Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Enkelt Bulk Avlesning av digitale Nukleinsyre Kvantifisering Analyser

Published: September 24, 2015 doi: 10.3791/52925
Automatic Translation
1, 2
1Broad Institute, 2Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

Abstract

Digitale analyser er kraftige metoder som muliggjør påvisning av sjeldne celler og telling av individuelle nukleinsyremolekyler. Imidlertid digitale analyser er fortsatt ikke rutinemessig anvendt, på grunn av kostnader og spesielle utstyr i forbindelse med kommersielt tilgjengelige metoder. Her presenterer vi en forenklet metode for avlesning av digitale dråpe analyser ved anvendelse av en konvensjonell real-time PCR instrument for å måle bulk fluorescens av dråpebasert digital-analyser.

Vi karakterisere ytelsen av bulk avlesning analyse ved bruk av syntetiske dråpe blandinger og en dråpe digital multippel forskyvning forsterkning (MDA) assay. Kvantitativ MDA spesielt nytte av en digital reaksjon format, men vår nye metoden gjelder for alle digitale analysen. For etablerte digitale analyseprotokoller som digital PCR, fungerer denne metoden for å fremskynde og forenkle analysen avlesning.

Våre bulk avlesning metodikk bringer fordelene med partitioned analyser uten behov for spesialisert avlesning instrumentering. De viktigste begrensninger av bulk avlesning metodikken er redusert dynamisk område, sammenlignet med dråpetelle plattformer og behovet for en standardprøve, selv om kravene til denne standarden er mindre krevende enn for en konvensjonell sanntids forsøk. Kvantitativ hele genomet forsterkning (WGA) brukes til å teste for forurensninger i WGA-reaksjoner, og er den mest følsomme måte for å påvise tilstedeværelsen av DNA-fragmenter med ukjente sekvenser, noe som gir metoden store løftet i ulike bruksområder, inkludert farmasøytisk kvalitetskontroll og astrobiologi.

Introduction

Digitale analyser for nukleinsyre kvantifisering (digital PCR) 1-4 og basen rekkefølge (sekvensering) er sterkt påvirket biovitenskap og medisin. Digitale analyser tilveie kvantifisering av molekyl tellinger på en absolutt skala (ikke i forhold til en kontroll), som gir høy følsomhet, slik at lettvinte sammenligninger på tvers av eksperimenter, og viktigst, som muliggjør bygging av store databaser som inneholder sammenlignbare data 5 (Tabell 1).

I løpet av de siste 15 årene, dukket hele genomet forsterkning (WGA) sammen med PCR som et generelt verktøy for nukleinsyre forsterkning. Som PCR, er WGA nyttig for analytisk og preparativ programmer ved å forsterke liten prøveelementer opp til et nivå som kan lett oppdages eller brukes for senere analyser som utgangspunkt sekvensering. I motsetning til PCR, er WGA ikke er spesifikk for en bestemt DNA-locus, i stedet for å tillate amplifisering av alle sekvenser i prøven, inkludert ukjente sekvenser.Denne fundamentale forskjell mellom PCR og WGA gjør metodene komplementære til hverandre og gir opphav til ulike utfordringer i søknaden.

Den høye utbyttet av WGA reaksjoner 6 muliggjør rutine forsterkning av genomisk DNA fra enkle molekyler 7, enkeltceller 8 og andre med lav biomasse prøvene 9 for kvantifisering eller videre analyse. De største utfordringene knyttet til WGA kjemi er det ekstrem følsomhet for forurensninger og ujevn forsterkning over individuelle templatmolekyler 6. Imidlertid er WGA stadig mer populært som encellede sekvensering har dukket opp som den "killer application" av WGA teknologi 10, og mal kvantifisering av WGA er viktig i mange bruksområder 7.

Instrumentering for digital nukleinsyre kvantifisering har tidligere blitt beskrevet i en rekke av ventil og ventilløse mikrofluid formats 11-14, inkludert dråpebaserte assays 15,16 (tabell 2). Men kommersielle microfluidic systemer for digital analyse krever spesialisert utstyr for reaksjon oppsett og produkt deteksjon 17. Custom ventilstyrte MicroFluidics er fleksible, men krever presisjon microfabrication og pneumatiske kontrollsystemer 18. Selv om det er relativt enkelt å lage monodisperse mikrodråper emulsjonsbaserte digitale assays 19,20, er digital avlesning teknisk tunge, og krever enten store vidvinkel avbildning (tilsvarende populære neste generasjons sekvense teknologier) 21,22 eller Høyhastighets Flow-basert dråpe deteksjon 23-25. Ideelt sett ville en digital assay være enkel fra set-up til avlesning, og reduserer behovet for komplisert instrumentering og tillate et stort antall prøver for å bli lest ut raskt. Her beskriver vi en forenklet metode for avlesning av digitale dråpe analyser som anvender en konvensjonell real-time PCR instrument å måle bulk fluorescens av dråpe-baserte digitale analyser.

Samtidig som den nye metode kan anvendes på digitale PCR-analyser, er det spesielt fordelaktig for digitale WGA-analyser hvor det analoge sanntids amplifikasjonsanalyser (som gir utmerkede resultater for PCR) er problematisk. WGA er vanlig anvendt på prøver med mal molekyler som er heterogene i sekvens, lengde og baseinnhold. Disse ulike templatmolekyler er forsterket med forskjellige satser 6, hvilket nødvendiggjør bruk av en referanse ("standard") prøve med passende egenskaper. Ofte er noen slik standard er tilgjengelig, eller egenskapene til de innkommende prøver er ukjent. Heterogeniteten av inngangsmaterialet og lengdeavhengig egenskap av WGA kjemi 26 også komplisere tolkningen av resultatene ved å skape tvetydighet i det som blir kvantifisert - inngangs masse, inn antallet molekyler, en kombinasjon av de to, eller ingen av delene. Finally, gjengir sekvens-non-spesifisitet kvantitativ multippel forskyvning forsterkning (MDA) mer følsom for forurensning enn kvantitativ PCR, siden forurensende molekyler med en hvilken som helst sekvens har et potensial til å gripe inn. Microfluidic digitale analyser adressere forurensning av segregerende templatmolekyler og redusere reaksjonsvolumer slik at færre forurensninger samples.

Her bruker vi en populær isotermisk WGA metode, MDA 27. Av notatet, flere andre WGA kjemi inkludert PicoPlex og MALBAC 28 avhenger avgjørende på initielle isotermisk tråd fortrengning trinn. Isoterme skritt forverre utfordringen med å søke analoge sanntids analyser for kvantitativ WGA. WGA kan verken helt forhindret under oppsett, som fører til uønsket variabel pre-forsterkning, og heller diskretisert ("syklet") på en måte der replikering av heterogene molekyler kan bli kjørt til ferdigstillelse og stoppet før neste syklus som PCR 11 (figur 1). En digital analyse format for WGA plass typiske reaksjonen oppsettsprosedyrer grunn av segregering av hvert molekyl for telling på analysepunktet (så pre-forsterkning påvirker ikke resultatene) original avlesning betyr nøyaktighet ville være uavhengige av variasjon i forsterkning effektivitet.

Analysen avhenger av dråper produseres i olje med ensartede volumer, som signalnivået per dråpe ved analysen endepunkt vil avhenge av dråpevolum, og vi ønsker ikke at konsistensen av resultatene for å stole på i snitt på tvers av en fordeling av dråpestørrelser. Making monodisperse dråper er nå en standard prosedyre (ca 3500 monodisperse dråpe papirer har blitt utgitt siden 2013), men krever microfluidic instrumentering 25. Faktisk har mer enn seks selskaper utviklet uavhengige kommersielle produkter som er avhengige av produksjonen av slike dråper, og dråpe lage microfluidic chips erkommersielt tilgjengelig 23,29. For denne studien brukte vi tilpasset microfluidic enheter produsert in-house (se Protocol). Sprøytepumper for å drive strømmen gjennom enhetene er også kommersielt tilgjengelige, men kan alternativt være substituert med en enkelt engangssprøyte for vakuumdrevet strømning for å redusere kostnadene 30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Legg merke til: fremstilling av mikrofluidanordningen er ikke nødvendig for denne analyse, som små dråper for denne protokollen kan bli dannet med eksisterende kommersielle dråpemaskin 23,29.

1. Gjør Droplet dannende mikrofluid Device

  1. Forbered mester mold for kanalene med SU-8 Master Fabrication protokollen skissert tidligere 31, men med en dråpe generator maske mønster 32.
  2. Dikte enheter i PDMS ved hjelp av teknikker for myk litografi 32,33.

2. Forbered Reaksjon Mix for Bulk Droplet Timer


Merk: Protokollen kan brukes til å kvantifisere nukleinsyrer ved hjelp av mange typer av amplifiseringsreaksjoner. Som et eksempel, er reagensene som er nødvendige for MDA av flere Lambda DNA-konsentrasjoner er gitt. Reagent detaljer er oppført i tabellen over spesifikke reagenser. Fordelingen av smal inne i dråpene avhenger sufficient blanding av prøven.

  1. Innhente eller Purify Phi29 DNA polymerase.
    1. Rens Phi29 som tidligere beskrevet 7, eller kjøp fra leverandør. Den Phi29 brukes for de viste forsøkene ble renset.
  2. Forbered 10 ml Denaturering Buffer bestående av 65 mM KOH, 1,65 mM EDTA, og 14 mM DTT.
  3. Forbered 10 ml Nøytralisering buffer bestående av 65 mM HCl, 0,21 M Tris-Cl pH 7,0, og 9 mM Tris-Cl pH 8,0.
  4. Forbered to standarder, en ingen mal kontroll (NTC) som nukleasefritt vann, og en høy mal konsentrasjon (rundt 4 pg / mL Lambda DNA). Denaturering 3,3 mL av hver standard med 3,3 mL av Denaturering buffer i en qPCR tube. Inkuber ved RT i 3 min. Slukke hver med 3,3 mL av nøytralisering Buffer.
  5. Denaturering 3,3 mL av malen av interesse med 3,3 mL av Denaturering buffer i en qPCR tube. Inkuber ved RT i 3 min. Slukk med 3,3 mLav nøytralisering Buffer.
  6. Forbered 11 mL av mester blanding per prøve på is. Den 2x MDA Reaksjonshovedblandingen består av 2x dobbelt-trådet DNA (dsDNA) bindende fargestoff, 2x qPCR referanse fargestoff, 50 uM randomisert oligo, 2 mg / ml BSA, 2 x Phi29 DNA Polymerase reaksjonsbuffer, 4.8 mM dNTP, nuklease-fri vann og 40 ug / ml Phi29 DNA polymerase. Legg Phi29 DNA polymerase sist å sikre polymerasen ikke støter pH-nivåer mye høyere eller lavere enn 7.5.Mix godt.
  7. Valgfritt: For færre falske positiver, utsetter mester mix med UV lys før dannelse dråper 34.
    1. Forbered 10 ul pre-blanding per prøve i et 0,5 ml eller 1,5 ml klar rør på is. Pre-mix består av 55 mikrometer randomisert oligo, 2,2 mg / ml BSA, 1,1x Phi29 DNA Polymerase reaksjonsbuffer, 5,3 mM dNTPs, og nukleasefritt vann.
    2. Plasser slangen i vann på isen som beskrevet 34 og utsettes for UV-lys (254 nm) til en accuakkumulerte dose på 5,7 J / cm2.
    3. Legg dsDNA-bindende fargestoff til 1x, fargestoff henvisning til 1x, og Phi29 til 40 ug / ml i pre-blandingen. Bland godt.
  8. Kombiner 10 mL av denaturert mal eller standard og 10 ul av mester blanding. Bland godt.

3. Droplet-formasjonen

Merk: Dråper kan være svært følsomme for statisk elektrisitet og skjærspenning. Fjern klær som kan forårsake statisk elektrisitet, og jorde deg selv før du danner dråper. Håndtak rør av emulsjon fra toppen av røret, så langt fra emulsjonen som mulig. Pipettes emulsjoner veldig sakte, fortrinnsvis med et bredt boring pipette tips. I utløpsområdet av en pipettespiss, se emulsjonen på siden av spissen for å bestemme pipettering hastighet.

  1. Form dråper. For forsøkene vist, har mikrofluidanordningen et oljeinnløp og to vandige innløp med en strømningsfokuserings knutepunkt for å generere små dråper. Bruk to Syringe pumper for å styre strømningshastighetene for 55 pl av olje med overflateaktivt middel og en 20 ul av reaksjonsblandingen gjennom mikrofluid chip for å generere 20000 1 nl dråper.
  2. Merk: Det er mulig å produsere dråper med mange typer olje med overflateaktivt middel, men preparatet vil i stor grad påvirke dråpe stabilitet ved høye temperaturer og over tid. En mulig kombinasjon er fluorert olje HFE 7500 med et anionisk overflateaktivt middel 19,35.
  3. Produserer dråper ved en hvilken som helst størrelse med en hvilken som helst metode 13,36, men størrelsen variasjon i dråpe populasjonen vil påvirke bulk fluorescens, og dermed nøyaktigheten av analysen. For forsøkene vist, dråper var monodisperse med et volum på 1 nl.
  4. Samle alle de dråper og olje inn i PCR-rør. For hver prøve, delmengde 30 mL av olje i ferske PCR rør med optiske caps, og overføre 20 pl dråper på toppen av oljen. Den konsistente volumer sikre at analysen er som ackuratere som mulig.
  5. Lukk tube caps tett, som løse caps vil la oljen fordampe.

4. Isoterm Amplification

  1. Ved hjelp av en PCR termo, qPCR termo, eller varm plate, inkubere prøvene ved 30 ° C i 7 timer, og inaktiverer i 1 min ved 75 ° C. Rørene av dråper kan bli liggende i et kjøleskap dekket med folie for et par timer på dette punktet.

5. Data Acquisition og analyse

  1. Umiddelbart etter reaksjonen inaktivering, måle fluorescens fargestoff nivåer for alle prøver ved hjelp av qPCR thermocycler. Optimale filterinnstillingene vil avhenge av fargestoff eksitasjon og emisjonsspekter. For dette eksempelet bruker 492 nm-516 nm filter satt for dsDNA-bindende fargestoff, og 585 nm-610 nm filter satt for referanse fargestoff. Andre fluorescerende måleteknikk kan anvendes for å kvantifisere fluorescensen.
  2. For hver prøve dele fluorescens intensiteten av dsDNA-bindende fargestoff etterfluorescensintensiteten av referanse fargestoff. Trekk fra bakgrunnsfluorescensen, og den normaliserte fluorescensen av templat-kontroll, fra alle prøvene.
  3. Lag en lineær standardkurve ved bruk av de korrigerte fluorescensmålinger fra standardene. NTC standard representerer fluorescens for en prøve med 0% fluoriserende dråper ("alle negative"), og den høye konsentrasjon mal fluorescens-målingen er den forventede fluorescens for en prøve med 100% fluoriserende dråper ("alle positive"). Ved å bruke det tilsvarende standardkurve, forutsi de mellomliggende forholdene mellom positive og negative dråper basert på deres bulk fluorescens.

6. produserende Dråper for Proof-of-Prinsipp Målinger

  1. Gjør fluorescerende (positive) dråper: Fremstill en PCR-reaksjonsblanding bestående av 0,1 ng lambda DNA, 1x dsDNA-bindende fargestoff, 1x referanse fargestoff, 1,5 enheter Taq-DNA-polymerase, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, og 0,5 mM primere. Thermocycle de Blandingen 30 ganger (95 ° C i 20 sekunder, 55 ° C i 20 sekunder, 72 ° C i 1 min), og deretter danne dråper som beskrevet ovenfor.
  2. Gjøre ikke-fluorescerende (negativ) dråper: Fremstill en PCR-reaksjonsblanding som består av 1x dsDNA-bindende fargestoff, 1x referanse fargestoff, 1,5 enheter Taq-DNA-polymerase, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, og 0,5 pM primere. Thermocycle de Blandingen 30 ganger (95 ° C i 20 sekunder, 55 ° C i 20 sekunder, 72 ° C i 1 min), og deretter danne dråper.
  3. Forming ferdigblandet dråpe forholdstall
    1. Fordel 20 mL av fluorerte olje i qPCR rør, dekk med en optisk cap å hindre fordamping.
    2. Forsiktig pipette 10 mL av godt blandet dråper i ønskede positive: negative forhold på toppen av oljen. I resultatene vist positive: negative dråpe forholdstall var en (alle positive), 0.8, 0.5, 0.2, 0.1, 0.01, 0.001, 0,0001, og 0 (alle negAtive).
  4. Måle fluorescens fargestoff nivåer for alle prøver ved å bruke qPCR thermocycler. For denne protokollen, bruker 492 nm-516 nm filter satt for dsDNA-bindende fargestoff, og 585 nm-610 nm filter satt for referanse fargestoff.
    1. Normal dsDNA bindende fargestoff fluorescens bruker referansen fargestoff fluorescens. Ytterligere normal av fluorescens av "all positiv" sample.
  5. Lag en lineær standardkurve ved hjelp av normalis fluorescensmålinger fra "alle positive" og "alle negative" prøver. Ved å bruke det tilsvarende standardkurve, forutsi de mellomliggende forholdene mellom positive og negative dråper basert på deres bulk fluorescens.
  6. Gjenta eksperimentet for hvert forhold (n = 3) med uavhengige dråpedannelse og blanding i hvert replikat.

7. Proof-of-prinsippet MDA Experiment

  1. Måle konsentrasjonen av Lambda DNA-stamoppløsning med en spectrophotometer.
    1. Beregn malen konsentrasjonen som er nødvendig til gjennomsnittlig 10 templatmolekyler per dråpe. For denne protokollen, anta dråpe volumene er en nl og en ng av Lambda DNA inneholder ca 1,9 x 10 7 eksemplarer. Derfor vil 10 maler per dråpe være 10 eksemplarer per nl, eller 526 fg Lambda DNA per il. Malen blir fortynnet ~ 6x når dråper dannes, og derfor den opprinnelige høyeste konsentrasjon mal vil være 3,2 pg / pl.
  2. Serielt fortynne Lambda DNA til 3,2 pg / mL med Denaturering Buffer og likt volum Nøytralisering Buffer. For en fortynningsfaktor på 0,1, kombinere 10 ul prøve med 45 mL av Denaturering buffer og inkuber ved romtemperatur i 3 min. Legg 45 LL av nøytralisering buffer for å slukke.
  3. Ytterligere fortynne prøven som beskrevet i trinn 7.2 til å gjøre resten av prøvene for forsøket. De første mal konsentrasjonene i de reaksjoner som er vist var 3,2 pg, 320 fg,160 fg, 32 fg, 16 fg, 3,2 fg, og 1,6 fg per mikroliter.
    Merk: De endelige mal konsentrasjoner etter Mastermix tillegg var 526 fg, 52,6 fg, 26,3 fg, 5,26 fg, 2,63 fg, 526 ag, og 263 ag per mikroliter. 10, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 og forventede Lambda kopier pr dråpe, henholdsvis.
  4. Generere og analysere dråper fra hver prøve som beskrevet i trinn 2.5-5.3.
  5. Erverve fluorescens bilder vist (figur 2,3) med et digitalt kamera montert på en epi-fluorescens mikroskop med 10x objektiv på RT. Tilegne tolv synsfelt for hver prøve. Riktig fluorescens bilder av et bakgrunnsbilde som oppnås med et fluorescerende lysbilde.
  6. Bruk en innekammer for bildebehandling 37 som emulsjonen oljen vil fordampe raskt.
  7. Analysere enkeltdråpe intensitet bruker en ImageJ makro (Opplysning kode fil).
    1. Velge en terskel fluorescensintensitet som best skiller ikke-fluoriserende dråper i NTC-bilder fra de fluoriserende dråper i høy mal konsentrasjons bilder. For hver ukjent prøve, beregne fraksjonen av dråper med en fluorescens-intensitet over terskelen.

8. PCR og MDA bulk reaksjoner

  1. Forbered PCR reaksjon.
    1. Serielt fortynnet templat-DNA med en fortynningsfaktor på 0,1. For hver fortynning, kombinere 10 ul templat sammen med 45 pl av Denaturering buffer og inkuber ved romtemperatur i 3 min. Kombiner fortynning med 45 mL av nøytralisering Buffer.
    2. Forbered 20 mL av PCR Mastermix per prøve. Den 1,1 x PCR-reaksjonsblandingen mester består av 60 enheter / pl Taq DNA-polymerase, 11 mM Tris-HCl, 55mm KCl, 1,65 mM MgCl2, 0,22 mM dNTP, 1,1 x dsDNA-bindende fargestoff, 1,1x referanse fargestoff, og 550 nM hver primer.
    3. Kombinere 2 mL fortynnet mal og 20 pl Mastermix.
      Merk: De endelige mal konsentrasjoner i tHan PCR-reaksjoner vist var 50 s, 5 pg, 500 fg, 50 fg, 5 fg, 500 ag, og 0 g Lambda DNA pr mikroliter, og ble utført i tre eksemplarer.
    4. Thermocycle PCR-reaksjon i qPCR maskin med følgende program. Kjør 40 sykluser av 95 ° C i 30 sek, 57 ° C i 20 sekunder, 72 ° C i 30 sekunder før 2 minutter ved 72 ° C i 2 minutter og oppbevaring ved 4 ° C.
    5. Normal dsDNA bindende fargestoff fluorescens bruker referansen fargestoff fluorescens før videre analyse.
  2. Forbered MDA reaksjon.
    1. Fortynne prøvene som beskrevet i trinn 8.1.1.
    2. Forbered 11 mL av mester blanding per prøve på is. Den 2x MDA Reaksjonshovedblandingen består av 2x dsDNA-bindende fargestoff, 2x referanse fargestoff, 50 uM randomisert oligo, 2 mg / ml BSA, 2 x phi29 DNA Polymerase reaksjonsbuffer, 4.8 mM dNTP, nuklease-fritt vann, og 40 pg / ml Phi29 DNA Polymerase.
    3. Tilsett Phi29 DNA-polymerase for å 40 ug / ml vare for å sikre polymerase does ikke støter pH-nivåer mye høyere eller lavere enn 7,5. Bland godt.
    4. Denaturering 3,3 mL fortynnet mal med 3,3 mL av Denaturering buffer i en qPCR tube. Inkuber ved RT i 3 min. Legg 3,3 mL av nøytralisering Buffer.
    5. Kombiner 10 mL denaturert mal og 10 ul av mester blanding. Bland godt.
    6. Kjør MDA reaksjon i qPCR maskin med følgende program.
    7. Hold ved 30 ° C i 4 timer, måle fluorescens hvert 7,5 min.
    8. Inaktivere ved 75 ° C i 1 min.
    9. Normal dsDNA bindende fargestoff fluorescens bruker referansen fargestoff fluorescens. Ytterligere normal ved maksimal fluorescens for hver prøve.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mens konvensjonelle bulk / real-time avlesning kan brukes til både kvantitativ PCR og kvantitative WGA analyser (figur 1), digitale kvantitative analyser gi fordeler (tabell 1). I fremgangsmåten som er beskrevet, kan vi lese ut digitale assays i mikrodråpe-format med et enkelt bulk endepunkt måling (figur 2). Selv om denne metoden er bredt anvendelig, har vi fokus på kvantitative WGA (MDA) fordi denne metoden presenterer spesielle utfordringer for vanlige sanntids analyser.

For å sjekke om vår real-time PCR instrument kan oppdage ulike fraksjoner av fluorescerende mikrodråper dispergert i olje, målte vi mesteparten fluorescens av syntetiske blandinger av fluorescerende og ikke-fluoriserende dråper (figur 2). Hovedtyngden fluorescens og positive dråpetelling (uavhengig vurdering av fluorescens mikroskopi) skalerer lineært med innspill brøkdel av fluorescerende dråper som forventet (Figur 3A). Eksperimentet ble utført tre ganger, med uavhengig dråpedannelse og blanding for hvert sett.

For å evaluere den teoretiske kvantifisering ytelse for "ukjente" samples, etablerte vi lineære standardkurver bruker utelukkende positive og helt negative kontrollprøver. Med slike dråpe-lot-spesifikke standardkurver, beregnet vi brøkdel av syntetiske positive og negative dråpe blandinger på basis av hver prøve bulk fluorescens. Resultatene viser god utvikling i dråpe ratio kvantifisering over to logger av dynamisk område (R2 = 0,984; figur 3B). Inngangs analyttkonsentrasjon lett beregnes ut fra fraksjonen av positive eller negative 38 dråper.

For å teste vår metode i en ekte kvantitativ WGA analysen har vi målt fluorescens nivåer og brøkdel av positive dråper av en digital dråpe MDA analysen med Lambda DNA over en wi de område av konsentrasjoner (figur 4). I figur 4B, er representative fluorescerende bilder av dråpene vist. Både bulk fluorescens og positive dråpe fraksjon fra de digitale prøvene MDA skaleres som forventet med gjennomsnittlig dråpe malen per, noe som indikerer at mesteparten avlesning kan trofast vise resultatet av en digital assay (R2 = 0,927). Vi gjentok eksperimentet for hver konsentrasjon, uavhengig danner små dråper, og gjennomføring av WGA for hver replikere.

Tabell 1
Tabell 1. Sammendrag av sanntid og digitale analyser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

able2.jpg "/>
Tabell 2. Oppsummering av eksisterende metoder for å kvantifisere nukleinsyrer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 1
Figur 1. Real-time kvantitativ PCR og MDA av Lambda DNA. MDA er ikke diskretisert gjennom temperatursvingninger som PCR, og er utsatt for preamplification hvis ikke forberedt nøye på is. Her ble kvantitativ PCR og MDA utført med økende konsentrasjoner av Lambda DNA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figure 2. Skjematisk av analog avlesning av dråper og representative bilder. (A) Positive og negative dråper ble samlet fluorescerende og ikke-fluorescerende reagenser i en microfluidic enhet. Dråpene var pre-blandet i forskjellige positive: negative forhold. Bulk fluorescens ble målt med et standard sanntid termo, og fraksjonen av positive dråper ble bestemt ved fluorescens mikroskopi. (B) Representant fluorescerende kledde bilder av økende prosenter av positive dråper (skala bar = 200 mikrometer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Bulk fluorescens og fluorescerende brøkdel av kombinasjoner av forberedt seg positive og negative av dråperts. (A) Fluorescent (positive) og ikke-fluorescerende (negativ) smådråper ble forblandet i forskjellige forhold. Sammenligning av inngangs fraksjon av positive dråper med den målte masse og fluorescensen måles positiv dråpefraksjon (n = 3, linjene representerer +/- SD). Den stiplede linje representerer den forventede fluorescerende fraksjonen fikk en lineær sammenheng. (B) Sammenligning av predikerte forholdstall basert på standarder til forventet fluorescerende innspill brøkdel. Linjen angir den forventede verdien gitt en lineær sammenheng. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Bulk fluorescens og fluoriserende fraksjon av en dråpe digital MDA-analyse. Digital MDA ble utført med IncreAsing konsentrasjoner av templat Lambda DNA (n = 3, Feilstolpene representerer SD) og målt som beskrevet i figur 2A. Den linjen viser forventet fluorescerende brøk med Poissonfordelingen å modellere dataene fra eksperimentet vårt. b) Representant fluorescerende kledde bilder av dråper etter reaksjon inaktivering (skala bar = 200 mikrometer) for å øke forventet Lambda DNA-molekyler per dråpe (NTC, 0,005, 0,05, 0,5 og 10). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Digitale analyser er kraftige metoder som muliggjør påvisning av sjeldne celler og telling av individuelle av nukleinsyremolekyler. Imidlertid digitale analysene er fortsatt ikke rutinemessig anvendt i analytiske laboratorier, delvis på grunn av kostnaden av spesialisert utstyr i forbindelse med kommersielt tilgjengelige metoder. Her beskriver vi et endepunkt digital analyse for kvantifisering av nukleinsyrer med en forenklet analog avlesning ved anvendelse av en standard sanntids kvantitativ PCR maskinen. Denne metoden er rask å sette opp, og avlesning er mye enklere enn dråpetellemetoder.

Vår analyse mister single-molekyl (single-dråpe) følsomhet av individuelle dråpe målinger for enkelheten i hopetall endepunkt måling ved hjelp av standard instrumentering. I vår digitale MDA eksperiment, kunne vi ikke skille mindre enn en positiv dråpe per 200 negative dråper fra bakgrunnen, til tross for bekreftelse av fluorescensmikropskopi at den faktiske FRADette skjer av positive dråper ble som forventet (figur 4). Følsomheten og bakgrunnen i bulk fluorescens målingsgrensen følsomheten av bulkmåle analysen for lave positive dråpefraksjoner. Hvis høyere følsomhet er nødvendig, er en digital avlesning anbefalt. Forskjeller i oljenivå eller bulk dråpevolum i stor grad kan påvirke prøven fluorescens data. Selv normalisering med en referanse fargestoff kan ikke gjøre opp for forskjellene oljevolumene gjør i fluorescens leser. Det er mulig at optimalisering av analysevolum, instrument innhentingsparametere, mikro geometri, eller optiske filtre kan forbedre ytelsen assay.

Den følsomhet og dynamisk område av bulk digitale assays kan også forbedres ved å optimalisere størrelsen på partisjonen. Større dråper gi en større mengde fluorescerende produkter fra hver mal molekyl, som kan bidra til å overvinne instrumental bakgrunn og bedre følsomhet for lave inngangs konsentrasjoner. Påden annen side mindre dråper tillate isolering av flere molekyler per volum analysert. Dersom malen konsentrasjonen er høyst variabel tvers Prøver kan både små og store dråpe reaksjonene utføres parallelt for å utvide det dynamiske område 39 analysen.

Konsistente dråpe volumer er også nødvendig for nøyaktig måling. Mange tilpasset microfluidic løsninger finnes for hurtig dannelse av monodisperse dråper fra en prøve, både i serier og i parallell 19,40 41,42. Mens noen aktiverer dråpe generasjon fra flere separate prøver i parallell, vil enkle modifikasjoner på eksisterende konstruksjoner tillater samtidig dråpe generering av et antall prøver. For eksempel gjelder Bio-Rad ddPCR system 23 jevnt trykk til de viker av en rekke uavhengige dråpestakere, muliggjør samtidig dråpedannelse fra flere prøver.

Våre bulk avlesning metodikk åpner nøkkelenFordelene med partisjon digitale analyser uten behov for spesialisert avlesning instrumentering og er godt egnet for kvantitativ WGA. Her fokuserte vi på kvantitative WGA, som er svært utsatt for bakgrunns forurensninger på grunn av sin manglende sekvensspesifisitet 7. I tillegg er det ukjente og potensielt bred molekylvektfordeling av produktene fra sanntids kvantitative analyser WGA gjør tolkning vanskelig i anvendelser hvor antall opprinnelige maler er av interesse. Digitale analysen formaterings adresser begge disse problemene. Forurensninger som finnes i individuelle reaksjons skillevegger, hindrer dominans av lav molekylvekt analytter med høy molekylvekt forurensninger som ville oppstå i en konvensjonell sanntids analyse. I figurene 2B og 4B, mulige forurensninger, sett på som lyspunkter innenfor dråpene, er isolert og ikke forsterke eller bidra vesentlig til generelle fluorescens. Videresignal som genereres i digitale assays er proporsjonal med antall maler, ikke størrelsen på malene eller deres forsterkning hastighet. Selv om vår metode er avhengig av standarder for å kalibrere bulk digital måling, til kravet matche prøven og standard kjennetegn kan være avslappet betraktelig.

Kvantitativ WGA er vanlig å kvantifisere forurensninger i WGA reaksjoner 7,34, og er den mest sensitive metoden kjent for å kvantifisere tilstedeværelse av DNA av ukjent sekvens, gir metoden store løftet i applikasjons områder så forskjellige som farmasøytisk kvalitetskontroll, dataanalyse, og astrobiologi. Bulk digital avlesning kan komme andre digitale analyseprotokoller som digital PCR, ved å påskynde, parallelizing, og forenkle analysen avlesning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Evagreen Dye Biotium 31000
Bovine serum albumin New England Biotechnologies B9000S
Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer New England Biotechnologies B0269S Vortex periodically until aggregate dissolves
Lambda DNA New England Biotechnologies N3011S Heated to 50 oC and quenched on ice prior to dilution
Randomized MDA oligos Integrated DNA Technologies 5'-NNNNN*N-3'
PCR primers Integrated DNA Technologies 5’-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3’ and 5’-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3’
UltraPure Nuclease-free water Life Technologies 10977-015 UV-treated for 30 min in Stratalinker 2400 before use (optional)
ROX reference dye Life Technologies 12223-012
PCR optical strip caps Life Technologies 4323032
PCR tubes Agilent Technologies 401428
dNTP (25 micromolar each) Agilent Technologies 200415
Thermocycler - Mx3000P qPCR system Agilent Technologies 401403
Barrier pipette tips VWR 89003-046
Bio-rad oil for evagreen Bio-rad 186-4005
JumpStart Taq ReadyMix Sigma-Aldrich P2893-100RXN

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sykes, P. J., Neoh, S. H., Brisco, M. J., Hughes, E., Condon, J., Morley, A. A. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).
  2. Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. Nanoliter scale PCR with TaqMan detection. Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).
  3. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 96 (16), 9236-9241 (1999).
  4. Day, E., Dear, P. H., McCaughan, F. Digital PCR strategies in the development and analysis of molecular biomarkers for personalized medicine. Methods. 59 (1), 101-107 (2013).
  5. Tatusova, T., Ciufo, S., Fedorov, B., O'Neill, K., Tolstoy, I. RefSeq microbial genomes database: new representation and annotation strategy. Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D553-D559 (2014).
  6. Blainey, P. C. The future is now: single-cell genomics of bacteria and archaea. FEMS Microbiol. Rev. 37 (3), 407-427 (2013).
  7. Blainey, P. C., Quake, S. R. Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination. Nucleic Acids Res. 39 (4), e19 (2011).
  8. Blainey, P. C., Quake, S. R. Dissecting genomic diversity, one cell at a time. Nat. Methods. 11 (1), 19-21 (2014).
  9. Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology. ISME J. 2 (3), 233-241 (2008).
  10. Method of the Year 2013. Nature Methods. 11 (1), 1 (2014).
  11. Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria. Science. 314 (5804), 1464-1467 (2006).
  12. OpenArray Technology Overview. , Life Technologies. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-openarray/open-array-technology.html (2014).
  13. Shen, F., Du, W., Kreutz, J. E., Fok, A., Ismagilov, R. F. Digital PCR on a SlipChip. Lab Chip. 10 (20), 2666-2672 (2010).
  14. Heyries, K. A., et al. Megapixel digital PCR. Nat. Methods. 8 (8), 649-651 (2011).
  15. Dressman, D., Yan, H., Traverso, G., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (15), 8817-8822 (2003).
  16. Kiss, M. M., et al. High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets. Anal. Chem. 80 (23), 8975-8981 (2008).
  17. Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nat. Methods. 9 (6), 3 (2012).
  18. Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Parallel picoliter rt-PCR assays using microfluidics. Anal. Chem. 78 (3), 956-958 (2006).
  19. Lee, M., et al. Synchronized reinjection and coalescence of droplets in microfluidics. Lab Chip. 14 (3), 509-513 (2014).
  20. Rhee, M., et al. Pressure stabilizer for reproducible picoinjection in droplet microfluidic systems. Lab Chip. 14 (23), 4533-4539 (2014).
  21. Hatch, A. C., et al. 1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR. Lab Chip. 11 (22), 3838-3845 (2011).
  22. Illumina. , Technology. http://www.illumina.com/technology.html (2014).
  23. Droplet digital PCR applications guide. , Bio-Rad. Available from: http://www.bio-rad.com/en-us/category/digital-pcr (2014).
  24. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  25. Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).
  26. Lage, J. M., et al. Whole genome analysis of genetic alterations in small DNA samples using hyperbranched strand displacement amplification and array-CGH. Genome Res. 13 (2), 294-307 (2003).
  27. Dean, F. B., et al. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (8), 5261-5266 (2002).
  28. Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell. Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).
  29. Mitos Dropix Systems. , Dolomite. http://www.dolomite-microfluidics.com/webshop/mitos_dropix_system (2014).
  30. Abate, A. R., Weitz, D. A. Syringe-vacuum microfluidics: A portable technique to create monodisperse emulsions. Biomicrofluidics. 5, 14107 (2011).
  31. Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells. J Vis Exp. (80), e50618 (2013).
  32. Fainman, Y. Optofluidics : fundamentals, devices, and applications. , McGraw-Hill. (2010).
  33. Xia, Y. W. G.M. Softlithographie. Angew Chem. 110 (5), 26 (1998).
  34. Woyke, T., et al. Decontamination of MDA reagents for single cell whole genome amplification. PLoS One. 6 (10), e26161 (2011).
  35. System for hot-start amplification via a multiple emulsion. US patent. Hindson, B. J. , (2014).
  36. Utada, A. S., et al. Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device. Science. 308 (5721), 537-541 (2005).
  37. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR. PLoS One. 8 (4), e62961 (2013).
  38. Dube, S., Qin, J., Ramakrishnan, R. Mathematical analysis of copy number variation in a DNA sample using digital PCR on a nanofluidic device. PLoS One. 3 (8), e2876 (2008).
  39. Shen, F., et al. Multiplexed quantification of nucleic acids with large dynamic range using multivolume digital RT-PCR on a rotational SlipChip tested with HIV and hepatitis C viral load. J Am. Chem. Soc. 133 (44), 17705-17712 (2011).
  40. Link, D. R., Anna, S. L., Weitz, D. A., Stone, H. A. Geometrically mediated breakup of drops in microfluidic devices. Phys. Rev. Lett. 92 (5), 054503 (2004).
  41. Nisisako, T., Torii, T. Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles. Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).
  42. Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device. Lab Chip. 12 (4), 802-807 (2012).

Tags

Molecular Biology Whole Genome Amplification digital analyse MDA PCR single-molekyl enkelt celle nukleinsyrer mikro-dråper MicroFluidics emulsjon
Enkelt Bulk Avlesning av digitale Nukleinsyre Kvantifisering Analyser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morinishi, L. S., Blainey, P. Simple … More

Morinishi, L. S., Blainey, P. Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays. J. Vis. Exp. (103), e52925, doi:10.3791/52925 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter