Abstract
אחד התהליכים העיקריים של דלקת היא החדירה של תאי מערכת חיסון מלומן של כלי הדם לרקמות שמסביב. מצב זה מתרחש כאשר תאי אנדותל, אשר מרפדים את כלי דם, הפכו לדבק במחזור תאים חיסוניים כגון מונוציטים. מדידה במבחנה של הדביקות הזאת עד עכשיו נעשתה על ידי כימות המספר הכולל של מונוציטים שלדבוק שכבת האנדותל או כספירה ישירה או על ידי מדידה עקיפה של הקרינה של מונוציטים חסיד. בעוד מדידות כאלה לעשות לציין הדביקות הממוצעת של אוכלוסיית תאי אנדותל, הם מבולבל על ידי מספר הגורמים, כגון מספר תאים, ולא לחשוף את חלקם של תאי האנדותל, כי הם דבקים למעשה. כאן אנו מתארים ומדגימים שיטה המאפשרת הספירה של תאים מודבקים בתוך אוכלוסייה שנבדקה של monolayer האנדותל. תאי האנדותל גדלים על coverslips הזכוכית והבא רצוייםטיפול מאותגרים עם מונוציטים (שעשוי להיות שכותרתו fluorescently). לאחר הדגירה, הליך שטיפה, מעורבת סבבים רבים של טבילה וניקוז, התאים הם קבועים. תאי האנדותל דבקים, אשר מוקפים במונוציטים בקלות מזוהים ומנויים, נותנים מדד הידבקות החושף את החלק הממשי של תאי האנדותל באוכלוסייה שהם דבקים.
Introduction
הסתננות של תאים חיסוניים כגון מונוציטים פני שכבת תאי האנדותל המרפדים את כלי דם היא צעד חשוב בתהליך של דלקת 1. זה מאפשר הביות של תאי מערכת חיסון (immunocytes) לאתר של פציעה. במקרים אחרים ובמקומות כגון עורקים הכליליים ועורק הראשי, חדירה של מונוציטים דרך שכבת האנדותל יכולה להוביל למגורים לטווח ארוך רצויים של תאים אלה בקיר של העורק, שעלול להוביל להיווצרות הפלאק 2. בכל המקרים של חדירת immunocyte, הצעד הראשון כרוך בהפעלתם של תאי האנדותל באזור מקומי של כלי הדם. תאי האנדותל מופעלים על ידי ציטוקינים פרו-דלקתיים כגון TNF-α ו- IL-6 להגדיל ביטוי של חלבונים בתא שטח כגון VCAM, ICAM ו- E-selectin המאפשרים הגיוס וקשר של immunocytes על פני השטח של תאי אנדותל 3 6.
= "Jove_content" ילדה> בתחילה, מדידה של הידבקות תא אנדותל בוצעה על ידי ספירת מונוציטים שדבקו אנדותל monolayer 7. מגבלותיה של שיטה זו במונחים של דיוק הובילו לשימוש בהלימפוציטים שכותרתו ברדיו או במונוציטים, ואחריו כימות של חומר רדיואקטיבי אשר תואם לימפוציטים או מונוציטים הידבקות 4. שיטה זו הוחלפה סופו של דבר על ידי שיטת הקרינה מבוססת, לפיה immunocytes עניין תויגה עם צבע פלואורסצנטי וכפוף לאותו ההליך כאמור לעיל עם ההבדל הוא הקרינה שבמקום רדיואקטיביות נמדדה 8. כיום שיטה זו התגלתה כנוחה ביותר ונמכר בצורת ערכה על ידי מספר ספקים מסחריים. בעוד assay זה יכול למדוד את הרמות יחסי של דביקות בין בקרות ודגימות ניסוי, זה לא לגלות אם שינוי בקרינה נובע משינוי אחיד בדביקות על פני כל הדואראוכלוסיית תא ndothelial או אם השינוי נובע מהבדל של דביקות בתת-אוכלוסייה של תאים. זה ניכר גם שהחומרה של שטיפה מפעילה השפעה עמוקה על התוצאה, ויותר חשוב מכך, את האחידות של שטיפה את מונוציטים מאוגד בין monolayers תא אנדותל שונה תשפיע במידה רבה על הקרבה של תוצאות ממשכפל והשחזור של התוצאות בין דגימות . לאחרונה, מספר מערכות שלשאוב מונוציטים בתקשורת ברחבי monolayer תא האנדותל שמשו כדי לטפל בבעיה זו 9. בנוסף, זרימת מערכות אלה גם לשחזר את האפקט של כוח גזירה על תאי האנדותל. למרות היתרונות של מערכות כאלה הם ברורים ומאוד אטרקטיביים, זה גם חשוב להבין כי בעוד דביקות תא האנדותל יכולה להיות מוגברת באופן משמעותי, כמו במקרה של דלקת חריפה ב, על ידי גורמים כגון TNFα, כמה מפעילים אחרים, כגון קרינה מייננת 10 לעורר שינויים לאכובע אינו מזוהה בקלות בתוך מבחנה מסגרות זמן ניסיונית על ידי מערכות מאוד מחמירות אלה. בעוד כגון שינויים של הרגע של דביקות תא האנדותל הם החמיצו או פוטרו במבחנה בקלות, זה לא פיר בהכרח in vivo, שבו שינויים קטנים כאמור בתוך זמן חיים, שהוא אופייני לדלקת כרונית, יכולים להפעיל תוצאות מאוד משמעותיות. לפיכך שיטה חזקה, עדיין רגישה, וספציפית כדי לזהות ולמדוד נחוצה דביקות תא האנדותל.
כאן, אנו מדווחים על שיטה למדידת דביקות של תאי האנדותל ישירות. שיטה זו אינה מסתמכת על מדידת הקרינה כאינדיקטור פונדקאית עקיף של דביקות תא האנדותל. הוא מגלה אם שינויים בדביקות הם עקב שינוי אחיד על פני כל התאים או מרותק לתת-אוכלוסייה. יתר על כן, היא מאפשרת שיתוף צביעת תאי אנדותל עם סמנים כמו בטא galactosidase הקשורים הזדקנות, מר כדאיות תאker, Calcien בבוקר ונוגדנים נגד פני תא וחלבונים תאיים, המאפשרים לעמותה של תאי האנדותל דבקים פרט למדינות תא מסוימים או ביטוי של חלבונים ספציפיים.
Protocol
1. הכנת Coverslips הזכוכית
- לעקר קוטר 12 מ"מ עגול coverslips זכוכית ידי טבילתם באתנול 70% לפחות 10 דקות, כאשר מדי פעם תסיסה על מנת להבטיח חשיפה כוללת של כל coverslips לאתנול. יוצקים coverslips הזכוכית ואתנול לתוך צלחת תרבית תאים סטריליים (או 6 סנטימטר או 10 סנטימטרים קוטר).
- עם זוג 5 מלקחיים עדינים סטריליים, להרים ולמקם את כל coverslip זכוכית בודד לתוך באר של צלחת גם אשכול 24. תשמור על מנת להבטיח שcoverslips אינו נוגע בצדי היטב והם בערך באמצע של הבאר.
- השאר את הצלחת גם אשכול 24 מכוסה האו"ם עם coverslips זכוכית לייבוש בזרימת הממשלה. זה לוקח בערך 10 דקות
- במהלך תקופה זו, להכין את תערובת הציפוי על ידי דילול 10 מ"ג / מיליליטר פיברונקטין אדם בפתרון של האנק מאוזן מלח (HBSS) 0.1 מ"ג / מיליליטר.
- כאשר coverslips יבש, של פתרון ציפוי פיפטה 100 μl על כל שיתוף זכוכיתverslip כך הפתרון מכסה רק את הזכוכית ללא איגום סביב החלק החיצוני של הבאר. מניחים את הצלחת 24 גם אשכול המכוסה בתרבית תאי חממה לשעה לפחות.
- רק לפני השימוש, להסיר את פתרון הציפוי. אותו פתרון הציפוי יכול להיות מועבר לצינור סטרילי ומשמש עד שלוש פעמים ללא הפסד גלוי של יעילות.
2. הכנת חד שכבתי תא האנדותל
- תאי תרבות אנושיים כליליים אנדותל העורק (EC) במדיום על 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני.
- לשאוב את התקשורת ותרבות ולשטוף monolayer EC עם 10 מיליליטר HBSS
- לשאוב את HBSS ולהוסיף 2 מיליליטר 0.5% טריפסין, 0.2% פתרון EDTA. לדגור על RT עבור כ 5 דקות.
- כאשר ניתן וחילצה EC על ידי ברז לצד השני של הבקבוק, להוסיף 5 מיליליטר של מעכבי טריפסין סויה ועם פיפטה להשפריץ את פני השטח של הבקבוק כדי לסלק נוסף התאים.
- העברת תאים לתוך צינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות הצינורב XG 200 במשך 5 דקות.
- לשאוב את supernatant ו resuspend גלולה בר ב5 מיליליטר של תקשורת. ספירת התאים עם haemocytometer ולהתאים את ריכוז התאים 50,000 EC לכל מיליליטר של תקשורת EC.
- לוותר על 1 מיליליטר של ההשעיה התא לבאר כל הצלחת גם 24 המכילה coverslips זכוכית מצופה. דגירה תאי O / N בתרבית תאי החממה ב 37 מעלות צלזיוס בתוספת 5% פחמן דו חמצני.
- התאים מוכנים לשימוש בניסויים כאשר monolayer ומחוברות נוצר, תוך 3 ימים.
3. הכנת מונוציטים
- העבר את HL-60 תאים בתרבית שבRPMI בתוספת 10% עגל בסרום עוברי, כתרבות השעיה, לתוך צינור 15 מ"ל. צנטריפוגה התאים ב XG 200 במשך 5 דקות.
- הסר את תאי supernatant ו resuspend ב 5 מיליליטר תקשורת ולהתאים את ריכוז תאים עם תקשורת 2 מיליון תאים / מיליליטר. אם תיוג הקרינה של HL-60 הוא רצוי, resuspend תאי RPMI ללא סרום ויחסי הציבורoceed כאמור בסעיף 4.
- הוסף 0.5 מיליליטר של HL-60 השעיה תא לבאר כל צלחת 24 גם אשכול המכילה monolayer EC דגירה הצלחת בתרבית תאי חממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני לנבחרה לתקופה קצובה של זמן בין 1 ו -3 שעות. הבדל קטן הוא ציין בין שעה 1 ונקודת זמן 3 שעות, שבו רוויה מחייבת מושגת.
- היכונו לשטיפה / קצירת תא: מלא צינור 120 מיליליטר עם של HBSS 100 מיליליטר. לוותר על 1 מיליליטר של פורמלין לבאר כל צלחת גם טרי 24.
- לאחר תקופת הדגירה, להשתמש זוג מלקחיים חדים ולהרים את coverslip הזכוכית מהבאר והחזק את coverslip אנכי ומורחים את הקצה של coverslip על פיסת הרקמה על הספסל במשך 3 שניות, נזהר שלא לגעת ב משטח מכוסה תא של coverslip עם הרקמה.
- מחזיק coverslip היטב עם זוג המלקחיים, להטביע את coverslip ובמתוך HBSS חמש פעמים.
- לאחר דאנק החמישיבHBSS, מורח את הקצה של coverslip על הרקמה במשך 3 שניות.
- חזור על הנהלים הטובלים וספיגה מתואר ב3.6 ו -3.7, מה שהופך את הסכום כולל של שלושה סטים של 5 הטבעות אחרי טיפה.
- העבר את coverslip לפורמלין 10% המכיל גם כדי לתקן את התאים ב RT. Coverslip מוכן לספירה, לאחסון לטווח ארוך או להיות נתון להליכים אחרים שיתוארו להלן.
4. תיוג של HL-60 תאים עם Tracker הנייד (לא חובה)
- רוזן ולהעביר כמות מתאימה של HL-60 תאים (למשל, 10 מ') לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. צנטריפוגה HL-60 תאים ב XG 200 במשך 5 דקות. הסר supernatant.
- גלולה גלולה תא במעקב סלולארי בתקשורת RPMI ללא סרום בריכוז של 1 מיליון תאים / מיליליטר. דגירה תאים בתרבית תאי חממה עבור שעה 1.
- תאי צנטריפוגה XG 200 במשך 5 דקות וזורקים supernatant. גלולה תא גלולה בתקשורת לריכוז של 2 מיליון ג/ אמות מיליליטר.
- הוסף 0.5 מיליליטר של שכותרת Tracker הנייד HL-60 לכל תאי האנדותל המכילים גם גדלו על coverslip זכוכית. המשך על 3.3.
5. ספירת תאי האנדותל דבק
- הר coverslips על שקופיות מיקרוסקופ עם נגדי כתם DAPI לזהות תאים בודדים.
- באמצעות מיקרוסקופ הפוכה עם מטרת 4X או 10X, לרכוש תמונות של כמה שדות (לדוגמא, 5 שדות) ולספור את המספר הגבוה ביותר של מונוציטים שמצטברים בתאי האנדותל בלתי מוקרן (זה צריך להיות בדרך כלל 3-5).
- קבע פעמיים מספר זה כסף של מונוציטים בתא האנדותל להיות שהוגדר כאשכול. אם נדרש, קריטריון שונה יכול לשמש להגדרת אשכול בהתאם לאופי של הניסוי.
- לספור את מספר האשכולות ואת מספר תאי אנדותל בתחום. מחלקים את לשעבר ע"י האחרון כדי להשיג את אחוז תאי האנדותל דבקים. ציוןשדות רבים כדי להשיג סטייה ממוצעת וסטנדרטית של הספירה.
Counterstaining 6. עם נוגדנים
- לאחר assay ההידבקות והתאים על coverslip תוקנו בפורמלין 10% במשך 15 דקות ב RT, להכפיף את coverslips לimmunofluorescence באמצעות הליך סטנדרטי 10 ונוגדנים של בחירה.
- הוספה והסרה של הפתרונות השונים מאוד בעדינות כדי למנוע פירוק מונוציטים שמחוברים לתאי אנדותל.
7. counterstaining לפעילות בטא-galactosidase הקשורים הזדקנות
- לאחר assay ההידבקות ותאים על coverslip תוקנו בפורמלין במשך 15 דקות, כתם לפעילות בטא galactosidase הקשורים הזדקנות כפי שמתואר בהוראות המלוות את ערכת הצביעה. הוספה והסרה של הפתרונות השונים מאוד בעדינות כדי למנוע פירוק מונוציטים שמחוברים לתאי אנדותל.
Representative Results
שיטה זו מאפשרת זיהוי של תאי האנדותל דבקים בודדים בתוך אוכלוסייה. לדוגמא, בעוד monolayer של תאי האנדותל מוקרן האו"ם שמר כמה HL-60 מונוציטים סדירים הבאים דגירה וכביסה, monolayer האנדותל ב -7 ימים שלאחר הקרנת 10Gy לפני דגירה עם מונוציטים היו קשורים במונוציטים באשכולות סביב תאי האנדותל בודדים ( איור 1). למרות שתופעה זו היא לצפות בקלות תחת מיקרוסקופ לעומת שלב, מיקרוסקופ פלואורסצנטי מגלה תמונה ברורה אף יותר של אשכולות מונוציטים.
לאחר ביצוע assay ההידבקות תאר, אפשר להמשיך למכתימים את התאים לממברנה, cytoplasmic או גרעיני (איור 2) חלבונים באמצעות נוגדנים מתאימים עם שיטות immunofluorescence סטנדרטיים. יתר על כן, assay אנזים מבוסס כגון בטא-galactosidase הקשורים הזדקנות (איור 3) יכול להיות גם PErformed.
מאז כל אשכול מונוציטים מתאים לתא האנדותל בודד, ספירה של האשכולות תחשוף את המספר האמיתי של תאי האנדותל דבקים בתוך monolayer (איור 4), ולכן אחוז תאי האנדותל דבקים באוכלוסייה (הטבלה 1, איור 6) . זוהי השיטה היחידה עד כה שמאפשר כגון כימות של דביקות תא האנדותל. ראוי לציין כי תאי האנדותל המשמשים בניסויים הנה-עכבות קשר ולא להגדיל במספר לאחר שהשיג נקודת המפגש. זה מבטל את מורכבות פוטנציאל טמונה במספר תא האנדותל עלה בנקודות זמן מאוחר יותר. אם תרצה, מונוציטים המצורפים לmonolayers אנדותל ניתן וחילצה ב -0.5% פתרון EDTA טריפסין-0.2% (במקום 3.9 קיבעון ב) והקרינה שלהם נמדדו באמצעות קורא צלחת, כמו במקרה של בשיטות עכשוויות (איור 5). 
הידבקות באיור 1. של מונוציטים על monolayer של תאי האנדותל. בתאי האנדותל בלתי מוקרן, מונוציטים דבקו כתאים בודדים באופן סדיר ואקראי (משמאל לוחות) ובאשכולות על תאי האנדותל בודדים של 7 ימים לאחר 10 Gy המוקרנים monolayer (לוחות מימין). לוחות נמוכים הם תמונות הקרינה של הפנלים העליונים, המאשרים כי התאים כדוריים הקטנים ובהירים הגלויים תחת ניגוד שלב אכן מונוציטים שמראש שכותרתו עם התא-Tracker ירוק. חלק מאשכולות מונוציטים מסומנים על ידי חצים לבנים. תמונות צולמו באמצעות מטרת 10X. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
מכתים איור 2. תאי אנדותל עבור assay חלבונים לאחר הידבקות. לאחר ביצוע assay ההידבקות תאר, תאים על coverslips הזכוכית היו נתונים לimmunofluorescence לגילוי (א) חלבון קרום (CD44), ב) חלבון cytoplasmic (טובולין) או ג) חלבון גרעיני (γ-H2AX). לוחות שמאל של (א) ו- (ב) (ראה עם מטרת 20X) מונוציטים מופע שכותרתו מראש עם תא Tracker הירוק ותמונה דומה על הלוחות תקין לחשוף CD44 וmicrotubules (אדום) וגרעינים צבעוניים DAPI (כחול). חצים לבנים בצבע על גרעין תא אנדותל המוקרן שהוכתמו נוגדנים נגד γ-H2AX (C). גרעיני מונוציטים שהם מוכתמים בהירים כחולים על ידי DAPI בקלות להבחין בין הגרעינים הסגלגלים בצורה של תאי האנדותל. תמונות צולמו עם מטרת 20X. "Target =" _ jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig2large.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. מכתים בטא galactosidase הקשורים הזדקנות של תאי האנדותל. לאחר assay ההידבקות, תאים על coverslips היו נתונים לצביעה לבטאו galactosidase הקשורים הזדקנות שגורם lysosomes של תאים מזדקנים להכחיל, כפי שעולים בתא אנדותל ש הוא חייב באופן סלקטיבי על ידי מספר רב של מונוציטים, אשר מזוהים בקלות בשל גודלם הקטן וצורה כדורית. תמונה נראית דרך אובייקטיבי 20X. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
2,924 / 52924fig4.jpg "/>
ספירת 4. איור של אשכולות מונוציטים על תאי האנדותל בודדים. לאחר assay ההידבקות, תמונות של התאים נלקחו מכמה עמדות שונות ואשכולות מונוציטים המזוהים והקיפה (בירוק). אשכול הוגדר כמסכת של 10 או יותר מונוציטים בתא האנדותל. מספר אשכולות מונוציטים ומספר 12 ימי תאי האנדותל לאחר מוקרן (המנוקד באדום) בתמונה נספר ואחוז תאי אנדותל חסיד מחושבים כפי שמוצג בטבלה 1. תמונה שצולמה באמצעות אובייקטיבי 10X. אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. כימות הקרינה של מונוציטים חסיד. adhe הבא assay שיאון, תאים על coverslips זכוכית trypsinised והקרינה של מונוציטים שכותרתו מראש עם CellTracker הירוק נמדדה, באמצעות קורא צלחת הקרינה, כאינדיקציה עקיפה של הדביקות של monolayer האנדותל. תוצאות ממדידות כאלה בימים האמורים שלאחר הקרנה-התקבלו וקלוע בגרף לעיל.
ייצוג איור 6. ציוני assay הידבקות מהטבלה 1. תאי האנדותל דבקים בחמישה מקומות שונים בשלושה coverslips זכוכית הובקעו כמתואר באיור 4 והתוצאות נספר מעל הוכחה כי 12 ימים לאחר 10 הקרנת Gy, 8 עד 10 אחוזים ממוקרנים תאי האנדותל הפכו דבק.
| 3 "> אחוז דבק | |||
| דיסק 1 | דיסק 2 | דיסק 3 | |
| שדה 1 | 8.65 | 8.29 | 8.21 |
| שדה 2 | 10.44 | 7.27 | 7.21 |
| שדה 3 | 9.63 | 9.05 | 8.33 |
| שדה 4 | 11.11 | 7.09 | 8.41 |
| שדה 5 | 10.55 | 9.4 | 11.61 |
| ממוצע | 10.07 | 8.22 | 8.75 |
עשרות assay 1. הידבקות שולחן. תאי האנדותל דבקים בחמישה מקומות שונים בשלושה coverslips זכוכית הובקעו כמתואר בFigure 4 והתוצאות נספר מעל הוכחה כי 12 ימים לאחר 10 הקרנת Gy, 8 עד 10 אחוזים מתאי האנדותל המוקרנים הפכו דבק.
Discussion
Assay הידבקות מונוציטים שתואר לעיל שימש בהצלחה בניסויים שנועדו לחקור את ההשפעות הביולוגיות של קרינה מייננת על monolayers אנדותל 10. אמנם זה לא השיטה היחידה העומדת לרשות להעריך את הדביקות של monolayer האנדותל, היא השיטה היחידה המאפשרת כימות של החלק או אחוז תאי אנדותל בmonolayer כי הוא דבק. זו הבחנה חשובה כמו שינוי הכמותי עולמי בהידבקות של מונוציטים, כפי שנמדד על ידי שיטות אחרות ניתן לייחס גם לעלייה כללית בדביקות של כל התאים של monolayer האנדותל או לדביקות הגידול של תת-אוכלוסייה של תאי האנדותל בתוך monolayer, כפי שמוצג בדוגמא לעיל. הערך שיש במידע זה בא לידי ביטוי בעובדה שהיכולת לכמת אחוז תאי האנדותל שהציגו דביקות משופרת לאחר ההקרנה הובילה לאינסמסוגל מסקנה שהשפעה זו אינה נובעת ממוטציה הגנטית של גן מסוים כאחוז התאים שהיו דבקים היתה מאוד מעל (מעל 1,000 פעמים יותר) שבו ניתן היו לצפות מן המוטציה של גן אקראי על ידי X-קרינה במינון ש .
הגורם המאפשר שחזור טוב של התוצאות הוא משטר הכביסה. כנוהל השטיפה כרוך הטבילה של coverslip הזכוכית לחיץ לשטוף אחריו מספיגה על רקמה, השתנות במערבולת החיץ שמתעוררת באופן בלתי נמנע מהשיטה של pipetting של החיץ לשטוף לתוך באר הישנה הוא נמנע. ואכן זה היה התצפית של השתנות מוגזמות בין משכפל שהושג באמצעות שיטת pipetting שאלצה אותנו לתכנן הליך כביסה שהסיר את האלמנט השונות מהשלב הכביסה.
אמנם, המגבלות של שקר assay זה בצורך לבצע ספירה ידנית של אשכולות מונוציטים, שעושה not לאפשר לו להיות מותאם לתפוקה גבוהה מנתח. שנית, ההחלטה על אופן מונוציטים רבים מהווים אשכול יש שתיקבע באופן שרירותי וחצי הרמה ניתן להגדיר גבוהה מדי ולגרום להרחקה של כמה אשכולות אמיתיים. יכול גם להיות שנצפה החוסר בכוח גזירה בשיטה זו כהגבלה בניסויים שבהם דביקות משופרת גס של תאי האנדותל מושרה (למשל, + TNFα). במצבים אחרים לעומת זאת, החוסר בכוח הגזירה הוא יתרון שכן היא מאפשרת זיהוי של הגדלת פחות מוגזמת של דביקות. עלייה צנועה בדביקות מונוציטים יכולה להיות חשובה ורלוונטית במיוחד. בvivo, מונוציטים לא (בזמן ניסוי טיפוסי) צפוי לצרף במספרים גדולים לתאי אנדותל עם עלייה צנועה בדביקות, במידה רבה בשל הגזירה כוח. בזמן עם זאת, כמה מונוציטים כנראה הייתם, וזה סביר יותר מייצג את הסביבה של דלקת כרונית. כמו,העדר כוח גזירה יכול להיות יתרון כפי שהוא מספק הזדמנות לעליות קטנות בדביקות תא האנדותל להתגלות במסגרות זמן ניסיוניות שהן בדרך כלל קצרים ואולי גם חולפים כדי לאפשר גידול צנוע בדביקות שנצפה תחת מאמץ גזירה.
היכולת להכפיף את התאים לאחר assay זה לניתוחים אחרים כגון assay הזדקנות ומכתים immunofluorescence מגדילה את התועלת של שיטה זו שכן היא מאפשרת את הקשר של דביקות של תאי האנדותל ספציפיים לחלבונים תאיים מסוימים או מדינות סלולריות כפי שהודגם לעיל, תכונה ש אינו זמין עם מבחני הידבקות המבוגרים.
שיטה זו נעשתה שימוש בתאים-הונצח est2 אדם כלילית אנדותל ותוצאות דומות התקבלו גם בתאים ראשוניים אדם כלילית אנדותל 10, מדגים שזה לא ספציפי רק קו תא מסוים. כמו כן, ADOption של שיטה זו של מנסה לאמוד דביקות של תאי האנדותל אינו מונע העמדת אותם תאים לassay ההידבקות הסטנדרטי שמודד הקרינה של immunocytes שכותרת. יחד, דוח זה מוכיח כי שיטה זו היא תכליתית, כוללת ומספקת הרבה יותר מידע מאשר assay ההידבקות הסטנדרטי.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hepes Buffered Saline Solution (HBSS) | Sigma | H6648 | |
| Glass coverslips Round 12 mm Diameter | Menzel-Glaser | CB00120RA1 | |
| 24-well cluster plate | Costar | 3526 | |
| Meso-Endo Cell media | Cell Applications | 212-500 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4174 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Life Technologies | 17075-029 | |
| Cell Tracker Green | Life Technologies | C7025 | |
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Foetal Calf Serum | Life Technologies | 10500064 | |
| Beta glasctosidase Assay kit | CellSignaling | 9860 | |
| Fibronectin | Sigma | F0895 |
References
- Ortega-Gomez, A., Perretti, M., Soehnlein, O. Resolution of inflammation: an integrated view. EMBO Mol Med. 5 (5), 661-674 (2013).
- Libby, P. Inflammation and cardiovascular disease mechanisms. Am J Clin Nutr. 83 (2), 456S-460S (2006).
- Ikuta, S., Kirby, J. A., Shenton, B. K., Givan, A. L., Lennard, T. W. Human endothelial cells: effect of TNF-alpha on peripheral blood mononuclear cell adhesion. Immunology. 73 (1), 71-76 (1991).
- Watson, C., et al. IL-6 acts on endothelial cells to preferentially increase their adherence for lymphocytes. Clin Exp Immunol. 105 (1), 112-119 (1996).
- Sans, M., et al. VCAM-1 and ICAM-1 mediate leukocyte-endothelial cell adhesion in rat experimental colitis. Gastroenterology. 116 (4), 874-883 (1999).
- Su, Y., Lei, X., Wu, L., Liu, L. The role of endothelial cell adhesion molecules P-selectin, E-selectin and intercellular adhesion molecule-1 in leucocyte recruitment induced by exogenous methylglyoxal. Immunology. 137 (1), 65-79 (2012).
- Hallahan, D., Kuchibhotla, J., Wyble, C. Cell adhesion molecules mediate radiation-induced leukocyte adhesion to the vascular endothelium. Cancer Res. 56 (22), 5150-5155 (1996).
- Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion. J Immunol Methods. 159 (1-2), 93-100 (1993).
- Prabhakarpandian, B., Shen, M. C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvasc Res. 82, 210-220 (2011).
- Lowe, D., Raj, K. Premature aging induced by radiation exhibits pro-atherosclerotic effects mediated by epigenetic activation of CD44 expression. Aging Cell. 13 (5), 900-910 (2014).
