Introduction
El modelo de trasplante de corazón se utiliza con frecuencia para investigar I / R-lesión, rechazo de aloinjerto, vasculopatía post-trasplante y la eficiencia de los agentes inmunomoduladores. Los modelos de ratón se combinan muchas ventajas como el inmunológico conocido y antecedentes genéticos, la disponibilidad de muchas cepas puras y transgénicos y los costos experimentales relativamente bajos.
En 1973, una técnica de trasplante de corazón abdominal en ratones fue descrita por primera vez por Corry et al 1. En este modelo injertos se revascularizados antes de fin de a lado anastomosis de la aorta ascendente a la aorta abdominal del receptor y de la principal arteria pulmonar a la vena cava inferior. En 1991, una técnica de sutura para el trasplante de corazón cervical en ratones fue descrito por Chen et al 2. En este modelo una perfusión coronaria retrógrada se establece por la anastomosis de la arteria carótida del destinatario a la aorta ascendente del grpopa. Los drenajes de sangre venosa a través del seno coronario en la aurícula derecha, el ventrículo derecho y se expulsa a través de la arteria pulmonar en el receptor vena yugular externa (Figura 1). En comparación con la implantación del injerto abdominal el modelo de cuello uterino es menos invasiva y la localización superficial del injerto permite un acceso muy fácil para los exámenes de seguimiento adicionales (por ejemplo, la palpación, la ecocardiografía, la microscopía de fluorescencia intravital) 3,4.
A pesar de las mejoras técnicas 5,6, un uso más generalizado de este modelo ha sido limitado debido a dificultades técnicas para realizar las anastomosis suturadas de vasos pequeños con una alta incidencia de fugas de anastomosis y la trombosis. En 1991, Matsuura et al. introdujo la técnica de manguito en la que la pared del vaso es evertido sobre un cilindro sintético, que facilita en gran medida el modelo de trasplante de corazón 7 cervical. La técnica fue further adoptado para varios modelos experimentales de trasplante renal incluyendo 8, 9 de páncreas, la integridad física 10, 11,12 hepática, pulmonar 13,14 y el trasplante vascular 15. En comparación con la técnica de sutura el tiempo requerido para las anastomosis y, por lo tanto, el tiempo de isquemia caliente es más corta y hay complicaciones vasculares significativamente menos usando la técnica del manguito 16. Además, permite a los cirujanos con poca formación en microcirugía para realizar la operación con una alta tasa de éxito. Una desventaja de la técnica del manguito es el requisito previo de la ligadura de la arteria carótida común, que puede alterar la perfusión cerebral.
En este trabajo de vídeo presentamos una técnica de manguito mejorado y simplificado para el trasplante de corazón cervical en ratones.
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Protocol
Todos los experimentos fueron aprobados por el alemán Corazón Centro de Múnich y el Gobierno de Baviera, Alemania (Gz. 55.2-1-54-2532.3-17-13). Los animales fueron alojados en una instalación específica libre de patógenos y recibieron atención humana en el cumplimiento de los "Principios de Laboratorio Animal Care" formuladas por la Sociedad Nacional para la Investigación Médica y de la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio" proporcionada por la Academia Nacional de Ciencias y publicado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH Publication no. 86-23, revisado 1985).
NOTA: Un conjunto completo de instrumentos de microcirugía estériles, incluyendo dos pinzas curvas y dilatadores de los vasos, es necesario para el procedimiento (Figura 2a). La profilaxis antibiótica perioperatoria no es habitualmente necesaria, pero pueden estar indicados en animales inmunocomprometidos. Los animales fueron sacrificados por inhalación de isoflurano usando terminal.
Donantes de Preparación y la cosecha del injerto
<ol>2. Destinatario Preparación
- Prepararlos puños para anastomosis cortando el tubo de poliimida con un bisturí No. 11 o una tijera bajo el microscopio. El manguito se compone de un cuerpo cilíndrico y una extensión (1/3 de la circunferencia) para la colocación de la pinza vascular, cada uno de una longitud de 1 mm (figura 2b).
- Anestesiar al animal y de confirmar la tolerancia quirúrgica como se describe anteriormente. Inyectar 0,25 ml de solución salina caliente por vía subcutánea (sc) para la reposición de líquidos.
- Quite el pelo de la región cervical derecha usando una máquina de afeitar eléctrica y coloque el animal en posición supina sobre una almohadilla caliente. Asegure las piernas con hebras de cinta evitando estiramiento excesivo de las extremidades anteriores, ya que puede comprometer la respiración. Cubra los ojos utilizando pomada oftálmica para evitar la sequedad. Desinfectar el sitio quirúrgico tres veces con clorhexidina.
- Hacer una incisión cutánea transversal desde el ángulo mandibular derecho a la muesca yugular.
- Sin rodeos movilizar a la extvena yugular ernal. Cauterizar ramas laterales con unas pinzas bipolares y seccionar ellos.
- Divida la vena yugular externa entre ligaduras en el nivel de la confluencia con la vena de la glándula submandibular.
- Tire de la vena yugular externa a través del manguito y ocluir el vaso proximal mediante la colocación de una pinza vascular en la extensión del manguito. Retire la abrazadera y el riego de la luz del vaso con solución salina heparinizada 01:10.
- Evert la pared del vaso sobre el manguito y fijarlo con una circunferencia 8-0 ligadura de seda preestablecido.
- Retire la parte superficial del músculo esternocleidomastoideo.
- Movilizar a la arteria carótida común derecha y seccionar el buque entre ligaduras por debajo de la bifurcación de la carótida.
- Tire de la arteria carótida a través del manguito y ocluir el vaso proximal mediante la colocación de una pinza Yasargil en la extensión del manguito. Retire la abrazadera y el riego de la luz del vaso con solución salina heparinizada 01:10.
- Suavemente dilate la luz arterial con un dilatador buque, Evert la pared del vaso sobre el manguito y arreglarlo con un circunferencial 8-0 ligadura de seda preestablecido.
- Para ganar espacio suficiente para la implantación del injerto, quitar el lóbulo derecho de la glándula submandibular.
- Mantenga el campo quirúrgico húmedo hasta la implantación.
3. Implantación del injerto
- Coloque el injerto en la región cervical receptor boca abajo con la aorta orientado medialmente y la arteria pulmonar lateralmente.
- Tire de la aorta del injerto sobre el brazalete con la arteria carótida y asegurar la anastomosis con una ligadura circunferencial 8-0 seda.
- Incisión en el tronco pulmonar en su cara anterior y tire de ella sobre el brazalete con la vena yugular externa. Una vez más asegurar la anastomosis con una ligadura circunferencial de 8-0 seda.
- Retire la abrazadera en la vena yugular externa, siguiendo por el desamarre de la arteria carótida. Los corazones se llena inmediatamente con sangre. Para mejorar reperfusion caer 37 ° C una solución salina caliente en el injerto. Normalmente, el corazón se desarrolla el ritmo sinusal en un minuto. Retire la extensión del manguito en el sitio venosa.
- Asegurar la posición correcta del injerto, anastomosis deben estar libre de tensiones y buques sin torsión. No vasos cauterizados de la piel ya que esto puede afectar la cicatrización de heridas. El sangrado generalmente se detiene espontáneamente. Cierre la piel con una sutura continua única de 8-0.
4. Cuidado posoperatorio
- Inyectar 0,25 ml cálida sc solución salina para la reposición de líquidos.
- Para antagonizar narcóticos inyectan naloxona (1,2 mg / kg), flumazenil (0,5 mg / kg) y atipamezol (2,5 mg / kg de peso corporal) sc Izquierda del animal en la almohadilla caliente hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. Observar al animal durante al menos una hora adicional para registrar cualquier comportamiento anormal. No devuelva un animal que se ha sometido a una cirugía para la compañía de otros animales hasta que esté completamente Recoverojo.
- Proporcionar analgesia preventiva con buprenorfina (0,05 mg / kg sc tres veces por día) o una analgesia alternativa de acuerdo con un protocolo institucional local para una duración mínima de 72 horas después del procedimiento.
- El cirujano y un veterinario deben ver a los animales con regularidad. En caso de pérdida de peso> 15%, la apatía, la hinchazón o animales de infección lado quirúrgicos son sacrificados mediante inhalación de isoflurano terminal.
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Representative Results
Nuestro equipo podría realizar con éxito la técnica descrita después de aproximadamente 20 cirugías de formación. La parte más difícil es eversión la pared vascular de la arteria carótida sobre el brazalete, ya que fácilmente voltea hacia atrás y múltiples intentos puede conducir a la rotura de la pared. Después del período de entrenamiento, el tiempo quirúrgico total media fue de 60 ± 8 min. Se requieren alrededor de 20 minutos para la cosecha de donantes, 25 min para la preparación de los vasos cervicales y 15 minutos para anastomosis y cierre de la piel.
Para la investigación de infarto de I / R lesión se realizaron más de 200 operaciones en singénica C57BL / 6 ratones en varios parámetros experimentales con una tasa de éxito quirúrgico del 92%. La muerte prematura fue causada por dificultades en la realización de las anastomosis (n = 3), la fuga anastomótica (n = 2) y la insuficiencia cardiopulmonar (n = 10). Un animal fue sacrificado después de la recuperación debido al deterioro neurológico. Entre los sobrevivientes perioperatorias, la supervivencia del injerto fue> 95% a7 días (Figura 4). Un número de destinatarios singeneicos injerto se han mantenido con vida durante más de 3 meses. A pesar de no uso de la profilaxis antibiótica, no observamos complicaciones infecciosas.
En una primera serie, 12 singénicos ratones C57BL / 6 fueron trasplantadas para los exámenes histopatológicos (Figura 3). Los injertos se expusieron a 4 h de isquemia fría por el almacenamiento en hielo a 4 ° C antes de la implantación. Los trasplantes se cosecharon después de 7 días de reperfusión y se tiñeron en hematoxilina y eosina (H & E) y Sirius rojo. Animales no trasplantados (n = 6) sirvieron como controles. I / R conducen a una fuerte reacción inflamatoria con edema tisular, hiperemia, leucocitos infiltrantes, la oclusión microvascular y una fibrosis intersticial. En esta serie de principios de un animal murió después de una inyección repetida de ketamina / xilazina. Esta complicación se podría evitar aún más mediante el uso de una anestesia totalmente antagonizable incluyendo midazolam, medetomodine y fentanilo. < / p>
Figura 1: (a) Ilustración esquemática del flujo sanguíneo en heterotópico cervical trasplante cardiaco. La sangre de los flujos de la arteria carótida del receptor retrógrada en la aorta ascendente y en las arterias coronarias para perfundir el injerto cardíaco. Los drenajes de sangre venosa en la aurícula derecha a través del seno coronario, llena el ventrículo derecho y se expulsa a través de la arteria pulmonar en la vena yugular externa del destinatario. El ventrículo izquierdo está completamente anulada. (B) intraoperatoria Vista de anastomosis. La aorta ascendente (2) se tira sobre el manguito con la arteria carótida (1) y el tronco pulmonar (3) sobre el manguito con la vena yugular externa (4). En la imagen aún no se había completado la anastomosis venosa.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: (a) Se necesita un conjunto completo de instrumentos de microcirugía estériles incluyendo dos pinzas curvas y dos dilatadores de los vasos. (B) Para la anastomosis puños de 19 a 24 g con una extensión y microvasculares abrazaderas se utilizan.
Figura 3: histológico Las muestras Demostración de miocardio I / R de la lesión en singénicos ratones C57BL / 6 H & E tinción (magnificación 20X) de los corazones de los animales de control (A) y de los animales después de 4 horas de isquemia fría y 7 días de reperfusión (b).. Yo prolongado / R dio lugar a una fuerte reacción inflamatoria con ed tejidoema, hiperemia, leucocitos infiltrantes y la oclusión microvascular. En el mismo ajuste experimental tinción con rojo Sirius (magnificación 40X) mostraron una marcada deposición de colágeno intersticial después de I / R (d) en comparación con el grupo control (c).
Figura 4:. Cardiaco aloinjerto de supervivencia de Kaplan-Meier que muestra la supervivencia del injerto en syngeneic ratones C57BL / 6. Animales mercancías de los sacrificados en el día postoperatorio 7 para su examen histopatológico.
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Discussion
Hemos completado más de 200 trasplantes cardíacos con una tasa de éxito superior al 90% en varios parámetros experimentales. Con la técnica descrita aquí, el procedimiento completo se puede hacer dentro de los 60 min por un cirujano experimentado. Mediante la preparación de los vasos cervicales antes de la obtención de órganos, el tiempo total de isquemia del injerto puede ser limitado a 20 min. Tiempo para la implantación (tiempo de isquemia caliente) es significativamente más corto usando la técnica del manguito en comparación con la técnica de sutura 16.
En lugar de simplemente ablación del corazón como se describió previamente 5,17, que inducen la detención cardiaca por perfusión del injerto con una solución cardiopléjica utilizado clínicamente y por la hipotermia. La solución cristaloide Custodiol HTK contiene bajas concentraciones de sodio, calcio y magnesio 10 mmol / l de potasio y, y las detenciones efectivamente el corazón. El aditivos histidina, triptófano y a-cetoglutarato reducir la acidosis, proporcionan ATP y protegen las membranas celulares duisquemia anillo. Esto se asemeja a la condición clínica de un paro cardíaco controlada durante la cirugía a corazón abierto y hace que este modelo ideal para la investigación de infarto de I / R de la lesión. Además, permite la aplicación de agentes farmacológicos dentro de la solución cardiopléjica al comienzo de la isquemia fría. Almacenamiento de los injertos a 0-4 ° C es posible para un intervalo de tiempo máximo de 4 hr. Un tiempo de isquemia prolongado puede conducir a hipocontractilidad miocardio complicado por extensión excesiva de las cavidades derechas y sangrado.
En nuestra experiencia, a pocos puntos clave críticos facilitarán revascularización exitosa. Por la movilización completa de la arteria carótida y el uso de un perfil Yasargil máximo abrazadera de longitud bajo Vassel para la anastomosis puede ser preservado. El vasoespasmo se puede evitar dejando caer 1:10 papaverina diluida sobre la arteria. Para evitar el deterioro neurológico la arteria carótida se liga por debajo de la bifurcación de preservar la circulación colateral a t que la arteria carótida interna. La luz del vaso es cuidadosamente dilatadas con un dilatador buque con un superfino (0,2 mm) de punta y evitar el desgarro de la pared. En nuestra experiencia la colocación de suturas que sostienen a lo descrito previamente 7 no es obligatorio. La selección del tamaño del manguito es crucial para la revascularización exitosa. El diámetro del manguito interior para anastomosis arterial debe ser algo mayor que el diámetro exterior de la arteria carótida común (250-300 micras) para dar cuenta de la falta de correspondencia con el mayor aorta ascendente del injerto. Para los ratones que pesan 20-25 g puños de uso de 22 a 24 G (dentro diámetro del manguito de 0.510 a 0.643 mm) para la arteria carótida y puños de 19 a 21 G (dentro diámetro del manguito de 0.724 a 0.912 mm) para la vena yugular externa . Preferimos material de sutura multifilamento (seda) ya que esto facilita anudado. La pinza microvascular se coloca en la extensión del manguito. Esta inmoviliza el recipiente y facilita la eversión de la pared.
ove_content "> hipotermia debe evitarse cuidadosamente ya que prolonga la recuperación y es una causa importante de mortalidad perioperatoria. neuroleptanalgesia Antagonizable usando midazolam, medetomodine y fentanilo proporciona una buena tolerancia quirúrgica y abrocha recuperación en comparación con ketamina / xilazina 18.Aunque el modelo de trasplante de corazón cervical es un no-fisiológica, el modelo no cargado del corazón debido a la direccionalidad única de flujo sanguíneo intracardíaco, es una herramienta indispensable en el trasplante cardiaco experimental. Los detalles técnicos que se muestran en este trabajo de vídeo deben permitir las investigaciones para establecer este modelo relativamente fácil en sus laboratorios.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps JFC-7.2 | S&T | P-00036 | Curved tip 0.20 mm |
| Vessel dilatator D-5a | S&T | S-00124 | |
| Adventita scissor | S&T | S-00102 | |
| Vascular clamp B-1V | S&T | S-00396 | |
| Yasargil Clip | Peter Lazic | 65,097 | 3.5 mm lenght |
| Bipolar forceps | Micromed | 148-100-011 | tip 0.25 mm |
| Polyimide tubes | River Tech Medical | 19-24 gauge | |
| 8.0 silk ligatures | Catgut | ||
| Custodiol HTK solution | Essential Pharmaceuticals |
References
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