Introduction
Il modello di trapianto di cuore è spesso utilizzato per studiare / R-infortunio io, rigetto post-trapianto vasculopatia e l'efficienza degli agenti immunomodulatori. Modelli murini uniscono numerosi vantaggi come la immunologico noto e background genetico, la disponibilità di molti ceppi inbred e transgenici e relativamente bassi costi sperimentali.
Nel 1973, una tecnica di trapianto di cuore addominale nei topi è stato descritto da Corry et al 1. In questo modello innesti vengono rivascolarizzati entro end-to-side anastomosi dell'aorta ascendente alla aorta addominale del destinatario e della principale arteria polmonare per la vena cava inferiore. Nel 1991, una tecnica di sutura per il trapianto di cuore cervicale nei topi è stato descritto da Chen ed altri 2. In questo modello un retrogrado perfusione coronarica è stabilito da anastomosi della carotide del destinatario per l'aorta ascendente del grpoppa. Gli scarichi sangue venoso attraverso il seno coronarico nell'atrio destro, il ventricolo destro e viene espulso attraverso l'arteria polmonare nel ricevente vena giugulare esterna (Figura 1). In confronto al trapianto di impianto addominale il modello cervicale è meno invasiva e la posizione superficiale del trapianto permette un'accessibilità molto facile per gli esami di follow-up aggiuntivi (ad esempio, la palpazione, l'ecocardiografia, la microscopia a fluorescenza intravitale) 3,4.
Nonostante i miglioramenti tecnici 5,6, un uso più diffuso di questo modello è stato limitato a causa di difficoltà tecniche per eseguire anastomosi suturati dei piccoli vasi con un elevata incidenza delle perdite anastomosi e trombosi. Nel 1991, Matsuura et al. introdotto la tecnica bracciale in cui la parete del vaso è estroflesso su un cilindro sintetico, che facilita notevolmente il modello di trapianto di cuore cervicale 7. La tecnica era Further adottato per vari modelli sperimentali di trapianto renale, tra cui 8, 9 del pancreas, degli arti 10, epatica 11,12, 13,14 e trapianto polmonare vascolare 15. Rispetto alla tecnica di sutura il tempo richiesto per anastomosi e, quindi, il tempo di ischemia calda è più breve e ci sono complicazioni vascolari significativamente meno con la tecnica bracciale 16. Inoltre, esso consente al chirurgo con formazione minima in microchirurgia per eseguire l'operazione con un alto tasso di successo. Uno svantaggio di questa tecnica è il bracciale legatura prerequisito della carotide comune, che possono alterare la perfusione cerebrale.
In questo articolo il video vi presentiamo una tecnica bracciale migliorato e semplificato per il trapianto di cuore cervicale nei topi.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal tedesco Heart Center di Monaco di Baviera e il governo della Baviera, Germania (Gz. 55.2-1-54-2532.3-17-13). Gli animali sono stati alloggiati in una specifica struttura gratuito patogeno e hanno ricevuto assistenza umana in conformità ai "Principi di laboratorio cura degli animali" formulate dalla Società Nazionale per la ricerca medica e la "Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio" fornita dalla National Academy di Scienze e pubblicato dal National Institutes of Health (NIH pubblicazione n. 86-23, rivisto 1985).
NOTA: Un set completo di strumenti di microchirurgia sterili, tra cui due pinze curve e dilatatori nave, è necessario per la procedura (Figura 2a). La profilassi antibiotica perioperatoria non è di routine necessario ma può essere indicato in animali immunocompromessi. Gli animali sono stati sacrificati con il morsetto inalazione isoflurano.
Donatori Preparazione e Graft Harvest
<ol>2. Destinatario Preparazione
- Prepararepolsini per anastomosi tagliando il tubo poliimmide con un bisturi No. 11 o una forbice sotto il microscopio. Il bracciale è costituito da un corpo cilindrico ed una estensione (1/3 della circonferenza) per il posizionamento della pinza vascolare, ciascuna di una lunghezza di 1 mm (Figura 2b).
- Anestetizzare l'animale e confermare la tolleranza chirurgica come descritto sopra. Iniettare 0,25 ml di soluzione salina calda per via sottocutanea (sc) per la sostituzione del fluido.
- Rimuovere i capelli della regione cervicale destra con un rasoio elettrico e posto l'animale in posizione supina su un tappetino caldo. Fissare le gambe con fili di nastro adesivo, evitando pressioni eccessive gli arti anteriori come questo può compromettere la respirazione. Coprire gli occhi con pomata oftalmica per prevenire la secchezza. Disinfettare il sito chirurgico tre volte con clorexidina.
- Fare un incisione cutanea trasversale dall'angolo mandibolare diritto alla tacca giugulare.
- Senza mezzi termini mobilitare il external vena giugulare. Cauterize rami laterali con una pinza bipolare e transetto.
- Dividere la vena giugulare esterna tra legature a livello della confluenza con la vena dalla ghiandola sottomandibolare.
- Estrarre la vena giugulare esterna attraverso il bracciale e occludere il vaso prossimalmente posizionando un morsetto vascolare sull'estensione del bracciale. Togliere la legatura ed irrigare il lume del vaso con soluzione salina eparinizzata 01:10.
- Evert la parete del vaso sopra il bracciale e fissarlo con un preset circonferenziale 8-0 legatura di seta.
- Togliere la parte superficiale del muscolo sternocleidomastoideo.
- Mobilitare il diritto carotide comune e transetto della nave tra le legature di sotto della biforcazione carotidea.
- Estrarre carotide attraverso il bracciale e occludere il vaso prossimalmente posizionando un morsetto Yasargil sull'estensione del bracciale. Togliere la legatura ed irrigare il lume del vaso con soluzione salina eparinizzata 01:10.
- Delicatamente Dilate il lume arterioso con un dilatatore vaso, Evert la parete del vaso sopra il bracciale e risolvere il problema con un preset circonferenziale 8-0 legatura di seta.
- Per guadagnare spazio sufficiente per innesto impianto, rimuovere il lobo destro della ghiandola sottomandibolare.
- Mantenere il campo operatorio umido finché l'impianto.
3. Graft impianto
- Posizionare l'innesto nella regione cervicale destinatario testa in giù con l'aorta orientato medialmente e l'arteria polmonare lateralmente.
- Estrarre l'aorta dell'innesto sul bracciale con la carotide e fissare la anastomosi con una legatura circonferenziale 8-0 seta.
- Incidere il tronco polmonare sul suo aspetto anteriore e tirarlo sopra il bracciale con la vena giugulare esterna. Anche in questo caso garantire l'anastomosi con una legatura circonferenziale 8-0 seta.
- Rimuovere la fascetta sulla vena giugulare esterna, seguendo dal sbloccaggio della carotide. I cuori riempie immediatamente con il sangue. Per migliorare reperfusion goccia 37 ° C soluzione salina calda sul trapianto. Normalmente il cuore si sviluppa ritmo sinusale entro un minuto. Rimuovere l'estensione bracciale al sito venoso.
- Garantire la posizione dell'innesto corretta, anastomosi devono essere privi di tensione e di navi senza torsione. Non vasi cauterizzata della pelle in quanto ciò può compromettere la guarigione della ferita. Il sanguinamento di solito si arresta spontaneamente. Chiudere la pelle con un solo 8-0 continuo di sutura.
4. Cura postoperatoria
- Iniettare 0,25 ml soluzione salina calda sc per la sostituzione del fluido.
- Inimicarsi narcotici iniettare naloxone (1,2 mg / kg), flumazenil (0,5 mg / kg) e atipamezol (2,5 mg / kg di peso corporeo) sc sinistra l'animale sul pad caldo fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Osservare l'animale per almeno un'ora aggiuntiva di registrare un comportamento anomalo. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino al completo Recoverosso.
- Fornire preemptive analgesia con buprenorfina (0,05 mg / kg sc tre volte al giorno) o un'analgesia alternativa secondo un protocollo istituzionale locale per una durata minima di 72 ore dopo la procedura.
- Il chirurgo e un veterinario dovrebbe vedere regolarmente animali. In caso di perdita di peso> 15%, apatia, gonfiore o chirurgiche animali di infezione lato sono eutanasia con il morsetto inalazione isoflurano.
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Representative Results
La nostra squadra ha potuto svolgere con successo la tecnica descritta dopo circa 20 interventi chirurgici di formazione. La parte più difficile è per rovesciare la parete del vaso della carotide sul bracciale, perché gira facilmente avanti e tentativi multipli può portare alla lacerazione della parete. Dopo il periodo di formazione, il tempo operatorio totale media era di 60 ± 8 min. Circa 20 minuti sono necessari per la raccolta dei donatori, 25 minuti per la preparazione dei vasi cervicali e 15 minuti per anastomosi e la chiusura della pelle.
Per le indagini di infarto I / R-infortunio abbiamo effettuato oltre 200 operazioni in singenici C57BL / 6 topi in diverse impostazioni sperimentali con un tasso di successo del 92% chirurgica. Morte precoce è stata causata dalle difficoltà nell'eseguire le anastomosi (n = 3), perdite anastomotica (n = 2) e insufficienza cardiopolmonare (n = 10). Un animale è eutanasia dopo il recupero a causa di danno neurologico. Tra i sopravvissuti perioperatorie, la sopravvivenza del trapianto è> 95% a7 giorni (figura 4). Un certo numero di destinatari innesto singenici sono stati tenuti in vita per più di 3 mesi. Pur non usando la profilassi antibiotica, non abbiamo osservato alcun complicanze infettive.
In una prima serie, 12 singenici topi C57BL / 6 sono stati trapiantati per esami istopatologici (Figura 3). Innesti sono stati esposti a 4 ore di ischemia freddo memorizzazione su ghiaccio a 4 ° C prima dell'impianto. Trapianti sono state raccolte dopo 7 giorni di riperfusione e colorate in ematossilina eosina (H & E) e Sirius rosso. Animali Nontransplanted (n = 6) sono serviti da controllo. I / R portare ad una forte reazione infiammatoria con edema dei tessuti, iperemia, leucociti infiltranti, microvascolare occlusione e una fibrosi interstiziale. In questa prima serie di un animale è morto dopo una iniezione ripetuta di ketamina / xylazina. Questa complicanza potrebbe essere ulteriormente evitato utilizzando un'anestesia completamente antagonizable compreso midazolam, medetomodine e fentanil. < / p>
Figura 1: (a) Illustrazione schematica del flusso di sangue nel eterotopica cervicale trapianto cardiaco. Il sangue dai flussi carotide del destinatario retrogrado nell'aorta ascendente e nelle arterie coronarie per perfusione l'innesto cardiaco. Gli scarichi di sangue venoso in atrio destro attraverso il seno coronarico, riempie il ventricolo destro e viene espulsa attraverso l'arteria polmonare nella vena giugulare esterna del destinatario. Il ventricolo sinistro è completamente bypassato. (B) intraoperatoria Veduta di anastomosi. L'aorta ascendente (2) viene tirato sopra la cuffia con l'arteria carotidea (1) e il tronco polmonare (3) sopra la cuffia con la vena giugulare esterna (4). Nella foto l'anastomosi venosa non era ancora stata completata.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: (a) è necessaria una serie completa di strumenti di microchirurgia sterili tra cui due pinze curve e due dilatatori nave. (B) Per anastomosi polsini da 19-24 G con un'estensione e microvascolari morsetti sono utilizzati.
Figura 3: istologica Campioni Dimostrazione miocardico I / R-infortunio in singenici C57BL / 6 topi colorazione H & E (20X ingrandimenti) dei cuori di animali di controllo (a) e da animali dopo 4 ore di ischemia fredda e 7 giorni di riperfusione (b).. I prolungata / R ha provocato una forte reazione infiammatoria con ndr tessutoema, iperemia, infiltrazione leucociti e microvascolare occlusione. Nella stessa impostazione sperimentale Sirius colorazione rosso (40X di ingrandimento) ha mostrato segnato interstiziale deposizione di collagene dopo I / R (d) rispetto al gruppo di controllo (c).
Figura 4:. Cardiaca Alloinnesto di sopravvivenza di Kaplan-Meier visualizzazione sopravvivenza del trapianto in singenici C57BL / 6 topi. Animali ware eutanasia in giornata postoperatoria 7 per l'esame istopatologico.
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Discussion
Abbiamo completato oltre 200 trapianti cardiaci con una percentuale di successo superiore al 90% in diversi contesti sperimentali. Con la tecnica qui descritta, la procedura completa può essere eseguita entro 60 minuti da un chirurgo esperto. Preparando i vasi cervicali prima reperimento di organi, il tempo totale ischemia innesto può essere limitata a 20 min. Tempo per l'impianto (tempo di ischemia calda) è molto più breve con la tecnica gambetto rispetto alla tecnica di sutura 16.
Invece di ablazione del cuore come descritto in precedenza 5,17, induciamo arresto cardiaco mediante perfusione l'innesto con una soluzione cardioplegica usato in clinica e ipotermia. La soluzione Custodiol HTK cristalloide contiene 10 mmol / l di potassio e basse concentrazioni di sodio, calcio e magnesio, e arresta efficacemente cuore. La additivi istidina, triptofano e a-chetoglutarato ridurre l'acidosi, forniscono ATP e proteggono le membrane cellulari duanello ischemia. Questo assomiglia alla condizione clinica di un arresto cardiaco controllati durante un'operazione a cuore aperto e rende questo modello ideale per l'indagine di infarto I / R-infortunio. Inoltre, permette l'applicazione di agenti farmacologici all'interno della soluzione cardioplegica all'inizio di ischemia fredda. Deposito di innesti a 0-4 ° C è possibile per un intervallo di tempo massimo di 4 ore. Un tempo di ischemia prolungato può portare a ipocontrattilità miocardico complicato da sovraestensione delle camere cardiache di destra ed emorragie.
Nella nostra esperienza, alcuni punti chiave critici agevoleranno rivascolarizzazione successo. Con completa mobilizzazione della carotide e l'uso di un profilo Yasargil morsetto massima lunghezza basso vassel per anastomosi può essere conservato. Vasospasmo può essere evitata facendo cadere 01:10 papaverina diluito sulla arteria. Per evitare danni neurologici della carotide è legatura di sotto della biforcazione di preservare circolo collaterale a t egli carotide interna. Il lume del vaso è attentamente dilatati con un dilatatore vaso con un sopraffino (0,2 mm) punta evitando lacerazione della parete. Nella nostra esperienza il posizionamento di suture che tengono come descritto in precedenza 7 non è obbligatoria. La scelta delle dimensioni del bracciale è cruciale per il successo rivascolarizzazione. Il diametro interno polsino per anastomosi arteriosa dovrebbe essere leggermente maggiore del diametro esterno della carotide comune (250-300 micron) per tenere conto della mancata corrispondenza con il grande dell'aorta ascendente dell'innesto. Per i topi di peso 20-25 g di uso polsini da 22 a 24 G (diametro interno del bracciale da 0.510 a 0,643 millimetri) per la carotide e polsini da 19 a 21 G (diametro interno polsino da 0,724 a 0,912 millimetri) per la vena giugulare esterna . Noi preferiamo materiale di sutura polifilamento (seta), che facilita annodatura. Il morsetto microvascolare è posto sul prolungamento del bracciale. Questo immobilizza la nave e facilita eversione del muro.
ove_content "> L'ipotermia deve essere accuratamente evitato in quanto prolunga il recupero ed è una delle principali cause di mortalità perioperatoria. neuroleptanalgesia Antagonizable con midazolam, medetomodine e fentanil fornisce buona tolleranza chirurgico e aggancia recupero rispetto alla ketamina / xylazina 18.Anche se il modello trapianto di cuore cervicale è un non-fisiologica, modello cuore non caricati a causa della direzionalità unica di intracardiaca il flusso di sangue, è uno strumento indispensabile nel trapianto cardiaco sperimentale. I dati tecnici riportati in questo documento video dovrebbe consentire ricerche per stabilire questo modello relativamente facile nei loro laboratori.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps JFC-7.2 | S&T | P-00036 | Curved tip 0.20 mm |
| Vessel dilatator D-5a | S&T | S-00124 | |
| Adventita scissor | S&T | S-00102 | |
| Vascular clamp B-1V | S&T | S-00396 | |
| Yasargil Clip | Peter Lazic | 65,097 | 3.5 mm lenght |
| Bipolar forceps | Micromed | 148-100-011 | tip 0.25 mm |
| Polyimide tubes | River Tech Medical | 19-24 gauge | |
| 8.0 silk ligatures | Catgut | ||
| Custodiol HTK solution | Essential Pharmaceuticals |
References
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