Abstract
Digitala analyser är kraftfulla metoder som möjliggör detektion av sällsynta celler och räkning av enskilda nukleinsyramolekyler. Emellertid digitala analyser är fortfarande inte rutinmässigt tillämpats, på grund av kostnaden och särskild utrustning associerad med kommersiellt tillgängliga metoder. Här presenterar vi en förenklad metod för avläsning av digitala droppanalyser med användning av en konventionell realtids-PCR instrument för att mäta bulk fluorescens av droppbaserade digitala analyser.
Vi karakteriserar prestandan hos bulk avläsning analys med användning av syntetiska dropp blandningar och en dropp digitalt multipel Displacement Amplification (MDA) -analys. Särskilt fördelar Kvantitativ MDA från en digital reaktions format, men vår nya metod gäller för alla digitala analys. För etablerade digitala analysprotokoll såsom digital PCR, fungerar den här metoden för att påskynda och förenkla analys avläsning.
Vår bulk avläsning metod ger fördelarna med partitioned analyser utan behovet av specialiserad avläsning instrumentering. De huvudsakliga begränsningar bulk avläsning metoden minskar dynamiskt omfång jämfört med droppräknings plattformar och behovet av ett standardprov, även om kraven för denna standard är mindre krävande än för en konventionell realtid experiment. Kvantitativ hela genomet förstärkning (WGA) används för att testa för främmande ämnen i WGA reaktioner och är den mest känsliga sättet att upptäcka närvaron av DNA-fragment med okända sekvenser, vilket ger metoden mycket lovande i olika tillämpningsområden, inklusive läkemedels kvalitetskontroll och astrobiologi.
Introduction
Digitala analyser för nukleinsyra kvantifiering (digital PCR) 1-4 och basorder (sekvensering) starkt påverkar biovetenskap och medicin. Digitala analyser ger kvantifiering av molekylära räknas på en absolut skala (inte i förhållande till en kontroll), vilket ger hög känslighet, vilket möjliggör facile jämförelser mellan experiment, och avgörande, vilket möjliggör byggandet av stora databaser med jämförbara data 5 (tabell 1).
Under de senaste 15 åren, hela genomet förstärkning (WGA) dök upp tillsammans med PCR som ett allmänt verktyg för nukleinsyraamplifiering. Liksom PCR, är WGA användbar för analytiska och preparativa applikationer genom att förstärka minut provelement upp till en nivå som lätt kan upptäckas eller användas för efterföljande analyser som bas sekvensering. Till skillnad från PCR, är WGA inte specifika för en viss DNA-locus, snarare tillåta förstärkning av alla sekvenser i provet, inklusive okända sekvenser.Denna grundläggande skillnad mellan PCR och WGA gör metoder som kompletterar varandra och ger upphov till olika utmaningar i sin ansökan.
Den högt utbyte av WGA reaktioner 6 möjliggör rutin förstärkning av genomiskt DNA från enstaka molekyler 7, enskilda celler 8 och andra låg biomassaprover 9 för kvantifiering eller vidare analys. De största utmaningarna i samband med WGA kemi är dess extrema känslighet för föroreningar och den ojämna förstärkning över enskilda mallmolekylerna 6. Dock är WGA ökar i popularitet som encelliga sekvensering har blivit den "killer application" av WGA teknik 10, och mall kvantifiering av WGA är viktigt i många tillämpningsområden 7.
Instrumentering för digital nukleinsyra kvantifiering har tidigare beskrivits i en mängd olika med och utan ventil mikroflödes formats 11-14, inklusive droppbaserade analyser 15,16 (tabell 2). Men kommersiella mikroflödessystem för digital analys kräver specialutrustning för reaktion installation och produktdetektering 17. Anpassade ventilförsedda mikrofluidik är flexibla, men kräver precision mikro och pneumatiska styrsystem 18. Även om det är relativt enkelt att göra monodispersa mikrodroppar för emulsionsbaserade digitala analyser 19,20, är digital avläsning tekniskt betungande, vilket kräver antingen stora vidvinkel imaging (liknande populära nästa generations sekvenseringsteknologier) 21,22 eller höghastighetsflödesbaserad droppdetektering 23-25. Helst skulle en digital analys vara enkelt från set-up för att avläsning, vilket minskar behovet av komplexa instrument och låta ett stort antal prover som skall läsas ut snabbt. Här beskriver vi en förenklad metod för avläsning av digitala droppanalyser som använder en konventionell realtids-PCR instrument att mäta bulk fluorescens av droppbaserade digitala analyser.
Även kan tillämpas den nya strategin för digitala PCR-analyser, är det särskilt fördelaktigt för digitala WGA analyser för vilka analog realtids amplifieringsanalyser (som ger utmärkta resultat för PCR) är problematiska. WGA är allmänt tillämpas på prov med mallmolekyler som är heterogena i sekvens, längd och bas innehåll. Dessa olika mallmolekyler förstärks i olika takt 6, vilket nödvändiggör användningen av en referens ("standard") prov med matchande egenskaper. Ofta finns ingen sådan standard finns, eller egenskaperna hos de inkommande proverna är okända. Heterogenitet ingångsmaterial och längd beroende egendom WGA kemi 26 också försvåra tolkningen av resultaten genom att skapa oklarhet i vad som kvantifieras - ingångsvikt, input antalet molekyler, en kombination av båda, eller ingetdera. Finally, gör sekvens icke-specificitet kvantitativ multipel förskjutningsförstärkning (MDA) känsligare för föroreningar än kvantitativ PCR eftersom förorenings molekyler av varje sekvens har en potential att störa. Microfluidic digitala analyser adress förorening genom segregerande mallmolekylerna och minska reaktionsvolymer så att färre föroreningar samplas.
Här använder vi en populär isotermiska WGA-metoden, MDA 27. Notera flera andra WGA kemi inklusive PicoPlex och MALBAC 28 beror ytterst på första isotermisk strängförskjutningssteg. Isotermiska steg förvärra utmaningen att tillämpa analoga realtidsanalyser för kvantitativ WGA. WGA kan varken helt förhindras under installationen, vilket leder till oönskade variabel pre-förstärkning, eller diskretiseras ("cyklade") på ett sätt där replikering av heterogena molekyler kan drivas till fullbordan och stoppas innan nästa cykel som PCR 11 (Figur 1). Ett digitalt analysformat för WGA rymmer typiska reaktionsinställningsprocedurerna på grund av segregeringen av varje molekyl för räkning på analys endpoint (så pre-förstärkning påverkar inte resultatet) ursprungliga avläsning innebär noggrannhet skulle vara i stort sett oberoende av variation i amplifieringseffektivitet.
Analysen är beroende av droppar som produceras i olja med enhetliga volymer, som signalnivån per droppe på analys endpoint kommer att bero på droppvolym, och vi vill inte att resultaten blir konsekventa bero på i genomsnitt över en fördelning av droppstorlekar. Att monodispersa droppar är nu ett standardförfarande (ca 3500 monodispersa dropp artiklar har publicerats sedan 2013), men kräver mikroflödes instrumentering 25. I själva verket har mer än sex företag utvecklat oberoende kommersiella produkter som är beroende av produktionen av sådana droppar och droppfattandet mikrofluid marker ärkommersiellt tillgänglig 23,29. För denna studie använde vi anpassade mikrofluidikanordningar produceras internt (se protokollet). Sprutpumparna för att driva flödet genom anordningarna är också kommersiellt tillgängliga, men alternativt kan vara substituerad med en enda engångsspruta för vakuumdriven strömning för att minska kostnaderna 30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: tillverkning av mikroflödessystem enheten är inte nödvändigt för denna analys, som droppar för detta protokoll kan bildas med befintliga kommersiella dropp beslutsfattare 23,29.
1. Gör droppen bildande mikroflödessystem enhet
- Förbered huvudform för kanalerna med SU-8 master Fabrication protokoll som beskrivs tidigare 31, men med en droppgenerator maskmönster 32.
- Tillverka enheter i PDMS med hjälp av tekniker för mjuk litografi 32,33.
2. Förbered Reaction Mix för Bulk Droplet Avläsning
Anmärkning: Protokollet kan användas för att kvantifiera nukleinsyror med användning av många typer av amplifieringsreaktioner. Som ett exempel, är de reagens som behövs för MDA av flera Lambda DNA-koncentrationer ges. Reagens detaljer listas i tabellen för särskilda reagenser. Fördelningen av mall inom dropparna beror på sufficient blandning av provet.
- Skaffa eller Rena Phi29 DNA-polymeras.
- Rena Phi29 som tidigare beskrivits 7, eller köp från leverantören. Den Phi29 användes för experimenten visas renades.
- Bered 10 ml denatureringsbuffert bestående av 65 mM KOH, 1,65 mM EDTA och 14 mM DTT.
- Bered 10 ml neutraliseringsbuffert bestående av 65 mM HCl, 0,21 M Tris-Cl pH 7,0, och 9 mM Tris-Cl pH 8,0.
- Bered två standarder, en kontroll utan templat (NTC), såsom nukleas-fritt vatten, och en hög templatkoncentration (omkring 4 pg / pl lambda-DNA). Denaturera 3,3 fil av varje standard med 3,3 il denatureringsbuffert i en qPCR rör. Inkubera vid rumstemperatur under 3 minuter. Släck alla med 3,3 mikroliter av neutraliseringsbuffert.
- Denaturera 3,3 pl av mallen av intresse med 3,3 il denatureringsbuffert i en qPCR rör. Inkubera vid rumstemperatur under 3 minuter. Släck med 3,3 plav neutraliseringsbuffert.
- Förbered 11 il huvudblandning per prov på is. Den 2x MDA reaktions mastermix består av 2x dubbelsträngat DNA (dsDNA) bindande färgämne, 2x qPCR referens färgämne, 50 pM randomiserad oligo, 2 mg / ml BSA, 2x Phi29 DNA-polymeras Reaktionsbuffert, 4,8 mM dNTP, nukleasfritt vatten , och 40 | ig / ml Phi29 DNA-polymeras. Lägg Phi29 DNA-polymeras sist att säkerställa polymeraset inte stöta pH-nivåer mycket högre eller lägre än 7.5.Mix väl.
- Tillval: För färre falska positiva, utsätta huvudblandning med UV-ljus innan bilda droppar 34.
- Förbered 10 pl förblandning per prov i en 0,5 ml eller 1,5 ml klar röret på is. Förblandningen består av 55 | iM randomiserade oligo, 2,2 mg / ml BSA, 1.1x Phi29 DNA-polymeras Reaktionsbuffert, 5,3 mM dNTP, och nukleasfritt vatten.
- Placera röret i vatten på is såsom beskrivits 34 och utsättas för UV-ljus (254 nm) till en Accuackumulerade dos av 5,7 J / cm 2.
- Lägg till dsDNA-bindande färgämne till 1x, referensfärg till 1x, och Phi29 till 40 mikrogram / ml i pre-blandningen. Blanda väl.
- Kombinera 10 il denaturerad mall eller standard och 10 il huvudblandning. Blanda väl.
3. hyalindroppsbildning
Anm: Droppar kan vara mycket känsliga för statisk elektricitet och skjuvspänning. Ta bort kläder som kan orsaka statisk elektricitet, och jorda dig innan du bilda droppar. Handtag rör av emulsionen från toppen av röret, så långt från emulsionen som möjligt. Pipette emulsioner mycket långsamt, företrädesvis med ett brett hål pipettspetsen. När dispense från en pipettspets, titta emulsionen på den sida av spetsen för att bestämma pipettering hastighet.
- Bilda droppar. För experimenten som visas, har den mikrofluidikanordning ett oljeinlopp och två vatteninlopp med en flödesfokuserings korsning för alstring droppar. Använd två SyriNGE pumpar för att reglera flödeshastigheter av 55 | il av olja med ytaktivt medel och en 20 | il av reaktionsblandningen genom mikroflödes chip för att generera 20.000 1 nl droppar.
- Obs: Det är möjligt att producera droppar med många typer av olja med tensid, men sammansättningen kommer att kraftigt påverka dropp stabilitet vid höga temperaturer och över tid. En möjlig kombination är fluorerade olje HFE 7500 med en anjontensid 19,35.
- Producera droppar vid valfri storlek med någon metod 13,36, men storleken variabilitet i dropppopulationen kommer att påverka bulk fluorescens och därmed analysens noggrannhet. För experimenten som visas, droppar var monodispers med en volym av 1 ni.
- Samla alla dropparna och olja i PCR-rör. För varje prov, portion 30 l olja i nya PCR-rör med optiska lock och överföra 20 pl droppar ovanpå oljan. De konsekventa volymerna säkerställa analysen är som acKuratorer som möjligt.
- Stäng röret mössor tätt, som lösa lock gör det möjligt för oljan att avdunsta.
4. Isotermiska Amplifiering
- Med hjälp av en PCR termo, qPCR termo eller värmeplatta, inkubera proverna vid 30 ° C under 7 timmar, och inaktivera under 1 minut vid 75 ° C. Rören av dropparna kan lämnas i ett kylskåp täckt med folie under några timmar vid denna punkt.
5. Datainsamling och analys
- Omedelbart efter reaktionsinaktive, mäta färgämnesfluorescens nivåer för alla prover med qPCR termo. Optimala filterinställningar beror på färg excitation och emissionsspektra. I det här exemplet använda 492 nm-516 nm filter set till dsDNA-bindande färgämne, och 585 nm-610 nm filter fastställs för referens färgämnet. Andra fluorescerande mätningstekniker kan användas för att kvantifiera fluorescens.
- För varje prov, dela upp fluorescensintensiteten hos dsDNA-bindande färgämne genomfluorescensintensiteten hos referens färgämne. Subtrahera bakgrundsfluorescens, eller den normaliserade fluorescensen hos kontroll utan templat, från samtliga prover.
- Skapa en linjär standardkurva genom att använda de korrigerade fluorescensmätningar från normerna. NTC standarden representerar fluorescens för ett prov med 0% fluorescerande droppar ("alla negativa"), och den höga templatkoncentration fluorescensmätning är den förväntade fluorescens för ett prov med 100% fluorescerande droppar ("alla positiva"). Med användning av motsvarande standardkurvan, förutsäga de mellanliggande förhållanden av positiva och negativa droppar baserat på deras bulk fluorescens.
6. producerande Droppar för Proof-of-principle Mätningar
- Gör fluorescerande (positiva) droppar: Förbered en PCR-reaktionsblandning bestående av 0,1 ng Lambda DNA, 1x dsDNA-bindande färgämne, 1x referens färgämne, 1,5 enheter Taq-DNA-polymeras, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, och 0,5 pM primrar. Thermocycle de blandningen 30 gånger (95 ° C under 20 sek, 55 ° C under 20 sek, 72 ° C under 1 min), sedan bilda droppar, såsom beskrivits ovan.
- Göra icke-fluorescenta (negativa) droppar: Förbered en PCR-reaktionsblandning bestående av 1x dsDNA-bindande färgämne, 1x referens färgämne, 1,5 enheter Taq-DNA-polymeras, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, och 0,5 pM primrar. Thermocycle de blandningen 30 gånger (95 ° C under 20 sek, 55 ° C under 20 sek, 72 ° C under 1 min), sedan bilda droppar.
- Forming färdigblandade droppförhållanden
- Fördela 20 pl fluorerad olja i qPCR rören, täck med ett optiskt lock för att förhindra avdunstning.
- Pipett försiktigt 10 il väl blandade droppar i önskade positiva: negativa förhållanden ovanpå oljan. I resultaten visade positiva: negativa droppförhållanden var en (alla positiva), 0,8, 0,5, 0,2, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001, och 0 (alla negtivt).
- Mät färgämnesfluorescens nivåer för alla prover med hjälp av qPCR termo. För detta protokoll, använder 492 nm-516 nm filter in för dsDNA-bindande färgämnet och 585 nm-610 nm filtersats för referens färgämnet.
- Normalisera dsDNA bindande färgämnesfluorescens hjälp av referens färgämnesfluorescens. Ytterligare normalisera av fluorescens av "alla positiva" prov.
- Skapa en linjär standardkurva med hjälp av normaliserade fluorescensmätningarna från "alla positiva" och "alla negativa" prover. Med användning av motsvarande standardkurvan, förutsäga de mellanliggande förhållanden av positiva och negativa droppar baserat på deras bulk fluorescens.
- Upprepa experimentet för varje förhållande (n = 3) med oberoende droppbildning och blandning för varje replikat.
7. Proof-of-Principle MDA Experiment
- Mäta koncentrationen av lambda-DNA-stamlösning med en spectrophotometer.
- Beräkna koncentrationen som krävs för att i genomsnitt 10 mallmolekyler per dropp mall. För detta protokoll, antar droppvolymen är en nl och 1 ng av lambda DNA innehåller ca 1,9 x 10 7 kopior. Därför kommer 10 mallar per droppe vara 10 kopior per nl, eller 526 fg Lambda DNA per il. Mallen kommer att spädas ut ~ 6x när droppar bildas, därför den ursprungliga högsta templatkoncentrationen blir 3,2 pg / l.
- Seriellt späda Lambda DNA till 3,2 pg / l med denaturering buffert och lika stor volym neutraliseringsbuffert. För en utspädningsfaktor på 0,1, kombinera 10 ul prov med 45 | il av denatureringsbuffert och inkubera vid RT i 3 minuter. Lägg 45 ll neutraliseringsbuffert att släcka.
- Ytterligare späda provet som beskrivs i steg 7,2 för att göra resten av proverna för experimentet. De initiala mall koncentrationerna i reaktionerna som visas var 3,2 pg, 320 fg,160 fg, 32 fg, 16 fg, 3,2 fg och 1,6 fg per mikroliter.
Obs: De slutliga templatkoncentrationer efter mastermix Dessutom var 526 fg, 52,6 fg, 26,3 fg, 5,26 fg, 2,63 fg, 526 ag och 263 ag per mikroliter. 10, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 och 0,005 förväntade Lambda kopior per droppe, respektive. - Generera och analysera droppar från varje prov som beskrivs i steg 2.5-5.3.
- Förvärva fluorescens bilderna (Figur 2,3) med en digital kamera monterad till en epi-fluorescensmikroskop med en 10x mål på RT. Förvärva tolv synfält för varje prov. Korrigera fluorescens bilder av en bakgrundsbild som erhållits med en fluorescerande bild.
- Använd en innehöll kammare för avbildning 37 som emulsionsoljan förångas snabbt.
- Analysera enskilda droppnivåer med hjälp av en ImageJ makro (Supplemental kod fil).
- Välj en tröskel fluorescensintensiteten som bäst separerar icke-fluorescerande droppar i NTC bilder från fluorescerande droppar i koncentrations bilder med hög mall. För varje okänt prov, beräkna den fraktion av små droppar med en fluorescensintensitet över tröskelvärdet.
8. PCR och MDA bulk reaktioner
- Bered PCR-reaktion.
- Seriellt utspädd mall-DNA med en utspädningsfaktor av 0,1. För varje spädning, kombinera 10 pl mall med 45 | il av denatureringsbuffert och inkubera vid RT i 3 minuter. Kombinera utspädning med 45 pl av neutraliseringsbuffert.
- Förbered 20 pl PCR mastermix per prov. Den 1.1x PCR-reaktions mastermix består av 60 enheter / | il Taq DNA-polymeras, 11 mM tris-HCl, 55mm KCl, 1,65 mM MgCl2, 0,22 mM dNTP, 1.1x dsDNA-bindande färgämne, 1.1x referens färgämne och 550 nM varje primer.
- Kombinera 2 pl utspätt mall och 20 pl mastermix.
Obs: De slutliga templatkoncentrationer i than PCR-reaktioner som visas var 50 pg, 5 pg, 500 fg, 50 fg, 5 fg, 500 ag, och 0 g lambda-DNA per mikroliter, och utfördes i triplikat. - Thermocycle PCR-reaktion i qPCR maskin med följande program. Kör 40 cykler av 95 ° C under 30 sek, 57 ° C under 20 sek, 72 ° C under 30 sekunder innan 2 min vid 72 ° C under 2 min och hållning vid 4 ° C.
- Normalisera dsDNA bindande färgämnesfluorescens hjälp av referens färgämnesfluorescens före ytterligare analys.
- Bered MDA reaktion.
- Späd prover som beskrivs i steg 8.1.1.
- Förbered 11 il huvudblandning per prov på is. Den 2x MDA reaktions mastermix består av 2x dsDNA-bindande färgämne, 2x referens färgämne, 50 pM randomiserad oligo, 2 mg / ml BSA, 2x phi29 DNA-polymeras Reaction Buffer, 4.8 mM dNTP, nukleasfritt vatten, och 40 | ig / ml phi29 DNA-polymeras.
- Tillsätt Phi29 DNA-polymeras för 40 mikrogram / ml pågå för att säkerställa polymeras does inte stöta pH-nivåer mycket högre eller lägre än 7,5. Blanda väl.
- Denaturera 3,3 mikroliter av utspädd mall med 3,3 il denatureringsbuffert i en qPCR rör. Inkubera vid rumstemperatur under 3 minuter. Lägg 3,3 il neutraliseringsbuffert.
- Kombinera 10 mikroliter denaturerad mall och 10 il huvudblandning. Blanda väl.
- Kör MDA reaktion i qPCR maskin med följande program.
- Håll vid 30 ° C under 4 timmar, mäta fluorescens var 7,5 minut.
- Inaktivera vid 75 ° C under 1 minut.
- Normalisera dsDNA bindande färgämnesfluorescens hjälp av referens färgämnesfluorescens. Ytterligare normalisera av den maximala fluorescens för varje prov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Medan konventionella bulk / realtid avläsning kan användas för både kvantitativ PCR och kvantitativa WGA analyser (Figur 1), digitala kvantitativa analyser ger fördelar (tabell 1). I den metod som beskrivs, vi läste upp digitala analyser i mikrodroppformat med en enkel bulk endpoint mätningen (Figur 2). Även om denna metod är brett tillämpbar, fokuserar vi på kvantitativ WGA (MDA) eftersom denna metod innebär särskilda utmaningar för konventionella realtidsanalyser.
För att kontrollera om vår realtids-PCR instrument kan upptäcka olika fraktioner av fluorescerande mikrodroppar dispergerade i olja, mätte vi bulk fluorescens av syntetiska blandningar av fluorescerande och icke-fluorescerande droppar (Figur 2). Huvuddelen fluorescens och positiva dropp räknas (oberoende bedömningar av fluorescensmikroskopi) skala linjärt med ingångs fraktionen av fluorescerande droppar som förväntat (Figur 3A). Experimentet genomfördes tre gånger, med oberoende droppbildning och blandning för varje uppsättning.
För att utvärdera den teoretiska kvantifiering prestanda för "okända" prov har vi etablerat linjära standardkurvor med hjälp av helt positiva och helt negativa kontrollprover. Med sådana dropp-lotspecifika standardkurvor, vi beräknat den del av syntetiska positiva och negativa dropp blandningar baserade på varje prov bulk fluorescens. Resultaten visar goda resultat i dropp förhållande kvantifiering över två stockar av dynamiskt omfång (R 2 = 0,984, Figur 3B). Ingångsanalytkoncentrationen lätt beräknas från den fraktion av positiva eller negativa dropparna 38.
För att testa vår metod i en verklig kvantitativ WGA analys mätte vi fluorescensnivåer och bråkdel av positiva droppar av en digital droppe MDA analys med Lambda DNA över en wi de koncentrationsintervall (Figur 4). I figur 4B, är representativa fluorescerande bilder av dropparna visas. Både bulk fluorescens och positiv droppfraktion från de digitala MDA sampel skala som förväntat med den genomsnittliga mall per droppe, vilket indikerar att den bulk avläsning troget kan fånga resultatet av en digital analys (R 2 = 0,927). Vi upprepade experimentet för varje koncentration, oberoende bilda droppar och genomföra WGA för varje kopia.
Tabell 1. Sammanfattning av realtid och digitala analyser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
able2.jpg "/>
Tabell 2. Sammanfattning av befintliga metoder för kvantifiering av nukleinsyror. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 1. realtid kvantitativ PCR och MDA av Lambda DNA. MDA inte diskretiseras genom temperaturcykling som PCR, och är benägen att föramplifiering om inte beredda försiktigt på is. Här var kvantitativ PCR och MDA utfördes med ökande koncentrationer av Lambda DNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figure 2. Schematisk av analog avläsning av droppar och representativa bilder. (A) Positiva och negativa droppar genererades från fluorescerande och icke-fluorescerande reagens i en mikrofluidikanordning. Dropparna förblandades i olika positiva: negativ-förhållanden. Bulk fluorescens-nivåer mättes med en standardrealtidstermocykler, och fraktionen av positiva droppar bestämdes genom fluorescensmikroskopi. (B) Representativa fluorescerande överlagrade bilder med ökande förhållanden mellan positiva droppar (skala bar = 200 pm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Bulk fluorescens och fluorescerande fraktion av kombinationer av separat framställd positiva och negativa droplets. (A) Lysrör (positiv) och icke-fluorescerande (negativa) droppar förblandades i olika förhållanden. Jämförelse av den ingående fraktionen av positiva droppar med den uppmätta bulk fluorescens och uppmätt positiv droppfraktion (n = 3, staplar representerar +/- SD). Den streckade linjen representerar den förväntade fluorescerande fraktionen ges ett linjärt samband. (B) Jämförelse mellan förväntade förhållanden baseras på standarder till den förväntade fluorescerande ingångs fraktion. Linjen visar det förväntade värdet ges ett linjärt förhållande. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Bulk fluorescens och fluorescerande del av en droppe digital MDA analys. Digital MDA utfördes med IncreAsing koncentrationer av mall Lambda-DNA (n = 3, felstaplar representerar SD) och mättes såsom beskrivs i Figur 2A. Linjen visar den förväntade fluorescerande fraktionen med hjälp av poissonfördelning att modellera data från vårt experiment. b) Representativa fluorescerande överlagrade bilder av droppar efter reaktion inaktive (skala bar = 200 nm) för att öka förväntade Lambda DNA-molekyler per droppe (NTC, 0,005, 0,05, 0,5, och 10). Klicka här för att se en större version av denna siffra .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Digitala analyser är kraftfulla metoder som möjliggör detektion av sällsynta celler och räkning av individuella av nukleinsyramolekyler. Emellertid digitala analyser fortfarande inte rutinmässigt används i analyslaboratorier, delvis beroende på kostnaderna för specialutrustning associerad med kommersiellt tillgängliga metoder. Här beskriver vi en slutpunkt digital analys för att kvantifiera nukleinsyror med en förenklad analog avläsning med en vanlig realtids kvantitativ PCR maskin. Denna metod är snabb att ställa upp, och avläsning är mycket enklare än droppräkningsmetoder.
Vår analys förlorar enda molekyl (single-droppen) känsligheten hos de enskilda dropp mätningar för enkelheten i en masse slutpunkt mätning med standardinstrumenteringen. I vår digitala MDA experiment, vi kunde inte urskilja mindre än en positiv droppe per 200 negativa droppar från bakgrunden, trots bekräftelse genom fluorescensmikroskopi att den faktiska fraInsatser av positiva droppar var som förväntat (figur 4). Känsligheten och bakgrund i bulk fluorescens mätgränsen känslighet bulkmätningsanalys för en låg positiv droppfraktioner. Om högre känslighet krävs, en digital avläsning rekommenderas. Skillnader i oljenivåer eller bulkdroppvolymer i hög grad kan påverka provfluorescensdata. Även normalisering med en referens färgämnet kan inte kompensera för skillnader oljevolymer gör i fluorescens läser. Det är möjligt att optimera analysvolym, instrument ackvisitionsparametrar, mikrogeometri, eller optiska filter kan förbättra analysens prestanda.
Känsligheten och dynamiska omfånget av bulk digitala analyser kan också förbättras genom att optimera partitionens storlek. Större droppar ge en större mängd av fluorescerande produkter från varje mall molekyl, som kan bidra till att lösa instrument bakgrund och förbättra känsligheten för låga ingångskoncentrationer. Pådäremot mindre droppar tillåter isoleringen av flera molekyler per volym analyseras. Om templatkoncentration är mycket varierande över prover, kan både små och stora droppreaktioner utföras parallellt för att utöka analysen dynamiskt omfång 39.
Konsekvent droppvolymen är också nödvändiga för noggrann mätning. Många anpassade mikroflödes lösningar finns för att snabbt bilda monodispersa droppar från ett prov, både i serie 19,40 och parallellt 41,42. Medan få gör det möjligt för droppgenerering från flera separata prover parallellt, skulle enkla ändringar av befintliga konstruktioner möjliggör samtidig dropp generering av valfritt antal prover. Exempelvis Bio-Rad ddPCR systemet 23 applicerar jämnt tryck till inloppen hos en rad oberoende dropp beslutsfattare, som gör samtidigt droppbildning från ett flertal prover.
Vår bulk avläsning metodik accesser nyckelfördelarna med partitione digitala analyser utan behovet av specialiserad avläsning instrumentering och är väl lämpad för kvantitativ WGA. Här har vi fokuserat på kvantitativa WGA, som är mycket känslig för bakgrundsföroreningar på grund av sin bristande sekvensspecificitet 7. Dessutom det okända och potentiellt bred molekylviktsfördelning av produkter från kvantitativ realtids-WGA analyser gör tolkning svårt i tillämpningar där antalet ursprungliga mallar är av intresse. Digital analysformateringsadresser båda dessa problem. Föroreningar finns inom individuella reaktions partitioner, förhindra dominans med låg molekylvikt analyter genom hög molekylvikt föroreningar vilket skulle ske i en konventionell realtid analys. I fig 2B och 4B, eventuella föroreningar, ses som ljusa fläckar inom dropparna, är segregerade och inte förstärka eller bidrar i hög grad till den totala fluorescens. Vidaresignal, som alstras i digitala analyser är proportionell mot antalet av mallar, inte storleken på mallar eller deras amplifiering hastigheten. Även om vår metod bygger på standarder för att kalibrera bulk digitala mätningen kravet matcha provet och standard egenskaper kan vara avslappnad avsevärt.
Kvantitativ WGA används ofta för att kvantifiera föroreningar i WGA reaktioner 7,34, och är den mest känsliga metod som är känd för att kvantifiera förekomsten av DNA av okänd sekvens, vilket ger metoden mycket lovande i applikations så skilda områden som farmaceutisk kvalitetskontroll, kriminalteknik, och astrobiologi. Bulk digital avläsning kan gynna andra digitala analysprotokoll såsom digital PCR, genom att påskynda, parallelizing, och förenkla analys avläsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Evagreen Dye | Biotium | 31000 | |
| Bovine serum albumin | New England Biotechnologies | B9000S | |
| Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer | New England Biotechnologies | B0269S | Vortex periodically until aggregate dissolves |
| Lambda DNA | New England Biotechnologies | N3011S | Heated to 50 oC and quenched on ice prior to dilution |
| Randomized MDA oligos | Integrated DNA Technologies | 5'-NNNNN*N-3' | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | 5’-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3’ and 5’-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3’ | |
| UltraPure Nuclease-free water | Life Technologies | 10977-015 | UV-treated for 30 min in Stratalinker 2400 before use (optional) |
| ROX reference dye | Life Technologies | 12223-012 | |
| PCR optical strip caps | Life Technologies | 4323032 | |
| PCR tubes | Agilent Technologies | 401428 | |
| dNTP (25 micromolar each) | Agilent Technologies | 200415 | |
| Thermocycler - Mx3000P qPCR system | Agilent Technologies | 401403 | |
| Barrier pipette tips | VWR | 89003-046 | |
| Bio-rad oil for evagreen | Bio-rad | 186-4005 | |
| JumpStart Taq ReadyMix | Sigma-Aldrich | P2893-100RXN |
References
- Sykes, P. J., Neoh, S. H., Brisco, M. J., Hughes, E., Condon, J., Morley, A. A. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).
- Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. Nanoliter scale PCR with TaqMan detection. Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Day, E., Dear, P. H., McCaughan, F. Digital PCR strategies in the development and analysis of molecular biomarkers for personalized medicine. Methods. 59 (1), 101-107 (2013).
- Tatusova, T., Ciufo, S., Fedorov, B., O'Neill, K., Tolstoy, I. RefSeq microbial genomes database: new representation and annotation strategy. Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D553-D559 (2014).
- Blainey, P. C. The future is now: single-cell genomics of bacteria and archaea. FEMS Microbiol. Rev. 37 (3), 407-427 (2013).
- Blainey, P. C., Quake, S. R. Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination. Nucleic Acids Res. 39 (4), e19 (2011).
- Blainey, P. C., Quake, S. R. Dissecting genomic diversity, one cell at a time. Nat. Methods. 11 (1), 19-21 (2014).
- Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology. ISME J. 2 (3), 233-241 (2008).
- Method of the Year 2013. Nature Methods. 11 (1), 1 (2014).
- Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria. Science. 314 (5804), 1464-1467 (2006).
- OpenArray Technology Overview. , Life Technologies. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-openarray/open-array-technology.html (2014).
- Shen, F., Du, W., Kreutz, J. E., Fok, A., Ismagilov, R. F. Digital PCR on a SlipChip. Lab Chip. 10 (20), 2666-2672 (2010).
- Heyries, K. A., et al. Megapixel digital PCR. Nat. Methods. 8 (8), 649-651 (2011).
- Dressman, D., Yan, H., Traverso, G., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (15), 8817-8822 (2003).
- Kiss, M. M., et al. High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets. Anal. Chem. 80 (23), 8975-8981 (2008).
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nat. Methods. 9 (6), 3 (2012).
- Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Parallel picoliter rt-PCR assays using microfluidics. Anal. Chem. 78 (3), 956-958 (2006).
- Lee, M., et al. Synchronized reinjection and coalescence of droplets in microfluidics. Lab Chip. 14 (3), 509-513 (2014).
- Rhee, M., et al. Pressure stabilizer for reproducible picoinjection in droplet microfluidic systems. Lab Chip. 14 (23), 4533-4539 (2014).
- Hatch, A. C., et al. 1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR. Lab Chip. 11 (22), 3838-3845 (2011).
- Illumina. , Technology. http://www.illumina.com/technology.html (2014).
- Droplet digital PCR applications guide. , Bio-Rad. Available from: http://www.bio-rad.com/en-us/category/digital-pcr (2014).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).
- Lage, J. M., et al. Whole genome analysis of genetic alterations in small DNA samples using hyperbranched strand displacement amplification and array-CGH. Genome Res. 13 (2), 294-307 (2003).
- Dean, F. B., et al. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (8), 5261-5266 (2002).
- Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell. Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).
- Mitos Dropix Systems. , Dolomite. http://www.dolomite-microfluidics.com/webshop/mitos_dropix_system (2014).
- Abate, A. R., Weitz, D. A. Syringe-vacuum microfluidics: A portable technique to create monodisperse emulsions. Biomicrofluidics. 5, 14107 (2011).
- Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells. J Vis Exp. (80), e50618 (2013).
- Fainman, Y. Optofluidics : fundamentals, devices, and applications. , McGraw-Hill. (2010).
- Xia, Y. W. G.M. Softlithographie. Angew Chem. 110 (5), 26 (1998).
- Woyke, T., et al. Decontamination of MDA reagents for single cell whole genome amplification. PLoS One. 6 (10), e26161 (2011).
- System for hot-start amplification via a multiple emulsion. US patent. Hindson, B. J. , (2014).
- Utada, A. S., et al. Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device. Science. 308 (5721), 537-541 (2005).
- Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR. PLoS One. 8 (4), e62961 (2013).
- Dube, S., Qin, J., Ramakrishnan, R. Mathematical analysis of copy number variation in a DNA sample using digital PCR on a nanofluidic device. PLoS One. 3 (8), e2876 (2008).
- Shen, F., et al. Multiplexed quantification of nucleic acids with large dynamic range using multivolume digital RT-PCR on a rotational SlipChip tested with HIV and hepatitis C viral load. J Am. Chem. Soc. 133 (44), 17705-17712 (2011).
- Link, D. R., Anna, S. L., Weitz, D. A., Stone, H. A. Geometrically mediated breakup of drops in microfluidic devices. Phys. Rev. Lett. 92 (5), 054503 (2004).
- Nisisako, T., Torii, T. Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles. Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).
- Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device. Lab Chip. 12 (4), 802-807 (2012).
