Abstract
Digitale assays er kraftfulde metoder, der muliggør detektion af sjældne celler og tælling af individuelle nukleinsyremolekyler. Men digitale assays er stadig ikke rutinemæssigt anvendes, på grund af omkostningerne og særligt udstyr forbundet med kommercielt tilgængelige metoder. Her præsenteres en forenklet metode til udlæsning af digitale droplet assays under anvendelse af en konventionel realtids-PCR instrument til måling hovedparten fluorescens af dråber-baserede digitale assays.
Vi karakteriserer ydeevnen af bulk udlæsning assay under anvendelse af syntetiske dråbe blandinger og en dråbe digitalforstærkning multiple forskydning (MDA) assay. Kvantitativ MDA især fordele fra et digitalt reaktion format, men vores nye metode gælder for alle digitale assay. For etablerede digitale assayprotokoller såsom digital PCR, denne metode tjener til at fremskynde og forenkle analysen udlæsning.
Vores hovedparten udlæsning metode bringer fordelene ved partitioned analyser uden behov for specialiseret udlæsning instrumentering. De vigtigste begrænsninger hovedparten udlæsning metode reduceres dynamikområde sammenlignet med dråbe-optælling platforme og behovet for en standardprøve, selv om kravene til denne standard er mindre krævende end for en konventionel realtid eksperiment. Kvantitativ hele genomamplifikation (WGA) anvendes til at teste for forurenende stoffer i WGA reaktioner og er den mest følsomme måde at detektere tilstedeværelsen af DNA-fragmenter med ukendte sekvenser, der giver fremgangsmåden meget lovende i forskellige anvendelsesområder herunder farmaceutiske kvalitetskontrol og astrobiologi.
Introduction
Digitale assays for nukleinsyre kvantificering (digital PCR) 1-4 og base rækkefølge (sekventering) er stærkt påvirker biovidenskab og medicin. Digitale analyser giver kvantificering af molekylære tællinger på en absolut skala (ikke i forhold til en kontrol), der giver høj følsomhed, så overfladiske sammenligninger på tværs af eksperimenter, og afgørende, så opførelsen af store databaser, der indeholder sammenlignelige data 5 (tabel 1).
Over de sidste 15 år, hel genomamplifikation (WGA) opstået sammen med PCR som et generelt værktøj til nukleinsyreamplifikation. Ligesom PCR, WGA er nyttigt for analytiske og præparative applikationer ved at forstærke minut prøve elementer op til et niveau, der nemt kan opdages eller anvendes til efterfølgende analyser som basis sekventering. I modsætning til PCR, WGA er ikke specifikke for en bestemt DNA-locus, snarere tillader opformering af alle sekvenser i prøven, herunder ukendte sekvenser.Denne grundlæggende forskel mellem PCR og WGA gør de metoder, der supplerer hinanden og giver anledning til forskellige udfordringer i deres ansøgning.
Den højt udbytte af WGA reaktioner 6 muliggør rutinemæssig opformering af genomisk DNA fra enkelte molekyler 7, enkeltceller 8 og andre lav biomasse prøver 9 til kvantificering eller yderligere analyse. De største udfordringer forbundet med WGA kemi er dens ekstreme følsomhed over for forureninger og den ujævne forstærkning tværs individuelle skabelon molekyler 6. Dog er WGA stigende popularitet som encellede sekventering har vist sig som den "killer application" af WGA-teknologi 10 og skabelon kvantificering af WGA er vigtig i mange anvendelsesområder 7.
Instrumentering til digital nukleinsyre kvantificering er tidligere blevet beskrevet i en række ventil og ventilløs mikrofluid formats 11-14, herunder dråbe-baserede assays 15,16 (tabel 2). Men kommercielle mikrofluide systemer til digital analyse kræver specialudstyr til reaktion opsætning og produkt registrering 17. Brugerdefineret ventilforsynede mikrofluidik er fleksible, men kræver præcision mikrofabrikation og pneumatiske kontrolsystemer 18. Selv om det er relativt enkelt at gøre monodisperse mikro-dråber til emulsion-baserede digitale assays 19,20, digital udlæsning er teknisk besværlig, kræver enten store Vidvinkelbilledet imaging (svarende til populære næste generations sekventering teknologier) 21,22 eller højhastigheds-flow-baserede dråbe afsløring 23-25. Ideelt set ville en digital assay være enkel fra set-up til udlæsning, hvilket reducerer behovet for komplekse instrumentering og tillade et stort antal prøver, der skal udlæses hurtigt. Her beskriver vi en forenklet metode til udlæsning af digitale droplet assays, der bruger et konventionelt realtids-PCR instrument at måle fluorescens hovedparten af dråber-baserede digitale assays.
Selv om den nye metode kan anvendes til digitale PCR-assays, er det særligt fordelagtigt for digitale WGA assays for hvilke analog realtid amplifikationsassays (som giver gode resultater for PCR) er problematiske. WGA er almindeligt anvendt på prøver med template molekyler, der er heterogene i rækkefølge, længde og baseindhold. Disse forskellige templatemolekyler amplificeres ved forskellige hastigheder 6, hvilket nødvendiggør anvendelsen af en reference ("standard") prøve med matchende egenskaber. Ofte sådan standard ikke er tilgængelig, eller egenskaberne ved de indkommende prøver er ukendte. Heterogenitet input materiale og længde-afhængig egenskab ved WGA kemier 26 også komplicere fortolkning af resultater ved at skabe uklarhed i, hvad der bliver kvantificeres - input masse, input antal molekyler, en kombination af de to, eller ingen af delene. Finally, sekvensen-ikke-specificitet gør kvantitativ forstærkning multipel forskydning (MDA) mere følsomme over for forurening end kvantitativ PCR siden forurenende molekyler af enhver sekvens har et potentiale til at blande sig. Mikrofluide digitale assays behandle forurening med adskillelse templatemolekyler og reducere reaktionsvolumener, således at færre kontaminanter samples.
Her bruger vi en populær isotermiske WGA metode, MDA 27. Notatet flere andre WGA kemier herunder PicoPlex og MALBAC 28 afhænger afgørende af indledende skridt isoterm strengdeplacering. Isotermiske trin forværre den udfordring at anvende analoge realtid analyser til kvantitativ WGA. WGA kan hverken helt forhindres under opsætningen, hvilket fører til uønsket præ-variabel forstærkning, eller diskretiseres ("cykluser") på en måde, replikation af heterogene molekyler kan drives til færdiggørelse og stoppet før den næste cyklus som PCR 11 (figur 1). En digital assay format til WGA rumme typiske reaktion opsætning på grund af adskillelsen af hvert molekyle til tælling ved analysen endpoint (så pre-forstærkning påvirker ikke resultaterne) original udlæsning betyder nøjagtighed ville være stort set uafhængig af variationer i forstærkning effektivitet.
Analysen afhænger af dråber produceret i olie med ensartede mængder, som signalniveauet pr dråbe ved analysen endepunkt vil afhænge af dråben volumen, og vi ønsker ikke konsistensen af resultaterne til at afhænge af gennemsnit på tværs af en fordeling af dråbestørrelser. Making monodisperse dråber er nu en standardprocedure (ca. 3.500 monodisperse dråbe papirer er blevet offentliggjort siden 2013), men kræver mikrofluid instrumentering 25. Faktisk har mere end seks selskaber udviklet selvstændige kommercielle produkter, der er afhængige af produktionen af sådanne dråber, og dråbe-making mikrofluide chips erkommercielt tilgængelig 23,29. Til denne undersøgelse anvendte vi tilpassede mikrofluidenheder fremstillet in-house (se protokol). Sprøjtepumper at drive strømmen gennem enhederne er også kommercielt tilgængelige, men kan alternativt være substitueret med en enkelt engangssprøjte til vakuum-drevet flow at reducere omkostningerne 30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Bearbejdning af mikrofluidanordning er ikke nødvendigt for denne analyse, som dråber til denne protokol kan dannes med eksisterende kommercielle dråbe beslutningstagere 23,29.
1. Gør Droplet-dannende mikrovæskeanordning
- Forbered mastermodel for kanalerne med SU-8 Master Fabrication protokollen beskrevet tidligere 31, men med en dråbe generator maskemønster 32.
- Fabrikere enheder i PDMS ved hjælp af teknikker til bløde litografi 32,33.
2. Forbered Reaktion Bland for Bulk Droplet Udlæsning
Bemærk: Protokollen kan anvendes til at kvantificere nukleinsyrer under anvendelse af mange typer af amplifikationsreaktioner. Som et eksempel er de reagenser, der er nødvendige for MDA af flere Lambda DNA-koncentrationer givet. Reagens detaljer er angivet i tabellen over specifikke reagenser. Fordelingen af skabelon i dråberne afhænger sufficient blanding af prøven.
- Opnå eller Purify Phi29 DNA-polymerase.
- Rense Phi29 som tidligere beskrevet 7, eller køb fra leverandør. Den Phi29 anvendes til de viste eksperimenter blev oprenset.
- Forbered 10 ml denatureringspuffer bestående af 65 mM KOH, 1,65 mM EDTA og 14 mM DTT.
- Forbered 10 ml neutraliseringsbuffer bestående af 65 mM HCI, 0,21 M Tris-CI pH 7,0, og 9 mM Tris-CI pH 8,0.
- Forbered to standarder, man ikke skabelonkontrol (NTC), såsom nuclease-frit vand, og en høj skabelonkoncentration (ca. 4 pg / pl Lambda DNA). Denaturere 3,3 pi af hver standard med 3,3 ul Denaturation Buffer i en qPCR rør. Inkuber ved stuetemperatur i 3 min. Stands hver med 3,3 pi af neutraliseringsbuffer.
- Denaturere 3,3 ul af skabelonen af interesse med 3,3 ul Denaturation Buffer i en qPCR rør. Inkuber ved stuetemperatur i 3 min. Stands med 3,3 piaf neutraliseringsbuffer.
- Forbered 11 ul mester blanding pr prøve på is. 2x MDA reaktionen Master blandingen består af 2x dobbeltstrenget DNA (dsDNA) bindende farvestof, 2x qPCR referencefarvestof, 50 pM randomiseret oligo, 2 mg / ml BSA, 2x Phi29 DNA-polymerase Reaction Buffer, 4.8 mM dNTP'er, nuclease-frit vand og 40 ug / ml Phi29 DNA-polymerase. Tilføj Phi29 DNA-polymerase sidste for at sikre polymerasen ikke støder pH-niveauer meget højere eller lavere end 7.5.Mix godt.
- Valgfrit: For færre falske positiver, eksponere mester mix med UV-lys før dannelse dråber 34.
- Forbered 10 pi forblanding per prøve i et 0,5 ml eller 1,5 ml klart rør på is. Forblandingen består af 55 uM oligo randomiseret, 2,2 mg / ml BSA, 1,1 x Phi29 DNA-polymerase Reaction Buffer, 5.3 mM dNTP'er og nuclease-frit vand.
- Glasset anbringes i vand på is som beskrevet 34 og udsættes for UV-lys (254 nm) til en accuakkumulerede dosis på 5,7 J / cm2.
- Tilføj dsDNA-bindende farvestof til 1x, referencefarvestof til 1x, og Phi29 til 40 ug / ml i forblanding. Bland godt.
- Kombiner 10 pi denatureret skabelon eller standard og 10 pi mester blanding. Bland godt.
3. dråbedannelse
Bemærk: Små dråber kan være meget følsom over for statisk elektricitet og forskydningsspænding. Fjern tøj, som kan forårsage statisk elektricitet, og jorde dig selv, inden den dråber. Griberør emulsion fra toppen af røret, så langt fra emulsionen som muligt. Pipette emulsioner meget langsomt, helst med en bred boring pipettespids. Når dispensering fra en pipettespids, se emulsionen på den side af spidsen for at bestemme pipetteringshastighed.
- Form dråber. Til eksperimenterne viste, at mikrofluidapparat har en olie indløb og to vandige indløb med en strøm-fokusering krydset til generering dråber. Brug to SyriNGE pumper til at styre strømningshastighederne af 55 pi olie med overfladeaktivt middel og en 20 pi reaktionsblanding gennem mikrofluid chip til at generere 20.000 1 nl dråber.
- Bemærk: Det er muligt at fremstille små dråber med mange olietyper med overfladeaktivt middel, men sammensætningen vil i høj grad påvirke dråber stabilitet ved høje temperaturer og over tid. En mulig kombination er fluoreret olie HFE 7500 med et anionisk overfladeaktivt 19,35.
- Fremstil dråber på ethvert størrelse med enhver metode 13,36, men størrelsen variation i dråben population vil påvirke hovedparten fluorescens, og dermed nøjagtigheden af assayet. Til eksperimenterne viste, dråber var monodisperse med et volumen på 1 nl.
- Saml alle de dråber og olie i PCR-rør. For hver prøve, portion 30 pi olie i frisk PCR-rør med optiske caps, og overføre 20 pi dråber oven på olien. De konsekvente mængder sikrer assayet er som ackuratere som muligt.
- Luk rør caps stramt, da løse hætter vil lad olien fordampe.
4. Isotermisk Amplification
- Ved hjælp af en PCR thermocycler, qPCR thermocycler eller varmeplade, inkuberes prøverne ved 30 ° C i 7 timer, og inaktivere i 1 min ved 75 ° C. Rørene af dråber kan efterlades i et køleskab tildækket med folie i et par timer på dette tidspunkt.
5. dataopsamling og analyse
- Umiddelbart efter reaktion inaktivering, måle farvestof fluorescens niveauer for alle prøver ved hjælp af qPCR thermocycler. Optimale filterindstillinger vil afhænge af farvestof excitation og emission spektre. I dette eksempel skal du bruge 492 nm-516 nm filter sat til dsDNA-bindende farvestof og 585 nm-610 nm filter sat for henvisningen farvestof. Andre fluorescerende måleteknikker kan anvendes til at kvantificere fluorescens.
- For hver prøve, opdele fluorescensintensiteten af dsDNA-bindende farvestof vedfluorescensintensiteten af referencen farvestof. Fratræk baggrundsfluorescensen eller den normaliserede fluorescens af nogen skabelonkontrol fra alle prøver.
- Opret en lineær standardkurve ved hjælp af de korrigerede fluorescensmålingerne fra normerne. NTC-standarden repræsenterer fluorescensen for en prøve med 0% fluorescerende dråber ("all negative"), og høj skabelonkoncentration fluorescensmåling den er den forventede fluorescens for en prøve med 100% fluorescerende dråber ("all positive"). Anvendelse af den tilsvarende standardkurven, forudsige de mellemliggende forhold mellem positive og negative dråber baseret på deres bulk-fluorescens.
6. producerende Dråber til Proof-of-principle Målinger
- Gør fluorescerende (positive) dråber: Forbered en PCR-reaktionsblanding bestående af 0,1 ng lambda-DNA, 1x dsDNA-bindende farvestof, 1x referencefarvestof, 1,5 enheder Taq-DNA-polymerase, 10 mM Tris-HCI, 50 mM KCI, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP og 0,5 pM primere. Thermocycle blandingen 30 gange (95 ° C i 20 sek, 55 ° C i 20 sek, 72 ° C i 1 min), derefter danner dråber, som beskrevet ovenfor.
- Gør ikke-fluorescerende (negative) dråber: Forbered en PCR-reaktionsblanding bestående af 1x dsDNA-bindende farvestof, 1x referencefarvestof, 1,5 enheder Taq-DNA-polymerase, 10 mM Tris-HCI, 50 mM KCI, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, og 0,5 pM primere. Thermocycle blandingen 30 gange (95 ° C i 20 sek, 55 ° C i 20 sek, 72 ° C i 1 min), så danne dråber.
- Danner færdigblandede dråben nøgletal
- Fordel 20 pi fluoreret olie i qPCR rør, dække med en optisk hætte for at forhindre fordampning.
- Forsigtigt pipette 10 pi velblandet dråber i ønskede positive: negative forhold oven på olien. I de viste resultater, positive: negative dråbe forhold blev 1 (alle positive), 0,8, 0,5, 0,2, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 og 0 (alle negtiv).
- Mål farvestof fluorescens niveauer for alle prøver ved hjælp af qPCR thermocycler. Til denne protokol, skal du bruge 492 nm-516 nm filter sat til dsDNA-bindende farvestof og 585 nm-610 nm filter sat for henvisningen farvestof.
- Normalisere dsDNA bindende farvestoffluorescens hjælp af reference farvestoffluorescens. Yderligere normalisere ved fluorescens af "alle positive" prøve.
- Opret en lineær standardkurve ved hjælp af de normaliserede fluorescensmålingerne fra "alle positive" og "alle negative" prøver. Anvendelse af den tilsvarende standardkurven, forudsige de mellemliggende forhold mellem positive og negative dråber baseret på deres bulk-fluorescens.
- Gentag forsøget for hver Forholdet (n = 3) med uafhængig dråbedannelse og blanding i hver gentagelse.
7. Proof-of-princippet MDA Experiment
- Måle koncentrationen af lambda-DNA-stamopløsning med en spectrophotometer.
- Beregn koncentrationen nødvendig til de gennemsnitlige 10 template molekyler pr dråbe skabelon. Til denne protokol, antager dråbe mængder er 1 nl og 1 ng Lambda DNA indeholder cirka 1,9 x 10 7 eksemplarer. Derfor vil 10 skabeloner pr dråbe være 10 kopier pr nl, eller 526 fg Lambda DNA pr gl. Skabelonen vil blive udvandet ~ 6x når dråber dannes derfor den indledende højeste skabelon koncentration vil være 3,2 pg / pl.
- Serielt fortynde Lambda DNA til 3,2 pg / pl med denatureringsbuffer og lige så stort volumen neutraliseringsbuffer. For en fortyndingsfaktor på 0,1, kombinere 10 pi prøve med 45 pi denatureringsbuffer og inkuberes ved stuetemperatur i 3 minutter. Tilføj 45 ll i neutraliseringsbuffer at slukke.
- Yderligere fortynde prøven som beskrevet i trin 7.2 for at gøre resten af prøverne til eksperimentet. De første koncentrationer skabelon i reaktionerne vist var 3,2 pg, 320 fg,160 fg, 32 fg, 16 fg, 3,2 fg og 1,6 fg pr mikroliter.
Bemærk: De endelige skabelon-koncentrationer efter mastermiksens Derudover var 526 fg, 52,6 fg, 26,3 fg, 5,26 fg, 2,63 fg, 526 ag, og 263 ag pr mikroliter. 10, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 og 0,005 forventede Lambda kopier pr dråbe, henholdsvis. - Generere og analysere dråber fra hver prøve som beskrevet i trin 2.5-5.3.
- Erhverve fluorescens viste billeder (figur 2,3) under anvendelse af et digitalt kamera monteret på et epi-fluorescensmikroskop med et 10x objektiv ved stuetemperatur. Erhverve tolv synsfelter for hver prøve. Korrekte fluorescens billeder ved et baggrundsbillede opnået med et fluorescerende dias.
- Brug en indesluttet kammer til billeddannelse 37 som emulsionen olie vil fordampe hurtigt.
- Analysere enkelte dråbe intensiteter ved hjælp af et ImageJ makro (Supplerende kode fil).
- Vælg en tærskel fluorescensintensitet, der bedst adskiller ikke-fluorescerende dråber i NTC billeder fra de fluorescerende dråber i de høje skabelon koncentration billeder. For hver ukendt prøve, beregne fraktionen af smådråber med en fluorescensintensitet over tærskelværdien.
8. PCR og MDA bulk-reaktioner
- Forbered PCR-reaktion.
- Serielt fortyndet template-DNA med en fortyndingsfaktor på 0,1. For hver fortynding kombinere 10 pi skabelon med 45 pi denatureringsbuffer og inkuberes ved stuetemperatur i 3 minutter. Kombiner fortynding med 45 pi neutraliseringsbuffer.
- Forbered 20 ul PCR mastermiksens per prøve. Den 1.1x PCR-reaktion Master blandingen består af 60 enheder / pl Taq DNA-polymerase, 11 mM Tris-HCI, 55MM KCI, 1,65 mM MgCl2, 0,22 mM dNTP, 1,1 x dsDNA-bindende farvestof, 1.1x referencefarvestof og 550 nM hver primer.
- Kombiner 2 pi fortyndet skabelon og 20 pi mastermiksens.
Bemærk: De endelige skabelon koncentrationer i than PCR-reaktioner viste var 50 pg, 5 pg, 500 fg, 50 fg, 5 fg, 500 ag og 0 g Lambda DNA pr mikroliter, og blev udført in triplo. - Thermocycle PCR-reaktion i qPCR maskine med følgende program. Køre 40 cykler af 95 ° C i 30 sek, 57 ° C i 20 sekunder, 72 ° C i 30 sek, før 2 minutter ved 72 ° C i 2 minutter og holde ved 4 ° C.
- Normalisere dsDNA bindende farvestof fluorescens hjælp henvisning farvestof fluorescens forud for yderligere analyse.
- Forbered MDA reaktionen.
- Fortynd prøver som beskrevet i trin 8.1.1.
- Forbered 11 ul mester blanding pr prøve på is. 2x MDA reaktionen Master blandingen består af 2x dsDNA-bindende farvestof, 2x referencefarvestof, 50 pM randomiseret oligo, 2 mg / ml BSA, 2x phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer, 4.8 mM dNTP'er, nuclease-frit vand, og 40 ug / ml phi29 DNA Polymerase.
- Tilsæt Phi29 DNA-polymerase til 40 ug / ml vare for at sikre polymerase does ikke støder pH-niveauer meget højere eller lavere end 7,5. Bland godt.
- Denaturere 3.3 pi fortyndet template med 3,3 pi denatureringsbuffer i en qPCR rør. Inkuber ved stuetemperatur i 3 min. Tilføj 3.3 pi neutraliseringsbuffer.
- Kombiner 10 pi denatureret skabelon og 10 pi mester blanding. Bland godt.
- Kør MDA reaktion i qPCR maskine med følgende program.
- Hold ved 30 ° C i 4 timer, måle fluorescens hver 7,5 min.
- Inaktivere ved 75 ° C i 1 min.
- Normalisere dsDNA bindende farvestoffluorescens hjælp af reference farvestoffluorescens. Yderligere normalisere af den maksimale fluorescens for hver prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mens konventionelle bulk / realtid udlæsninger kan anvendes til både kvantitativ PCR og kvantitative WGA assays (figur 1), digitale kvantitative assays tilvejebringer fordele (tabel 1). I den beskrevne metode, vi læser ud digitale analyser i mikro-dråbe-format med en simpel bulk-endpoint måling (figur 2). Selv om denne fremgangsmåde er bredt anvendelig har vi fokus på kvantitativ WGA (MDA), fordi denne metode giver særlige udfordringer for konventionelle realtid analyser.
At kontrollere, om vores real-time PCR instrument kunne detektere forskellige fraktioner af fluorescerende mikrodråber dispergeret i olie, målte vi hovedparten fluorescens af syntetiske blandinger af fluorescerende og ikke-fluorescerende dråber (figur 2). Hovedparten fluorescens og positive dråbe tæller (uafhængigt vurderet fluorescensmikroskopi) skalere lineært med input del af fluorescerende dråber som forventet (Figur 3A). Eksperimentet blev udført tre gange, med uafhængige dråbedannelse og blanding for hvert sæt.
For at vurdere den teoretiske kvantificering ydeevne til "ukendte" prøver, vi etableret lineære standardkurver hjælp helt positive og helt negative kontrolprøver. Med sådanne dråbe-lot-specifikke standard kurver, vi beregnet den del af syntetiske positive og negative dråber blandinger på basis af hver prøve bulk fluorescens. Resultaterne viser gode resultater i dråbe forhold kvantificering tværs af to logfiler over dynamikområde (R2 = 0,984; figur 3B). Koncentrationen af input-analyt-let beregnes ud fra den del af positive eller negative dråber 38.
For at teste vores metode i en reel kvantitativt WGA assay målte vi niveauer af fluorescens og brøkdel af positive dråber af en digital dråbe MDA assay med lambda-DNA over en wi de koncentrationsområde (figur 4). I figur 4B er repræsentative fluorescerende billeder af dråberne vist. Både bulk fluorescens og positiv fraktion dråber fra de digitale MDA prøver skalere som forventet med gennemsnitlige template pr dråbe, hvilket indikerer, at hovedparten udlæsning trofast kan fange resultatet af en digital assay (R2 = 0,927). Vi gentog eksperimentet for hver koncentration, uafhængig danner dråber og gennemførelsen af WGA for hver replikat.
Tabel 1. Oversigt over realtid og digitale analyser. Klik her for at se en større version af dette tal.
able2.jpg "/>
Tabel 2. Oversigt over eksisterende metoder til kvantificering af nukleinsyrer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 1. Real-time kvantitativ PCR og MDA af lambda-DNA. MDA ikke diskretiseres ved temperaturcyklus som PCR, og er tilbøjelig til preamplification hvis ikke forberedt forsigtigt på is. Her blev kvantitativ PCR og MDA udført med stigende koncentrationer af Lambda DNA. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figure 2. Skematisk af analog udlæsning af dråber og repræsentative billeder. (A) Positive og negative dråber blev genereret fra fluorescerende og ikke-fluorescerende reagenser i en mikrofluidapparat. Dråberne blev præ-blandet i forskellige positive: negative forhold. Bulk niveauer af fluorescens blev målt med et standard realtid thermocycler, og fraktion af positive dråber blev bestemt ved fluorescensmikroskopi. (B) Repræsentant fluorescerende overlejret billeder af stigende forhold mellem positive dråber (skala bar = 200 um). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Bulk fluorescens og fluorescerende del af kombinationer af separat fremstillet positive og negative droplets. (A) Fluorescerende (positiv) og ikke-fluorescerende (negative) smådråber blev forblandet i forskellige forhold. Sammenligning af input brøkdel af positive dråber med den målte hovedparten fluorescens og måles positive dråbe fraktion (n = 3, repræsenterer barer +/- SD). Den stiplede linie repræsenterer den forventede fluorescerende fraktion givet en lineær sammenhæng. (B) Sammenligning af forudsagte nøgletal baseret på standarder for forventede fluorescerende fraktion input. Linjen angiver den forventede værdi givet en lineær sammenhæng. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Bulk fluorescens og fluorescerende del af en dråbe digital MDA assay. Digital MDA blev udført med increNrug koncentrationer af template lambda-DNA (n = 3, repræsenterer fejlsøjler SD) og målt som beskrevet i figur 2A. Linjen angiver den forventede fluorescerende fraktion ved hjælp af Poisson fordelingen at modellere data fra vores eksperiment. b) Repræsentant fluorescerende overlejret billeder af dråber efter reaktion inaktivering (skala bar = 200 um) for at øge de forventede Lambda DNA-molekyler pr dråbe (NTC, 0,005, 0,05, 0,5, og 10). Klik her for at se en større version af dette tal .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Digitale assays er kraftfulde metoder, der muliggør detektion af sjældne celler og tælling af de enkelte af nukleinsyremolekyler. Imidlertid digitale assays stadig ikke rutinemæssigt anvendes i analyselaboratorier, dels på grund af udgifterne til specialudstyr forbundet med kommercielt tilgængelige metoder. Her beskriver vi et endepunkt digital assay til kvantificering af nukleinsyrer med en forenklet analog udlæsning ved anvendelse af en standard realtid kvantitativ PCR maskine. Denne metode er hurtig at sætte op, og udlæsning er meget enklere end dråbe tælling metoder.
Vores analyse mister enkelt-molekyle (single-dråbe) følsomhed af individuelle dråber målinger for enkelhed massevis endepunkt måling med standard instrumentering. I vores digitale MDA eksperiment, kunne vi ikke skelne mindre end 1 positiv dråbe pr 200 negative dråber fra baggrunden, trods bekræftelse ved fluorescensmikroskopi, at den faktiske FRAIndsatsen positive dråber blev som forventet (figur 4). Følsomheden og baggrund i bulk fluorescensmåling grænse følsomheden af bulk måling assay for lavt positive dråbe fraktioner. Hvis højere følsomhed er påkrævet, er en digital udlæsning anbefales. Forskelle i oliestand eller bulk dråbe mængder kan i høj grad påvirke prøve fluorescensdata. Selv normalisering med en reference farvestof kan ikke gøre op for forskelle oliemængder gør i fluorescens læser. Det er muligt, at optimere assayvolumen, instrument optagelsesparametre, mikrobrønd geometri eller optiske filtre kan forbedre assay ydeevne.
Følsomheden og dynamiske område af bulk digitale analyser kan også forbedres ved at optimere den partition størrelse. Større dråber giver en større mængde af fluorescerende produkter fra hver skabelon molekyle, som kan bidrage til at overvinde instrumental baggrund og forbedre følsomheden for lav input koncentrationer. PåDerimod mindre dråber tillader isolering af flere molekyler pr volumen analyseres. Hvis skabelonkoncentration varierer meget på tværs prøver, kan både små og store dråber reaktioner udføres parallelt for at udvide analysen dynamikområde 39.
Konsekvent dråbe mængder er også nødvendigt for nøjagtig måling. Mange brugerdefinerede mikrofluide løsninger findes for hurtigt at danne monodisperse dråber fra en prøve, både i serie 19,40 og sideløbende 41,42. Mens få mulighed dråben generation fra flere separate prøver parallelt, ville simple ændringer af eksisterende design mulighed for samtidig dråbe generering af et vilkårligt antal prøver. For eksempel Bio-Rad ddPCR systemet 23 anvender ensartede tryk til indløbene af en række uafhængige droplet beslutningstagere, gør det muligt samtidig dråbedannelse fra flere prøver.
Vores bulk-udlæsning metodik adgang nøgleFordelene ved inddelte digitale assays uden behov for specialiseret udlæsning instrumentering og er velegnet til kvantitativ WGA. Her har vi fokuseret på kvantitative WGA, som er meget modtagelige for baggrunden forureninger på grund af sin manglende sekvensspecificitet 7. Hertil kommer, at ukendte og potentielt bred molekylvægtsfordeling af produkter fra realtid kvantitative WGA assays gør fortolkningen vanskeligt i applikationer, hvor antallet af originale skabeloner er af interesse. Digitale assay formatering adresser begge disse problemer. Forureninger er indeholdt i individuelle reaktion partitioner, forhindre dominansen af lav molekylvægt analysander med høj molekylvægt forureninger som det ville ske i en konventionel realtid assay. I figur 2B og 4B, eventuelle forureninger, ses som lyse pletter inden dråberne er adskilte og ikke supplere eller bidrage væsentligt til den samlede fluorescens. Endvideresignal genereret i digitale assays er proportional med antallet af skabeloner, ikke størrelsen af skabeloner eller deres amplifikation sats. Selvom vores Metoden bygger på standarder for at kalibrere hovedparten digitale måling, at kravet om at matche prøven og standard karakteristika kan lempes betydeligt.
Kvantitativ WGA er almindeligt anvendt til at kvantificere forurenende stoffer i WGA reaktioner 7,34, og er den mest følsomme fremgangsmåde kendt at kvantificere tilstedeværelsen af DNA med ukendt sekvens, giver fremgangsmåden meget lovende anvendelsesområder så forskellige som farmaceutisk kvalitetskontrol, retsvidenskab, og astrobiologi. Bulk digital udlæsning kan gavne andre digitale assayprotokoller såsom digital-PCR, ved at fremskynde, parallelizing, og forenkle assay udlæsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Evagreen Dye | Biotium | 31000 | |
| Bovine serum albumin | New England Biotechnologies | B9000S | |
| Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer | New England Biotechnologies | B0269S | Vortex periodically until aggregate dissolves |
| Lambda DNA | New England Biotechnologies | N3011S | Heated to 50 oC and quenched on ice prior to dilution |
| Randomized MDA oligos | Integrated DNA Technologies | 5'-NNNNN*N-3' | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | 5’-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3’ and 5’-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3’ | |
| UltraPure Nuclease-free water | Life Technologies | 10977-015 | UV-treated for 30 min in Stratalinker 2400 before use (optional) |
| ROX reference dye | Life Technologies | 12223-012 | |
| PCR optical strip caps | Life Technologies | 4323032 | |
| PCR tubes | Agilent Technologies | 401428 | |
| dNTP (25 micromolar each) | Agilent Technologies | 200415 | |
| Thermocycler - Mx3000P qPCR system | Agilent Technologies | 401403 | |
| Barrier pipette tips | VWR | 89003-046 | |
| Bio-rad oil for evagreen | Bio-rad | 186-4005 | |
| JumpStart Taq ReadyMix | Sigma-Aldrich | P2893-100RXN |
References
- Sykes, P. J., Neoh, S. H., Brisco, M. J., Hughes, E., Condon, J., Morley, A. A. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).
- Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. Nanoliter scale PCR with TaqMan detection. Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Day, E., Dear, P. H., McCaughan, F. Digital PCR strategies in the development and analysis of molecular biomarkers for personalized medicine. Methods. 59 (1), 101-107 (2013).
- Tatusova, T., Ciufo, S., Fedorov, B., O'Neill, K., Tolstoy, I. RefSeq microbial genomes database: new representation and annotation strategy. Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D553-D559 (2014).
- Blainey, P. C. The future is now: single-cell genomics of bacteria and archaea. FEMS Microbiol. Rev. 37 (3), 407-427 (2013).
- Blainey, P. C., Quake, S. R. Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination. Nucleic Acids Res. 39 (4), e19 (2011).
- Blainey, P. C., Quake, S. R. Dissecting genomic diversity, one cell at a time. Nat. Methods. 11 (1), 19-21 (2014).
- Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology. ISME J. 2 (3), 233-241 (2008).
- Method of the Year 2013. Nature Methods. 11 (1), 1 (2014).
- Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria. Science. 314 (5804), 1464-1467 (2006).
- OpenArray Technology Overview. , Life Technologies. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-openarray/open-array-technology.html (2014).
- Shen, F., Du, W., Kreutz, J. E., Fok, A., Ismagilov, R. F. Digital PCR on a SlipChip. Lab Chip. 10 (20), 2666-2672 (2010).
- Heyries, K. A., et al. Megapixel digital PCR. Nat. Methods. 8 (8), 649-651 (2011).
- Dressman, D., Yan, H., Traverso, G., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (15), 8817-8822 (2003).
- Kiss, M. M., et al. High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets. Anal. Chem. 80 (23), 8975-8981 (2008).
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nat. Methods. 9 (6), 3 (2012).
- Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Parallel picoliter rt-PCR assays using microfluidics. Anal. Chem. 78 (3), 956-958 (2006).
- Lee, M., et al. Synchronized reinjection and coalescence of droplets in microfluidics. Lab Chip. 14 (3), 509-513 (2014).
- Rhee, M., et al. Pressure stabilizer for reproducible picoinjection in droplet microfluidic systems. Lab Chip. 14 (23), 4533-4539 (2014).
- Hatch, A. C., et al. 1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR. Lab Chip. 11 (22), 3838-3845 (2011).
- Illumina. , Technology. http://www.illumina.com/technology.html (2014).
- Droplet digital PCR applications guide. , Bio-Rad. Available from: http://www.bio-rad.com/en-us/category/digital-pcr (2014).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).
- Lage, J. M., et al. Whole genome analysis of genetic alterations in small DNA samples using hyperbranched strand displacement amplification and array-CGH. Genome Res. 13 (2), 294-307 (2003).
- Dean, F. B., et al. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (8), 5261-5266 (2002).
- Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell. Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).
- Mitos Dropix Systems. , Dolomite. http://www.dolomite-microfluidics.com/webshop/mitos_dropix_system (2014).
- Abate, A. R., Weitz, D. A. Syringe-vacuum microfluidics: A portable technique to create monodisperse emulsions. Biomicrofluidics. 5, 14107 (2011).
- Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells. J Vis Exp. (80), e50618 (2013).
- Fainman, Y. Optofluidics : fundamentals, devices, and applications. , McGraw-Hill. (2010).
- Xia, Y. W. G.M. Softlithographie. Angew Chem. 110 (5), 26 (1998).
- Woyke, T., et al. Decontamination of MDA reagents for single cell whole genome amplification. PLoS One. 6 (10), e26161 (2011).
- System for hot-start amplification via a multiple emulsion. US patent. Hindson, B. J. , (2014).
- Utada, A. S., et al. Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device. Science. 308 (5721), 537-541 (2005).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR. PLoS One. 8 (4), e62961 (2013).
- Dube, S., Qin, J., Ramakrishnan, R. Mathematical analysis of copy number variation in a DNA sample using digital PCR on a nanofluidic device. PLoS One. 3 (8), e2876 (2008).
- Shen, F., et al. Multiplexed quantification of nucleic acids with large dynamic range using multivolume digital RT-PCR on a rotational SlipChip tested with HIV and hepatitis C viral load. J Am. Chem. Soc. 133 (44), 17705-17712 (2011).
- Link, D. R., Anna, S. L., Weitz, D. A., Stone, H. A. Geometrically mediated breakup of drops in microfluidic devices. Phys. Rev. Lett. 92 (5), 054503 (2004).
- Nisisako, T., Torii, T. Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles. Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).
- Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device. Lab Chip. 12 (4), 802-807 (2012).
