Introduction
Kalp nakli modeli sıkça I / R-yaralanma, allogreft reddini, nakil sonrası vaskülopatisinin ve imünmodüller ajanların etkinliğini araştırmak için kullanılır. Fare modelleri bilinen immünolojik ve genetik geçmişleri, birçok kendilenmiş ve transgenik suşları ve nispeten düşük maliyetlerle deneysel durumu gibi birçok avantaj birleştirir.
1973 yılında, farelerde abdominal Kalp nakli bir teknik ilk Corry ark 1 tarafından tarif edilmiştir. Bu modelde greftler alıcının abdominal aorta ve vena kava inferior ana pulmoner arter çıkan aort uç-yan anastomoz ile revaskülarize edilmektedir. 1991 yılında, farelerde rahim kalp transplantasyonu için olan bir dikiş tekniği Chen ve ark 2 tarafından tarif edilmiştir. Bu modelde bir retrograd koroner arter perfüzyon gr çıkan aorta alıcının karotis arter anastomoz tarafından kurulanKıç. Venöz kan sağ atriuma, sağ ventrikül içine koroner sinüs yoluyla drene ve alıcı dış şahdamarından (Şekil 1) içine pulmoner arter yoluyla atılır. Karın greft implantasyonu ile karşılaştırıldığında servikal modeli daha az invaziv ve greft yüzeysel konumu ek izlem muayeneleri (örn palpasyon, ekokardiyografi, intravital floresan mikroskopi) 3,4 için çok kolay erişilebilirlik sağlar.
Teknik gelişmelere 5,6 olmasına rağmen, bu modelin daha yaygın kullanımı anastomoz kaçağı ve tromboz insidansının yüksek olan küçük damarların dikilir anastomoz gerçekleştirmek için teknik zorluklar nedeniyle sınırlı kalmıştır. 1991 yılında, Matsuura ve ark. damar duvarı büyük ölçüde servikal Kalp nakli 7 modelini kolaylaştıran bir sentetik silindir, üzerinde dışa dönük olduğu kaf tekniğini tanıttı. Tekniği fu oldurther renal 8, pankreas 9, bacak 10, hepatik 11,12, 13,14 akciğer ve damar nakli 15 de dahil olmak üzere çeşitli deneysel modeller için transplant kabul etmiştir. Dikiş tekniği ile karşılaştırıldığında gereken anastomozlar için zaman ve böylece sıcak iskemi süresi kısadır ve içinde manşet tekniği kullanılarak 16 daha az vasküler komplikasyonları vardır. Ayrıca, yüksek başarı oranı ile işlemi gerçekleştirmek için mikrocerrahi az eğitim ile cerrahlar sağlar. Manşet tekniğinin bir dezavantajı serebral perfüzyon değiştirebilir karotis arter, bir önkoşul ligasyonu olduğunu.
Bu videoyu yazıda farelerde servikal Kalp nakli için geliştirilmiş ve basitleştirilmiş manşet tekniği sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bütün deneyler Alman Kalp Merkezi Münih ve Bavyera, Almanya (Gz. 55.2-1-54-2532.3-17-13) Hükümeti tarafından kabul edildi. Hayvanlar belli bir patojen serbest tesis içinde yer ve Tıbbi Araştırmalar Ulusal Derneği ve Ulusal Bilimler Akademisi tarafından verilen "Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu" ile formüle "Laboratuar Hayvan Bakımı İlkeleri" ile uyumlu insan bakım alınmıştır Fen ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH Yayın no. 86-23, 1985 revize) tarafından yayınlandı.
NOT: İki kavisli bir forseps ve damar dilatatörler dahil steril mikrocerrahi aletlerin tam bir set, prosedür (Şekil 2a) için gereklidir. Perioperatif antibiyotik profilaksisi rutin gerekli değildir, ancak, bağışıklığı bozulmuş hayvanlarda endike olabilir. Hayvanlar, terminal izofluran inhalasyonu ile sakrifiye edildi.
Donör Hazırlama ve Aşı Hasat
<ol>2. Alıcı Hazırlık
- HazırlamakBir No. 11 neşter veya mikroskop altında bir makas ile polimid boru keserek anastomozlar için manşet. Manşet, bir silindirik gövde ve damar kelepçesi yerleştirilmesi için bir uzantı (çevresinin 1/3), 1 mm (Şekil 2b) bir uzunluğu, her oluşur.
- Hayvan anestezisi ve yukarıda tarif edildiği gibi, cerrahi tolerans teyit etmektedir. Sıvı replasmanı için 0.25 ml ılık tuzlu su solüsyonu subkutan (sc) enjekte edilir.
- Elektrikli tıraş makinesi kullanarak sağ servikal bölgenin saç çıkarın ve sıcak bir pad üzerinde bir yatar pozisyonda hayvan yerleştirin. Solunum tehlikeye sokabilir, bu kadar ön uzuvları gerilmeden kaçınarak bant ipliklerini bacakları sabitleyin. Kuruluğunu önlemek için oftalmik merhem kullanarak gözleri örtün. Cerrahi siteyi klorheksidin ile üç kez dezenfekte edin.
- Juguler çentik sağ mandibular açıdan enine deri kesi olun.
- Açık açık ext seferberernal juguler ven. Iki kutuplu bir forseps ile yan dalları cauterize ve bunları transect.
- Submandibuler bezden ven ile izdiham düzeyinde ligatures arasındaki dış juguler ven bölün.
- Manşet harici juguler ven çekin ve manşet uzantısı üzerinde bir damar kelepçe koyarak proksimale gemi tıkamak. Bitişik harfleri çıkarın ve 01:10 heparinli serum fizyolojik ile damar lümeni sulamak.
- Manşet üzerinde damar duvarını Evert ve önceden belirlenmiş bir çevresel 8-0 ipek ligatür ile sabitleyin.
- Sternocleidomastoid kasının yüzeysel kısmını çıkarın.
- Sağ karotis arter harekete geçirmek ve karotis bifurkasyonu altındaki ligatures arasındaki gemi transect.
- Manşet ile karotis arter çekin ve manşet uzantısı üzerinde bir Yaşargil kelepçe koyarak proksimale gemi tıkamak. Bitişik harfleri çıkarın ve 01:10 heparinli serum fizyolojik ile damar lümeni sulamak.
- Yavaşça dilate bir gemi dilatatörle arter lümen, manşet üzerinde damar duvarını tersine çevrilmesi ve önceden belirlenmiş bir çevresel 8-0 ipek ligatür ile sabitleyin.
- Greft implantasyonu için yeterli yer kazanmak için, submandibular bezin sağ lobunu çıkarın.
- Implantasyon kadar nemli ameliyat alanını tutun.
3. Greft İmplantasyonu
- Başaşağı medial odaklı aorta ve pulmoner arter yanal ile alıcı servikal bölgede greft yerleştirin.
- Karotis arter ile manşet üzerine greft aorta çekin ve çevresel 8-0 ipek ligatür ile anastomoz sabitleyin.
- Onun ön yönü üzerinde akciğer gövde insizyon ve dış juguler ven ile manşet üzerine çekin. Yine çevresel 8-0 ipek ligatür ile anastomoz sabitleyin.
- Karotid arter çözülmesini aşağıdaki dış juguler ven kelepçeyi çıkarın. Kalpler kanla hemen doldurur. R artırmak içineperfusion greft üzerine 37 ° C sıcak tuzlu su çözeltisi bırakın. Normalde kalp bir dakika içinde sinüs ritmi geliştirir. Venöz yerinde manşet uzantısını kaldırın.
- Doğru greft pozisyonunu sağlamak, anastomozlar torsiyon olmadan gerilimsiz ve damarları olmalıdır. Bu beri cilt koterize gemiler yara iyileşmesini bozabilir etmeyin. Kanama genellikle kendiliğinden durur. Tek bir 8-0 sürekli dikiş ile cilt kapatın.
4. Ameliyat Sonrası Bakım
- Sıvı replasmanı için 0.25 ml ılık tuzlu su solüsyonu sc enjekte edilir.
- Narkotik nalokson (1,2 mg / kg), flumazenil (0.5 mg / kg) ve sternal yatma muhafaza edilmesi için yeterli bilinci yerine kadar sıcak bir pedi üzerinde hayvan sol sc atipamezol (2,5 mg / kg vücut ağırlığı) enjekte antagonize etmek. Herhangi bir anormal davranış kaydetmek için en az bir saat daha hayvan gözlemleyin. Tamamen geri kazanılması kadar diğer hayvanların şirkete ameliyat geçirmiş bir hayvan iade etmeyinKırmızı.
- Buprenorfin ile önleyici analjezi sağlamak (0.05 mg / kg sc günde üç kez) ya da işlemden sonra 72 saat içinde minimum bir süre için yerel kurumsal protokole göre alternatif bir analjezi.
- Cerrah ve bir veteriner hayvanları düzenli olarak görmelisiniz. Kilo kaybı>% 15, halsizlik, şişme veya cerrahi yan enfeksiyon hayvanlar durumunda terminal izofluran inhalasyonu ile ötenazi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ekibimiz başarıyla yaklaşık 20 eğitim ameliyatlarından sonra açıklanan teknik gerçekleştirebilir. En zorlu kısmı kolayca geri çevirir ve çoklu girişimler duvarın yırtılmaya yol açabilir, çünkü manşet üzerinde karotis arter damar duvarını tersine çevrilmesi için olduğunu. Eğitim döneminden sonra, ortalama toplam ameliyat süresi 60 ± 8 dk idi. Yaklaşık 20 dakika donör hasat, servikal damarlar ve anastomoz ve cilt kapatılması için 15 dakika hazırlanması için 25 dakika gereklidir.
Miyokard I / R-Yaralanma soruşturma için biz% 92 cerrahi başarı oranı ile çeşitli deneysel ortamlarda singenik C57BL / 6 farelerinde 200 operasyonlar gerçekleştirildi. Erken ölüm anastomoz gerçekleştirmede güçlükler (n = 3), anastomoz kaçağı (n = 2) neden ve kardiyopulmoner yetmezlik (n = 10) oldu. Bir hayvan nedeniyle nörolojik bozulma İyileştikten sonra ötenazi edildi. Perioperatif ölüm arasında, greft sağkalım de>% 95 idi7 gün (Şekil 4). Singenik greft alıcı bir dizi 3 ay boyunca canlı tutuldu. Antibiyotik proşaksisi değil rağmen, herhangi bir enfeksiyöz komplikasyonları dikkat etmedi.
İlk seride, 12 singenik C57BL / 6 fareleri histopatolojik tetkikler (Şekil 3) için transplante edildi. Greftler, implantasyondan önce, 4 ° C 'de buz üzerinde muhafaza soğuk iskemi 4 saat için maruz bırakılmıştır. Nakli reperfüzyon 7 gün sonra hasat edilmiş ve hematoksilin ve eozin (H & E) ile Sirius kırmızısı ile boyanmış. Nontransplanted hayvanları (n = 6), kontrol olarak kullanıldı. Doku ödemi, hiperemi, sızan lökosit, mikrovasküler oklüzyon ve interstisyel fibrozis güçlü bir inflamatuar reaksiyona I / R kurşun. Bu erken seriye tek hayvan ketamin / ksilazin bir tekrarlanan enjeksiyon sonrası öldü. Bu komplikasyon daha midazolam, medetomodine ve fentanil içeren tam antagonizable anestezi kullanılarak önlenebilir. < / p>
Şekil 1: Heterotopik Servikal Kalp Nakli Kan Akımının (a) şematik İllüstrasyon. Alıcının karotid arter akışlarının kan kardiyak greft serpmek için çıkan aort içine ve koroner arterler içine retrograd. Koroner sinüs yoluyla sağ atriyuma venöz kan drene, sağ ventrikül doldurur ve alıcının dış juguler ven içine pulmoner arter yoluyla atılır. Sol ventrikül tamamen atlanır. (B) anastomoz intraoperatif Görünümü. Aorta (2) karotid arter (1) ve pulmoner gövde ile manşet üzerine çekilir (3) dış juguler ven ile manşet üzerinde (4). Resimde venöz anastomoz henüz tamamlanmış değil.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: (a) iki kavisli bir forseps ve iki gemi dilatatörler dahil steril mikrocerrahi aletleri tam bir set gereklidir. Bir uzantısı ve mikrovasküler kelepçeler ile 19-24 G anastomoz kolluklar için (b) kullanılmıştır.
Şekil 3: Miyokard g / singenik C57BL / 6 Farelerinde R yaralanma gösterilmesi Histolojik numuneler, H ve 4 saat soğuk iskemiden sonra kontrol hayvanlarında (a) ve hayvanlardan kalplerin E boyama (20X büyütme) ve reperfüzyonun 7 gün (b).. Uzun süreli I / R doku ed ile güçlü bir enflamatuar reaksiyon sonuçlandıema, hiperemi, sızan lökositler ve mikrovasküler oklüzyon. Aynı deney ayar için Sirius kırmızısı ile boyama (40X büyütmede) olarak İnterstisyel kolajen birikimini işaretlenmiş gösterdi sonra / kontrol grubunun (C) ile karşılaştırıldığında R (d).
Şekil 4:. Singeneik C57BL / 6 farelerinde greft sağ kalımı görüntüleyen Kardiyak Allogreft Survival Kaplan-Meier arsa. Hayvanlar histopatolojik inceleme için ameliyat sonrası 7. günde ötenazi ware.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz çeşitli deneysel ortamlarda% 90 üzerinde bir başarı oranı ile 200 kalp nakli tamamladık. Burada anlatılan teknik ile, tam bir prosedür, deneyimli bir cerrahın 60 dakika içinde yapılabilir. Organ ihale öncesi servikal damarları hazırlayarak toplam greft iskemi süresi 20 dakika ile sınırlı olabilir. Implantasyon (sıcak iskemi süresi) için zaman sütür tekniği 16 oranla manşet tekniği kullanılarak önemli ölçüde daha kısadır.
Bunun yerine sadece daha önce 5,17 açıklandığı gibi kalbi eksize nedeniyle, bir klinik olarak kullanılan kardiyoplejik çözeltisi ile ve hipotermi greft perfüzyon ile kardiyak arrest neden olur. Kristaloid Custodiol HTK solüsyonu 10 mmol / L potasyum ve sodyum, kalsiyum ve magnezyum düşük konsantrasyonlarda içerir ve etkili bir şekilde kalp tutukladı. Katkı maddeleri histidin, triptofan ve a-ketoglutarat, asidoz azaltır ATP sağlar ve hücre membranları du korumahalka iskemi. Bu açık kalp ameliyatı sırasında kontrollü bir kardiyak arrest klinik durumunu andırıyor ve miyokard I / R-yaralanma soruşturma bu model idealdir. Ayrıca, soğuk iskemi başında Kardiyoplejik çözüm içinde farmakolojik ajanların uygulama sağlar. 0-4 ° C 'de depolama greft 4 saatlik bir maksimum süre aralığı için mümkündür. Uzamış iskemi süresi sağ kalp boşluklarında ve kanama fazla uzaması ile komplike miyokard hypocontractility yol açabilir.
Bizim tecrübelerimize göre, birkaç kritik anahtar noktaları başarılı revaskülarizasyon kolaylaştıracaktır. Tam karotid arter mobilizasyonu ve anastomoz için düşük profilli Yaşargil kelepçe maksimum Vassel uzunluğu kullanılarak korunabilir. Vazospazm arter üzerine 1:10 seyreltilmiş papaverin bırakarak önlenebilir. Nörolojik bozukluklara önlemek için karotid arter t kollateral dolaşımı korumak için çatallanma altında bağlanır O internal karotis arter. Damar lümen dikkatlice duvarın yırtılmasını kaçınarak ince (0.2 mm) ucu ile bir gemi dilatatörle dilate. Bizim tecrübelerimize göre tutma sütür yerleştirme önceden 7 zorunlu değildir nitelendirdi. Manşet boyutu seçimi başarılı revaskülarizasyon için çok önemlidir. Arteriyel anastomoz için iç kaf çapı greft büyük çıkan aort ile uyumsuzluğu hesaba karotis arter (250-300 mikron) dış çapından biraz daha büyük olmalıdır. Dış şahdamarından için (0.724 den 0.912 mm manşet iç çapı) 19 ile 21 G karotis arter için (0.510 den 0.643 mm manşet iç çapı) 22 ila 24 G 20-25 gr ağırlığında kullanım manşetleri farelerde ve manşetleri için . Biz bu düğümlenmesi kolaylaştırır olarak polyfilament sütür materyali (ipek) tercih ederler. Mikrovasküler kelepçe manşet uzantısı üzerine yerleştirilir. Bu gemiyi hareketsiz ve duvarın dışa dönmeden kolaylaştırır.
o kurtarma uzatır ve perioperatif mortalitenin başlıca nedenidir çünkü "ove_content> Hipotermi dikkatle kaçınılmalıdır. Antagonizable Nöroleptanaljezi midazolam, medetomodine kullanarak ve fentanil ketamin / xylazine 18 oranla iyileşme iyi bir cerrahi tolerans sağlar ve hızlandırır.Servikal kalp nakli modeli olmayan bir fizyolojik olmayan yüklü kalp modeli nedeniyle intrakardiyak kan akışının eşsiz yönlülük olmakla birlikte, deneysel kalp nakli vazgeçilmez bir araçtır. Bu videoyu yazıda gösterilen teknik ayrıntılar araştırmalar kendi laboratuarlarında nispeten kolay bu modeli kurmak için izin vermelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps JFC-7.2 | S&T | P-00036 | Curved tip 0.20 mm |
| Vessel dilatator D-5a | S&T | S-00124 | |
| Adventita scissor | S&T | S-00102 | |
| Vascular clamp B-1V | S&T | S-00396 | |
| Yasargil Clip | Peter Lazic | 65,097 | 3.5 mm lenght |
| Bipolar forceps | Micromed | 148-100-011 | tip 0.25 mm |
| Polyimide tubes | River Tech Medical | 19-24 gauge | |
| 8.0 silk ligatures | Catgut | ||
| Custodiol HTK solution | Essential Pharmaceuticals |
References
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transplant Proc. 5, 733-735 (1973).
- Chen, Z. H. A technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice. Transplantation. 52, 1099-1101 (1991).
- Martins, P. N. Assessment of graft function in rodent models of heart transplantation. Microsurgery. 28, 565-570 (2008).
- Schramm, R., et al. The subepicardial microcirculation in heterotopically transplanted mouse hearts: an intravital multifluorescence microscopy study. J Thorac Cardiovasc Surg. 134, 210-217 (2007).
- Liu, F., Kang, S. M.
- Gong, W., et al. Introduction of modified cervical cardiac transplant model in mice. Exp Clin Transplant. 10, 158-162 (2012).
- Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. 51, 896-898 (1991).
- Chen, H., Zhang, Y., Zheng, D., Praseedom, R. K., Dong, J. Orthotopic kidney transplantation in mice: technique using cuff for renal vein anastomosis. PloS one. 8, e77278 (2013).
- Maglione, M., et al. A novel technique for heterotopic vascularized pancreas transplantation in mice to assess ischemia reperfusion injury and graft pancreatitis. Surgery. 141, 682-689 (2007).
- Sucher, R., et al.
- Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28, 47-50 (1979).
- Oldani, G., Lacotte, S., Morel, P., Mentha, G., Toso, C.
- Okazaki, M., et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 7, 1672-1679 (2007).
- Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation. J Vis Exp : JoVE. , (2012).
- Zou, Y., et al. Mouse model of venous bypass graft arteriosclerosis. Am J Pathol. 153, 1301-1310 (1998).
- Zhou, Y., Gu, X., Xiang, J., Qian, S., Chen, Z. A comparative study on suture versus cuff anastomosis in mouse cervical cardiac transplant. Exp Clin Transplant. 8, 245-249 (2010).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3000 operations by one surgeon. J Heart Lung Transplant. 20, 1123-1128 (2001).
- Arras, M., Autenried, P., Rettich, A., Spaeni, D., Rulicke, T. Optimization of intraperitoneal injection anesthesia in mice: drugs, dosages, adverse effects, and anesthesia depth. Comp Med. 51, 443-456 (2001).
