Introduction
在心脏移植模型经常用于研究I / R损伤，移植排斥反应，移植后血管病变和免疫调节剂的效率。小鼠模型结合许多优点，如公知的免疫学和遗传背景，许多近交和转基因品系和相对低的成本的实验的可用性。
1973年，腹部心脏移植小鼠的技术由科里等 [1]首次描述。在此模型中的移植物是由升主动脉到主肺动脉到下腔静脉的收信人的腹主动脉和的端 - 侧吻合术吻合血管。 1991年，宫颈心脏移植小鼠缝合技术由陈等人 2被描述。在此模型中一个逆行冠状动脉灌注由收件人的颈动脉的吻合建立到克的升主动脉船尾。经由冠状窦静脉血液排入右心房，右心室，并通过肺动脉到受体颈外静脉（图1）排出。相较于腹腔移植植入颈椎模型是创伤小，移植物的位置表浅能够很容易获得额外的随访检查（ 如触诊，超声心动图，活体荧光显微镜）3,4。
尽管技术改进5,6，更广泛地使用这种模式已被有限的，由于技术上的困难进行了小血管缝合吻合术吻合口瘘和血栓形成的高发期。 1991年，松浦晃一郎等人 。引入其中血管壁被外翻在一个合成柱面，大大方便了颈部心脏移植7的模型的袖口技术。该技术是福rther通过了各种实验移植模型，包括8肾，胰9，四肢10，11,12肝，肺13,14和血管移植15。相比于缝合技术吻合术的所需时间，因此，热缺血时间较短，有显著较少血管并发症使用袖套法16。此外，它使医生与显微稍加培训与成功率高执行该操作。袖带技术的缺点是在颈总动脉，这可能会改变脑灌注的前提结扎。
在这个视频文章中，我们介绍了宫颈心脏移植小鼠改进和简化套管法。
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Protocol
所有实验均批准了德国心脏中心慕尼黑和德国巴伐利亚州（GZ。55.2-1-54-2532.3-17-13）的政府。动物饲养在无特定病原体设施，并与“实验动物保健的原则”，由国家红会的医学研究和“指南实验动物的护理和使用”由美国国家科学院提供的配方获得人文关怀符合科学和美国国立卫生研究院（NIH公开号86-23，1985年修订）出版。
注：一套完整的无菌显微仪器，其中包括两个弯钳和血管扩张器，是必要的过程（ 图2a）。围手术期抗生素预防是不是经常必要的，但可能在免疫功能低下的动物来表示。使用终端异氟烷吸入处死动物。
供体的制备与移植收获
<OL>2.收件人准备
- 备通过切割聚酰亚胺管具有11号解剖刀或在显微镜下剪刀的袖口吻合。袖带包括一个圆柱体和一个延伸部分（圆周的1/3），用于安置所述血管夹，每1毫米（图2b）的长度的。
- 麻醉动物，并确认手术耐受如上所述。注入0.25毫升温生理盐水溶液皮下注射（SC）的补液。
- 卸下右颈部区域的使用的电动剃须刀的头发，然后将动物在一个温暖垫仰卧位置。固定双腿的胶带，同时避免过度拉伸的前肢，因为这会危及呼吸链。封面使用眼药膏，以防止干燥的眼睛。消毒手术部位三次洗必泰。
- 做一个横向皮肤切口从右侧下颌角到颈静脉切迹。
- 说白了动员分机ernal颈静脉。烧灼偏科用双极钳和横切它们。
- 划分结扎的颈外静脉与下颌下腺静脉汇合处的水平。
- 通过袖带拉颈外静脉，并通过将一血管钳上的袖带的延伸堵塞血管近侧。取出结扎和灌溉管腔1:10肝素生理盐水。
- 外翻血管壁在压脉袋和与预设的圆周8-0丝线结扎固定。
- 删除胸锁乳突肌的肤浅的一部分。
- 动员的右颈总动脉和横切下面颈动脉分叉连字之间的容器中。
- 通过袖带拉颈动脉和通过将Yasargil夹具上的袖带的延伸堵塞血管近侧。取出结扎和灌溉管腔1:10肝素生理盐水。
- 轻轻dilatE中的动脉管腔与血管扩张器，外翻血管壁在袖口和预设的圆周8-0丝线结扎固定。
- 为了获得足够的空间用于移植植入，取出颌下腺右叶。
- 保持术野湿润，待注入。
3.植骨
- 放置在收件人颈部接枝与指向内侧主动脉和肺动脉横向倒置。
- 拉移植物的主动脉在与该颈动脉的压脉袋，并固定吻合圆周8-0丝线结扎。
- 切开肺动脉干在其前方面和在与该外部颈静脉压脉袋拉出。再次确保吻合圆周8-0丝线结扎。
- 除去外部颈静脉夹具，通过松开所述颈动脉以下。心中有血立刻填补。提升自主eperfusion下降37℃温生理盐水溶液涂布到移植物。一般情况下，心脏的发展在一分钟内窦性心律。取出袖口延伸静脉部位。
- 确保正确的移植物的位置，吻合口必须是无张力和船只没有扭转。不要在皮肤，因为这烧灼血管可能影响伤口愈合。出血一般自动停止。关闭皮肤用一个8-0连续缝合。
4.术后护理
- 注入0.25毫升温暖的生理盐水SC补液。
- 为了对抗毒品注射纳洛酮（1.2毫克/千克），氟马西尼（0.5毫克/千克）和atipamezol（2.5毫克/千克体重）SC左动物的保暖垫，直到它已经恢复足够的意识，以保持胸骨斜卧。观察动物的至少一个附加小时到注册任何异常行为。不返回已经历手术给其他动物的公司，直到完全recove动物红色。
- 提供超前镇痛丁丙诺啡（0.05毫克/千克SC每天三次）或根据本地机构协议72小时的步骤后的最小持续时间的替代镇痛。
- 外科医生和一名兽医应定期看动物。如果体重下降> 15％，冷漠，肿胀或手术侧感染动物的使用终端异氟烷吸入安乐死。
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Representative Results
我们的团队经过大约20个训练手术能成功执行所描述的技术。最具挑战性的部分是外翻颈动脉上的压脉袋的血管壁，因为它很容易翻转回来，多次尝试可能导致撕裂壁。训练期间之后，平均总手术时间为60±8分钟。大约20分钟都需要捐助的收获，25分钟准备的颈部血管和15分钟吻合及皮肤缝合的。
心肌I / R损伤的调查，我们进行了200的操作在同系的C57BL / 6小鼠中各种实验设置与92％的手术的成功率。早期的死亡是难以执行吻合引起的（N = 3），吻合口瘘（2例）和心肺衰竭（N = 10）。一个动物复苏后安乐死，由于神经损伤。在围手术期的幸存者，移植物存活率为> 95％7天（ 图4）。许多同基因移植受者一直维持存活超过3个月。尽管没有使用抗生素预防，我们没有观察到任何感染性并发症。
在第一系列，12同系的C57BL / 6小鼠移植的组织病理学检查（ 图3）。植入前移植物暴露于4小时冷缺血的由存储在冰上于4℃。 7天后，再灌注移植收获和染色，HE染色（H＆E）和Sirius红。 Nontransplanted动物（N = 6）作为对照。 I / R导致与组织水肿，充血，白细胞浸润，微血管阻塞和间质纤维化强烈的炎症反应。在本月初系列重复注射氯胺酮/甲苯噻嗪后，一只动物死亡。这种并发症可以通过使用完全antagonizable麻醉包括咪达唑仑，medetomodine和芬太尼进一步避免。< / P>
图1：在颈椎异位心脏移植血流量（ 一 ）示意图。从收件人的颈动脉流动的血液逆行进入升主动脉并进入冠状动脉灌注心脏移植物。静脉血排入经由冠状窦的右心房，填充右心室，并通过肺动脉进入收件人的颈外静脉喷出。左心室被完全绕过。 （二）术中见吻合。升主动脉（2）被放到与颈内动脉（1）和肺动脉干袖带（3）在与该外部颈静脉压脉袋（4）。在图片中的静脉吻合尚未完成。JPG“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图2：（一 ）需要一套完整的无菌显微仪器包括二弯钳和两个血管扩张器中。 （b）对于从19-24ģ吻合箍带延长和微血管钳的使用。
图3：组织学样品展示心肌I / R损伤在同系C57BL / 6小鼠 H＆从控制动物（a）和动物后4小时冷缺血心E染色（20X放大倍率）和7天再灌注（B）。长期I / R导致与组织ED强烈的炎症反应EMA，充血，白细胞浸润和微血管阻塞。在相同的实验设置天狼猩红染色（40X放大倍率）显示明显间质胶原沉积I / R后（四 ）相对于对照组（c）。
图4：心脏移植存活的Kaplan-Meier曲线在同系C57BL / 6小鼠显示移植物的存活。动物安乐死洁具7进行组织病理学检查术后第二天。
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Discussion
我们已经完成了超过200个心脏移植，成功率为90％，在各种实验设置。与这里所描述的技术中，完整的程序，可在60分钟内由有经验的外科医生进行。由器官获取之前制备颈部血管，总接枝缺血时间可以限制到20分钟。时间用于植入（热缺血时间）是显著缩短使用袖套法相比，缝合技术16。
而不是简单地切除如前所述5,17的心脏，我们通过灌注移植与临床使用的心脏停搏液和低温导致心脏骤停。该晶体Custodiol HTK液含有10毫摩尔/升钾和低浓度的钠，钙和镁，以及有效地抓人心脏。添加剂组氨酸，色氨酸和α-酮戊二酸减少酸中毒，提供ATP和保护细胞膜杜环缺血。这类似于心脏直视手术过程中控制的心脏骤停的临床情况，使这款机型非常适合心肌I / R损伤的调查。而且，它允许在冷缺血的开始的心脏停搏液内应用的药物制剂。移植物在0-4℃下的存储，可以有4小时的最大时间间隔。长时间缺血时间可能会导致心肌hypocontractility通过右侧心脏腔出血过度扩张复杂。
根据我们的经验，有几个关键的关键点，将有利于成功的血运重建。通过颈动脉的完全调动和使用低轮廓Yasargil钳最大vassel长度吻合得以保存。血管痉挛，可避免通过删除一点10稀释罂粟碱到动脉。为了避免神经损伤颈动脉结扎分叉下方保留侧支循环到t他颈内动脉。血管腔仔细扩张与血管扩张器与超微（0.4 MM）提示，同时避免墙体撕裂。在我们的经验安置保持缝线如前所述7不是强制性的。袖带尺寸的选择对于成功的血运重建的关键。内箍直径为动脉吻合应稍大于颈总动脉（250-300微米）来计算与移植物的较大的升主动脉的失配的外径大。用于颈动脉从22至24克的小鼠体重20-25克使用箍（袖带内直径从0.510至0.643毫米）和袖口从19至21克（袖带内直径从0.724到0.912毫米），用于对外部颈静脉。我们宁愿polyfilament缝合材料（丝），因为这有利于打结。微血管钳放置在箍的扩展。此固定不变的容器中，并有利于壁的外翻。
ove_content“>低温必须小心地避免，因为它延长了恢复和是围手术期死亡率的一个主要原因。使用Antagonizable神经安定咪达唑仑，medetomodine和芬太尼相比氯胺酮/赛拉嗪18提供良好的手术公差和扣紧恢复。虽然颈心脏移植模型是一个非生理的，非装载心脏模型由于心内血流量的独特方向性，它是在实验性心脏移植中不可缺少的工具。在这个视频文章中的技术细节应该允许研究建立这个模型在他们的实验室比较容易。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps JFC-7.2 | S&T | P-00036 | Curved tip 0.20 mm |
| Vessel dilatator D-5a | S&T | S-00124 | |
| Adventita scissor | S&T | S-00102 | |
| Vascular clamp B-1V | S&T | S-00396 | |
| Yasargil Clip | Peter Lazic | 65,097 | 3.5 mm lenght |
| Bipolar forceps | Micromed | 148-100-011 | tip 0.25 mm |
| Polyimide tubes | River Tech Medical | 19-24 gauge | |
| 8.0 silk ligatures | Catgut | ||
| Custodiol HTK solution | Essential Pharmaceuticals |
References
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