye utvidet med et fartøy dilatator med en superfin (0,2 mm) tips og samtidig unngå å rive av veggen. I vår erfaring plassering av holding sting som tidligere beskrevet 7 er ikke obligatorisk. Valg av mansjett størrelse er avgjørende for vellykket revaskularisering. Den indre diameter for mansjetten arteriell anastomose bør være noe større enn den ytre diameter av arteria carotis communis (250-300 um) for å ta hensyn til mistilpasning med den større oppstigende aorta for transplantatet. For mus som veier 20-25 g bruker mansjetter fra 22 til 24 G (innvendig mansjett diameter fra 0,510 til 0,643 mm) for halspulsåren og mansjetter fra 19 til 21 G (innvendig mansjett diameter fra 0,724 til 0,912 mm) for ytre halsvenen . Vi foretrekker polyfilament sutur materiale (silke) da dette letter knyting. Mikrovaskulær klemmen er plassert på forlengelsen av mansjetten. Dette immobiliserer fartøyet og letter vrenging av veggen.
ove_content "> må Hypotermi nøye unngås siden det forlenger utvinning og er en viktig årsak til perioperativ dødelighet. Antagonizable neuroleptanalgesia hjelp midazolam, medetomodine og fentanyl gir god kirurgisk toleranse og fester utvinning i forhold til ketamin / xylazin 18.Selv om cervical hjertetransplantasjonsmodell er en ikke-fysiologisk, ubelastet hjertemodell på grunn av den unike retningen på intrakardiale blodstrøm, er det et uunnværlig verktøy i eksperimentell hjertetransplantasjon. De tekniske detaljene som er vist i denne videoen papiret bør tillate forskere å etablere denne modellen relativt lett i sine laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps JFC-7.2 | S&T | P-00036 | Curved tip 0.20 mm |
| Vessel dilatator D-5a | S&T | S-00124 | |
| Adventita scissor | S&T | S-00102 | |
| Vascular clamp B-1V | S&T | S-00396 | |
| Yasargil Clip | Peter Lazic | 65,097 | 3.5 mm lenght |
| Bipolar forceps | Micromed | 148-100-011 | tip 0.25 mm |
| Polyimide tubes | River Tech Medical | 19-24 gauge | |
| 8.0 silk ligatures | Catgut | ||
| Custodiol HTK solution | Essential Pharmaceuticals |
References
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transplant Proc. 5, 733-735 (1973).
- Chen, Z. H. A technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice. Transplantation. 52, 1099-1101 (1991).
- Martins, P. N. Assessment of graft function in rodent models of heart transplantation. Microsurgery. 28, 565-570 (2008).
- Schramm, R., et al. The subepicardial microcirculation in heterotopically transplanted mouse hearts: an intravital multifluorescence microscopy study. J Thorac Cardiovasc Surg. 134, 210-217 (2007).
- Liu, F., Kang, S. M.
- Gong, W., et al. Introduction of modified cervical cardiac transplant model in mice. Exp Clin Transplant. 10, 158-162 (2012).
- Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. 51, 896-898 (1991).
- Chen, H., Zhang, Y., Zheng, D., Praseedom, R. K., Dong, J. Orthotopic kidney transplantation in mice: technique using cuff for renal vein anastomosis. PloS one. 8, e77278 (2013).
- Maglione, M., et al. A novel technique for heterotopic vascularized pancreas transplantation in mice to assess ischemia reperfusion injury and graft pancreatitis. Surgery. 141, 682-689 (2007).
- Sucher, R., et al.
- Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28, 47-50 (1979).
- Oldani, G., Lacotte, S., Morel, P., Mentha, G., Toso, C.
- Okazaki, M., et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 7, 1672-1679 (2007).
- Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation. J Vis Exp : JoVE. , (2012).
- Zou, Y., et al. Mouse model of venous bypass graft arteriosclerosis. Am J Pathol. 153, 1301-1310 (1998).
- Zhou, Y., Gu, X., Xiang, J., Qian, S., Chen, Z. A comparative study on suture versus cuff anastomosis in mouse cervical cardiac transplant. Exp Clin Transplant. 8, 245-249 (2010).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3000 operations by one surgeon. J Heart Lung Transplant. 20, 1123-1128 (2001).
- Arras, M., Autenried, P., Rettich, A., Spaeni, D., Rulicke, T. Optimization of intraperitoneal injection anesthesia in mice: drugs, dosages, adverse effects, and anesthesia depth. Comp Med. 51, 443-456 (2001).
