Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Dijital Nükleik Asit Kantifikasyon Tahliller Basit Toplu Saati

Published: September 24, 2015 doi: 10.3791/52925
Automatic Translation
1, 2
1Broad Institute, 2Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

Abstract

Dijital deneyler hücrelerin nadiren ve tek tek nükleik asit moleküllerinin sayımı saptanmasını sağlayan güçlü yöntemlerdir. Ancak, dijital tahliller rutin nedeniyle maliyet ve piyasada mevcut yöntemlerle ilgili özel ekipman, uygulanan değil hala. Burada damlacık tabanlı dijital tahliller kütle floresan ölçmek için geleneksel bir gerçek-zamanlı PCR cihazı kullanılarak dijital damlacık deneylerinin okunması için basit bir yöntem sunulmaktadır.

Biz sentetik damlacık karışımları ve damlacık dijital çoklu deplasman amplifikasyon (MDA) testi kullanılarak toplu okuma testinin performansını karakterize. Dijital reaksiyon biçimi Kantitatif MDA özellikle faydaları, ama bizim yeni bir yöntem herhangi bir dijital tahlil için de geçerlidir. Dijital PCR gibi kurulan dijital deney protokolleri için, bu yöntem, hızlandırmak ve deney okuma kolaylaştırmak için hizmet eder.

Bizim toplu okuma metodolojisi partitione avantajlarını getiriyorözel okuma enstrümantasyon gerek kalmadan d tahliller. Bu standart için gereksinimler geleneksel gerçek zamanlı deney için daha az talepkar olmasına rağmen toplu okuma metodolojisi temel sınırlamalar, damlacık sayma platformları ve standart bir numune için ihtiyacı ile karşılaştırıldığında dinamik aralık azalır. Kantitatif tüm genom amplifikasyonu (WGA) WGA reaksiyonlarda kirletici maddeler için test etmek için kullanılır ve farmasötik kalite kontrol ve astrobiyolojiden dahil olmak üzere çeşitli uygulama alanlarında yöntemi büyük umut veren bilinmeyen dizilerle DNA parçalarının varlığını tespit etmek için, en hassas bir şekilde işleme tabi tutulur.

Introduction

Nükleik asit ölçümü (dijital PCR) 1-4 ve taban sırası (sıralama) için dijital analizler şiddetle yaşam bilimleri ve tıp etkilemektedir. Dijital deneyleri, yüksek hassasiyet sağlayan deneyler üzerinde yüzeysel karşılaştırmalar sağlayarak ve en önemlisi, karşılaştırılabilir veriler 5 (Tablo 1) içeren büyük veritabanları yapımını sağlayan mutlak ölçek (bir kontrole göre değil) moleküler sayımı ölçümü sağlar.

Son 15 yılda, tüm genom amplifikasyonu (WGA) nükleik asit amplifikasyonu için genel bir araç olarak PCR ile birlikte ortaya çıktı. PCR gibi, WGA kolayca tespit veya baz sıralama gibi daha sonraki analizler için kullanılabilecek bir seviyeye kadar dakikalık numune elemanlarını yükselterek analitik ve preparatif uygulamalar için kullanışlıdır. PCR aksine, WGA tercih bilinmiyor sekanslar dahil olmak üzere numunedeki tüm sekanslar, amplifikasyon sağlayan belirli bir DNA lokusu için özel değildir.PCR ve WGA arasındaki bu temel fark birbirine tamamlayıcı yöntemler yapar ve bunların uygulamada farklı zorluklar doğurur.

WGA reaksiyonlar 6 yüksek verimi tek moleküllerin 7, tek hücreler 8 ve miktar tayini ya da daha fazla analiz için diğer düşük biyokütle örnekleri 9 genomik DNA rutin amplifikasyonunu sağlamaktadır. WGA kimya ile ilgili önemli zorluklar onun kirlere karşı aşırı hassasiyet ve bireysel şablon molekülleri 6 genelinde dengesiz amplifikasyon vardır. Tek hücreli sıralama Ancak, WGA kazanıyor popülerlik WGA tarafından WGA teknolojisi 10, ve şablon nicelikleme "katil uygulaması" olarak ortaya çıkmıştır uygulamanın 7 birçok alanda önemlidir.

Dijital nükleik asit ölçümü için Alet, daha önce Valfli ve supapsız mikroakışkan forma çeşitli tarif edilmiştirdamlacık bazlı deneyler dahil olmak üzere, ts 11-14, 15,16 (Tablo 2). Ancak, dijital analiz için ticari mikroakışkan sistemler reaksiyon kurulumu ve ürün tespiti 17 için özel ekipman gerektirir. Özel valfli Mikroakiskan esnek, ama hassas mikroüretim ve pnömatik kontrol sistemleri 18 gerektirir. Bu emülsiyon tabanlı dijital deneyleri 19,20 için monodispers mikro damlacıklar yapmak nispeten basit olmakla birlikte, dijital okuma büyük ölçekli geniş alan görüntüleme ya gerektiren, (popüler yeni nesil dizileme teknolojileri benzeri) teknik külfetli olduğu 21,22 veya Yüksek hızlı damlacık algılama 23-25 ​​akış tabanlı. İdeal olarak, bir dijital deney karmaşık enstrümantasyon ihtiyacını azaltarak ve hızlı bir şekilde dışarı okunacak örneklerin çok sayıda izin okunmasını set-up basit olurdu. Burada PCR i konvansiyonel gerçek zamanlı kullanan dijital damlacık deneyleri okuma için basitleştirilmiş bir yöntem tarifişle- mini yaparken damlacık tabanlı dijital testlerin toplu floresan ölçmek için.

Yeni yaklaşım, dijital PCR uygulanabilir olsa da, (PCR için mükemmel sonuç verir) sorunlu gerçek zamanlı amplifikasyon deneylerini analog olan bir dijital WGA deneyleri için özellikle avantajlıdır. WGA yaygın sekansı, uzunluğu, ve baz içeriği heterojendir şablon molekülleri ile örneklere uygulanır. Bu farklı şablon molekülleri referans ("standart") eşleşen özelliklere sahip numunenin kullanımını gerektiren, farklı oranlarda 6 güçlendirilir. Genellikle, böyle bir standart mevcuttur ya da gelen örneklerin özellikleri bilinmemektedir. Giriş kütlesi, moleküllerin giriş numarasını, iki ya da ne bir arada - WGA kimyaları giriş malzeme ve uzunluğu bağımlı mülkiyet heterojenliği 26 de sayısal ediliyor ne de belirsizlik yaratarak sonuçların yorumlanmasını zorlaştırmaktadır. FHerhangi bir dizinin kirletici molekülleri müdahale için potansiyele sahip çünkü inally, dizi-dışı özgüllük kantitatif PCR daha kirlenmeye kantitatif çoklu deplasman amplifikasyon (MDA) daha duyarlı hale getirmektedir. Mikroakışkan dijital tahliller şablon molekülleri ayırma ve daha az kirletici örneklenmiş öyle ki tepkime hacimleri azaltarak kirlenmesini hitap etmektedir.

Burada popüler bir izotermal WGA yöntemi, MDA 27 kullanın. Unutmayın ki, PicoPlex ve MALBAC 28 dahil olmak üzere birçok diğer WGA kimyaları ilk izotermal sarmal yer değiştirme merdivenlerinde önemlisi bağlıdır. Izotermal adımlar nicel WGA analog gerçek zamanlı deneyleri uygulanarak meydan alevlenmesine. WGA ne tamamen kurulum sırasında engelledi istenmeyen değişken ön büyütme giden, ne heterojen moleküllerin çoğaltma tamamlanmasına tahrik ve durdurulabilir bir şekilde ("sağlanıncaya") discretized edilebilir PCR 11 gibi sonraki döngüsü önce (Şekil 1). WGA için dijital tahlil biçimi nedeniyle tahlil uç noktada sayımı için her molekülün ayrılığı tipik reaksiyon kurulum işlemlerini barındıran özgün okuma doğruluğu amplifikasyon verimliliği varyasyon büyük ölçüde bağımsız olacağını ifade (yani preamplıfikasyon sonuçlarını etkilemez).

Tahlil uç noktada damlacık başına sinyal seviyesi damlacık hacmine bağlıdır olarak tahlil, üniforma hacimli yağ üretilen damlacıklar bağlıdır ve biz sonuçların tutarlılığı damlacık boyutları dağılımı boyunca ortalama bağlıdır istemiyorum. Monodispers damlacıkları yapma şimdi (yaklaşık 3.500 monodispers damlacık kağıtları 2013 yılından bu yana yayınlanmış) standart bir prosedür olduğunu, ancak mikroakışkan enstrümantasyon 25 gerektirir. Aslında, fazla altı şirketlerin bu tür damlacıkların üretimine dayanan bağımsız ticari ürünler geliştirdik ve damlacık yapma mikroakışkan cips23,29 ticari olarak temin edilebilir. Bu çalışma için, in-house (Protokol bakınız) üretilen özel mikroakışkan cihazları kullanılır. Şırınga cihazlar yoluyla akışı da ticari olarak temin edilebilir sürücü pompalar, fakat alternatif olarak, maliyetleri azaltmak için 30 vakum bağlı akış için tek tek kullanımlık şırınga ile sübstitüe edilmiş olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: Bu protokol için damlacıkları mevcut ticari damlacık makinesi 23,29 oluşturulabilir gibi mikroakışkan cihaz imalatı, Bu deney için gerekli değildir.

1. Damlacık oluşturan mikroakışkan Aygıt olun

  1. SU-8 Master Fabrikasyon protokolü ile kanallar için ana kalıp hazırlayın önce 31 özetlenen, ama bir damlacık jeneratör maske deseni 32.
  2. Yumuşak litografi 32,33 tekniklerini kullanarak PDMS cihazları imal.

2. Dökme Damlacık Göstergesi için reaksiyon Mix hazırlayın


Not: protokol amplifikasyon reaksiyonlarında pek çok türleri kullanılarak nükleik asitleri ölçmek için kullanılabilir. Bir örnek olarak, çok sayıda Lambda DNA konsantrasyonları MDA için gerekli reaktif verilmiştir. Reaktif ayrıntıları Belirli Reaktifler Tablo listelenmiştir. Damlacıkları içinde şablon dağılımı sufficien bağlıdırNumunenin t karışımı.

  1. Elde veya Arındırmak Phi29 DNA polimeraz.
    1. Daha önce tedarikçiden 7 veya satın açıklandığı gibi Phi29 arındırın. Gösterilen deneyleri için kullanılan Phi29 saflaştırılmıştır.
  2. 65 mM KOH, 1.65 mM EDTA ve 14 mM DTT içeren denatürasyonu Tamponu 10 ml hazırlayın.
  3. 65 mM HCI, 0.21 M Tris-Cl pH 7.0 ve 9 mM Tris-CI, pH 8,0 içeren Nötralizasyon Tamponu 10 ml hazırlayın.
  4. Böyle nükleaz içermeyen su gibi iki standartları, kimse şablon kontrolü (NTC) ve bir yüksek şablon konsantrasyonu (4 pg / etrafında ul Lambda DNA) hazırlayın. Bir qPCR tüpünde Denatürasyon Tampon 3.3 ul her standardın 3.3 ul denatüre. 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Nötralizasyon Tamponu 3,3 uL her söndürün.
  5. Bir qPCR tüpünde Denatürasyon Tampon 3.3 ul ilgi şablonun 3.3 ul denatüre. 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. 3,3 ul söndürünNötralizasyon Buffer.
  6. Buz üzerinde örnek başına usta karışımı 11 ul hazırlayın. 2x MDA Reaksiyon karışımı, ana 2x çift-şeritli DNA oluşur (dsDNA) bağlanma, boya, 2x qPCR referans boya, 50 uM randomize oligo, 2 mg / ml BSA, 2x Phi29 DNA Polimeraz Reaksiyon Tamponu, 4.8 mM dNTP, nükleaz içermeyen su ve 40 ug / ml Phi29 DNA polimerazı. Iyi 7.5.Mix daha pH seviyelerinin daha yüksek veya daha düşük karşılaşmak değil polimeraz sağlamak için son Phi29 DNA polimeraz ekleyin.
  7. İsteğe bağlı: Daha az yanlış pozitif için önce damlacıklar 34 oluşturan UV ışığı ile ana karışımı maruz.
    1. Buz üzerinde 0,5 ml veya 1.5 ml saydam bir tüp içinde örnek başına ön karışımın 10 ul hazırlayın. Ön-karışım 55 uM randomize oligo, 2,2 mg / ml BSA, 1.1x Phi29 DNA Polimeraz Reaksiyon Tamponu, 5.3 mM dNTP ve nükleaz içermeyen su oluşur.
    2. 34 tarif edildiği gibi buz su tüp yerleştirilir ve bir akü, UV ışığı (254 nm) maruz5.7 J formüle edilmiş dozu / cm 2.
    3. Ön karışım içinde bulunan 40 ug / ml dsDNA bağlayıcı 1x boya, 1x referans boya ve Phi29 ekleyin. İyice karıştır.
  8. Denatüre şablon veya standart 10 ul ve master karışımı 10 ul birleştirin. İyice karıştır.

3. Damlacık Oluşumu

Not: damlacıklar statik elektrik ve kayma gerilmesi çok hassas olabilir. Statik elektrik neden olabilecek giysiler çıkarın ve damlacıklar oluşturan önce kendinizi topraklayın. Mümkün olduğu kadar emülsiyondan, tüpün üstünden emülsiyon tüpleri tutun. Pipet emülsiyonlar çok yavaş, tercihen geniş delik pipet ucuyla. Bir pipet gelen dağıtım yaparken, pipet hızını belirlemek için uç tarafında emülsiyonu izleyebilirsiniz.

  1. Form damlacıkları. Deneyler göstermiştir için, mikroakışkan cihaz, bir yağ girişi ve damlacıklar üretmek için bir akış odaklama kavşağın iki sulu girişleri vardır. İki syri kullanınNGE 20.000 1 nl damlacıklar oluşturmak için mikroakışkan çip sayesinde yüzey aktif madde ile bir yağ 55 ul ve reaksiyon karışımı bir 20 ul akış hızlarını kontrol etmek pompalar.
  2. Bu yüzey aktif madde ile birlikte bir yağ, çok çeşitli olan damlacıkları üretmek mümkündür, ama bileşim, büyük ölçüde, yüksek sıcaklıklarda ve zaman içinde damlacık stabilitesini etkiler: edin. Olası bir kombinasyonu anyonik bir yüzey aktif 19,35 florlu yağ HFE 7500.
  3. Herhangi bir yöntem 13,36 ile herhangi bir boyutta damlacıklar üretmek ama damlacık popülasyonda boyut farklılaşabilirliği dökme floresan ve bu nedenle tahlilin hassasiyetini etkileyecektir. Gösterilen deneylerde, damlalar 1 nl bir hacimde tek dağılımlı idi.
  4. PCR tüpleri içine ve sıvı yağ toplayın. Her bir örnek için, kısım 30, optik kapaklar taze PCR tüpleri içine petrol ul ve yağ üstünde damlacıklar 20 ul transfer. Tutarlı hacimleri tahlil ac olarak sağlamakmümkün papaz.
  5. Yakın tüp gevşek kapakları petrol buharlaşmasına izin verecek şekilde, sıkıca kapakları.

4. İzotermal Büyütme

  1. PCR thermocycler, qPCR PCR, ya da sıcak plaka kullanılarak, 7 saat süre ile 30 ° C'de inkübe örnekleri ve 75 ° C'de 1 dakika süre ile etkisiz hale getirirler. Damlacıkların borular bu noktada bir kaç saat için folyo ile kaplı bir buzdolabı bırakılabilir.

5. Veri Toplama ve Analizi

  1. Hemen qPCR thermocycler kullanan tüm numuneler için boya flüoresan seviyelerini ölçmek reaksiyon inaktivasyonunu takip. Optimal filtre ayarlarını boya uyarma ve emisyon spektrumları bağlıdır. Bu örnek için, dsDNA bağlayıcı boya için ayarlanmış 492 nm-516 nm filtre ve referans boya için ayarlanmış 585 nm-610 nm filtre kullanın. Diğer floresan ölçüm teknikleri floresan ölçmek için kullanılabilir.
  2. Her numune için, tarafından dsDNA bağlayıcı boya floresan yoğunluğu bölmekReferans boyanın flüoresan yoğunluğu. Tüm örneklerden arka plan floresan veya hiçbir şablon kontrolü normalize floresan, çıkarma.
  3. Standartlardan düzeltilmiş floresan ölçümleri kullanarak doğrusal bir standart eğri oluşturun. NTC standart% 0 floresan damlacıklarıyla bir örnek için floresan ("Tüm negatif") temsil eder ve yüksek şablon konsantrasyonu floresan ölçümü% 100 floresan damlacıklarıyla bir örnek için beklenen floresan ("tüm pozitif") 'dir. Karşılık gelen standart eğri kullanılarak, bunların yığın floresan göre pozitif ve negatif damlacıkların ara oranları tahmin.

6. Üretim Damlacıklar Proof-of-İlke Ölçümleri için

  1. Floresan (pozitif) damlalar sağlayın: 0,1 ng Lambda DNA, 1 x dsDNA bağlayıcı boya, 1 x referans boya, 1.5 birim Taq DNA polimeraz, 10 mM Tris-HCI, 50 mM KCI, 1,5 m aşağıdakilerden oluşan bir PCR reaksiyon karışımı hazırlamakM MgCI2, 0.2 mM dNTP ve 0.5 uM primer. Karışım yukanda açıklandığı gibi 30 kat (20 saniye, 20 saniye, 1 dakika için 72 ° C, 55 ° C, 95 ° C) Thermocycle, daha sonra damlacıklar oluşturur.
  2. Floresan olmayan (negatif) damlalar sağlayın: 1x dsDNA bağlayıcı boyasından oluşan bir PCR reaksiyon karışımı hazırlandı, 1 x referans boya, 1.5 birim Taq DNA polimeraz, 10 mM Tris-HCI, 50 mM KCI, 1.5 mM MgCI2, 0.2 mM dNTP, ve 0.5 uM primer. Karışım 30 kez (20 saniye için 95 ° C, 20 saniye, 1 dakika süre ile 72 ° C'de 55 ° C), daha sonra damlacıklar oluşturmak Thermocycle.
  3. Ön karışımlı damlacık oranları Şekillendirme
    1. QPCR tüpler içine florlu yağı 20 ul dağıtın, buharlaşmayı önlemek için bir optik kapakla örtün.
    2. Petrol üstündeki olumsuz oranları: yavaşça istenen olumlu iyi karıştırılmış damlacıkların 10 ul pipetle. Gösterilen sonuçlar, pozitif: negatif oranlarının 1 damla (tüm pozitif), 0,8, 0,5, 0,2, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 ve 0 (bütün neg edildiative).
  4. QPCR thermocycler kullanan tüm numuneler için boya flüoresan seviyeleri ölçülür. Bu protokol için, dsDNA bağlayıcı boya için belirlenen 492 nm-516 nm filtresi ve referans boya için belirlenen 585 nm-610 nm filtresi kullanın.
    1. DsDNA referans boya floresan kullanarak boya floresan bağlayıcı Normale. Dahası "tüm pozitif" örnek floresan normalleştirmek.
  5. "Tüm pozitif" ve "negatif" örneklerinden normalize floresan ölçümleri kullanarak doğrusal bir standart eğri oluşturun. Karşılık gelen standart eğri kullanılarak, bunların yığın floresan göre pozitif ve negatif damlacıkların ara oranları tahmin.
  6. Her oran (n = 3) bağımsız bir damlacık oluşumu ve her bir deney için karıştırılarak deneyi tekrarlayın.

7. Proof-of-Prensibi MDA Deneyi

  1. Bir spec ile Lambda DNA stok çözeltisi konsantrasyonunu ölçmektrophotometer.
    1. Damlacık ortalama 10 şablon molekülleri gerekli şablon konsantrasyonu hesaplayın. Bu protokol için damlacık hacimleri 1 nl ve Lambda DNA 1 ng yaklaşık 1.9 x 10 7 kopyasını içerir varsayıyorum. Bu nedenle, damlacık başına 10 şablonları nl başına 10 kopya ya da ul başına 526 fg Lambda DNA olacaktır. Damlacıklar oluşacak zaman şablonu, bu nedenle, ilk üst şablon konsantrasyonu / ml 3,2 pg olacak ~ 6x seyreltilmiş olacaktır.
  2. Seri olarak denatürasyon tampon ve eşit hacimde Nötralizasyon Tamponu ile 3,2 ug / ul DNA Lambda seyreltin. 0.1 bir seyreltme faktörü için, Denatürasyon Tamponu 45 ul 10 ul örnek birleştirmek ve 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Nötralizasyon Tampon 45 İL gidermek için ekleyin.
  3. Deney için numune kalanını yapmak için adım 7.2 anlatıldığı gibi daha ileri örneği sulandırmak. Gösterilen reaksiyonlarda, ilk şablon konsantrasyonları, 3.2 pg, 320 fg edildi160 fg, 32 fg, 16 fg, 3.2 fg ve mikrolitre başına 1.6 fg.
    Not: master karışım ilave edildikten sonra son şablon konsantrasyonları 526 fg vardı, 52.6 fg, 26.3 fg, 5.26 fg, mikrolitre başına 2.63 fg, 526 ag ve 263 ag. Sırasıyla, damlacık başına 10, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01 ve 0.005 beklenen Lambda kopyalar.
  4. Oluşturmak ve adımları 2,5-5,3 tarif edildiği gibi, her örnekten damlacıklar analiz eder.
  5. Bir dijital fotoğraf makinesi kullanan gösterilen floresan görüntüleri (Şekil 2,3) oda sıcaklığında bir 10x amacı ile bir epi-floresan mikroskop monte edinin. Her numune için görüş oniki alanları edinin. Bir floresan slayt ile elde edilen bir arka plan görüntüsü ile doğru floresan görüntüler.
  6. Emülsiyon yağı çabuk buharlaşır gibi görüntüleme 37 için bir yer odasına kullanın.
  7. Bir ImageJ makro (Ek kod dosyası) kullanarak bireysel damlacık yoğunluklarını analiz edin.
    1. En iyi N floresan olmayan damlacıkları ayıran bir eşik floresan yoğunluğu seçinYüksek şablon konsantrasyonu görüntülerde floresan damlacıklar gelen TC görüntüler. Bilinmeyen her numune için, bir sınır değerin üzerinde floresan ile damlacıklar kısmını hesaplar.

8. PCR ve MDA toplu reaksiyonları

  1. PCR reaksiyonu hazırlayın.
    1. Seri 0,1 seyreltme faktörü ile şablon DNA sulandırmak. Her seyreltme için, Denatürasyon Tamponu 45 ul şablonun 10 ul birleştirmek ve 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Nötralizasyon Tampon 45 ul seyreltme birleştirin.
    2. Örnek başına PCR master 20 ul hazırlayın. 1.1x PCR reaksiyon karışımı, ana Taq DNA polimeraz ul 60 birim /, 11 mM Tris-HCI, 55mm KCI, 1.65 mM MgCl2, 0.22 mM dNTP oluşur, 1.1x boya, 1.1x referans boya ve 550 nM dsDNA bağlayıcı Her astar.
    3. Seyreltilen değişik şablon 2 ul ve 20 ul master birleştirin.
      Not: Nihai şablon konsantrasyonları tO gösterilen reaksiyonlar PCR 50 pg, 5 pg, 500 fg, mikrolitre başına 50 fg, 5 fg, 500 ag ve 0 g Lambda DNA idi ve üç kopya halinde yapıldı.
    4. Aşağıdaki programı ile QPCR makinesinde Thermocycle PCR reaksiyonu. 2 dakika boyunca 72 ° C 'de 2 dakika önce 30 saniye, 30 saniye için 20 sn için 57 ° C, 72 ° C, 95 ° C 40 döngü çalıştırın ve 4 ° C' de tutarak.
    5. DsDNA referans boya floresan önce daha fazla analiz kullanarak boya floresan bağlayıcı Normale.
  2. MDA reaksiyonu hazırlayın.
    1. Aşama 8.1.1 açıklandığı gibi örnekleri sulandırmak.
    2. Buz üzerinde örnek başına usta karışımı 11 ul hazırlayın. 2x MDA Reaksiyon karışımı, ana 2x dsDNA bağlayıcı boya, 2x referans boya, 50 uM randomize oligo oluşur 2 mg / ml BSA, 2x Phi29 DNA Polimeraz Reaksiyon Tamponu, 4.8 mM dNTP, nükleaz içermeyen su ve 40 ug / ml Phi29 DNA Polimeraz.
    3. 40 ug Phi29 DNA polimeraz ekleyin / polimeraz d sağlamak için son mloes 7.5 den pH seviyelerinin daha yüksek veya daha düşük değil karşılaşmak. İyice karıştır.
    4. Bir qPCR tüp içinde Denatürasyon Tamponu 3,3 ul seyreltilmiş numune, 3.3 uL denatüre. 3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Nötralizasyon Tampon 3.3 ul ekleyin.
    5. Denatüre şablonun 10 uL ve master karışımı 10 ul birleştirin. İyice karıştır.
    6. Aşağıdaki programı ile QPCR makinesi MDA reaksiyonu çalıştırın.
    7. Floresans her 7,5 dakika, ölçüm 4 saat 30 ° C'de tutun.
    8. 1 dakika süre ile 75 ° C 'de inaktive.
    9. DsDNA referans boya floresan kullanarak boya floresan bağlayıcı Normale. Bundan başka, her numune için maksimum flüoresan ile normalize.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Geleneksel bulk / gerçek zamanlı kantitatif PCR okumaları ve kantitatif WGA tahlilleri (Şekil 1) her ikisi için de kullanılabilmesine rağmen, bir dijital sayısal deneyler avantajları (Tablo 1) sağlar. Açıklanan yöntemde, basit bir toplu uç ölçümü (Şekil 2) ile mikro damlacık formatında dijital deneyleri okudu. Bu yöntem genel olarak uygulanabilir iken bu yöntem, geleneksel gerçek zamanlı deneyleri için özel zorluklar sunuyor, çünkü biz niceliksel WGA (MDA) odaklanır.

Bizim gerçek zamanlı PCR cihazı yağ içinde dağılmış floresan mikro damlacıklar değişen kesirler tespit olabilir olmadığını kontrol etmek için, biz floresan ve floresan olmayan damlacıkları (Şekil 2) sentetik karışımların toplu floresan ölçümü. Toplu floresan ve pozitif damlacık sayısı (bağımsız floresan mikroskobu ile değerlendirildi) beklendiği gibi (floresan damlacıkların giriş fraksiyonu doğrusal ölçeklendirmeŞekil 3A). Deney her set için bağımsız damlacık oluşumu ve karıştırma ile, üç kere yapıldı.

"Bilinmeyen" numuneler için teorik miktar performansını değerlendirmek için, tamamen pozitif ve tamamen negatif kontrol örnekleri kullanılarak doğrusal standart eğrileri kurdu. Bu tür damlacık-çok özgü standart eğrileri ile, her numunenin toplu floresan dayalı sentetik pozitif ve negatif damlacık karışımlarının fraksiyonu hesaplandı. (Şekil 3B R2 = 0,984) sonuçları dinamik aralık iki günlükleri arasında damlacık oranı nicellendirmesinde iyi bir performans gösteriyor. Giriş analit konsantrasyon kolayca pozitif ya da negatif damlacıklar 38 fraksiyondan hesaplanır.

Gerçek nicel WGA tahlilinde eden yöntemi test etmek için, bir wi boyunca floresans seviyelerini ve lambda DNA ile dijital bir damlacık MDA tahlilinde pozitif damlacıklar kısmını ölçüldü konsantrasyonlarının de aralığı (Şekil 4). Şekil 4B'de ise, damlacıklar temsili fluoresan görüntüleri gösterilir. Damlacık başına ortalama şablonla beklendiği gibi dijital MDA örneklerinden ikisi toplu floresan ve pozitif damlacık kesir toplu okuma sadakatle dijital deneyi (= 0,927 R 2) sonucunu yakalayabilir belirten ölçek. Biz bağımsız damlacıkları oluşturan ve her tekrar için WGA yürüten, her bir konsantrasyon için deneyi tekrarladı.

tablo 1
Tablo 1. gerçek zamanlı ve dijital deneyleri Özeti. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

able2.jpg "/>
Tablo nükleik asitlerin miktarlarının için mevcut yöntemlerden 2. Özeti. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figür 1
Şekil 1. Gerçek zamanlı kantitatif PCR ve Lambda DNA. MDA MDA PCR gibi sıcaklık döngüsü boyunca discretized ve buz üzerinde özenle hazırlanmış değilse Preamplification eğilimli değildir. Burada, kantitatif PCR ve MDA Lambda DNA konsantrasyonları artan yapıldı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Figurdamlacıkları ve temsili resimlerin analog okuma e 2. şematik. (A) Pozitif ve negatif damlacıkları mikroakışkan cihaz floresan ve floresan olmayan reaktiflerin elde edildi. Negatif oranları: damlacıkları farklı pozitif önceden karıştırılmıştır. Toplu floresan seviyeleri, standart bir gerçek-zamanlı PCR aleti ile ölçüldü, ve pozitif damlacıkların fraksiyon floresan mikroskobu ile belirlenmiştir. (B) Temsilcisi floresan pozitif damlacıkları (ölçek çubuğu = 200 mikron) oranlarını artırarak görüntüleri kaplattı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. Toplu floresan ve ayrı ayrı hazırlanmış olumlu ve olumsuz drople kombinasyonları floresan kesirts. (A) (pozitif) Floresan ve floresan olmayan (negatif) damlacıkları farklı oranlarda önceden karıştırıldı. Ölçülen bağıl floresan pozitif damlacıklar giriş fraksiyonunun karşılaştırması ve ölçülen pozitif damlacık fraksiyonu (n = 3, bar temsil +/- SD). Noktalı çizgi doğrusal bir ilişki verilen beklenen floresan kısmını temsil eder. Beklenen floresan giriş fraksiyona standartlara dayalı tahmin oranların (B) Karşılaştırma. Çizgi doğrusal bir ilişki verilen beklenen değeri gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4. Toplu floresan ve damlacık dijital MDA testinin. Dijital MDA floresan kesir artışlarla gerçekleştirildiasing şablonu Lambda DNA (n = 3, hata çubukları SD ifade etmektedir) konsantrasyonları Şekil 2A'da tarif edildiği gibi ölçülmüştür. Çizgi, bizim deney verileri modellemek için Poisson dağılımını kullanarak beklenen floresan kısmını gösterir. b) Temsilcisi floresan damlacık (NTC, 0.005, 0.05, 0.5, ve 10) başına beklenen Lambda DNA moleküllerini artırmak için reaksiyon inaktivasyonu (ölçek çubuğu = 200 mikron) sonra damlacıkların görüntülerini kaplattı. tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dijital deneyler, nadir görülen hücrelerin tespit ve nükleik asit moleküllerinin bireyin sayımı sağlayan güçlü bir yöntem vardır. Bununla birlikte, dijital deneyler de rutin olarak ticari olarak temin edilebilen yöntemler ile ilişkili özel ekipman maliyeti, kısmen, analitik laboratuar uygulanan bağlı değildir. Burada bir standart gerçek zamanlı kantitatif PCR makine kullanarak basitleştirilmiş bir analog okuma ile nükleik asitlerin miktarının belirlenmesi için bir son nokta dijital tahlil açıklar. Bu yöntem set-up hızlı ve okuma damlacık sayım yöntemleri daha kolaydır.

Bizim tahlil standart alet kullanarak topluca son nokta ölçüm basitlik bireysel damlacık ölçümlerin tek-molekül (tek damla) hassasiyeti kaybeder. Dijital MDA deneyde, floresan mikroskop gerçek fra tarafından teyidi rağmen, arka plan, 200 negatif damlacıkları başına 1 pozitif damlacık daha az ayırt edemediPozitif damlacıkların ction (Şekil 4) beklendiği gibi oldu. Toplu floresan ölçüm limiti duyarlılık ve arka plan düşük pozitif damlacık kesirler için toplu ölüm testinin hassasiyeti. Daha yüksek hassasiyet gerekli ise, bir dijital okuma önerilir. Yağ seviyeleri veya toplu damlacık hacimleri farklılıklar büyük ölçüde örnek floresan verileri etkileyebilir. Bir referans boya ile bile normalleşme yağ hacimleri floresan okur hale farklılıkları telafi edilemez. Bu tahlil hacmi, alet satın alma parametreleri, Mikro geometri, ya da optik filtreler optimize tahlil performansını artırmak mümkündür.

Duyarlılık ve toplu dijital testlerin dinamik aralığı da bölüm boyutunu optimize ederek geliştirilebilir. Büyük damlacıklar enstrümantal arka plan aşabilmesi ve düşük giriş konsantrasyonları duyarlılığını artırabilir her şablon molekülü, floresan ürünlerin büyük bir miktar verim. AçıkDiğer taraftan, daha küçük damlacıklar tahlil hacim başına daha fazla molekül izolasyonuna olanak tanır. Şablon konsantrasyon örnekleri arasında oldukça değişkendir ise, hem küçük hem de büyük bir damlacık reaksiyonları deney dinamik aralığı 39 genişletmek için paralel olarak gerçekleştirilebilir.

Tutarlı damlacık hacimleri de doğru ölçüm için gereklidir. Birçok özel mikroakışkan çözeltiler seri 19,40 ve 41,42 paralel hem de hızlı bir şekilde bir numune tek dağılımlı damlalar oluşturmak için mevcuttur. Birkaç paralel birkaç ayrı örneklerden damlacık oluşumunu sağlamak da, mevcut tasarımlardan basit modifikasyonlar örneklerin, herhangi bir sayıda eş zamanlı damlacık oluşturma izin verecektir. Örneğin, Bio-Rad ddPCR sistemi 23 çok sayıda örneğin aynı anda, damlacık oluşumunu sağlayan bağımsız damlacık makinesi, bir dizi girişleri için tek tip bir baskı uygular.

Bizim toplu okuma metodolojisi anahtarı kereözel bir okuma enstrümantasyon ve gerek kalmadan bölmeli bir dijital deneylerinde avantajları niceliksel WGA çok uygundur. Burada, biz nedeniyle dizisi özgüllüğü 7 eksikliğine arka plan kirleticilere karşı son derece duyarlı olan nicel WGA, üzerinde duruldu. Orijinal şablonlar sayısı ilgi olduğu Buna ek olarak, gerçek zamanlı kantitatif WGA tahlillerinden elde edilen ürün potansiyel olarak bilinmeyen ve geniş bir molekül ağırlığı dağılımı uygulamalarında yorumlanması zorlaştırır. Dijital tahlil biçimlendirme adresleri hem bu sorunları. Kirletici maddeler, geleneksel bir gerçek zamanlı deneyinde ortaya gibi yüksek molekül ağırlıklı kirletici maddelerin düşük molekül ağırlıklı analitlerin hakimiyeti önlenmesi, ayrı ayrı reaksiyon bölümleri içinde ihtiva edilir. Damlacıklar içinde parlak noktalar olarak görülen Şekil 2B ve 4B, olası kirletici maddeler, olarak, ayrılmış ve yükseltmek veya genel floresan önemli ölçüde katkıda yoktur. Ayrıca,Dijital deneylerde üretilen sinyalin şablonları değil, şablon boyutu ya da amplifikasyon oranı sayısı ile doğru orantılıdır. Bizim yöntem toplu dijital ölçüm kalibre etmek için standartlara dayanır rağmen, gereksinim örneği maç ve standart özelliklerinin önemli ölçüde rahat olabilir.

Kantitatif WGA yaygın WGA reaksiyonlar 7,34 kirletici maddeleri ölçmek için kullanılan ve en hassas bilinmeyen bir dizi DNA'nın varlığını ölçmek için bilinen bir yöntem, farmasötik gibi çeşitli uygulama alanlarında yöntemi büyük umut veren bir kalite denetimi, adli ve astrobiyolojiyi. Toplu dijital okuma, hızlandırmak koşutlama ve tahlil okuma basitleştirerek, dijital PCR gibi diğer dijital tahlil protokolleri yararlanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Evagreen Dye Biotium 31000
Bovine serum albumin New England Biotechnologies B9000S
Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer New England Biotechnologies B0269S Vortex periodically until aggregate dissolves
Lambda DNA New England Biotechnologies N3011S Heated to 50 oC and quenched on ice prior to dilution
Randomized MDA oligos Integrated DNA Technologies 5'-NNNNN*N-3'
PCR primers Integrated DNA Technologies 5’-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3’ and 5’-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3’
UltraPure Nuclease-free water Life Technologies 10977-015 UV-treated for 30 min in Stratalinker 2400 before use (optional)
ROX reference dye Life Technologies 12223-012
PCR optical strip caps Life Technologies 4323032
PCR tubes Agilent Technologies 401428
dNTP (25 micromolar each) Agilent Technologies 200415
Thermocycler - Mx3000P qPCR system Agilent Technologies 401403
Barrier pipette tips VWR 89003-046
Bio-rad oil for evagreen Bio-rad 186-4005
JumpStart Taq ReadyMix Sigma-Aldrich P2893-100RXN

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sykes, P. J., Neoh, S. H., Brisco, M. J., Hughes, E., Condon, J., Morley, A. A. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).
  2. Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. Nanoliter scale PCR with TaqMan detection. Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).
  3. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 96 (16), 9236-9241 (1999).
  4. Day, E., Dear, P. H., McCaughan, F. Digital PCR strategies in the development and analysis of molecular biomarkers for personalized medicine. Methods. 59 (1), 101-107 (2013).
  5. Tatusova, T., Ciufo, S., Fedorov, B., O'Neill, K., Tolstoy, I. RefSeq microbial genomes database: new representation and annotation strategy. Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D553-D559 (2014).
  6. Blainey, P. C. The future is now: single-cell genomics of bacteria and archaea. FEMS Microbiol. Rev. 37 (3), 407-427 (2013).
  7. Blainey, P. C., Quake, S. R. Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination. Nucleic Acids Res. 39 (4), e19 (2011).
  8. Blainey, P. C., Quake, S. R. Dissecting genomic diversity, one cell at a time. Nat. Methods. 11 (1), 19-21 (2014).
  9. Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology. ISME J. 2 (3), 233-241 (2008).
  10. Method of the Year 2013. Nature Methods. 11 (1), 1 (2014).
  11. Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria. Science. 314 (5804), 1464-1467 (2006).
  12. OpenArray Technology Overview. , Life Technologies. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-openarray/open-array-technology.html (2014).
  13. Shen, F., Du, W., Kreutz, J. E., Fok, A., Ismagilov, R. F. Digital PCR on a SlipChip. Lab Chip. 10 (20), 2666-2672 (2010).
  14. Heyries, K. A., et al. Megapixel digital PCR. Nat. Methods. 8 (8), 649-651 (2011).
  15. Dressman, D., Yan, H., Traverso, G., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (15), 8817-8822 (2003).
  16. Kiss, M. M., et al. High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets. Anal. Chem. 80 (23), 8975-8981 (2008).
  17. Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nat. Methods. 9 (6), 3 (2012).
  18. Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Parallel picoliter rt-PCR assays using microfluidics. Anal. Chem. 78 (3), 956-958 (2006).
  19. Lee, M., et al. Synchronized reinjection and coalescence of droplets in microfluidics. Lab Chip. 14 (3), 509-513 (2014).
  20. Rhee, M., et al. Pressure stabilizer for reproducible picoinjection in droplet microfluidic systems. Lab Chip. 14 (23), 4533-4539 (2014).
  21. Hatch, A. C., et al. 1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR. Lab Chip. 11 (22), 3838-3845 (2011).
  22. Illumina. , Technology. http://www.illumina.com/technology.html (2014).
  23. Droplet digital PCR applications guide. , Bio-Rad. Available from: http://www.bio-rad.com/en-us/category/digital-pcr (2014).
  24. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  25. Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).
  26. Lage, J. M., et al. Whole genome analysis of genetic alterations in small DNA samples using hyperbranched strand displacement amplification and array-CGH. Genome Res. 13 (2), 294-307 (2003).
  27. Dean, F. B., et al. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (8), 5261-5266 (2002).
  28. Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell. Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).
  29. Mitos Dropix Systems. , Dolomite. http://www.dolomite-microfluidics.com/webshop/mitos_dropix_system (2014).
  30. Abate, A. R., Weitz, D. A. Syringe-vacuum microfluidics: A portable technique to create monodisperse emulsions. Biomicrofluidics. 5, 14107 (2011).
  31. Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells. J Vis Exp. (80), e50618 (2013).
  32. Fainman, Y. Optofluidics : fundamentals, devices, and applications. , McGraw-Hill. (2010).
  33. Xia, Y. W. G.M. Softlithographie. Angew Chem. 110 (5), 26 (1998).
  34. Woyke, T., et al. Decontamination of MDA reagents for single cell whole genome amplification. PLoS One. 6 (10), e26161 (2011).
  35. System for hot-start amplification via a multiple emulsion. US patent. Hindson, B. J. , (2014).
  36. Utada, A. S., et al. Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device. Science. 308 (5721), 537-541 (2005).
  37. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR. PLoS One. 8 (4), e62961 (2013).
  38. Dube, S., Qin, J., Ramakrishnan, R. Mathematical analysis of copy number variation in a DNA sample using digital PCR on a nanofluidic device. PLoS One. 3 (8), e2876 (2008).
  39. Shen, F., et al. Multiplexed quantification of nucleic acids with large dynamic range using multivolume digital RT-PCR on a rotational SlipChip tested with HIV and hepatitis C viral load. J Am. Chem. Soc. 133 (44), 17705-17712 (2011).
  40. Link, D. R., Anna, S. L., Weitz, D. A., Stone, H. A. Geometrically mediated breakup of drops in microfluidic devices. Phys. Rev. Lett. 92 (5), 054503 (2004).
  41. Nisisako, T., Torii, T. Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles. Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).
  42. Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device. Lab Chip. 12 (4), 802-807 (2012).

Tags

Molecular Biology Sayı 103 tüm genom amplifikasyonu dijital deney MDA PCR tek bir molekül tek bir hücre nükleik asitler mikro-damlacıklar mikroakışkan emülsiyon
Dijital Nükleik Asit Kantifikasyon Tahliller Basit Toplu Saati
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morinishi, L. S., Blainey, P. Simple … More

Morinishi, L. S., Blainey, P. Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays. J. Vis. Exp. (103), e52925, doi:10.3791/52925 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter