Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.
一个细胞的超微结构的划分对于理解它的功能很重要。这可以是在整个制成多种类型的细胞,如肠上皮的内分泌细胞的组织扩散稀有细胞类型是一项艰巨的项目。食物和细菌的这些胃肠传感器已很难研究,因为它们以1:1的比例分散在其他的上皮细胞:1,000。最近,转基因报告小鼠已经产生荧光的手段,以确定肠内分泌细胞。其中之一是将肽YY-GFP小鼠。使用这款鼠标,我们开发了一种方法来关联焦和串行块面部扫描电子显微镜。我们命名方法cocem3D并应用它来识别特定的肠内分泌细胞在组织中推出3D细胞的超微结构。 cocem3D的分辨率是足够的,以确定细胞器一样小分泌囊泡和区分细胞膜为卷重ndering。 Cocem3D可以很容易地适应研究其它特定的细胞类型的三维超微结构其天然组织中。
生活在细胞内发生的时间和空间。随着时间的推移改变使用时间推移显微镜结合荧光成像技术,如超高分辨率显微镜经常研究。空间,特别是细胞或细胞 – 细胞相互作用内细胞器的结构中,只能由一个完整的帐户细胞的微细结构的衍生。综合考虑一个细胞的微细结构也能带来清晰基因组功能的情况下的基因组是可用的,像C.线虫线虫1或平面placozoa tricoplax粘着2。连续切片电子显微镜现在是一个可再现的,时间效率,和更便宜的任务由于自动化3D电子显微镜技术的发展,例如串行块面扫描电子显微镜3(SBEM)。
需要进行结构信息阐明的功能是在一定的CEL非常明显升类型,其中功能取决于物理的细胞 – 细胞相互作用,如神经元,神经胶质细胞,或感觉上皮细胞。我们是在阐明从在肠道的管腔养分感觉信号如何被转导到最终调制欲求行为的电信号特别感兴趣。该电路是复杂的,但开始在肠的壁,其中营养物质接触到感觉上皮细胞,称为肠内分泌细胞接触。不像其他感官上皮细胞,如味觉细胞,肠内分泌细胞在整个肠上皮的一个的比率分散到千4-7。因此,他们已经很难确定和研究,并且很长一段时间,他们只能作为胃肠激素的来源。但与细胞特异性的荧光报告小鼠的发展,这些细胞的复杂感觉功能正在出现。使用一个这些记者老鼠,肽YY-GFP(PyyGFP)小鼠,我们发现,enteroendocrINE细胞有显着的胞质尾,我们命名为neuropod。 neuropods的外观建议在细胞 – 细胞通信的保守功能。因此,我们推断,通过记录一个肠内分泌细胞的超微结构,neuropods的功能可以被衍生。
理解在分散细胞,其是难以识别的附属物的结构的需要是开发一种方法,以共聚焦显微镜和SBEM结合的主要理由。鉴定使用PyyGFP肠内分泌细胞特异报告小鼠感兴趣的细胞。该方法使我们能够记录的肠内分泌细胞及其neuropod整个超微结构。在neuropods,我们发现神经元轴突的结构特点,并neuropods外,我们发现肠神经胶质8肉体关系。的确,neuropods含有约70%的分泌囊泡表明在这些细胞的分泌功能中起重要作用的。建筑上的结构数据,最近我们发现,通过这些neuropods,肠内分泌细胞和神经元支配肠道形成神经上皮电路,在舌头8,9类似口味细胞。
使用此相关显微镜方法揭开的化学感受胃肠等机制的特点,从结构数据收集源于。我们认为这种方法可以是在细胞生物学的其他领域,特别是在细胞组织内以非常低的比率分散有用。我们提到的方法,相关的共聚焦和串行块面部扫描电子显微镜在三维(Cocem3D)。该方法包括以下主要步骤:组织解剖,共焦显微镜,SBEM成像,SBEM和共焦图象的相关性,并手工分割。相对于其他相关方法,这个概念是相当简单的,因为相关的物理而不是化学。
胃肠chemosensation正在成为生物医学研究中的一个令人兴奋的新领域。这在很大程度上是由于功能性味觉受体在肠内分泌细胞18的发现。随后的研究已经表明,肠内分泌细胞表达特异受体为营养物质,包括碳水化合物,脂质和氨基酸5,6,19,20。对于这些发现的催化因素是报告小鼠的发展,其中,肠内分泌细胞被荧光标记的20。我们开发了这些小鼠中,PyyGFP鼠标,来研究远端小肠和结肠17,21的肠内分泌细胞。这些细胞是感兴趣的,因为它们分泌PYY和胰高血糖素样肽1,这两者都是饱22,23的诱导剂。当时,这些细胞的完整超结构帐户是缺少,我们认为这是必要的,了解他们的信令机制。
内容】“>在这里,我们描述了一种在视觉上的方法,以消除共聚焦显微镜用SBEM。该方法被称为Cocem3D,这使我们能够记录肠内分泌细胞的完整超微结构。我们已经报道,这些细胞具有包含三一个neuropod四分之三的所有分泌囊泡8组成。内neuropod,有神经丝和很像神经轴突,neuropods由肠溶胶质细胞8培育出来的。更重要的是,它是尽管这些neuropods该肠内分泌细胞物理连接到神经元支配肠和结肠9。其中cocem3D的优势是它的简单。减小组织样本成可以通过共聚焦成像和SBEM便于组织内的特定细胞的识别的块。分泌囊泡和其它细胞器可以识别容易在为7nm /像素的分辨率。因为在SBEM的部分都将被丢弃,进一步PROCES唱组织,以确定特定的蛋白质是不在这一点上的选项。然而,方法如ATUM 24,其中来自组织块部分被保留的发展,很可能使特定的蛋白质在细胞的识别。对肠内分泌细胞确定化学感受受体的具体位置是用于药物治疗肥胖的发展至关重要的信息,因为肠内分泌细胞是在大脑中的肠道和饱足感的食物之间的感官接口。
The authors have nothing to disclose.
Our sincere appreciation is expressed to the following people: Drs. Sam Johnson and Benjamin Carlson of the Duke Light Microscopy Core Facility for their assistance with data visualization software, and Ms. Valerie Lapham and Dr. John M. Mackenzie, Jr. of the Center for Electron Microscopy at North Carolina State University for their advice on electron microscopy. We thank Dr. Elaine B. Bohórquez for her editorial assistance. Authors contributed in the following manner: DVB, SM, and RAL designed experiments and analyzed data. DVB performed experiments and FH performed manual rendering of data. SM is director of Renovo Neural, where SBEM data was acquired. DVB wrote the manuscript and all authors reviewed and edited the final manuscript. This work was supported by NIH grants R01DK091946 and Veterans Affairs grant I01BX002230 to RAL, and F32DK094704, to DVB.
Phosphate buffered saline | Life technologies | 10010023 | |
Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4%, freshly made in PBS, final pH 7.4 |
Glutaraldehyde | Sigma | G5882 | |
Dental wax | Electron Microscopy Sciences | 72660 | |
Low-melting agarose | Life technologies | 16520-100 | 5%, freshly made in PBS |
Standard Tissue-Tek Cryomold | Electron Microscopy Sciences | 62534-25 | |
DAPI nuclear stain | Life technologies | D1306 | |
Postively charged glass slides and coverslips | |||
Fine art paintbrush #1 | |||
Cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 11650 | |
Tannic acid | Electron Microscopy Sciences | 21700 | |
EMbed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
Liquid releasing agent | Electron Microscopy Sciences | 70880 | |
Liquid silver colloidal | Electron Microscopy Sciences | 12630 | |
CircuitWorks conductive epoxy | ITW Chemtronics | CW2400 | |
Variable flow peristaltic pump | VWR | 70730-064 | |
VT1200S Vibrating blade microtome | Leica | ||
Zeiss 780i confocal microscope | Carl Zeiss | ||
Sigma VP Scanning Electron Microscope | Carl Zeiss | ||
3view system | Gatan | ||
Renovo Neural Inc (Cleveland, OH) | http://www.renovoneural.com | Renovo provides 3d EM services | |
Fiji software | Open access software | ||
Computer station with 16GB of RAM or more | |||
Data visualization software Imaris 7.5 | Bitplane |