Abstract
Разграничение ультраструктуры клетки важно для понимания его функции. Это может быть непростой проект редких типов клеток распространяется по всей ткани из различных типов клеток, таких как клетки энтероэндокринные кишечного эпителия. Эти желудочно-кишечные датчики пищи и бактерий, было трудно изучить, потому что они распределены среди других эпителиальных клеток в соотношении 1: 1000. Недавно трансгенные репортер мышей были получены для идентификации энтероэндокринные клетки с помощью флуоресценции. Одним из них является пептид YY-GFP мыши. Используя эту мышь, мы разработали метод соотносить конфокальной и серийный блок-лицевой сканирующей электронной микроскопии. Мы назвали метод cocem3D и применил его для идентификации конкретного энтероэндокринные ячейку в ткани и раскрыть ультраструктуры ячейки в 3D. Разрешение cocem3D достаточно, чтобы идентифицировать органеллы, как малые, как секреторных везикул и отличать клеточные мембраны для объемного Rendering. Cocem3D могут быть легко адаптированы для изучения 3D ультраструктуры других типов конкретных клеток в их нативной ткани.
Introduction
Жизнь внутри клетки происходит во времени и пространстве. Изменения во времени часто изучаются с помощью покадровой микроскопии в сочетании с методами флуоресценции, как супер-разрешением микроскопии. Пространство, в частности, расположение органелл внутри клетки или клетки к клетке взаимодействий, могут быть получены только путем полного счета тонкой структуры клетки. Всеобъемлющий обзор тонкой структуры клетки также могут внести ясность в геномной функции в тех случаях, когда геном доступен, как С. Элеганс нематоды 1 или квартиру placozoa tricoplax слипчивых 2. Серийный секционирования электронная микроскопия теперь воспроизводимым, время эффективным и менее дорогие благодаря задачи для развития автоматизированных технологий 3D электронной микроскопии, как серийный блок-лицевой сканирующей электронной микроскопии (3 SBEM).
Необходимость структурной информации выяснения функции очень очевидна в определенной челТипы л где функция зависит от физических клеток в клетки-взаимодействий, такие как нейроны, глия, или сенсорных эпителиальных клеток. Мы особенно заинтересованы в выяснении, как сенсорные сигналы от питательных веществ в просвете кишки трансдуцируют в электрический сигнал, который, в конечном счете модулирует аппетитивных поведения. Схема сложна, но начинается на стенке кишечника, где питательные вещества вступают в контакт с сенсорных эпителиальных клеток, называемых энтероэндокринные клеток. В отличие от других сенсорных эпителиальных клеток, таких как вкусовые клетки, клетки энтероэндокринные рассредоточены по всей эпителии кишок в соотношении один к тысяча 4-7. Следовательно, они были трудно идентифицировать и изучить, и в течение длительного времени они рассматривались только как источник кишечной гормонов. Но с развитием флуоресценции репортерных мышей клеточно-специфической, комплекс сенсорная функция этих клеток становится. Используя один из этих репортеров мышей, пептидный YY-GFP (PyyGFP) мышь, мы обнаружили, что enteroendocrап пара та клетки имеют заметную цитоплазматический хвост, который мы назвали neuropod. Появление neuropods предложил консервативный функцию в клетки к клетке связи. Таким образом, мы полагали, что путем документирования ультраструктуры с энтероэндокринные клетки, функция neuropods может быть получена.
Необходимо понять структуру придаток в дисперсной клетки, которое трудно определить было главным обоснованием для разработки метода, чтобы объединить конфокальной микроскопии и SBEM. Клетка интерес был идентифицирован с помощью клеточных конкретных репортер мышей PyyGFP энтероэндокринные. Метод позволил задокументировать весь ультраструктуры в энтероэндокринные клетки и ее neuropod. В neuropods, мы обнаружили, структурные особенности аксонов, так и за пределами neuropods, мы обнаружили, физические отношения к кишечной глии 8. Действительно, neuropods содержат около 70% всех секреторных везикул предлагая существенную роль в секреторной функции этих клеток. Опираясь наструктурные данные, недавно мы обнаружили, что с помощью этих neuropods, энтероэндокринные клетки и нейроны, иннервирующих кишечник образуют нейроэпителиальных схему, аналогичную вкусовых клеток на языке 8,9.
Раскрытие такие особенности желудочно-кишечного тракта хемосенсорных механизмов вытекают из структурных данных, собранных с помощью этого метода микроскопии корреляционная. Мы считаем, этот метод может быть полезным и в других областях клеточной биологии, в частности, когда клетки распределены в ткани при очень низкой соотношении. Мы называют методом конфокальной как корреляционного и серийный блок лицевой сканирующей электронной микроскопии в 3D (Cocem3D). Метод состоит из следующих основных этапов: рассечение тканей, конфокальной микроскопии, изображений SBEM, SBEM и конфокальной корреляцию изображения и ручной сегментации. По сравнению с другими методами корреляционного, понятие достаточно просто, потому что корреляция физической, а не химическим.
Protocol
Все по уходу за животными и эксперименты были проведены в соответствии с протоколом, утвержденным Комитетом по Уходу за животными и использованию Университета Дьюка в.
Cocem3D вытекает из комбинации ранее опубликованных протоколов 10,11 и был применен здесь, чтобы изучить конкретный энтероэндокринные соте с использованием PyyGFP репортер мышь 12. Этот метод может быть легко применены к другим клеткам интерес с использованием коммерчески доступных трансгенных репортерных мышей. Метод описан в трех секциях: Корреляционный конфокальной микроскопии, серийный блок-лицо сканирующей электронной микроскопии (SBEM), и данных визуализация в 3D.
Корреляционный конфокальной микроскопии
Цель этого раздела заключается в сборе сегмент ткани из дистального отдела толстой кишки размеров, которые позволяют корреляционная конфокальной и изображений SBEM. Протокол выглядит следующим образом:
1. Сбор ткани
- Подготовить10 мл 50 мкг / мл раствора гепарина в PBS.
- Подготовьте ксилазина / кетамина обезболивающий запас путем смешивания 10 мл кетамина (100 мг / мл) и 1 мл ксилазина (20 мг / мл).
- Развести Ксилазин / кетамин складе 1: 4 в 0,1 М PBS.
- Приготовьте 100 мл фиксирующего раствора, содержащего 4% параформальдегида и 0,1% глутарового альдегида в PBS.
- Обезболить в PyyGFP мышь, от 6 до 10 недель, с летальной дозой ксилазин / кетамина наркозом. Вводят обезболивающее внутрибрюшинно в 0,15 мл на 20 г веса мыши.
- Подтвердите правильное обезболивания мыши, зажимая хвост или пальцы, и использовать мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость.
- Используйте переменную потока перистальтического насоса заливать закрепитель внутрисердечно 10. Использование хирургические ножницы (13 см длина) разрезать брюшную полость, чтобы разоблачить кишечник, сердце, и легкие. Держите сердце с узким картина искривленных щипцов (длиной 12 см) и вставьте иглу бабочка (19 г) из перистальтического насоса яNto левого желудочка. Сразу же, сократить правое предсердие с пружинными ножницами прямых (длина 4 мм). Заливать со скоростью 2 мл / мин первая раствором гепарина в течение 1 мин, а затем с ледяной Фиксирующий раствор в течение 15 мин до хвоста мыши полностью жесткой.
Примечание: Очень важно, чтобы заливать с медленной скоростью, чтобы предотвратить разрывать мелких сосудов в слизистой оболочке кишечника. Ворвавшись судов будет компромисс ультраструктуры ткани в. Если перфузии является адекватным, печени следует обратиться бледный цвет в течение 3-5 мин. - Использование маленькие ножницы вскрыть брюшную полость и вырезать всю толстую кишку от пересечения с слепой кишки до дистального кишки. Поместите ткань в ледяной PBS. В то время как погруженный в PBS, разрезать небольшими ножницами весной толстой кишки вдоль брыжейки.
2. Анатомический и крепления Tissue сегменты
- Использование скальпеля, сократить около 6 небольших сегментов ткани (2 мм 2) от дистального отдела толстой кишки. Сделайте это на листе OF зубоврачебный воск и погружают в несколько капель PBS.
- После фиксации сегментов ткани в Фиксирующий раствор в течение 3 ч при 4 ° С.
3. Микро-рассечение тканей Блоки
- Готовят 5% легкоплавких агарозы в PBS и хранить его в водяной бане при 45 ° С.
- Вставить сегменты ткани в 5% с низкой температурой плавления агарозы с помощью небольшой пластиковый контейнер, как стандартного размера ткани-Tek Cryomold.
- Установите встроенные секции на вибрирующей лопасти микротоме и заполнить буфер поднос с ледяным PBS.
- Вырезать 300 мкм ткани полоски на 0,8 амплитуды и 0,04 мм Скорость / сек. Примечание: В этот момент, тканевые полоски будут смещены от агарозы.
- Re-вставлять 300 мкм ткани полоски в агарозы и смонтировать их на микротоме перпендикулярно лезвию vibratome в.
- Использование vibratome, вырезать ткани полоски при толщине 50 мкм. Примечание: Окончательные блоки ткани должна быть около 300 мкм в ширину х 50 мкм. Они дimensions оптимизированы с пилот конфокальных экспериментов, которые показали, что толщина энтероэндокринные клетки 15-20 мкм, а длина neuropod в 30-70 нм. Таким образом, вся камера может содержаться в блоке ткани 300 мкм в ширину и толщиной 50 мкм, если ориентация ячейки параллельна поверхности блока тканей. Вары эти размеры в зависимости от ткани и клетки типа интерес.
- Хранить блоки ткани в PBS при 4 ° С.
4. конфокальной микроскопии
- Приготовьте раствор ядерной пятно путем разбавления DAPI в ФБР в масштабе 1: 4000.
- Инкубируйте ткани блоков в DAPI ядерной пятно в течение 5 мин. Примечание: окрашивание DAPI облегчает отличительные индивидуальные клетки их ядер, что является полезным для соотнесения конфокальной и SBEM изображения.
- Mount блоки ткани на заряженной стекло, добавьте несколько капель PBS, и покрыть их с покровным.
- Использование конфокальной микроскопии, определить блокс с неповрежденной ворсинок и PyyGFP клеток, представляющих интерес и отображаемого им получить Z-стеки оптических срезов.
- Используйте 20X / 0,8 Zeiss План Apochromat цель, чтобы получить Z-стеки 1 мкм оптических срезов.
- Для Z-стек, использовать каналы для 405 нм (DAPI), чтобы определить отношение к другим клеткам, 488 нм эндогенного GFP локализовать клетки интерес, и дифференциального интерференционного контраста (DIC), чтобы определить местоположение по отношению к клеточной Просвет.
- Используйте разрешение изображения 1024 пикселей или выше.
5. Блоки внедрения в агарозном
- Подготовьте 10 мл фиксатора, содержащего 4% параформальдегида и 2,5% глутарового альдегида в PBS.
- Извлеките блоки ткани из стекло, осторожно добавл PBS в краях покровного стекла, чтобы скользить покровное от стекло без повреждения блока тканей. Затем, используя тонкую кисть искусство, чтобы передать блок тканей из слайда к 10,5 мл микроцентрифужных пробирку, содержащую 4% параформальдегида и 2,5% глутарового альдегида закрепитель.
- После починки блоки ткани O / N при 4 ° С.
- Перевести ткани блоки ФБС. Затем, вставлять блоки квартира на 5% с низкой температурой плавления агарозы с сэндвич их между двумя предметными стеклами.
Примечание: Встраивание блоки в тонком слое агарозы облегчает манипулирование во задней окрашивания. - Вырезать агарозы в квадрат и сделать выемку на верхней стороне. Примечание: Этот этап необходим для поддержания ориентации в последующих стадиях.
- Хранить блоки в 1,5 мл микроцентрифужных трубки с PBS при 4 ° С до дальнейшей обработки.
Серийный блок-лицо сканирующей электронной микроскопии (SBEM)
В этом разделе, блок ткани подготовлен и отображаемого с SBEM на низкой увеличения. Опрос образ блока лицом затем коррелируется с конфокальной данных, чтобы определить область, содержащую ячейку интересов. После того, как в регионеидентифицирован, ткани изображается с разрешением 7 нм / пиксел и кусочками 70 нм. Этого было достаточно, чтобы решить и различать большие плотные основные секреторных везикул от других органелл. В энтероэндокринные клеток, этот тип пузырьков варьирует между 100 и 150 нм в диаметре 13. Протокол выглядит следующим образом:
6. Окрашивание срезов ткани
- Удалить из ткани PBS и полоскать три раза, 5 мин каждый, в 0,1 М какодилатном буфера.
- Пятно блоки для 1 ч в 0,1% дубильной кислоты, растворенной в 0,1 М какодилатном буфера повышения контрастности клеточных мембран 14.
- Провести последующее окрашивание и обезвоживание тканей в соответствии с опубликованной протокола 11. После Deerinck др. Протокол, подготовки этих решений: 1) 1% (вес / объем) thiocarbonhydrazide (ТНС); 2) привести аспартат решение; 3) ацетат 1% уранила и 4) ферроцианида осмий tetraoxyde / калия (OsO 4 / К ферроцианида). Смешайте 4% ОСО 4 и 2xК ферроцианида складе [0,3 K ферроцианидных и 0,86 г Na какодилате в 10 мл H 2 O] в соотношении 1: 1, чтобы ОСО 4 / K ферроцианидных. Примечание: Наличие встроенного ткани в агарозном облегчает обработку во время окрашивания. Осторожно снимите агарозы для последующего смолы инфильтрации.
- Промыть образцы три раза, 5 мин каждый, в 0,1 М какодилатный буфер, а затем окрашивают раствором ОзО4 / К ферроцианида в течение 2 ч при 4 ° С.
- Промыть в ультра чистой воды три раза, 5 мин каждый, и пятно с ТКП в течение 30 мин при 60 ° С.
- Промыть в ультра чистой воды три раза, 5 минут каждый и пятна с 2% ОСО 4 (без К ферроцианида) в течение 60 мин при комнатной температуре. Снова промыть в ультра чистой воды три раза, 5 мин каждый.
- Пятно с 1% уранилацетате O / N при 4 ° С. Промыть в ультра чистой воды три раза, 5 мин каждый.
- Пятно свинца аспартата в течение 30 мин при 60 ° С. Промыть в ультра чистой воды три раза, 5 мин каждый.
- Дегидрировать тканей путем промывки в SOLUTIOнс с увеличением концентрации этанола. Промыть 2 раза, 5 мин каждый, при 50%, 75%, 85%, 95%, и абсолютной 100% этанола. В конце, промыть секции с пропиленоксидом два раза, 10 мин каждый.
7. Проникнув и внедрения срезов ткани в Ресин
- Проникнуть блоки смолой с использованием коммерчески avaialble комплект. Код для вставки в ткани смолы с использованием набора EPON вложение. Подготовка смолы смесь 48% эпоксидная смола, 20% мл DDSA, 30% мл НМА и 2% DMP30. Перемешайте смесь смолы энергично в течение 5 мин, а затем поместить смесь в вакууме в течение 30 мин, чтобы позволить пузырькам выйти на поверхность.
- Смешайте смолу с оксидом пропилена при соотношении 1: 1 и интенсивно встряхнуть. Удалить окончательное обезвоживание полоскание из тканей, а также добавить смолы в смеси с пропиленоксидом. Место флакона с образцами в ротатор O / N и оставить флакон колпачков. На следующий день, добавить свежеприготовленные Epon смолы и перемешивают в течение 90 мин в ротатор.
- Код для вставки блоков в смолы как можно более плоскими по сэндвич их вмежду стеклами, которые были вылечены с агентом жидкого выпуска, чтобы предотвратить их от прилипания к друг другу 15.
- После того, как блоки встроены плоские, вылечить блоки для сложения 48 ч при 60 ° С.
- Потяните слайды на части, чтобы освободить блоки.
8. Монтаж и обрезки ткани Блок для визуализации
- При вскрытии рамки, соответствовать ориентации тканевых блоков, встроенных в смоле с тем из конфокальных микрофотографиях для облегчения идентификации областей, содержащих клетки интерес до обрезки блок.
- Обрезать смолы встроен блок вручную до блок-лица ~ 500 х 500 мкм.
- Установите блок плашмя на штифт, содержащей проводящий эпоксидную смолу и сухой в течение 30 мин. Затем выложить блок плашмя на поверхности и сухой O / N на 60 ° C.
- Пальто блок с коллоидного серебра жидкости. Поддержание срезы ткани плоским, чтобы обеспечить разрезание блока под прямым углом, чтобы облегчить COrrelating серийные блок-лица и конфокальной микроскопии микрофотографии.
9. SBEM
- Изображение блока с помощью сканирующего электронного микроскопа, оснащенного системой SBEM (е .g., 3View).
- Установите начальный участок толщина в ~ 2 мкм с шагом и сократить до лицо ткани не выходит из блока.
- Приобретать surver изображение всего блока лица.
- Использование ПО Фиджи, проводить измерения и серийный блок-лица и конфокальной микрофотографии, чтобы создать общий знаменатель и счет для образца деформации при фиксации и окрашивания 16.
- Найдите интересующую область на блок лицом путем умножения знаменатель координат в конфокальных изображений. Используют также другие структурные особенности, как положение микроворсинок, бокаловидных клеток, или собственной пластинки, в качестве ссылки.
- Изображение область интереса на 2,25 кВ и 7 нм / пиксел (или 15,147X увеличения) в режиме высокой вакуума. Приращения Slice должен быть установленпри 70 нм или менее.
- Сбор данных SBEM в сырой 16-битной .dm3 формате.
10. Оптимизация SBEM картинки на поверхности Сегментация
- Преобразование изображения из SBEM сыром формате .dm3 в 8-битный .tiff.
- Фильтр .tiff изображения, используя 0,8 Gaussian Blur фильтр на Фиджи.
- Уменьшите набор на 25% от первоначального размера данных и сохранить его в качестве стека .tiff, чтобы свести к минимуму количество оперативной памяти, необходимой для обработки набора.
- Совместите стопку SBEM изображений с помощью плагина Фиджи "линейное выравнивание стека с плотно" в режиме перевода и обрезается с помощью "урожай" 3D плагин. Примечание: Обрезка помогает дополнительно снижается количество оперативной памяти, необходимой для сегментации и объем рендеринга.
Предоставление данных в 3D
11. конфокальной микроскопии
- Реконструировать Z-стеки, используя автоматический режим "Поверхности" инструмент превзойти. Рисунок 1D, показывает REConstruction каждого канала с помощью плавного опцию, подробно поверхности площадью в 0,126 мкм, и, как порога абсолютной интенсивности.
12. Серийный блок-лицо СЭМ
Примечание: Руководство сегментация данных очень много времени процедуру и, в зависимости от особенностей, которые будут оказываться процедуру может занять несколько недель. Сегментация для видео и показатели, представленные в Бохоркез др. 2014 8 делалось вручную и занимает около 500 ч труда. Рекомендуется приоритеты существенные черты, требующие рендеринг перед началом процесса сегментации. Процедура заключается в следующем:
- Используйте "Поверхности" инструмент в режиме вытяжки и опцию "контур" в режим отрисовки 50 мс до сегмента вручную и объема оказываемых ячейку интересов.
- Проследите контуры на каждом срезе клетки для гладкой рендеринга или каждые 5 срезов для ускорения рендеринга.
- Экспорт финале имвозраст, используя "снимок" инструмент в разрешении 300 точек на дюйм или более.
Representative Results
Метод, представленный здесь, был использован для изучения ультраструктуры определенной ячейке в слое эпителия. Клетка интерес в данном случае является недостижимой энтероэндокринные клеток. Их идентификация в месте стало возможным только в последние несколько лет с развитием флуоресценции репортера мышей клеток конкретных. В 2011 году мы разработали мышь, в которой промоутер гормона PYY запускает экспрессию зеленого флуоресцентного белка 17. В этом PyyGFP мыши, энтероэндокринные клетки дистальной части тонкой кишки и толстой кишки легко отличить под УФ-светом. Эта модель мышь была основой для идентификации блока тканей, содержащий энтероэндокринные клетку и обрабатывать его для SBEM. Корреляционный метод называется здесь cocem3D и был построен на ранее опубликованных протоколов 10,11.
Оптимизация размеры блока тканей имеет решающее значение для корреляции. В предварительных экспериментах,было установлено, что в блоке ткани 300 мкм длиной х 50 мкм количество SBEM изображений сводится к минимуму, охватывающий все тело клетки интерес. 1А показывает смотровой рассечения с помощью вибрирующего лезвия microtrome к получить тканей блок с правильными размерами. По крайней мере, 100 блоков получаются до сортировки через них, чтобы забрать тех, с неповрежденными клетками интерес. Отдельные блоки загружаются в конфокальной микроскопии и изображения Z-стеки оптически через каждые 1 мкм (рис 1B и C). Рисунок 1D показывает объем оказываемых вид на энтероэндокринные клетки в подвздошной кишке мыши. Его выдающийся neuropod распространяется под эпителиальных клеток в течение ~ 60 мкм.
Клетка интерес найдены корреляции конфокальной Z-стеки с SBEM образ весь блок лице. Пример представлен здесь в квартале от дистального отдела толстой кишки о PyyGFPмышь. После получения конфокальных Z-стеки (фиг.2А), блок встроен в тонкий слой легкоплавкого агарозы (фиг.2В). Это необходимо для последующей манипуляции блока. Важно поддерживать ориентацию блока как можно более плоским, чтобы соответствовать оптические срезы с кусочками SBEM. На фиг.2с, представитель изображение показано всей поверхности блока тканей. Части этой фигуре были ранее опубликованы в Bohorquez др., 2014 8. Это было затем коррелирует с конфокальной изображения, принимая во внимание ориентиров тканей и размеров. Рис 2D показывает наложение конфокальной и SBEM изображение блока, открывая Точное местоположение нашей камеры интересов.
После того, как клетки были идентифицированы, изображения SBEM делается при разрешении достаточно высокой, чтобы определить секреторных везикул и другие органеллы клеток. Набор данных представлены онRe была отображена на 7 нм на пиксель, как образы блока были приняты все 70 нм. Множество данных, содержащихся 643 изображений, которые охватывают 45 мкм глубины ткани. Через несколько микрон побрился во время начальной визуализации всей блока лицом при малом увеличении. Сырой набор SBEM данные были получены в формате .dm3 и превращается в .tiff для последующего обращения. Стек SBEM был обрезается с помощью программного обеспечения Фиджи плагин "урожай (3D)" блок содержит только область интереса. Это уменьшает количество оперативной памяти, необходимой для оказания объем. Клетки идентифицировали по ее положение и секреторные пузырьки, и сегментирован с использованием программного обеспечения Imaris. Рисунок 3 содержит визуализация в 3D в энтероэндокринные клетки.
Рисунок 1:. Корреляционный конфокальной микроскопии () Процедура рассекать кусокткани кишечника в ткани блоке 300 х 50 мкм. (Б) представитель ткани Блок правых измерениях. Следует отметить, что блок ткани из этих измерений от мыши тонкой кишки охватывает около 3 ворсинки или, в случае толстой кишки около 8 склепов. (С) ворсинок в тонком кишечнике, содержащего клеток, представляющих интерес. (D), конфокальной г-стек отображаются в 3D с помощью программного обеспечения Imaris показывает энтероэндокринные ячейку с заметным neuropod работает под кишечного эпителия. Синий = DAPI ядерной пятно. Бары = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Последовательный блок-лицо сканирующей электронной микроскопии (А) конфокальной изображение Селе.ИДКТК ткани блок из толстой кишки, содержащей клетки PyyGFP энтероэндокринные (зеленый) интересов. (Б) После того, как блок изображается с помощью конфокальной микроскопии, это то встроенные квартиру в легкоплавких агарозы с помощью стеклянных слайдов. Встраивание блока тканей в агарозном облегчает последующее манипулирование и выемка на левом углу помогает установить блок внутри SBEM в правильной ориентации. (С) SBEM изображение лица блока. (D) Соотношение конфокальной данных с SBEM для выявления клеток, представляющих интерес (белая стрелка). Изображения на С и D этой фигуры изменяются от Бохоркез др., 2014 8. Синий = DAPI ядерной пятно. Бары = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3:. Оказание данных в 3D () Объем оказание энтероэндокринные ячейки с использованием программного обеспечения Imaris. Ячейка содержит neuropod упакованный с секреторные пузырьки. Для полного описания ультраструктуры в энтероэндокринные клетки, пожалуйста, обратитесь к Бохоркез и др., 2014 8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Желудочно-кишечные chemosensation становится как захватывающий новой области в биомедицинских исследованиях. Это в значительной степени связано с открытием функциональных вкусовых рецепторов в клетках энтероэндокринные 18. Последующие исследования показали, что клетки энтероэндокринные выразить специфические рецепторы для питательных веществ, в том числе углеводов, липидов, аминокислот и 5,6,19,20. Каталитический фактором для этих открытий была разработка репортер мышей, в которых энтероэндокринные клетки флуоресцентно меченных 20. Мы разработали одну из этих мышей, мышь PyyGFP, чтобы изучить энтероэндокринные клетки в дистальном отделе тонкой кишки и толстой кишки 17,21. Эти клетки представляют интерес, поскольку они выделяют PYY и глюкагона, как пептид 1, оба из которых являются индукторы сытости 22,23. В то время, полное ультра-структурной счет этих клеток не хватало, что мы верили было важно, чтобы понять их сигнальные механизмы.
ontent "> Здесь мы описали визуально способ преодолеть конфокальной микроскопии с SBEM. Метод называют Cocem3D, что позволило задокументировать полный ультраструктуры клеток энтероэндокринные. Мы сообщили, что эти клетки имеют neuropod, содержащий трех- четверти всех секреторных везикул 8. В рамках neuropod, есть нейрофиламенты и так же, как аксонов, neuropods воспитываются кишечными глиальных клеток 8. Что более важно, это то, что эти neuropods что энтероэндокринные клетки физически подключить к нейронам, иннервирующих кишечник и толстой кишки 9.Один из самых сильных cocem3D является его простота. Уменьшение образца ткани в блок, который может быть отображена с помощью конфокальной и SBEM облегчает идентификацию конкретной ячейки в ткани. Секреторные везикулы и другие органеллы могут быть идентифицированы с легкостью при разрешении 7 нм / пиксел. Так как секции в SBEM отбрасываются, далее процеспеть тканей для выявления специфических белков не вариант на данный момент. Тем не менее, разработка методов, таких как ATUM 24, в котором участки из блока тканей сохраняются, скорее всего, обеспечивают возможность идентификации специфических белков в клетке. Определение конкретного местоположения хемосенсорных рецепторами на клетках энтероэндокринные важная информация для развития лекарственной терапии ожирения, поскольку энтероэндокринные клетки сенсорных интерфейс между пищи в кишечнике и сытости в мозге.
Disclosures
Доктор Сатиш Medicetty является сотрудником и получает 100% зарплаты от Renovo Neural Inc; Однако, это не меняет автора приверженность политике Юпитера на обмена данными и материалами. Нет конфликта интересов не объявлен для остальных авторов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Life technologies | 10010023 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4%, freshly made in PBS, final pH 7.4 |
| Glutaraldehyde | Sigma | G5882 | |
| Dental wax | Electron Microscopy Sciences | 72660 | |
| Low-melting agarose | Life technologies | 16520-100 | 5%, freshly made in PBS |
| Standard Tissue-Tek Cryomold | Electron Microscopy Sciences | 62534-25 | |
| DAPI nuclear stain | Life technologies | D1306 | |
| Postively charged glass slides and coverslips | |||
| Fine art paintbrush #1 | |||
| Cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 11650 | |
| Tannic acid | Electron Microscopy Sciences | 21700 | |
| EMbed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| Liquid releasing agent | Electron Microscopy Sciences | 70880 | |
| Liquid silver colloidal | Electron Microscopy Sciences | 12630 | |
| CircuitWorks conductive epoxy | ITW Chemtronics | CW2400 | |
| Variable flow peristaltic pump | VWR | 70730-064 | |
| VT1200S Vibrating blade microtome | Leica | ||
| Zeiss 780i confocal microscope | Carl Zeiss | ||
| Sigma VP Scanning Electron Microscope | Carl Zeiss | ||
| 3view system | Gatan | ||
| Renovo Neural Inc (Cleveland, OH) | http://www.renovoneural.com | Renovo provides 3d EM services | |
| Fiji software | Open access software | ||
| Computer station with 16 GB of RAM or more | |||
| Data visualization software Imaris 7.5 | Bitplane |
References
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 314, 1-340 (1986).
- Smith, C. L., et al. Novel cell types, neurosecretory cells, and body plan of the early-diverging metazoan Trichoplax adhaerens. Current biology : CB. 24, 1565-1572 (2014).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS biology. 2, e329 (2004).
- Engelstoft, M. S., et al. Seven transmembrane G protein-coupled receptor repertoire of gastric ghrelin cells. Molecular metabolism. 2, 376-392 (2013).
- Chandra, R., et al. Immunoglobulin-like domain containing receptor 1 mediates fat-stimulated cholecystokinin secretion. The Journal of clinical investigation. 123, 3343-3352 (2013).
- Wang, Y., et al. Amino acids stimulate cholecystokinin release through the Ca2+-sensing receptor. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G528-G537 (2011).
- Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. The Journal of physiology. 589, 1081-1093 (2011).
- Bohórquez, D. V., et al. An enteroendocrine cell-enteric glia connection revealed by 3D electron microscopy. PloS one. 9, e89881 (2014).
- Bohórquez, D. V., et al. Neuroepithelial circuit formed by innervation of sensory enteroendocrine cells. The Journal of clinical investigation. , (2015).
- Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis. Nature protocols. 4, 1145-1156 (2009).
- Deerinck, T., Bushong, E., Thor, A., Ellisman, M. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , University of California. San Diego San Diego, CA. (2010).
- Bohórquez, D. V., Chandra, R., Samsa, L. A., Vigna, S. R., Liddle, R. A. Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells. Journal of molecular histology. 42, 3-13 (2011).
- Nilsson, O., et al. Distribution and immunocytochemical colocalization of peptide YY and enteroglucagon in endocrine cells of the rabbit colon. Endocrinology. 129, 139-148 (1991).
- Mizuhira, V., Futaesaku, Y. New fixation method for biological membranes using tannic acids. Acta Histochem Cytochem. 5, 233-236 (1972).
- Reymond, O. L., Pickett-Heaps, J. D. A routine flat embedding method for electron microscopy of microorganisms allowing selection and precisely orientated sectioning of single cells by light microscopy. Journal of microscopy. 130, 79-84 (1983).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
- Bohórquez, D., Chandra, R., Samsa, L., Vigna, S., Liddle, R. Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells. J Mol Histol. 42, 3-13 (2011).
- Jang, H. J., et al. Gut-expressed gustducin and taste receptors regulate secretion of glucagon-like peptide-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 15069-15074 (2007).
- Liou, A. P., et al. The G-protein-coupled receptor GPR40 directly mediates long-chain fatty acid-induced secretion of cholecystokinin. Gastroenterology. 140, 903-912 (2011).
- Reimann, F., et al. Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell metabolism. 8, 532-539 (2008).
- Bohorquez, D. V., Liddle, R. A. Axon-like basal processes in enteroendocrine cells: characteristics and potential targets. Clinical and translational science. 4, 387-391 (2011).
- Batterham, R. L., et al. Gut hormone PYY(3-36) physiologically inhibits food intake. Nature. 418, 650-654 (2002).
- Flint, A., Raben, A., Astrup, A., Holst, J. J. Glucagon-like peptide 1 promotes satiety and suppresses energy intake in humans. The Journal of clinical investigation. 101, 515-520 (1998).
- Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Frontiers in neural circuits. 8, 68 (2014).
