Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Простой Массовая считывания цифровых нуклеиновых кислот количественного определения Анализы

Published: September 24, 2015 doi: 10.3791/52925
Automatic Translation
1, 2
1Broad Institute, 2Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

Abstract

Цифровые анализы являются мощными методы, позволяющие обнаружение редких клеток и подсчета отдельных молекул нуклеиновых кислот. Тем не менее, цифровые анализы еще не применяется обычно, из-за стоимости и определенного оборудования, связанного с коммерчески доступных методов. Здесь мы представляем упрощенный метод для считывания цифровых анализов капель с использованием обычного ПЦР в реальном времени инструмент для измерения объемной флуоресценции капель на основе цифровых анализов.

Мы характеризуют производительность объемной считывания анализа с использованием синтетических смесей капель и капель цифрового усиления несколько смещение (МДА) анализа. Количественный MDA особенно выгоды от цифровом формате реакции, но наш новый метод применяется к любому цифровому анализа. Для установленных цифровых протоколов анализа, таких как цифровой ПЦР, этот метод служит для ускорения и упрощения анализа считывание.

Наша методология основная считывания приносит преимущества partitioneD анализы без необходимости специализированного считывания инструментовки. Основные ограничения методики объемной считывания уменьшается динамический диапазон по сравнению с капли подсчета платформ и необходимость стандартного образца, хотя требования к этому стандарту, менее требовательны, чем стандартном эксперименте в режиме реального времени. Количественный весь геном усиления (WGA) используется для проверки на наличие загрязнений в WGA реакций и является наиболее чувствительным способом обнаружения присутствия фрагментов ДНК с неизвестными последовательностями, давая метод большие надежды в различных прикладных областях, включая фармацевтического контроля качества и астробиологии.

Introduction

Цифровые анализы для количественного нуклеиновых кислот (ПЦР цифровой) 1-4 и основание порядка (последовательности) сильно влияют на науки о жизни и медицина. Цифровые анализы обеспечивают количественную молекулярных графов по абсолютной шкале (не по отношению к контролю), обеспечивая высокую чувствительность, что позволяет легкое сравнение по экспериментах, и самое главное, что позволяет строительство крупных баз данных, содержащих сопоставимые данные 5 (таблица 1).

За последние 15 лет, весь геном усиления (WGA) появились вместе ПЦР в качестве общего инструмента для амплификации нуклеиновых кислот. Как ПЦР, WGA является полезным для аналитических и препаративных применений путем амплификации минуту элементы дискретизации до уровня, который может быть легко обнаружен и используется для последующих анализов, таких как базовой последовательности. В отличие от ПЦР, WGA не является специфичным для конкретного локуса ДНК, а позволяет усиление всех последовательностей в образце, в том числе неизвестных последовательностей.Это фундаментальное различие между PCR и WGA делает методы дополняют друг друга и приводит к различным вызовам в их применении.

Высокий выход WGA реакций 6 позволяет рутинной амплификации геномной ДНК из отдельных молекул 7, 8 одиночных клеток и других образцов с низким биомассы 9 для количественного или дальнейшего анализа. Основные проблемы, связанные с WGA химии являются его крайняя чувствительность к загрязнению и неравномерное усиление по отдельным матричных молекул 6. Тем не менее, РГА набирает популярность в качестве одноклеточного последовательности возникла как "убийца применения" WGA технологии 10 и шаблона количественного определения WGA является важным во многих областях применения 7.

Инструменты для цифрового количественного нуклеиновых кислот было описано ранее в различных клапаном и бесклапанного микрожидкостных FORMATS 11-14, в том числе капель на основе анализов 15,16 (таблица 2). Тем не менее, коммерческие микрофлюидных системы цифрового анализа требует специального оборудования для установки реакции и обнаружения продукта 17. Пользовательские клапанных микрофлюидики являются гибкими, но требуют точности изготовления микроструктур и пневматические системы управления 18. В то время как это относительно просто сделать монодисперсных микро-капли для эмульсионных основе цифровых анализов 19,20, цифровой дисплей технически обременительным, требуя либо масштабную изображений широкого поля (аналогично популярных технологий секвенирования следующего поколения) 21,22 или высокоскоростной поток на основе обнаружения капель 23-25. В идеале, цифровой анализ было бы просто из набора к считывания, снижая потребность в комплексной аппаратуры и позволяет большое количество образцов, которые будут считывать быстро. Здесь мы опишем упрощенный способ считывания цифровых капель анализов, которые использует обычный ПЦР в реальном времени яnstrument для измерения объемной флуоресценции капель на основе цифровых анализов.

В то время как новый подход может быть применен к цифровым ПЦР, особенно предпочтительно для цифровых WGA анализов для какого аналогового реальном времени амплификации анализы (которые дают превосходные результаты для ПЦР) являются проблематичными. WGA обычно применяется к образцам с молекулами шаблона, которые неоднородны по последовательности, длины и базового содержания. Эти различные матричных молекул усиливаются с различными скоростями 6, что требует использования ссылки ("стандартный") образца с соответствующими характеристиками. Часто существует такой стандарт не доступен, или характеристик входящих выборок неизвестны. Неоднородность исходного материала и длины зависит от имущества WGA химических 26 также усложняет интерпретацию результатов путем создания двусмысленности в то, что количественно - входной массу, введите число молекул, сочетание двух, или ни одного. Fаконец, последовательность-неспецифичность оказывает усиление количественного несколько смещение (МДА) более чувствительны к загрязнению, чем количественной ПЦР, так как загрязняющие молекулы любой последовательности есть потенциал, чтобы вмешиваться. Микрофлюидных цифровые анализы обратиться загрязнения путем разделения молекул шаблона и снижения объемов реакции, такие, что меньше загрязняющие вещества пробы.

Здесь мы используем популярный метод изотермического WGA, MDA 27. Следует отметить, что несколько других химические WGA в том числе и PicoPlex MALBAC 28 в решающей степени зависеть от начальных этапов изотермический замещения цепи. Изотермические шаги усугубить проблему применения аналоговых реальном времени для количественного анализов РГА. WGA не может быть ни полностью предотвратить во время установки, что приводит к нежелательному переменной предварительной амплификации, ни дискретизированы ("циклическое") в пути, где репликации разнородных молекул может привести к их завершению и остановился до следующего цикла, как ПЦР 11 (рис 1). Цифровой формат анализа для WGA вмещает типичные процедуры настройки реакции из-за сегрегации каждой молекулы для перечисления на конечной анализа (так предварительной амплификации не влияет на результаты) оригинал считывания означает точность будет в значительной степени зависит от изменения эффективности амплификации.

Анализ зависит от капель, произведенных в масле с единых объемов, а уровень сигнала на капли на конечной анализа будет зависеть от объема капли, и мы не хотим, чтобы консистенция результатов зависит от усреднения по распределению размеров капель. Создание монодисперсных капель теперь стандартная процедура (около 3500 Монодисперсные капель документы были опубликованы с 2013 года), но требует микрожидкостных приборы 25. На самом деле, больше, чем шесть компаний разработали независимые коммерческие продукты, которые полагаются на производство таких капель, и капли решений микрофлюидных чипыв продаже 23,29. Для этого исследования мы использовали пользовательские устройства, произведенные микрожидкостных в доме (см Protocol). Шприцевые насосы для привода потока через устройства также коммерчески доступны, но в качестве альтернативы, может быть замещен одной одноразового шприца вакуумного приводом потока снизить затраты 30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: Изготовление микрожидкостных устройств не является необходимым для этого анализа, а капли для данного протокола могут быть сформированы с существующими коммерческими производителей капельных 23,29.

1. Сделайте капли формирования микрофлюидных устройство

  1. Приготовить базовую форму для каналов с протоколом Мастер по изготовлению СУ-8 описано ранее 31, но с генератором капель рисунке маски 32.
  2. Изготовление устройств в PDMS, используя методы мягкого литографии 32,33.

2. Подготовьте Reaction Mix для массовых дроплета Считывание


Примечание: Этот протокол может быть использован для количественного нуклеиновых кислот с использованием многих типов реакций амплификации. В качестве примера, реагенты, необходимые для MDA из нескольких концентраций ДНК Lambda приведены. Детали реагентов приведены в таблице конкретных реагентов. Распределение шаблона в капель зависит от sufficienт перемешивание образца.

  1. Получить или полимеразной Очищение Phi29 ДНК.
    1. Очищают Phi29, как описано ранее, 7 или покупку от поставщика. Phi29 используется для экспериментов, показанных очищали.
  2. Подготовьте 10 мл денатурации буфера, состоящего из 65 мМ КОН, 1,65 мМ ЭДТА, и 14 мм DTT.
  3. Подготовка 10 мл нейтрализации буфера, состоящего из 65 мМ HCl, 0,21 М Трис-Cl, рН 7,0, и 9 мМ Трис-Cl рН 8,0.
  4. Подготовьте два стандарта, один без управления шаблон (NTC), такие как нуклеазы без воды, и один высокую концентрацию шаблона (около 4 мкг / мкл ДНК лямбда). Денатурации 3,3 мкл каждого стандарта с 3,3 мкл буфера денатурации в КПЦР трубки. Инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин. Quench друг с 3,3 мкл буфера нейтрализации.
  5. Денатурации 3,3 мкл шаблона интереса с 3,3 мкл буфера денатурации в КПЦР трубки. Инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин. Quench 3,3 мклнейтрализации буфера.
  6. Подготовка 11 мкл мастер смеси на образец на льду. С 2х МДА мастер реакционную смесь состоит из 2х двухцепочечной ДНК (дц) связывание красителя, 2x КПЦР ссылка краситель, 50 мкМ рандомизированы олиго, 2 мг / мл БСА, 2x Phi29 ДНК-полимеразы реакции буфера, 4,8 мМ дНТФ, нуклеазы без воды и 40 мкг / мл ДНК-полимеразы Phi29. Добавить полимеразы ДНК Phi29 последний обеспечить полимеразы не столкнуться уровень рН значительно выше или ниже, чем 7.5.Mix также.
  7. Дополнительно: Для меньшего количества ложных срабатываний, не подвергайте мастер микс с УФ-света до формирования капель 34.
    1. Подготовка 10 мкл предварительной смеси на образец в 0,5 мл или 1,5 мл прозрачного трубки на льду. Премикс состоит из 55 мкм рандомизированы олиго, 2,2 мг / мл БСА, 1.1x Phi29 ДНК-полимеразы реакции буфера, 5,3 мм дНТФ и нуклеазы без воды.
    2. Поместите пробирку в воде на льду, как описано 34 и подвергать воздействию УФ света (254 нм) с Accuнакопившуюся доза 5,7 Дж / ​​см 2.
    3. Добавить дц-связывающий краситель 1x, опорный краситель 1x, и Phi29 40 мкг / мл в предварительной смеси. Хорошо перемешать.
  8. Комбинат 10 мкл денатурированного шаблона или стандарта и 10 мкл мастер смеси. Хорошо перемешать.

3. Формирование капли

Примечание: Капли могут быть очень чувствительны к статическому электричеству и напряжения сдвига. Удалить одежду, которые могут вызвать статическое электричество, и избавьтесь до формирования капель. Ручка трубы эмульсии из верхней части трубки, как можно дальше от эмульсии, как это возможно. Пипеток эмульсии очень медленно, желательно с широким наконечником пипетки отверстия. При нанесении его из пипетки, смотреть эмульсии на стороне наконечника, чтобы определить скорость пипетирования.

  1. Форма капли. Для экспериментов показано, Микрожидкостных устройство имеет входное отверстие масла и две водные входные отверстия с перехода потока фокусировки для генерации капель. Используйте два syriNGE насосы для управления скоростью потока 55 мкл масла с поверхностно-активным веществом и 20 мкл реакционной смеси через микрожидкостных чипа генерировать 20000 1 NL капли.
  2. Примечание: Можно производить капли со многими типами масел с поверхностно-активным веществом, но состав будет очень сильно влиять капель стабильность при высоких температурах и в течение долгого времени. Одним из возможных комбинация фторированное масло HFE 7500 с анионного поверхностно 19,35.
  3. Образуют капли при любом размере с любым способом 13,36, но изменчивость размера в популяции капель повлияет на суммарную флуоресценцию, и поэтому точность анализа. Для экспериментов, показанные, капельки монодисперсных объемом 1 нл.
  4. Собирают все капли и масла в ПЦР пробирок. Для каждого образца, 30 мкл аликвоту масла в свежих ПЦР пробирок с оптическими крышками, и передать 20 мкл капель в верхней части масла. Последовательные объемы обеспечения анализа как переменноговикарию, как это возможно.
  5. Закрыть труба крышки плотно, а свободные крышки позволит маслу испариться.

4. Усиление изотермический

  1. Использование Термоциклер ПЦР, КПЦР Термоциклер или плитой, инкубировать образцов при 30 ° С в течение 7 ч, и инактивировать в течение 1 мин при 75 ° С. Трубки капель может быть оставлен в холодильнике, покрытой фольгой в течение нескольких часов в этой точке.

5. Приобретение и анализ данных

  1. Сразу же после инактивации реакции, измерить уровни флуоресценции красителя для всех образцов с использованием амплификаторе КПЦР. Оптимальные настройки фильтра будет зависеть от возбуждения красителя и спектры излучения. Для этого примера, используйте нм 516 нм фильтра 492 набор для дц-связывающего красителя, и нм фильтр 585 нм 610 набор для опорного красителя. Другие флуоресцентные методы измерения могут быть использованы для количественной оценки флуоресценции.
  2. Для каждого образца, разделить интенсивности флуоресценции дц-связывающего красителяинтенсивность флуоресценции контрольной красителя. Вычтите фоновой флуоресценции, или нормализованное флуоресценцию контроля нет шаблона, от всех образцов.
  3. Создать линейный стандартную кривую, используя исправленные измерения флуоресценции от стандартов. НТК стандарт представляет флуоресценцию для образца с 0% люминесцентных капель ("все негативное"), и измерение флуоресценции высокая концентрация шаблон ожидаемый флуоресценции для образца с 100% люминесцентных капель ("все положительные"). Используя соответствующий стандартной кривой, предсказать промежуточных передаточных отношений положительных и отрицательных капель на основе их суммарную флуоресценцию.

6. на капли для доказательства правильности измерений Принцип

  1. Сделать люминесцентные (положительные) капли: Подготовка ПЦР реакционной смеси, состоящей из 0,1 нг Лямбда ДНК, 1x дц-связывания красителя, 1x ссылка на красителях, 1,5 единиц Taq-ДНК-полимеразы, 10 мМ Трис-HCl, 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl 2, 0,2 мМ дНТФ и 0,5 мкм праймеров. Термоцикла смеси 30 раз (95 ° С в течение 20 сек, 55 ° С в течение 20 сек, 72 ° С в течение 1 мин), а затем образованием капель, как описано выше.
  2. Сделать нефлуоресцентной (отрицательные) капельки: Подготовка реакционной смеси ПЦР, состоящей из 1x дц-связывающего красителя, 1x ссылкой на красителе, 1,5 единиц Taq ДНК-полимеразы, 10 мМ Трис-HCl, 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl 2, 0,2 мМ дНТФ, и 0,5 мкМ праймеров. Термоцикла смеси 30 раз (95 ° C в течение 20 сек, 55 ° C в течение 20 сек, 72 ° С в течение 1 мин), а затем образованием капель.
  3. Формирование предварительного смешанные отношения капель
    1. Распределить 20 мкл фторированной нефти в КПЦР труб, покрытие с оптическим крышкой для предотвращения испарения.
    2. Аккуратно пипетки 10 мкл хорошо смешанных капель в желаемых положительных: соотношениях негативных сверху маслом. В результатов, показанных, положительные: отрицательные показатели капель были 1 (все положительные), 0,8, 0,5, 0,2, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001, и 0 (всего NEGтельный).
  4. Измерьте уровень флуоресценции красителя для всех образцов с использованием амплификаторе КПЦР. Для этого протокола, используйте нм 516 нм фильтра 492 набор для дц-связывающего красителя, и нм фильтр 585 нм 610 набор для опорного красителя.
    1. Нормализовать дц связывания флуоресценции красителя, используя флуоресценцию ссылка краситель. Кроме того нормализовать по флуоресценции "всех положительных" образца.
  5. Создать линейный стандартную кривую, используя нормированные измерения флуоресценции от "всех положительных» и «отрицательных» всех образцов. Используя соответствующий стандартной кривой, предсказать промежуточных передаточных отношений положительных и отрицательных капель на основе их суммарную флуоресценцию.
  6. Повторите эксперимент для каждого коэффициента (п = 3) с независимым образованием капель и перемешивания в течение каждой повторности.

7. Доказательство-из-Принципе МДА Эксперимент

  1. Измерьте концентрацию Лямбда ДНК маточного раствора с спецификацииtrophotometer.
    1. Рассчитать концентрацию шаблона, необходимую для средних молекул 10 шаблонов на капли. Для этого протокола, предположим, объемы капель являются 1 п и 1 нг ДНК лямбда содержит приблизительно 1,9 х 10 7 копий. Таким образом, 10 шаблонов в капле будет 10 копий в NL, или 526 FG Лямбда ДНК на мкл. Шаблон будет разбавлен ~ 6х, когда капельки формируются, поэтому начальная концентрация высокая шаблон будет 3,2 пг / мкл.
  2. Серийно разбавить ДНК лямбда 3,2 пг / мкл с денатурации буфера и равный объем буфера для нейтрализации. Для коэффициент разбавления 0,1, объединить 10 мкл пробы с 45 мкл буфера денатурации и инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин. Добавить 45 LL нейтрализации буфера, чтобы утолить.
  3. Кроме того разбавить образец, как описано в шаге 7.2, чтобы сделать остальную часть образцов для эксперимента. Начальные концентрации шаблон в реакциях, показанные были 3,2 пг, 320 фг,160 FG, FG 32, 16 FG, FG 3.2, 1.6 и FG в мкл.
    Примечание: Конечные концентрации шаблон после того Mastermix были 526 FG, FG 52,6, 26,3 FG, FG 5.26, 2.63 FG, 526 AG, и 263 мкл AG за. 10, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 и ожидаемые Lambda копий в капле, соответственно.
  4. Создание и проанализировать капли от каждого образца, как описано в шагах 2.5-5.3.
  5. Приобретать флуоресценции изображения показаны (рис 2,3) с использованием цифровой камерой, установленной на эпи-флуоресцентного микроскопа с 10-кратным цель при комнатной температуре. Приобретать двенадцать поля зрения для каждого образца. Правильные флуоресцентные изображения с помощью фонового изображения, полученного с флуоресцентным слайд.
  6. Используйте камеру, содержащуюся на изображения 37, как эмульсия масла быстро испаряются.
  7. Анализ отдельных интенсивности капель используя ImageJ макрос (Справочная файла код).
    1. Выберите интенсивность флуоресценции порог, который лучше всего отделяет нефлуоресцентных капель в NTC изображения с люминесцентных капель в концентрации снимков высокого шаблонов. Для каждого неизвестного образца, рассчитать долю капель с интенсивностью флуоресценции выше порога.

8. ПЦР и MDA сыпучих реакции

  1. Подготовка ПЦР.
    1. Серийно разбавить шаблона ДНК с коэффициентом разбавления 0,1. Для каждого разведения, объединить 10 мкл шаблона с 45 мкл буфера денатурации и инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин. Объедините разбавления 45 мкл буфера для нейтрализации.
    2. Подготовка 20 мкл ПЦР Mastermix на образец. 1.1x ПЦР мастер реакционную смесь состоит из 60 единиц / мкл полимеразы Taq ДНК, 11 мМ Трис-HCl, 55 мм KCl, 1,65 мМ MgCl 2, 0,22 мМ дНТФ, 1.1x дц-связывающий краситель, краситель 1.1x опорного и 550 нм каждый праймер.
    3. Комбинат 2 мкл разбавленного шаблона и 20 мкл Mastermix.
      Примечание: Конечные концентрации шаблон в тОн ПЦР-реакции были показаны 50 пг, 5 мкг, 500 FG, FG 50, FG 5, 500 AG, и 0 г лямбда-ДНК на микролитр, и проводили в трех повторностях.
    4. Реакция ПЦР в термоцикла КПЦР машины со следующей программой. Запуск 40 циклов 95 ° С в течение 30 сек, 57 ° С в течение 20 сек, 72 ° С в течение 30 сек до 2 мин при 72 ° С в течение 2 мин и выдержка при температуре 4 ° С.
    5. Нормализовать дц связывания флуоресценции красителя с помощью красителя флуоресценции опорный перед дальнейшего анализа.
  2. Подготовка реакцию MDA.
    1. Развести образцы, как описано в шаге 8.1.1.
    2. Подготовка 11 мкл мастер смеси на образец на льду. С 2х МДА мастер реакционную смесь состоит из 2x дц-связывающего красителя, 2x опорного красителя, 50 мкМ рандомизированного олигонуклеотида, 2 мг / мл БСА, 2x phi29 ДНК-полимеразы Реакционный буфер, 4,8 мМ дНТФ, нуклеазы без воды, и 40 мкг / мл Phi29 ДНК-полимеразы.
    3. Добавить полимеразы ДНК Phi29 40 мкг / мл, чтобы обеспечить последнему полимеразы DOES не столкнуться уровень рН значительно выше или ниже, чем 7,5. Хорошо перемешать.
    4. Денатурации 3,3 мкл разбавленного шаблона с 3,3 мкл буфера денатурации в КПЦР трубки. Инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин. Добавить 3,3 мкл буфера для нейтрализации.
    5. Комбинат 10 мкл денатурированного шаблона и 10 мкл мастер смеси. Хорошо перемешать.
    6. Запуск реакции MDA в КПЦР машины со следующей программой.
    7. Держите при температуре 30 ° С в течение 4 ч, измерения флуоресценции каждый 7,5 мин.
    8. Деактивировать при 75 ° С в течение 1 мин.
    9. Нормализовать дц связывания флуоресценции красителя, используя флуоресценцию ссылка краситель. Кроме нормализации максимальной флуоресценции для каждого образца.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В то время как обычные основная / в реальном времени показания могут быть использованы как для количественной ПЦР и количественных анализов WGA (рис 1), цифровые количественные анализы обеспечивают преимущества (таблица 1). В способе, описанном, считываем цифровые анализов в формате микро-капель с простым объемной измерения конечной точки (рис 2). Хотя этот метод широко применим, мы ориентируемся на количественном WGA (MDA), потому что этот метод создает особые проблемы для обычных реальном времени анализов.

Чтобы проверить, может ли наша ПЦР в реальном времени инструмент обнаружения различные фракции флуоресцентных микрокапель, диспергированных в масле, мы измерили суммарную флуоресценцию синтетических смесей люминесцентных и нефлуоресцентных капель (рисунок 2). Основная флуоресценции и положительные счетчики капель (независимо оценивали с помощью флуоресцентной микроскопии) изменяется линейно с входной фракции люминесцентных капель, как ожидалось (3А). Эксперимент проводили трижды, с независимым образованием капель и смешивания для каждого набора.

Чтобы оценить теоретическую производительность количественного для "неизвестных" образцов, мы создали линейные кривые, используя стандартные полностью положительные и отрицательные полностью контрольные образцы. С такими капель-лот-специфичными кривыми стандартных, мы рассчитали долю синтетических положительных и отрицательных смесей капель на основе объемной флуоресценции каждого образца. Результаты показывают, хорошую производительность в капли отношение количественного через два бревна динамического диапазона (R 2 = 0,984; рис 3B). Концентрация ввода анализируемого легко вычисляется из фракции положительных или отрицательных капель 38.

Чтобы проверить наш метод в реальной количественной WGA анализа, мы измерили уровни флуоресценции и доля положительных капель цифровой капель MDA анализа с лямбда-ДНК через Wi де диапазон концентраций (Рисунок 4). На фиг.4В, представительные флуоресцентные изображения капель показаны. И основная флуоресценции и положительный капель фракцию из цифровых выборок MDA масштабировать как ожидалось со средним шаблона на капли, указывая, что основная считывания может точно захватить результат цифровой анализа (R 2 = 0,927). Мы повторили эксперимент для каждой концентрации, независимо формирования капель и проведение WGA для каждой повторности.

Таблица 1
Таблица 1. Резюме в режиме реального времени и цифровых анализов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

able2.jpg "/>
Таблица 2. Резюме существующих методов количественного нуклеиновых кислот. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

фигура 1
Рисунок 1. реальном времени количественной ПЦР и МДА лямбда ДНК. MDA не дискретизированы через температурного цикла, как ПЦР, и склонен к предусилением если не тщательно подготовлены на льду. Здесь количественной ПЦР и МДА проводили с увеличением концентрации лямбда ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2
Figurе 2. Схематическое аналогового считывания капель и представительств изображений. (А) Положительные и отрицательные капли были получены от люминесцентных ламп и нефлуоресцентных реагентов в микрожидком устройства. Капли предварительно смешивают в различных положительных: отрицательный соотношениях. Объемные уровни флуоресценции были измерены с помощью стандартного реального времени амплификаторе и доля положительных капель определяли с помощью флуоресцентной микроскопии. (B), представитель люминесцентные обложил изображения увеличения соотношения положительных капель (масштаб бар = 200 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Массовая флуоресценции и люминесцентные доля комбинаций отдельно приготовленной положительной и отрицательной dropleTS. (А) Флуоресцентный (положительный) и нефлуоресцирующего (отрицательный) капельки предварительно смешивают в различных соотношениях. Сравнение входного фракции положительных капель с измеренной флуоресценции и объемной измеряется положительным капель фракция (N = 3, стержни означают +/- SD). Пунктирная линия представляет собой ожидаемое флуоресцентный доля, учитывая линейная зависимость. (Б) Сравнение прогнозируемых отношений на основе стандартов к ожидаемой флуоресцентного входного фракции. Линия указывает ожидаемое значение данного линейная зависимость. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Массовая флуоресценции и люминесцентные доля капельной цифровой MDA анализа. Digital MDA была выполнена с растет в ценеКонцентрации asing шаблона лямбда ДНК (п = 3, ошибка бары представляют SD) и измеряли, как описано на рисунке 2А. Линия указывает ожидаемое флуоресцентный фракции, используя распределение Пуассона для моделирования данные с нашего эксперимента. б) представитель люминесцентные обложил изображения капель после реакции инактивации (масштаб бар = 200 мкм) для повышения ожидаемых молекулы Лямбда ДНК в капле (NTC, 0,005, 0,05, 0,5 и 10). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры ,

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Цифровые анализы являются мощными методы, позволяющие обнаружение редких клеток и подсчета индивидуума молекул нуклеиновой кислоты. Тем не менее, цифровые анализы еще не применяется обычно в аналитических лабораториях, отчасти из-за стоимости специализированного оборудования, связанного с имеющимися методами. Здесь мы опишем конечной цифровой анализ для количественного нуклеиновых кислот с упрощенной аналогового считывания, используя стандартный в режиме реального времени количественной ПЦР машины. Этот метод является быстрым в настройке, и считывание намного проще, чем капли методов подсчета.

Наша анализ лишается одного молекула (один-капли) чувствительность отдельных измерений капель для простоты массово конечная точка измерения с использованием стандартных измерительных приборов. В нашем эксперименте цифровой MDA, мы не могли отличить менее 1 положительного капли на 200 отрицательных капель от фона, несмотря на подтверждение флуоресцентной микроскопии, что фактическая FRAие положительных капелек, как ожидается, (рис 4). Чувствительность и фон в объемном предела измерения флуоресценции чувствительность анализа объемной измерений для низких положительных фракций капель. Если высокая чувствительность требуется, цифровой индикации рекомендуется. Различия в уровнях нефть или объемов сыпучих капель может существенно повлиять данные флуоресценции образца. Даже нормализации с эталонной красителя не могут компенсировать различия объемы нефти делают в флуоресценции читает. Вполне возможно, что оптимизации объем пробы, параметры измерения инструмента, геометрии микролуночные или светофильтры могут повысить производительность анализа.

Чувствительность и динамический диапазон объемных цифровых анализах также может быть улучшена за счет оптимизации размера раздела. Крупные капли дают большее количество флуоресцентных изделий из каждой молекулы шаблона, который может помочь преодолеть инструментальное оформление и улучшить чувствительность для низких концентрациях ввода. НаС другой стороны, меньшие капельки позволяет изолировать более молекул в единице объема анализа. Если концентрация шаблон неодинакова образцов, как малые и большие реакции капель может осуществляться параллельно, чтобы расширить динамический диапазон 39 анализа.

Последовательные объемы капель также необходимы для точного измерения. Многие пользовательские микрофлюидных решения существуют для быстрого формирования монодисперсных капель из образца, как в серии 19,40 и 41,42 параллельно. В то время как некоторые позволяют генерацию капель из нескольких отдельных образцов параллельно, простые модификации существующих конструкций позволит одновременной генерации капель любого количества образцов. Например, система Bio-Rad ddPCR 23 применяется равномерное давление на входы серии независимых производителей капель, позволяя одновременное образование капель из нескольких образцов.

Наша методология основная считывания доступ ключПреимущества секционированных цифровых анализов без необходимости специализированного инструментария считывания и хорошо подходит для количественного РГА. Здесь мы сосредоточились на количественной WGA, что весьма чувствительны к фоновым загрязняющих веществ из-за отсутствия специфичности 7 последовательности. Кроме того, неизвестно, и, возможно, широкое молекулярно-массовое распределение продуктов в режиме реального времени количественных анализов WGA сделать интерпретация трудно в приложениях, где количество оригинальных шаблонов представляет интерес. Цифровые адреса форматирования анализ обе эти проблемы. Загрязняющие вещества содержатся в отдельных разделах реакции, предотвращая доминирование с низким молекулярным весом анализируемых высокой молекулярной массой загрязняющих веществ, как будет происходить в обычном режиме реального времени анализа. На рисунках 2В и 4В, возможных загрязнений, рассматривается как яркие пятна в пределах капель, отделены и не усиливать или внести существенный вклад в общую флуоресценции. Кроме того,Сигнал, генерируемый в цифровых анализов пропорциональна количеству шаблонов, а не размер шаблонов или их скорости амплификации. Хотя наш метод опирается на стандарты для калибровки объемной цифровой измерение, требование, чтобы соответствовать образец и стандартные характеристики могут быть значительно смягчены.

Количественный WGA обычно используется для количественной оценки загрязнений в WGA реакций 7,34, и является наиболее чувствительным методом, известным количественного определения присутствия ДНК неизвестной последовательности, давая метод большие надежды в прикладных областях, как разнообразны, как фармацевтическая контроль качества, судебно-медицинской экспертизы, и астробиологии. Массовая цифровой индикации могут воспользоваться другие протоколы цифровой анализа, таких как цифровое ПЦР, ускоряя, распараллеливания и упрощения анализа считывания.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Evagreen Dye Biotium 31000
Bovine serum albumin New England Biotechnologies B9000S
Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer New England Biotechnologies B0269S Vortex periodically until aggregate dissolves
Lambda DNA New England Biotechnologies N3011S Heated to 50 oC and quenched on ice prior to dilution
Randomized MDA oligos Integrated DNA Technologies 5'-NNNNN*N-3'
PCR primers Integrated DNA Technologies 5’-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3’ and 5’-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3’
UltraPure Nuclease-free water Life Technologies 10977-015 UV-treated for 30 min in Stratalinker 2400 before use (optional)
ROX reference dye Life Technologies 12223-012
PCR optical strip caps Life Technologies 4323032
PCR tubes Agilent Technologies 401428
dNTP (25 micromolar each) Agilent Technologies 200415
Thermocycler - Mx3000P qPCR system Agilent Technologies 401403
Barrier pipette tips VWR 89003-046
Bio-rad oil for evagreen Bio-rad 186-4005
JumpStart Taq ReadyMix Sigma-Aldrich P2893-100RXN

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sykes, P. J., Neoh, S. H., Brisco, M. J., Hughes, E., Condon, J., Morley, A. A. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).
  2. Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. Nanoliter scale PCR with TaqMan detection. Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).
  3. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 96 (16), 9236-9241 (1999).
  4. Day, E., Dear, P. H., McCaughan, F. Digital PCR strategies in the development and analysis of molecular biomarkers for personalized medicine. Methods. 59 (1), 101-107 (2013).
  5. Tatusova, T., Ciufo, S., Fedorov, B., O'Neill, K., Tolstoy, I. RefSeq microbial genomes database: new representation and annotation strategy. Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D553-D559 (2014).
  6. Blainey, P. C. The future is now: single-cell genomics of bacteria and archaea. FEMS Microbiol. Rev. 37 (3), 407-427 (2013).
  7. Blainey, P. C., Quake, S. R. Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination. Nucleic Acids Res. 39 (4), e19 (2011).
  8. Blainey, P. C., Quake, S. R. Dissecting genomic diversity, one cell at a time. Nat. Methods. 11 (1), 19-21 (2014).
  9. Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology. ISME J. 2 (3), 233-241 (2008).
  10. Method of the Year 2013. Nature Methods. 11 (1), 1 (2014).
  11. Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria. Science. 314 (5804), 1464-1467 (2006).
  12. OpenArray Technology Overview. , Life Technologies. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-openarray/open-array-technology.html (2014).
  13. Shen, F., Du, W., Kreutz, J. E., Fok, A., Ismagilov, R. F. Digital PCR on a SlipChip. Lab Chip. 10 (20), 2666-2672 (2010).
  14. Heyries, K. A., et al. Megapixel digital PCR. Nat. Methods. 8 (8), 649-651 (2011).
  15. Dressman, D., Yan, H., Traverso, G., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (15), 8817-8822 (2003).
  16. Kiss, M. M., et al. High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets. Anal. Chem. 80 (23), 8975-8981 (2008).
  17. Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nat. Methods. 9 (6), 3 (2012).
  18. Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Parallel picoliter rt-PCR assays using microfluidics. Anal. Chem. 78 (3), 956-958 (2006).
  19. Lee, M., et al. Synchronized reinjection and coalescence of droplets in microfluidics. Lab Chip. 14 (3), 509-513 (2014).
  20. Rhee, M., et al. Pressure stabilizer for reproducible picoinjection in droplet microfluidic systems. Lab Chip. 14 (23), 4533-4539 (2014).
  21. Hatch, A. C., et al. 1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR. Lab Chip. 11 (22), 3838-3845 (2011).
  22. Illumina. , Technology. http://www.illumina.com/technology.html (2014).
  23. Droplet digital PCR applications guide. , Bio-Rad. Available from: http://www.bio-rad.com/en-us/category/digital-pcr (2014).
  24. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  25. Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).
  26. Lage, J. M., et al. Whole genome analysis of genetic alterations in small DNA samples using hyperbranched strand displacement amplification and array-CGH. Genome Res. 13 (2), 294-307 (2003).
  27. Dean, F. B., et al. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (8), 5261-5266 (2002).
  28. Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell. Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).
  29. Mitos Dropix Systems. , Dolomite. http://www.dolomite-microfluidics.com/webshop/mitos_dropix_system (2014).
  30. Abate, A. R., Weitz, D. A. Syringe-vacuum microfluidics: A portable technique to create monodisperse emulsions. Biomicrofluidics. 5, 14107 (2011).
  31. Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells. J Vis Exp. (80), e50618 (2013).
  32. Fainman, Y. Optofluidics : fundamentals, devices, and applications. , McGraw-Hill. (2010).
  33. Xia, Y. W. G.M. Softlithographie. Angew Chem. 110 (5), 26 (1998).
  34. Woyke, T., et al. Decontamination of MDA reagents for single cell whole genome amplification. PLoS One. 6 (10), e26161 (2011).
  35. System for hot-start amplification via a multiple emulsion. US patent. Hindson, B. J. , (2014).
  36. Utada, A. S., et al. Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device. Science. 308 (5721), 537-541 (2005).
  37. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR. PLoS One. 8 (4), e62961 (2013).
  38. Dube, S., Qin, J., Ramakrishnan, R. Mathematical analysis of copy number variation in a DNA sample using digital PCR on a nanofluidic device. PLoS One. 3 (8), e2876 (2008).
  39. Shen, F., et al. Multiplexed quantification of nucleic acids with large dynamic range using multivolume digital RT-PCR on a rotational SlipChip tested with HIV and hepatitis C viral load. J Am. Chem. Soc. 133 (44), 17705-17712 (2011).
  40. Link, D. R., Anna, S. L., Weitz, D. A., Stone, H. A. Geometrically mediated breakup of drops in microfluidic devices. Phys. Rev. Lett. 92 (5), 054503 (2004).
  41. Nisisako, T., Torii, T. Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles. Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).
  42. Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device. Lab Chip. 12 (4), 802-807 (2012).

Tags

Молекулярная биология выпуск 103 полного генома усиления цифровой анализ мда ПЦР одного молекула одна ячейка нуклеиновые кислоты микро-капли микрофлюидики эмульсии
Простой Массовая считывания цифровых нуклеиновых кислот количественного определения Анализы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morinishi, L. S., Blainey, P. Simple … More

Morinishi, L. S., Blainey, P. Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays. J. Vis. Exp. (103), e52925, doi:10.3791/52925 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter