Introduction
Hjertet transplantation modellen bruges ofte til at undersøge I / R-skade, allograftafstødning, efter transplantation vaskulopati og effektiviteten af immunmodulerende midler. Musemodeller kombinerer mange fordele som den kendte immunologiske og genetiske baggrunde, tilgængeligheden af mange indavlede og transgene stammer og relativt lave eksperimentelle omkostninger.
I 1973 blev en teknik af abdominal hjertetransplantation hos mus først beskrevet af Corry et al 1. I denne model podninger er revaskulariseret af end-to-side anastomoser af de opstigende aorta til modtagerens abdominale aorta og i de vigtigste lungepulsåren til vena cava inferior. I 1991 blev en sutur teknik til livmoderhalskræft hjertetransplantation i mus beskrevet af Chen et al 2. I denne model en retrograd koronararterie perfusion etableres ved anastomose af modtagerens halspulsåre til de opstigende aorta GRagter. Veneblodet afløb via koronar sinus ind i højre atrium, højre hjertekammer og udstødes gennem lungepulsåren i recipienten eksterne halsvene (figur 1). I sammenligning med den abdominale graft implantation cervikal model er mindre invasiv og overfladiske placering af implantatet giver en meget nem tilgængelighed for yderligere opfølgende undersøgelser (f.eks palpering, ekkokardiografi, intravital fluorescensmikroskopi) 3,4.
Trods tekniske forbedringer 5,6, har en mere udbredt anvendelse af denne model blevet begrænset på grund af tekniske vanskeligheder at udføre syet anastomoser af små fartøjer med en høj forekomst af anastomose lækage og trombose. I 1991 Matsuura et al. indført manchetten teknik, hvor karvæggen krænges over et syntetisk cylinder, hvilket i høj grad letter model af cervikal hjertetransplantation 7. Teknikken var further vedtaget for forskellige eksperimentelle transplanterede modeller, herunder renal 8, pancreas 9, led 10, hepatisk 11,12, lunge 13,14 og vaskulær transplantation 15. I sammenligning med suturen teknik krævede tid for anastomoser og dermed den varme iskæmi er kortere, og der er betydeligt mindre vaskulære komplikationer ved hjælp af manchetten teknik 16. Desuden giver kirurger med lidt træning i mikrokirurgi til at udføre operationen med en høj succesrate. En ulempe ved manchetten teknik er forudsætningen ligering af arteria carotis communis, hvilket kan ændre cerebral perfusion.
I denne video afhandling præsenterer vi en forbedret og forenklet manchet teknik til livmoderhalskræft hjertetransplantation i mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg blev godkendt af den tyske Heart Center Munich og regeringen i Bayern, Tyskland (Gz. 55.2-1-54-2532.3-17-13). Dyr blev opstaldet i en specifik patogen fri facilitet og fik menneskelig omsorg i overensstemmelse med "Principper for Laboratory Animal Care" formuleret af den nationale Selskab for Medicinsk Forskning og "Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr" leveres af National Academy of Sciences og udgivet af National Institutes of Health (NIH publikation nr. 86-23, revideret 1985).
BEMÆRK: Et komplet sæt af sterile mikrokirurgiske instrumenter, herunder to buede pincet og fartøj dilatators, er nødvendig for proceduren (figur 2a). Perioperative antibiotisk profylakse er ikke rutinemæssigt nødvendig, men kan være indiceret hos immunkompromitterede dyr. Dyr blev aflivet under anvendelse af terminal isofluran inhalering.
Donor Forberedelse og Graft Harvest
<ol>2. Modtager Forberedelse
- Forberedmanchetterne for anastomoser af polyimid slangen skæring med en nr 11 skalpel eller saks under mikroskopet. Manchetten består af et cylindrisk legeme og en udvidelse (1/3 af omkredsen) til placering af den vaskulære klemme, hver af en længde på 1 mm (figur 2b).
- Bedøver dyret og bekræft kirurgisk tolerance, som beskrevet ovenfor. Injicer 0,25 ml varm saltvandsopløsning subkutant (sc) for fluid udskiftning.
- Fjerne hår af retten cervikale region ved hjælp af en elektrisk barbermaskine og placere dyret i rygleje på en varm pad. Fastgør benene med strenge af tape samtidig undgå overstretching de forreste lemmer, da dette kan kompromittere respiration. Dække øjnene anvendelse af oftalmisk salve for at forhindre tørhed. Desinficer operationsstedet tre gange med klorhexidin.
- Lav en tværgående incision i huden fra højre kæbevinklen til jugularis hak.
- Ligeud mobilisere external halsvene. Cauterize sidegrene med et bipolære pincet og transektere dem.
- Opdele den eksterne halsvene mellem ligaturer på niveau med sammenløbet med vene fra submandibulære kirtel.
- Træk den eksterne halsvene gennem manchetten og okkludere karret proximalt ved at placere en vaskulær klemme om udvidelse af manchetten. Fjern ligaturen og overrisle karhulrummet med 01:10 hepariniseret saltvand.
- Krænge karvæggen over manchet og ordne det med en forudindstillet omkredsen 8-0 silke ligatur.
- Fjern den overfladiske del af musculus sternocleidomastoideus.
- Mobilisere rigtige fælles halspulsåren og transektere karret mellem ligaturer under carotis bifurkation.
- Træk halspulsåren gennem manchetten og okkludere karret proximalt ved at placere en Yasargil klemme om udvidelse af manchetten. Fjern ligaturen og overrisle karhulrummet med 01:10 hepariniseret saltvand.
- Forsigtigt dilate de arterielle lumen med et fartøj dilatator, krænge karvæggen over manchet og ordne det med en forudindstillet omkredsen 8-0 silke ligatur.
- For at få plads nok til graft implantation, fjerne det rigtige lap af submandibulære kirtel.
- Hold den operative felt fugtig indtil implantation.
3. Graft Implantation
- Placer implantatet i modtageren cervikale region hovedet med aorta orienteret medialt og lateralt lungepulsåren.
- Træk aorta af implantatet over manchetten med halspulsåren og fastgør anastomose med en rundtgående 8-0 silkeligatur.
- Incise det pulmonale stammen på forreste del og træk det over manchetten med den eksterne halsvene. Igen fastgøre anastomose med en rundtgående 8-0 silkeligatur.
- Fjern klemmen på eksterne halsvene, efterfulgt af frakobling af halspulsåren. Hjerterne fylder straks med blod. For at øge reperfusion drop 37 ° C varm saltvandsopløsning på transplantatet. Normalt hjertet udvikler sinusrytme inden for et minut. Fjern manchetten forlængelse ved den venøse site.
- Sørg korrekt graft position, skal anastomoser være uden spændinger og skibe uden vridning. Må ikke ætses fartøjer i huden, da dette kan forringe sårheling. Blødning normalt stopper spontant. Luk huden med en enkelt 8-0 kontinuerlig sutur.
4. Postoperativ pleje
- Injicer 0,25 ml varm saltvandsopløsning sc for væskeerstatning.
- At antagonisere narkotika injicere naloxon (1,2 mg / kg), flumazenil (0,5 mg / kg) og atipamezol (2,5 mg / kg legemsvægt) sc Venstre dyret på den varme pad, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje. Observere dyret i mindst én yderligere en time for at registrere en eventuel unormal adfærd. Må ikke returnere et dyr, der har gennemgået operation for at selskab med andre dyr, indtil fuldt Recoverød.
- Give forebyggende analgesi med buprenorphin (0,05 mg / kg sc tre gange om dagen) eller en alternativ analgesi ifølge en lokal institutionel protokol for en varighed på 72 timer minimum efter proceduren.
- Kirurgen og en dyrlæge bør se dyr regelmæssigt. I tilfælde af vægttab> 15%, apati, hævelse eller kirurgiske side infektion dyr aflives under anvendelse af terminal isofluran inhalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vores hold held kunne udføre den beskrevne teknik efter ca. 20 uddannelse operationer. Den mest udfordrende del er at krænge karvæggen af halspulsåren over manchetten, fordi det let vipper tilbage og flere forsøg kan føre til rivning af væggen. Efter praktikperioden er den gennemsnitlige totale operative tid var 60 ± 8 min. Der kræves omkring 20 min for donor høst, 25 min til udarbejdelse af de cervikale skibe og 15 minutter for anastomoser og hud lukning.
Til undersøgelse af myokardie I / R-skade udførte vi over 200 operationer i syngene C57BL / 6 mus i forskellige eksperimentelle indstillinger med en kirurgisk succesrate på 92%. Tidlige død var forårsaget af vanskeligheder med at udføre de anastomose (n = 3), anastomotisk lækage (n = 2) og hjerte-svigt (n = 10). Et dyr blev aflivet efter helbredelse på grund af neurologisk svækkelse. Blandt perioperative overlevende, transplantatoverlevelse var> 95% ved7 dage (figur 4). En række syngene graft modtagere er blevet holdt i live i over 3 måneder. Trods ikke bruger antibiotisk profylakse, vi ikke observere nogen infektiøse komplikationer.
I en første række blev 12 syngene C57BL / 6-mus transplanteret til histopatologiske undersøgelser (figur 3). Transplantater blev udsat for 4 timer af kold iskæmi ved opbevaring på is ved 4 ° C før implantation. Transplantationer blev høstet efter 7 dages reperfusion og farves i hematoxylin og eosin (H & E) og Sirius red. Nontransplanted dyr (n = 6) tjente som kontroller. I / R føre til en kraftig inflammatorisk reaktion med vævsødem, hyperæmi, infiltrerende leukocytter, mikrovaskulær okklusion og en interstitiel fibrose. I denne tidlige serie et dyr døde efter en gentagen injektion af ketamin / xylazin. Denne komplikation kan yderligere undgås ved hjælp af et fuldt antagonizable anæstesi herunder midazolam, medetomodine og fentanyl. < / p>
Figur 1: (a) Skematisk illustration af blodgennemstrømningen i Heterotop Livmoderhalskræft hjertetransplantation. Blod fra modtagerens carotis arterie strømme retrograd i opstigende aorta og ind i kranspulsårerne til perfundere hjertets graft. Veneblodet løber ud i højre atrium via koronar sinus, fylder den højre ventrikel og udstødes gennem lungepulsåren i modtagerens eksterne halsvene. Den venstre ventrikel er helt omgået. (B) Intraoperativ Udsigt anastomoser. Aorta ascendens (2) trækkes over manchetten med halspulsåren (1) og pulmonal stammen (3) over manchetten med den eksterne halsvene (4). På billedet den venøse anastomose endnu ikke var afsluttet.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: (a) Et komplet sæt af sterile mikrokirurgiske instrumenter, herunder to buede pincet og to fartøj dilatators er påkrævet. (B) For anastomoser manchetter fra 19-24 G med forlænger og mikrovaskulære klemmer bruges.
Figur 3: Histologisk Prøver Demonstration Myokardial I / R-skade i Syngene C57BL / 6-mus H & E-farvning (20X forstørrelse) af hjerter fra kontroldyr (a) og fra dyr efter 4 timer koldt iskæmi og 7 dage efter reperfusion (b).. Langvarig I / R resulterede i en kraftig inflammatorisk reaktion med vævet edema, hyperæmi, infiltrerende leukocytter og mikrovaskulære okklusion. I samme forsøgsopstilling Sirius rødfarvning (40X forstørrelse) viste markante interstitiel collagen deposition efter I / R (d) sammenlignet med kontrolgruppen (c).
Figur 4:. Cardiac allograftoverlevelse Kaplan-Meier plot viser transplantatoverlevelse i syngene C57BL / 6-mus. Dyr ware aflivet på postoperative dag 7 til histopatologisk undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har gennemført over 200 hjerte-transplantationer med en succesrate på over 90% i forskellige eksperimentelle indstillinger. Med teknikken beskrevet her, kan den fuldstændige procedure ske inden for 60 minutter af en erfaren kirurg. Ved udarbejdelsen af cervikale skibe før indkøb orgel, kan den samlede graft iskæmi tid være begrænset til 20 minutter. Tid til implantation (varm iskæmi tid) er væsentlig kortere hjælp af manchetten teknik i forhold til suturen teknik 16.
I stedet for blot at udskære hjertet som tidligere beskrevet 5,17, vi inducere hjertestop ved perfusion af transplantatet med en klinisk anvendt cardioplegisk opløsning og hypotermi. Den krystalloid Custodiol HTK opløsning indeholder 10 mmol / l kalium og lave koncentrationer af natrium, calcium og magnesium, og effektivt standser hjertet. Den tilsætningsstoffer histidin, tryptophan og a-ketoglutarat reducere acidose, giver ATP og beskytte cellemembranerne DUring iskæmi. Dette ligner den kliniske tilstand af et kontrolleret hjertestop under åben hjertekirurgi og gør denne model ideel til undersøgelse af myokardie I / R-skade. Desuden er det muligt anvendelse af farmakologiske midler inden for cardioplegisk opløsning ved begyndelsen af kold iskæmi. Lagring af transplantater ved 0-4 ° C er muligt for en maksimal tidsinterval på 4 timer. En forlænget iskæmi tid kan føre til myokardie hypokontraktilitet kompliceres af overextension de rigtige hjerte kamre og blødning.
Det er vores erfaring, vil et par kritiske nøgle-punkter lette vellykket revaskularisering. Ved fuldstændig mobilisering af halspulsåren og anvendelsen af en lav profil Yasargil maksimal clamp Vassel længde for anastomose kan bevares. Vasospasme kan undgås ved at droppe 1:10 fortyndet papaverin på arterien. For at undgå neurologisk svækkelse halspulsåren er ligeret under forgreningen til at bevare sikkerhedsstillelse cirkulation til t han arteria carotis interna. Karhulrummet er omhyggeligt udvidet med et fartøj dilatator med en superfin (0,2 mm) spids samtidig undgå rivning af væggen. Det er vores erfaring placering af holder suturer som tidligere beskrevet 7 er ikke obligatorisk. Udvælgelsen af manchet størrelse er afgørende for en vellykket revaskularisering. Den indvendige manchet diameter for arteriel anastomose bør være noget større end den udvendige diameter af den fælles carotidarterie (250-300 um) for at tage højde for mismatch med større opadgående aorta af implantatet. For mus, der vejer 20-25 g brug manchetter fra 22 til 24 G (inde manchet diameter fra 0.510 til 0,643 mm) til halspulsåren og manchetter fra 19 til 21 G (inde manchet diameter fra 0,724 til 0,912 mm) til den eksterne halsvene . Vi foretrækker polyfilament suturmateriale (silke), da dette letter knuder. Det mikrovaskulære klemme er placeret på en udvidelse af manchetten. Dette immobiliserer beholderen og letter udkrængning af væggen.
ove_content "> Hypotermi skal omhyggeligt undgås, da det forlænger nyttiggørelse og er en væsentlig årsag til perioperativ mortalitet. Antagonizable neuroleptanalgesia hjælp midazolam, medetomodine og fentanyl giver god kirurgisk tolerance og fæstner helbredelse sammenlignet med ketamin / xylazin 18.Selvom den cervikale hjertetransplantation model er en ikke-fysiologisk, ikke-loaded heart model grund af den unikke retningen af intrakardial blodgennemstrømning, det er et uundværligt værktøj i eksperimentel hjertetransplantation. De tekniske detaljer, der er vist i denne video papir bør tillade research til at etablere denne model relativt let i deres laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps JFC-7.2 | S&T | P-00036 | Curved tip 0.20 mm |
| Vessel dilatator D-5a | S&T | S-00124 | |
| Adventita scissor | S&T | S-00102 | |
| Vascular clamp B-1V | S&T | S-00396 | |
| Yasargil Clip | Peter Lazic | 65,097 | 3.5 mm lenght |
| Bipolar forceps | Micromed | 148-100-011 | tip 0.25 mm |
| Polyimide tubes | River Tech Medical | 19-24 gauge | |
| 8.0 silk ligatures | Catgut | ||
| Custodiol HTK solution | Essential Pharmaceuticals |
References
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transplant Proc. 5, 733-735 (1973).
- Chen, Z. H. A technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice. Transplantation. 52, 1099-1101 (1991).
- Martins, P. N. Assessment of graft function in rodent models of heart transplantation. Microsurgery. 28, 565-570 (2008).
- Schramm, R., et al. The subepicardial microcirculation in heterotopically transplanted mouse hearts: an intravital multifluorescence microscopy study. J Thorac Cardiovasc Surg. 134, 210-217 (2007).
- Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. J Vis Exp : JoVE. 238, (2007).
- Gong, W., et al. Introduction of modified cervical cardiac transplant model in mice. Exp Clin Transplant. 10, 158-162 (2012).
- Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. 51, 896-898 (1991).
- Chen, H., Zhang, Y., Zheng, D., Praseedom, R. K., Dong, J. Orthotopic kidney transplantation in mice: technique using cuff for renal vein anastomosis. PloS one. 8, e77278 (2013).
- Maglione, M., et al. A novel technique for heterotopic vascularized pancreas transplantation in mice to assess ischemia reperfusion injury and graft pancreatitis. Surgery. 141, 682-689 (2007).
- Sucher, R., et al. Orthotopic hind-limb transplantation in rats. J Vis Exp : JoVE. , (2010).
- Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28, 47-50 (1979).
- Oldani, G., Lacotte, S., Morel, P., Mentha, G., Toso, C. Orthotopic liver transplantation in rats. J Vis Exp : JoVE. , (2012).
- Okazaki, M., et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 7, 1672-1679 (2007).
- Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation. J Vis Exp : JoVE. , (2012).
- Zou, Y., et al. Mouse model of venous bypass graft arteriosclerosis. Am J Pathol. 153, 1301-1310 (1998).
- Zhou, Y., Gu, X., Xiang, J., Qian, S., Chen, Z. A comparative study on suture versus cuff anastomosis in mouse cervical cardiac transplant. Exp Clin Transplant. 8, 245-249 (2010).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3000 operations by one surgeon. J Heart Lung Transplant. 20, 1123-1128 (2001).
- Arras, M., Autenried, P., Rettich, A., Spaeni, D., Rulicke, T. Optimization of intraperitoneal injection anesthesia in mice: drugs, dosages, adverse effects, and anesthesia depth. Comp Med. 51, 443-456 (2001).
