Abstract
En av kardinal prosesser av betennelse er infiltrasjon av immunceller fra hulrommet i blodkaret til det omgivende vev. Dette skjer når endotelceller, hvilken linje blodkar, blir limet til sirkulerende immunceller slik som monocytter. In vitro måling av denne klebeevne har frem til nå blitt gjort ved å kvantifisere det totale antall monocytter som fester seg til en endotelial sjiktet enten som en direkte telling eller ved indirekte måling av fluorescensen av adherente monocytter. Selv om slike målinger, indikerer at den gjennomsnittlige klebrighet endotelial cellepopulasjon, er de skamme av en rekke faktorer, så som celleantall, og avslører ikke andelen av endotelceller som faktisk er limet. Her beskriver vi og vise en metode som gjør det mulig opptellingen av selvklebende celler i en testet befolkning på endothelial enkeltlag. Endoteliale celler blir dyrket på dekkglass, og følgende ønskedebehandling blir utfordret med monocytter (som kan være fluorescensmerket). Etter inkubasjon en skylling prosedyre som involverer flere runder med nedsenking og drenering, blir cellene fiksert. Selvklebende endotelceller, som er omgitt av monocytter blir lett identifiseres og nummerert, noe som gir en adhesjon indeks som viser den faktiske andel av endoteliale celler i populasjonen som er limet.
Introduction
Infiltrasjon av immunceller som monocytter over endotelceller lag som linje blodkar er et viktig skritt i prosessen med betennelse 1. Dette gjør at homing av immunceller (immunocytter) til et skadested. I andre tilfeller og steder som kransarterien og halspulsåren, kan infiltrering av monocytter gjennom endoteliale sjikt føre til uønsket lang sikt oppholdstid av disse cellene i veggen av arterien, som kan føre til dannelsen av plakk 2. I alle tilfeller av immunocytt infiltrering, innebærer det første trinnet aktivering av endotelcellene i et lokalisert område i blodkaret. Endotelceller aktiveres av pro-inflammatoriske cytokiner som TNF-α og IL-6 for å øke ekspresjonen av celleoverflateproteiner som for eksempel VCAM, ICAM og E-selektin som letter rekruttering og feste av immunocytter på endotelcelleoverflaten, hvorved 3- 6.
7. Begrensningene ved denne metoden når det gjelder presisjon ført til bruk av radiomerket lymfocytt eller monocytt, etterfulgt av kvantifisering av radioaktivt materiale som tilsvarer lymfocytter eller monocytter adhesjon 4. Denne metoden ble etter hvert erstattet av en fluorescens-basert metode, hvorved immunocytter av interesse ble merket med fluorescens fargestoff og utsatt for den samme prosedyren som ovenfor med den forskjell at i stedet for fluorescens radioaktiviteten måles 8. Tiden denne metoden har dukket opp som den mest praktiske og selges som byggesett av flere kommersielle leverandører. Selv om denne assay kan måle relative nivåer av klebrig mellom kontroller og eksperimentelle eksempler, vil det ikke avsløre om en endring i fluorescens er på grunn av en jevn endring i klebeevnen på tvers av hele endothelial cellepopulasjon, eller hvis endringen skyldes en forskjell på klebrighet i løpet av en sub-populasjon av celler. Det er også tydelig at stringens vaske utøver en dyp effekt på resultatet, og enda viktigere, vil enhetlig skylling av ubundne monocytter mellom ulike endothelial cellemonolag påvirke sterkt på nærhet av resultater fra replikater og reproduserbarhet av resultatene mellom prøvene . Mer nylig ble flere systemer som pumper monocytter i media over en endotelial celle monolag brukt for å løse dette problemet 9. I tillegg er disse strømningssystemer også rekapitulere virkningen av skjærkraft på endotelceller. Mens fordelene ved slike systemer er klar og meget tiltalende, er det også viktig å innse at selv kan endotelcelle klebrighet bli sterkt utvidet, slik tilfellet er i akutt inflammasjon, av faktorer slik som TNFa, noen andre aktivatorer, slik som ioniserende stråling 10 Elicit endrer that er ikke lett oppdages innen in vitro eksperimentelle tidsrammer av disse svært strenge systemer. Selv om slike små endringer av endotelial celle klebrighet er lett tapt eller avvist in vitro, er det ikke nødvendigvis godartet in vivo, hvor slike små endringer innenfor en levetid, som er karakteristisk for kronisk betennelse, kan utøve meget betydelige resultater. Derav en robust, men likevel følsom og spesifikk metode for å detektere og måle endotelcelletype klebeevnen er nødvendig.
Her rapporterer vi en metode for å måle klebeevnen av endotelceller direkte. Denne metoden ikke er avhengig av måling av fluorescens som en indirekte surrogat indikator på endotelceller klebrighet. Det avslører om endringer i klebrighet skyldes uniform endring på tvers av alle celler eller begrenset til en sub-populasjon. Videre gir det co-farging av endotelceller med markører som senescens-assosiert beta-galaktosidase, celleviabilitet Marker, Calcien AM og antistoffer mot celleoverflate og intracellulære proteiner, slik at foreningen av de enkelte klebe endotelceller til visse celle tilstander eller ekspresjonen av spesifikke proteiner.
Protocol
1. Utarbeidelse av dekkglass
- Steriliser mm diameter 12 runde dekkglass ved å dyppe dem i 70% etanol i minst 10 minutter med leilighetsvis omrøring for å sikre total eksponering av alle dekk til etanol. Hell dekkglass og etanol i en steril cellekulturskål (enten 6 cm eller 10 cm diameter).
- Med et par sterile fin 5B tang, plukke opp og plassere hver enkelt glass dekkglass i en brønn av en 24 godt klynge plate. Vær nøye med å sikre at Dekk ikke berører sidene av godt og er omtrent i midten av brønnen.
- La un dekket 24 godt cluster plate med dekkglass til tørk i flyten kabinettet. Dette tar ca 10 min
- I løpet av denne perioden, fremstille beleggblandingen ved fortynning av 10 mg / ml humant fibronektin i Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS) til 0,1 mg / ml.
- Når objektglassene er tørre, pipettes 100 ul av beleggløsningen på hvert glass coverslip så løsningen kun dekker glasset uten å samle seg rundt utsiden av brønnen. Plasser dekket 24 også klynge plate i en cellekulturinkubator i minst en time.
- Like før bruk, fjerner beleggløsningen. Det samme beleggsløsning kan overføres til et sterilt rør og brukt opp til tre ganger uten synlig tap av effekt.
2. Utarbeidelse av endotelcelle med ett lag
- Kultur humane koronare arterie endotelceller (EC) i medium ved 37 ° C og 5% karbondioksid.
- Aspirer av kultur media og skyll EC monolaget med 10 ml HBSS
- Aspirer off HBSS og tilsett 2 ml 0,5% Trypsin, 0,2% EDTA løsning. Inkuber ved romtemperatur i omtrent 5 min.
- Når EC kan forskyves ved et trykk på siden av kolben, tilsett 5 ml soyabønnetrypsininhibitor og med pipette sprute overflaten av kolben for å ytterligere løsne cellene.
- Overfør cellene til en 15 ml tube og sentrifuger røretved 200 xg i 5 min.
- Aspirer av supernatanten og resuspender pelleten i EC 5 ml media. Tell cellene med et hemocytometer og justere cellekonsentrasjonen til 50000 EC per ml av EC media.
- Dispenser 1 ml av cellesuspensjonen i hver brønn på 24-brønners plate inneholdende belagte dekkglass. Inkuber cellene O / N i cellekulturinkubator ved 37 ° C pluss 5% karbondioksid.
- Cellene er klare til bruk i eksperimenter når et konfluent monolag dannes i løpet av 3 dager.
3. Fremstilling av monocytter
- Overfør HL-60-celler som er dyrket i RPMI supplert med 10% føtalt kalveserum, som suspensjonskultur, i et 15 ml rør. Sentrifuger cellene ved 200 xg i 5 min.
- Fjern supernatanten og resuspender cellene i 5 ml medium og justere cellekonsentrasjonen med media til 2 millioner celler / ml. Hvis fluorescens merking av HL-60 er ønskelig, resuspender cellene i RPMI uten serum og PRoceed som beskrevet i kapittel 4.
- Tilsett 0,5 ml av HL-60 cellesuspensjon til hver brønn på 24-brønners plate inneholdende gruppen EC monolaget og Inkuber platen i en cellekulturinkubator ved 37 ° C og 5% karbondioksyd i en valgt fast tidsrom på mellom 1 og 3 hr. Liten forskjell observeres mellom en time og tre timer tids punkt, hvor binde metning er oppnådd.
- Forbered celle vask / høsting: Fyll en 120 ml tube med 100 ml HBSS. Dispenser 1 ml formalin i hver brønn av en ny 24-brønners plate.
- Etter inkubasjonstiden, bruke et par skarpe tang og plukke opp glass dekkglass fra brønnen og hold dekk vertikale og bearbeid kanten av dekkglass på et stykke vev på benken i 3 sek, tar seg ikke å berøre celle dekket overflaten av dekkglass med vevet.
- Holder dekk fast med en pinsett, dunk dekk inn og ut av de HBSS fem ganger.
- Etter den femte dunki HBSS, DAB kanten av dekkglass på vevet i 3 sek.
- Gjenta dunking og dabbing prosedyrene beskrevet i 3.6 og 3.7, slik at totalt tre sett med fem dunks etterfulgt av en skvett.
- Overfør dekkglass i en brønn inneholdende 10% formalin for å fiksere cellene ved RT. Dekkglass er klar for opptelling, for langtidslagring eller for å bli utsatt for andre prosedyrer som er beskrevet nedenfor.
4. Merking av HL-60 celler med Cell Tracker (valgfritt)
- Teller og overføre passende mengde av HL-60-celler (f.eks 10 millioner) til et 15 ml sentrifugerør. Sentrifuger HL-60-celler ved 200 xg i 5 min. Fjern supernatant.
- Resuspender cellepelleten i Cell Tracker i RPMI-medium uten serum i en konsentrasjon på 1 million celler / ml. Inkuber cellene i cellekultur-inkubator i 1 time.
- Sentrifuger cellene ved 200 xg for 5 min og kast supernatanten. Resuspender cellepelleten i medium til en konsentrasjon på 2 millioner cells / ml.
- Tilsett 0,5 ml Cell Tracker-merkede HL-60 i hver brønn inneholdende endotelceller dyrket på dekkglass. Fortsett på 3.3.
5. Enumeration av selvklebende endotelceller
- Mount Dekk på objektglass med DAPI mot flekken for å identifisere individuelle celler.
- Ved hjelp av en invertert mikroskop med en 4x eller 10X objektiv, hente bilder av flere felt (for eksempel fem felt) og telle det høyeste antall monocytter som samler på un-bestrålt endotelceller (Dette bør vanligvis være 3-5).
- Set to ganger dette tallet som terskel av monocytter på en endotelcelle å være at defineres som en klynge. Om nødvendig kan et annet kriterium skal brukes for å definere en klynge avhengig av naturen av forsøket.
- Tell antall klynger og antallet av endoteliale celler i felten. Dividere førstnevnte med den sistnevnte for å oppnå den prosentandel av klebe endotelceller. Scoremange felt for å få et gjennomsnitt og standardavvik for de teller.
6. kontra med Antistoffer
- Etter adhesjonsassayet og cellene på dekkglass er blitt fiksert i 10% formalin i 15 min ved RT, med forbehold Dekkglass til immunfluorescens ved å bruke standard prosedyre 10 og antistoffer valg.
- Legge til og fjerne de ulike løsningene svært forsiktig for å unngå å flytte monocytter som er knyttet til endotelceller.
7. kontra for Senescence-assosiert Beta-galaktosidase aktivitet
- Etter adhesjonsassayet og cellene på dekkglass er blitt fiksert i formalin i 15 minutter og beis for begynnende alderdom-assosiert beta-galaktosidase-aktivitet som beskrevet i instruksjonene som følger fargingssettet. Legge til og fjerne de ulike løsningene svært forsiktig for å unngå å flytte monocytter som er knyttet til endotelceller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hepes Buffered Saline Solution (HBSS) | Sigma | H6648 | |
| Glass coverslips Round 12 mm Diameter | Menzel-Glaser | CB00120RA1 | |
| 24-well cluster plate | Costar | 3526 | |
| Meso-Endo Cell media | Cell Applications | 212-500 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4174 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Life Technologies | 17075-029 | |
| Cell Tracker Green | Life Technologies | C7025 | |
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Foetal Calf Serum | Life Technologies | 10500064 | |
| Beta glasctosidase Assay kit | CellSignaling | 9860 | |
| Fibronectin | Sigma | F0895 |
References
- Ortega-Gomez, A., Perretti, M., Soehnlein, O. Resolution of inflammation: an integrated view. EMBO Mol Med. 5 (5), 661-674 (2013).
- Libby, P. Inflammation and cardiovascular disease mechanisms. Am J Clin Nutr. 83 (2), 456S-460S (2006).
- Ikuta, S., Kirby, J. A., Shenton, B. K., Givan, A. L., Lennard, T. W. Human endothelial cells: effect of TNF-alpha on peripheral blood mononuclear cell adhesion. Immunology. 73 (1), 71-76 (1991).
- Watson, C., et al. IL-6 acts on endothelial cells to preferentially increase their adherence for lymphocytes. Clin Exp Immunol. 105 (1), 112-119 (1996).
- Sans, M., et al. VCAM-1 and ICAM-1 mediate leukocyte-endothelial cell adhesion in rat experimental colitis. Gastroenterology. 116 (4), 874-883 (1999).
- Su, Y., Lei, X., Wu, L., Liu, L. The role of endothelial cell adhesion molecules P-selectin, E-selectin and intercellular adhesion molecule-1 in leucocyte recruitment induced by exogenous methylglyoxal. Immunology. 137 (1), 65-79 (2012).
- Hallahan, D., Kuchibhotla, J., Wyble, C. Cell adhesion molecules mediate radiation-induced leukocyte adhesion to the vascular endothelium. Cancer Res. 56 (22), 5150-5155 (1996).
- Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion. J Immunol Methods. 159 (1-2), 93-100 (1993).
- Prabhakarpandian, B., Shen, M. C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvasc Res. 82, 210-220 (2011).
- Lowe, D., Raj, K. Premature aging induced by radiation exhibits pro-atherosclerotic effects mediated by epigenetic activation of CD44 expression. Aging Cell. 13 (5), 900-910 (2014).
