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Biology

특정 감각 세포의 상호 공 초점 및 3D 전자 현미경

doi: 10.3791/52918 Published: July 19, 2015

Abstract

셀의 미세 구조의 묘사는 그 기능을 이해하는 것이 중요하다. 여기에는 장 상피의 장 내분비 세포 등 다양한 세포 유형, 만들어진 조직 전반에 걸쳐 확산 드문 세포 유형에 대한 발굴 프로젝트가 될 수 있습니다. 1000 : 그들은 1의 비율로 다른 상피 세포 사이에 분산되어 있기 때문에 음식과 세균이 위장 센서 공부하기 어려운되었습니다. 최근, 트랜스 제닉 리포터 생쥐 형광 의해 장 내분비 세포를 식별하기 위해 생성되었다. 그 중 하나는 펩티드 YY-GFP 마우스이다. 이 마우스를 사용하여, 우리는 촛점과 직렬 블록면을 주 사형 전자 현미경을 상관하는 방법을 개발 하였다. 우리는 방법 cocem3D 이름과 조직의 특정 장 내분비 세포를 식별하고 3D로 세포의 미세 구조를 공개하는 데 적용. cocem3D의 해상도 볼륨 RE에서 세포막을 분비 소낭 작게 소기관를 식별하고 구별하기에 충분ndering. Cocem3D 쉽게 그 나라의 특정 조직에서 다른 세포 유형의 3 차원 미세 구조를 연구하기 위해 적응 될 수있다.

Introduction

세포 내 인생은 시간과 공간에서 일어난다. 경시 변화는 종종 초해 현미경 같은 형광 이미징 기술과 결합 경과 현미경을 사용하여 연구된다. 공간은, 세포 또는 세포 간 상호 작용 내부 소기관의 배열, 특히, 단지 셀의 미세 구조의 전체 계좌에 의해 유도 될 수있다. 셀의 미세 구조의 광범위한 계정은 C. 같은 유전체를 사용할 경우에 게놈 기능 선명 해 엘레 선충 1 평면 placozoa의 tricoplax는 2 adherens. 직렬 단면 전자 현미경 해주기 효율적인 재현성, 시간 및 직렬 블록면을 주 사형 전자 현미경 (3) (SBEM) 같은 자동화 된 3 차원 전자 현미경 기술의 개발, 덜 비싼 태스크 덕분이다.

기능을 규명하는 구조 정보의 필요성은 특정 CEL 매우 분명하다이러한 뉴런, 아교 세포, 또는 감각 상피 세포와 같은 기능이 물리적 세포 간 상호 작용에 따라 L 타입. 우리는 창자의 루멘의 영양소에서 감각 신호가 궁극적으로 appetitive 행동을 조절하는 전기 신호로 형질 도입하는 방법을 아는데 특히 관심이 있습니다. 회로는 복잡하지만 영양분 감각 상피 세포라는 장 내분비 세포와 접촉 여기서 소장의 벽에서 시작한다. 이러한 미각 세포 등의 다른 감각 상피 세포와 달리, 장 내분비 세포는 천 4-7 하나의 비로 창자 상피 전반에 걸쳐 분산된다. 결과적으로, 그들은 식별하고 연구하기 어려웠으며, 오랜 시간 동안 그들은 단지 소화관 호르몬의 소스로 간주 하였다. 그러나 셀 고유 형광 리포터 생쥐의 발달이 세포의 복잡한 감각 기능이 등장하고있다. 이 기자 마우스 중 하나, 펩티드 YY-GFP (PyyGFP) 마우스를 사용하여, 우리는 그 enteroendocr 발견오프라인 세포는 우리가 neuropod라는 저명한 세포질 꼬리를 가지고있다. neuropods의 외관은 세포 간 통신에 보존 된 기능을 제시 하였다. 그러므로, 우리는 장 내분비 세포의 미세 구조를 문서화하여 neuropods의 함수가 유도 될 수 있음을 추론했다.

식별하기 어려운 분산 셀 부속물의 구조를 이해하기 위해 필요 공 초점 현미경과 SBEM을 결합하는 방법을 개발하기위한 주된 이론적 근거이다. 관심 셀 PyyGFP 장 내분비 세포 특이 리포터 생쥐를 이용하여 확인 하였다. 이 방법은 우리가 장 내분비 세포와 neuropod의 전체 미세 구조를 문서화하는 것을 허용했다. neuropods 내에서, 우리는 신경 세포의 축색 돌기의 구조적 특징을 발견하고, neuropods 외부, 우리는 장 아교 세포 (8)에 대한 물리적 관계를 발견했다. 실제로, neuropods 이러한 세포의 분비 기능에 필수적인 역할을 제안 모든 분비 소포의 약 70 %가 포함되어 있습니다. 에 구축구조적 데이터는보다 최근 우리는 이러한 neuropods 통해서, 장 내분비 세포와 뉴런 직감 혀의 미각 8,9 세포의 것과 유사한 neuroepithelial 회로를 형성 지배하는 것을 발견했다.

구조적 데이터에서 비롯 위장 화학 감각 메커니즘 등의 기능을 폭로하는 것은이 상호 현미경 방법을 사용하여 모였다. 우리는이 방법은 세포가 매우 낮은 비율로 조직 내에서 분산 특히 세포 생물학의 다른 분야에서 유용하게 사용될 수 있으리라 생각합니다. 우리는 3D (Cocem3D)에 상관 공 초점 및 직렬 블록 얼​​굴 스캐닝 전자 현미경 등의 방법이라고. 방법은 다음과 같은 주요 단계로 구성되어 조직의 절개, 공 초점 현미경, SBEM 영상, SBEM 및 공 초점 이미지의 상관 관계 및 수동 분할을. 상관이 아닌 물리 화학적 상호 때문에 다른 방법에 비해, 개념은 비교적 간단하다.

Protocol

모든 동물 관리 및 실험은 듀크 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행되었다.

Cocem3D는 이전에 발행 프로토콜 10,11의 조합으로부터 비롯 및 PyyGFP 리포터 마우스 (12)를 사용하여 특정 장 내분비 세포를 연구하기 위해 여기에 적용 하였다. 이 방법은 용이하게 상업적으로 이용 가능한 형질 리포터 생쥐를 이용하여 관심있는 다른 셀들에 적용될 수있다. 상호 공 초점 현미경, 시리얼 블록면을 주 사형 전자 현미경 (SBEM) 및 3D 렌더링에 데이터 : 상기 방법은 세 개의 섹션에 설명되어있다.

상호 공 초점 현미경

이 섹션의 목적은 상호 공 초점 및 SBEM 영상을 허용 차원의 원위부 대장에서 조직 세그먼트를 수확하는 것입니다. 다음과 같이 프로토콜은 다음과 같습니다

1. 수확 조직

  1. 준비PBS 중 50 μg의 / ㎖ 헤파린 용액 10 ㎖.
  2. 10 케타민의 ㎖ (100 ㎎ / ㎖)과 자일 라진의 1 ㎖ (20 ㎎ / ㎖)을 혼합하여 자일 라진 / 케타민 마취제 주식을 준비합니다.
    1. 0.1M PBS에 4 : 자일 라진 / 케타민 재고 1을 희석.
  3. PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드와 0.1 % 글루 타르 알데히드가 포함 된 고정액 용액 100 ㎖를 준비합니다.
  4. 자일 라진 / 케타민 마취제의 치사량으로, 6-10주 된 PyyGFP 마우스를 마취. 마우스 무게 20g 당 0.15 ml의 복강 마취제를 주입한다.
  5. 꼬리 또는 발가락을 곤란하게하여 적절한 마우스 마취를 확인하고 건조를 방지하기 위해 눈에 연고를 사용합니다.
  6. 정착액 intracardially (10)를 관류하는 변수 흐름 연동 펌프를 사용합니다. 수술 가위를 사용하여 (13cm 길이) 컷 장, 심장, 폐를 노출 복강을 엽니 다. 좁은 패턴 곡선 집게 (12cm 길이)와 마음을 잡고 연동 펌프에서 나​​비 바늘 (19 G)를 삽입 전NTO는 뇌실을 떠났다. 즉시, 봄 직선 가위 (길이 4mm)과 우심방을 잘라. 2 ml의 속도로 관류 / 분 먼저 마우스의 꼬리까지 15 분 동안 빙냉 고착성 용액 후 헤파린 1 분 동안 용액과 함께 완전히 강성이다.
    주 : 장 점막에 작은 용기의 파열을 방지하기 위해 느린 속도로 관류하는 것이 매우 중요하다. 혈관의 파열은 조직의 미세 구조를 손상됩니다. 관류가 적절한 경우, 간은 3 ~ 5 분 이내에 색상으로 연한 설정해야합니다.
  7. 사용 작은 가위는 복강을 열고 원위부 직장에 맹장과 접합부에서 전체 대장을 절제. 얼음처럼 차가운 PBS에서 조직을 놓습니다. PBS에 잠겨있는 동안, 작은 스프링 가위 장간막 따라 대장을 오픈.

2. 조직 세그먼트를 해부 및 고정

  1. 메스를 사용하여 원위 결장에서 약 6 작은 조직 세그먼트 (2 ㎜ × 2)를 자른다. 시트 O에서이 작업을 수행F 치과 왁스의 PBS 몇 방울에 빠져들.
  2. 4 ° C에서 3 시간 동안 정착 용액에 조직 세그먼트를 포스트 - 수정.

3. 마이크로 해부 조직 블록

  1. 아가 PBS에서 5 % 저 융점을 준비하고 45 ℃에서 수조에 보관.
  2. 5 % 저 융점 아가로 오스 표준 크기 조직 테크 Cryomold 같은 작은 플라스틱 컨테이너를 사용하여 조직 세그먼트를 임베드.
  3. 진동 블레이드 마이크로톰에 포함 된 섹션을 마운트하고 얼음처럼 차가운 PBS로 버퍼 트레이를 입력합니다.
  4. 0.8 진폭 0.04 mm / sec의 속도로 300 μm의 조직 스트립을 잘라. 주 :이 시점에서, 조직 스트립은 아가 로스로부터 탈락된다.
  5. 다시 포함 아가로 오스 300 μm의 조직 스트립을하​​고 vibratome의 블레이드에 수직으로 마이크로톰에 그들을 탑재합니다.
  6. vibratome를 사용하여, 50 ㎛의 두께로 조직 스트립을 절단. 참고 : 최종 조직 블록이 약 300 ㎛ 폭 × 50 μm의 두께이어야한다. 이 Dimensions는 장 내분비 세포의 두께가 15 ~ 20 μm의 neuropod의 길이는 30 ~ 70 nm의 사이에있는 것으로 나타났다 파일럿 공 초점 실험에서 최적화되어 있습니다. 셀의 배향 조직 블록의 표면에 평행 한 경우, 따라서 전체 셀은 50 μm의 두께로 조직을 300 ㎛ 폭의 블록 내에 포함 할 수있다. 관심의 조직과 세포 유형에 따라 이러한 차원을 다릅니다.
  7. 4 ° C에서 PBS에서 조직 블록을 저장합니다.

4. 공 촛점 이미징

  1. 4,000 : 1 PBS에 DAPI를 희석하여 핵 얼룩 솔루션을 준비합니다.
  2. 5 분 DAPI 핵 얼룩의 조직 블록을 품어. 참고 : DAPI 염색은 공 초점 및 SBEM 이미지의 상관 관계에 도움이 그들의 핵에 의해 구별 개별 셀을 용이하게한다.
  3. 충전 된 유리 슬라이드에 장착 조직 블록은, PBS의 몇 방울을 추가로 커버 슬립 커버.
  4. 공 초점 현미경을 사용하여 블록을 식별그대로 융모 관심 PyyGFP 세포와 S와 Z-스택을 광학 섹션을 얻기 위해 그들을 군데.
    1. 1 μm의 광학 부분의 Z-스택을 얻기 위해 20X / 0.8 자이스 계획 고차 색지움 목표를 사용합니다.
    2. Z-스택 들어, 다른 셀에 관계를 결정하기 위해 405 nm의 (DAPI)을위한 채널을 사용하여, 488 nm의 내생 GFP 관심 셀 국산화, 미분 간섭 대비 (DIC)은로 세포의 상대적인 위치를 결정 루멘.
    3. 1,024 픽셀 이상의 이미지 해상도를 사용합니다.

아가로 오스 5. 임베딩 블록

  1. PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드와 2.5 % 글루 타르 알데히드가 포함 된 고정액 10 ㎖를 준비합니다.
  2. 신중 조직 블록을 손상시키지 않고 얻어 유리 슬라이드에서 커버 슬립을 슬라이드 커버 슬립의 가장자리에 PBS를 첨가하여 유리 슬라이드에서 조직 블록을 제거한다. 그런 다음, 1 슬라이드에서 조직 블록을 전송하는 미술 붓을 사용하여0.5 ml의 4 % 파라 포름 알데히드와 2.5 % 글루 타르 알데히드 정착액을 포함하는 microcentrifuge 관.
  3. 포스트 수정 조직 블록 O / N 4 ° C에서.
  4. PBS로 조직 블록을 전송합니다. 그런 다음, 5 %는 두 개의 유리 슬라이드 사이에 그들을 끼워 아가 저 융점의 평면 블록을 포함.
    주 : 아가로 오스의 얇은 층에 임베드 블록은 염색시 후방 조작을 용이.
  5. 광장에서 아가로 오스를 잘라 위 편에 홈을 만든다. 주 :이 단계는 후속 단계에서 배향을 유지하기 위해 필요하다.
  6. 추가 처리까지 4 ° C에서 PBS로 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 보관 블록.

직렬 블록 얼​​굴 스캐닝 전자 현미경 (SBEM)

이 섹션에서는 조직 블록이 준비하고 낮은 배율로 SBEM으로 몇 군데. 블록 얼굴 이미지 조사는 관심있는 셀을 포함하는 영역을 식별하기 위해 공 초점 데이터와 상관된다. 지역 일단식별되고, 조직은 7 ㎚ / 화소, 70 nm 인 슬라이스의 해상도로 촬상된다. 이것은 해결하고 다른 세포 소기관에서 큰 밀도가 핵심 분비 소포를 구분하기에 충분했다. 장 내분비 세포에서 소포 이런 종류의 직경이 13 내지 100 nm 사이에 150 다릅니다. 다음과 같이 프로토콜은 다음과 같습니다

6. 염색 조직 절편

  1. PBS에서 조직을 제거하고 0.1 M cacodylate 버퍼에 세 번, 5 분 각각 린스.
  2. 1 시간에 0.1 % 탄닌산 대 스테인 블록 세포막 (14)의 콘트라스트를 향상시키기 위해, 0.1 M cacodylate 완충액에 용해시켰다.
  3. 게시 된 프로토콜 (11)에 따라 이후의 염색 및 조직의 탈수를 수행합니다. Deerinck 등을 다음과 같습니다. 프로토콜은 이러한 솔루션을 준비 : 1) 1 % (W / V) thiocarbonhydrazide (THC) 2) 아스 파르 테이트 솔루션을 선도; 3) 1 % 우라 닐 아세테이트, 4) 오스뮴 tetraoxyde / 황 혈염 (OSO 4 / K 페로). 4 % OSO 4 배 혼합1 [10 ML의 H 2 O에 K 페로과 0.86g 나 Cacodylate을 0.3g을] K 페로 재고 : 1 비율은 OSO 4 / K 페로을 확인합니다. 주 : 아가로 오스에 매립 조직을 갖는 염색 중에 취급을 용이하게한다. 조심스럽게 이후의 수지 침투에 대한 아가로 오스를 제거합니다.
  4. 린스 후, 세 시료 0.1 M cacodylate 버퍼 시간, 5 분마다, 및 4 ℃에서 2 시간 동안 OsO4 / K 페로 용액으로 염색.
  5. 60 ℃에서 30 분 동안 TCH와 초순수 세 번, 5 분마다, 그리고 얼룩에 씻어.
  6. 실온에서 60 분 동안 2 % OSO 4 (NO K 페로)를 초순수에 세 번, 5 분 각각의 얼룩을 씻어. 초순수 다시 세 번, 5 분마다 린스.
  7. 4 ℃에서 / 1 % 우라 닐 아세테이트 O와 N을 얼룩. 초순수에 세 번, 5 분마다 린스.
  8. 60 ℃에서 30 분 동안 리드 아스 파르 테이트와 얼룩. 초순수에 세 번, 5 분마다 린스.
  9. solutio에 세척하여 조직을 탈수에탄올의 농도가 증가함에 따라 NS. 50 %, 75 %, 85 %, 95 %, 및 절대 100 % 에탄올로 2 회, 각각 5 분간 린스. 끝에서 프로필렌 옥사이드로 2 회, 10 분간 각 섹션을 헹군다.

수지 7. 침투 및 포함 조직 섹션

  1. 수지는 상업적 있음 키트를 사용하여 블록을 침투. EPON 임베딩 키트를 사용하여 수지에 포함 된 조직. 48 %의 에폭시 수지, 20 % DDSA ml의 30 % NMA 용액 및 2 % DMP30의 수지 혼합물을 준비한다. 5 분 동안 격렬 수지 혼합물을 교반하여 다음 기포 표면에 올 수 있도록 30 분 동안 진공 상태에서 혼합물을 놓는다.
  2. 1 프로필렌 옥사이드와 수지를 혼합 : 1의 비율을 힘차게 흔들어. 조직에서 최종 탈수 린스를 제거하고, 프로필렌 옥사이드와 혼합 수지를 추가합니다. 회 전자의 O의 샘플과 장소 바이알 / N 및 유리 병 상한선을 둡니다. 다음 날, 갓 EPON 수지를 추가 한 회에 90 분 동안 혼합한다.
  3. 그들을 끼워 가능한 평면 수지에 포함 된 블록서로 (15)에 달라 붙는 것을 방지하기 위해 액체 이형제 경화 된 유리 슬라이드 사이.
  4. 블록이 평탄 매립되면, 60 ° C에서 48 시간 동안 첨가 블록을 경화.
  5. 블록을 해제 떨어져 슬라이드를 당깁니다.

8. 설치 및 이미지에 대한 조직 블록을 트리밍

  1. 해부에서 블록 트리밍 전에 관심있는 세포를 포함하는 영역을 식별 용이하게하기 위해 공 초점 현미경의 것과 수지에 매립 조직 블록의 방향과 일치.
  2. 수동으로 다운 ~ 500 X 500 μm의 블록 얼​​굴에 수지 포함 된 블록을 낸다.
  3. 30 분 동안 전도성 에폭시 및 건조를 포함하는 핀에 평면 블록을 탑재합니다. 그런 다음, 60 ℃에서 표면 건조 O / N의 블록 평면 배치.
  4. 코트 콜로이드 실버 액체와 블록. CO를 용이하게하기 위해 직각 블록의 슬라이싱을 위해 조직 절편 평면 유지직렬 블록 얼​​굴과 공 초점 현미경을 rrelating.

9. SBEM

  1. 이미지 SBEM 시스템이 장착 된 스캐닝 전자 현미경을 사용하여 블록 (E · G., 3View).
  2. 설정 초기 두께 ~ 2 μm의 단위에서 부와 조직의 얼굴이 블록에서 나온다까지 잘라.
  3. 전체 블록 얼​​굴의 surver 이미지를 획득.
  4. 피지 소프트웨어를 사용하여, 정착시 16 염색 샘플 워핑위한 공통 분모와 계정을 생성하도록 직렬 블록 얼굴 및 공 촛점 현미경 모두의 측정을 수행.
  5. 공 초점 이미지의 좌표에 분모를 곱하여 블록의 얼굴에 관심 영역을 찾습니다. 참고로, 미세 융모, 술잔 세포, 또는 고유 층의 위치와 같은 다른 구조적 특징을 사용합니다.
  6. 이자의 이미지 영역 2.25 kV의 높은 진공 모드에서 7 nm의 / 픽셀 (또는 15,147X 배율). 슬라이스 단위로 설정해야합니다70 nm 이하에서.
  7. 원시 16 비트 .dm3 형식 SBEM 데이터를 수집합니다.

표면 분할 10. 최적화 SBEM는 이미지

  1. 8 비트 티파니 원시 .dm3 형식에서 SBEM 이미지를 변환합니다.
  2. 피지에서 0.8 가우스 흐림 필터를 사용하여 이미지를 .TIFF 필터링합니다.
  3. 원래 크기의 25 %로 설정 데이터를 스케일과 세트를 처리하기 위해 필요한 RAM 메모리의 양을 최소화 .TIFF 스택으로 저장.
  4. 변환 모드에서 피지 플러그인 "SIFT와 선형 스택 정렬"을 사용하여 SBEM 이미지의 스택을 맞추고 "작물 3D"플러그인을 사용하여립니다. 주 : 상기 분할 자르기 및 볼륨 렌더링을 위해 필요한 RAM 메모리의 양을 감소하는 데 도움이.

3D의 데이터 렌더링

11. 공 초점 현미경

  1. 자동이 "면"도구의 모드를 능가하여 Z-스택을 재구성. 그림 1D는, REC를 보여줍니다절대 강도로 0.126 μm의에서 표면 영역의 세부 사항에 부드러운 옵션을 사용하여 각 채널의 onstruction 및 임계 값.

12. 직렬 블록 얼​​굴 SEM

참고 : 수동 데이터 분할은 매우 시간 소모적 인 절차와 몇 주가 걸릴 수있는 절차를 렌더링 할 수있는 기능에 따라입니다. Bohórquez 등의 알에 제시된 비디오와 그림 분할. 2014 8은 수동으로 수행과 노동의 약 500 시간을 걸렸다. 그것은 분할 프로세스를 시작하기 전에 렌더링을 필요로하는 필수 기능의 우선 순위를하는 것이 좋습니다. 절차는 다음과 같다 :

  1. 그리기 모드에서 "면"도구와 관심의 셀을 렌더링 수동 세그먼트와 볼륨에 50 밀리의 드로잉 모드에서의 "윤곽"옵션을 사용합니다.
  2. 부드러운 렌더링 또는 빠른 렌더링을 위해 매 5 조각의 셀의 모든 조각에 윤곽을 추적합니다.
  3. 수출 최종 메신저300 DPI 이상의 해상도에서 "스냅 샷"툴을 사용하여 세.

Representative Results

여기에 제시된 방법은 상피 세포의 층 내의 특정 셀의 미세 구조를 연구하기 위해 사용되었다. 이 경우, 관심있는 세포는 어려운 장 내분비 세포이다. 원위치에서의 식별은 셀 고유 형광 리포터 생쥐의 개발 지난 몇 년간 가능했다. 2011 년에는 호르몬 PYY의 프로모터는 녹색 형광 단백질 17의 발현을 구동하는 마우스를 개발했다. 이 PyyGFP 마우스에서 소장과 대장의 말단 부분의 장 내분비 세포는 쉽게 자외선에서 구별된다. 이 마우스 모델은 장 내분비 세포를 함유하는 조직 블록을 식별하고 SBEM 위해 그것을 처리하도록 재단 하였다. 상관 방법은 cocem3D 여기라고하고 이전에 출판 프로토콜 10, 11에 지어졌다.

조직 블록의 크기를 최적화하는 것은 상관 중요하다. 예비 실험에서,그것이 관심 셀의 몸 전체를 덮으면서 조직 블록에서 300 μm의 긴 × 50 μm의 두께 SBEM 이미지의 수를 최소한으로 감소된다는 것을 결정 하였다.도 1a는 진동 블레이드 microtrome로를 사용하여 해부의 간과를 도시 오른쪽 치수 조직 블록을 얻었다. 적어도 100 블록은 관심의 손상 세포를 가진 사람을 선택하는 그들을 통해 정렬하기 전에 얻을 수있다. 선택된 블록이 공 초점 현미경 및 이미지 Z-스택에 의해 촬영되는 광학적마다 1 ㎛ (그림 1BC)를 이격되어있다. 그림 1D 마우스의 회장의 장 내분비 세포의 볼륨 렌더링 뷰를 보여줍니다. 그 유명한 neuropod는 ~ 60 μm의에 대한 상피 세포 아래에 확장합니다.

관심 셀 블록 전체 얼굴 SBEM 이미지와 공 초점 Z-스택들을 상관시킴으로써 발견된다. 예 PyyGFP의 원위부 대장에서 블록으로 여기에 제시쥐. 촛점 Z - 스택 (도 2A)를 얻은 후, 블록은 저 융점 아가로 오스의 얇은 층 (도 2b)에 내장된다. 이 블록의 후속 조작이 필요하다. 그것은 SBEM 슬라이스 광학 슬라이스 일치 최대한 평탄한 블록의 방향을 유지하는 것이 중요하다. 도 2c에서, 대표 화상은 조직 블록의 얼굴 전체의 도시된다. 이 그림의 일부가 이전에 Bohorquez 등의 알에 발표되었다. 2014 년 8. 이것은 이후에 계정 조직의 랜드 마크와 크기를 고려하여 공 초점 이미지와의 상관 관계를 보였다. 그림 2D는 계시, 블록의 공 초점 및 SBEM 이미지의 오버레이를 보여줍니다 관심의 우리의 세포의 정확한 위치.

셀이 식별되면, SBEM 촬상 소포는 분비하고 다른 세포 소기관을 식별하기에 충분히 높은 해상도로 수행된다. 데이터 세트는 그 제시블록의 이미지는 모든 70 나노 미터를 찍은 것처럼 다시는 픽셀 당 7 nm에서 이미지화했다. 데이터 세트는 조직 깊이 45 μm의 스팬 (643)의 이미지를 포함 하였다. 마이크론은 낮은 배율에서 전체 블록 얼​​굴의 초기 이미징 동안 면도있다. 원시 SBEM 데이터 세트는 .dm3 형식으로 취득 및 후속 처리를 위해 티파니로 변환되었다. SBEM 스택은 관심의 영역을 포함하도록 피지 소프트웨어 플러그인 "자르기 (3D)"블록을 이용하여 자른 하였다. 이것은 볼륨 렌더링에 필요한 RAM 메모리의 양을 감소시킨다. 셀 위치 및 분비 소낭에 의해 식별 및 Imaris 소프트웨어를 사용하여 분할 하였다. (3) 장 내분비 세포에서의 3D 렌더링을 포함 도표.

그림 1

그림 1 :. 상호 공 초점 현미경 () 워크 플로우의 조각을 해부하다조직에 장 조직은 300 × 50 μm의 두께를 차단합니다. (B) 오른쪽 치수의 대표 조직 블록. 쥐 소장에서 이러한 치수 조직 블록 결장 약 8 소낭의 경우, 약 3 또는 융모 걸쳐 유의. 관심의 세포를 함유하는 소장 (C) 융모. Imaris 소프트웨어를 사용하여 3D로 렌더링 (D) 공 촛점 Z - 스택은 눈에 띄는 neuropod이 장 상피 아래에 실행하는 장 내분비 세포를 보여줍니다. 블루 = DAPI 핵 얼룩. 바 = 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 직렬 블록 얼굴 스캐닝 전자 현미경 (A) 실리의 공 초점 이미지.관심 PyyGFP 장 내분비 세포 (녹색)를 포함 콜론에서 cted 조직 블록. 블록은 공 초점 현미경에 의해 촬상되면, (B)는, 그 다음, 아가 로스 유리 슬라이드를 이용하여 저 융점의 평면 매립. 아가로 오스의 조직 블록을 포함하면 이후의 조작을 용이하게하고, 왼쪽 모서리에있는 홈이 오른쪽 방향으로 SBEM 내에서 블록을 탑재하는 데 도움이됩니다. 블록의 얼굴의 (C) 화상 SBEM. SBEM와 공 초점 데이터 (D)의 상관 관계는 관심 (흰색 화살표)의 셀을 식별합니다. C와이 그림의 D에서 이미지 Bohorquez 등.에서 수정 된 2014 년 8. 블루 DAPI 핵 얼룩을 =. 바 = 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 :. Imaris 소프트웨어를 사용하여 장 내분비 세포의 데이터가 3D로 렌더링 () 볼륨 렌더링. 세포가 분비 소포로 포장 neuropod가 포함되어 있습니다. 장 내분비 세포의 미세 구조에 대한 자세한 설명은 Bohórquez 등. 2014 년 8을 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

위장 chemosensation는 생물 의학 연구에서 흥미로운 새로운 분야로 부상하고있다. 이는 장 내분비 세포 (18)의 기능적 미각 수용체의 발견으로 큰 부분이다. 후속 연구는 장 내분비 세포가 탄수화물, 지질 및 아미노산 5,6,19,20를 포함하여 영양소, 특정 수용체를 발현하는 것으로 나타났습니다. 이러한 발견을위한 촉매 요소는 장 내분비 세포가 형광 물질 (20)로 표시되는 리포터 마우스의 개발이었다. 우리는 원위부 소장과 대장 17,21의 장 내분비 세포를 연구하기 위해,이 마우스 하나, PyyGFP 마우스를 개발했다. 그들은 물림 22,23 유도제이다 둘 PYY 및 글루카곤 유사 펩티드 1 분비 때문에 이러한 세포는 관심이다. 당시,이 세포의 전체 초 구조 계정은 우리가 그들의 신호 메커니즘을 이해하는 것이 필수적 생각하는, 누락되었습니다.

"ontent은> 여기에서, 우리는 SBEM와 공 초점 현미경을 해소하기 위해 시각적 방법을 설명했다. 방법은 우리가 장 내분비 세포의 전체 미세 구조를 문서화 할 수 있습니다. 우리는이 세포가 3 ~ 포함 neuropod이보고 한 허용 Cocem3D로 불린다 세포를 장 내분비이 neuropods 물리적 뉴런에 연결하지만 분비 소포 8의 모든 분기. neuropod 내에서이 neurofilaments 및 신경 축삭 같은 많은있다, neuropods이 장 신경 교세포 (8)에 의해 양육된다. 더 중요한 것은이 장을 지배하는과 콜론 9.

cocem3D의 장점 중 하나는 단순하다. 공 초점에 의해 촬영하고 SBEM은 조직 내의 특정 셀의 식별을 용이하게 할 수있는 블록에 조직 샘플을 감소시킨다. 분비 소낭 및 다른 소기관 7 ㎚ / 화소의 해상도를 용이하게 식별 될 수있다. SBEM의 섹션이 폐기되기 때문에, 추가로 사전 처리특정 단백질을 식별하기 위해 조직의 노래하는 것은이 시점에서 옵션을 선택하지 않습니다. 그러나, 조직 블록으로부터 부분이 보존되는 아툼 (24) 등의 방법의 개발, 셀 내의 특정 단백질의 식별을 가능하게 할 가능성이있다. 장 내분비 세포는 뇌의 포만 창자 음식 간의 인터페이스 감각 때문에 장 내분비 세포에 화학 감각 수용기의 특정 위치를 결정하는 것은, 비만 약물 요법의 개발에 필수적인 정보이다.

Disclosures

박사 사티 Medicetty은의 직원과 Renovo 신경 Inc의에서 100 % 급여를 수신 그러나,이 데이터를 공유 및 재료에 조브 정책에 대한 저자의 준수를 변경하지 않습니다. 관심 없음 충돌이 남아있는 저자 선언되지 않습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline Life technologies 10010023
Heparin sodium salt Sigma H4784
Paraformaldehyde  Sigma 158127 4%, freshly made in PBS, final pH 7.4
Glutaraldehyde Sigma G5882
Dental wax Electron Microscopy Sciences 72660
Low-melting agarose Life technologies 16520-100 5%, freshly made in PBS
Standard Tissue-Tek Cryomold Electron Microscopy Sciences 62534-25
DAPI  nuclear stain Life technologies D1306
Postively charged glass slides and coverslips
Fine art paintbrush #1
Cacodylate buffer Electron Microscopy Sciences 11650
Tannic acid Electron Microscopy Sciences 21700
EMbed 812 kit  Electron Microscopy Sciences 14120
Liquid releasing agent  Electron Microscopy Sciences 70880
Liquid silver colloidal    Electron Microscopy Sciences 12630
CircuitWorks conductive epoxy   ITW Chemtronics CW2400
Variable flow peristaltic pump VWR 70730-064
VT1200S Vibrating blade microtome Leica
Zeiss 780i confocal microscope Carl Zeiss 
Sigma VP Scanning Electron Microscope  Carl Zeiss 
3view system Gatan
Renovo Neural Inc (Cleveland, OH) http://www.renovoneural.com Renovo provides 3d EM services
Fiji software Open access software
Computer station with 16 GB of RAM or more
Data visualization software Imaris 7.5  Bitplane

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References

  1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 314, 1-340 (1986).
  2. Smith, C. L., et al. Novel cell types, neurosecretory cells, and body plan of the early-diverging metazoan Trichoplax adhaerens. Current biology : CB. 24, 1565-1572 (2014).
  3. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS biology. 2, e329 (2004).
  4. Engelstoft, M. S., et al. Seven transmembrane G protein-coupled receptor repertoire of gastric ghrelin cells. Molecular metabolism. 2, 376-392 (2013).
  5. Chandra, R., et al. Immunoglobulin-like domain containing receptor 1 mediates fat-stimulated cholecystokinin secretion. The Journal of clinical investigation. 123, 3343-3352 (2013).
  6. Wang, Y., et al. Amino acids stimulate cholecystokinin release through the Ca2+-sensing receptor. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G528-G537 (2011).
  7. Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. The Journal of physiology. 589, 1081-1093 (2011).
  8. Bohórquez, D. V., et al. An enteroendocrine cell-enteric glia connection revealed by 3D electron microscopy. PloS one. 9, e89881 (2014).
  9. Bohórquez, D. V., et al. Neuroepithelial circuit formed by innervation of sensory enteroendocrine cells. The Journal of clinical investigation. (2015).
  10. Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis. Nature protocols. 4, 1145-1156 (2009).
  11. Deerinck, T., Bushong, E., Thor, A., Ellisman, M. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. University of California. San Diego San Diego, CA. (2010).
  12. Bohórquez, D. V., Chandra, R., Samsa, L. A., Vigna, S. R., Liddle, R. A. Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells. Journal of molecular histology. 42, 3-13 (2011).
  13. Nilsson, O., et al. Distribution and immunocytochemical colocalization of peptide YY and enteroglucagon in endocrine cells of the rabbit colon. Endocrinology. 129, 139-148 (1991).
  14. Mizuhira, V., Futaesaku, Y. New fixation method for biological membranes using tannic acids. Acta Histochem Cytochem. 5, 233-236 (1972).
  15. Reymond, O. L., Pickett-Heaps, J. D. A routine flat embedding method for electron microscopy of microorganisms allowing selection and precisely orientated sectioning of single cells by light microscopy. Journal of microscopy. 130, 79-84 (1983).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
  17. Bohórquez, D., Chandra, R., Samsa, L., Vigna, S., Liddle, R. Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells. J Mol Histol. 42, 3-13 (2011).
  18. Jang, H. J., et al. Gut-expressed gustducin and taste receptors regulate secretion of glucagon-like peptide-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 15069-15074 (2007).
  19. Liou, A. P., et al. The G-protein-coupled receptor GPR40 directly mediates long-chain fatty acid-induced secretion of cholecystokinin. Gastroenterology. 140, 903-912 (2011).
  20. Reimann, F., et al. Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell metabolism. 8, 532-539 (2008).
  21. Bohorquez, D. V., Liddle, R. A. Axon-like basal processes in enteroendocrine cells: characteristics and potential targets. Clinical and translational science. 4, 387-391 (2011).
  22. Batterham, R. L., et al. Gut hormone PYY(3-36) physiologically inhibits food intake. Nature. 418, 650-654 (2002).
  23. Flint, A., Raben, A., Astrup, A., Holst, J. J. Glucagon-like peptide 1 promotes satiety and suppresses energy intake in humans. The Journal of clinical investigation. 101, 515-520 (1998).
  24. Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Frontiers in neural circuits. 8, 68 (2014).
특정 감각 세포의 상호 공 초점 및 3D 전자 현미경
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Bohórquez, D., Haque, F., Medicetty, S., Liddle, R. A. Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell. J. Vis. Exp. (101), e52918, doi:10.3791/52918 (2015).More

Bohórquez, D., Haque, F., Medicetty, S., Liddle, R. A. Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell. J. Vis. Exp. (101), e52918, doi:10.3791/52918 (2015).

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