Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Microbead زرع الأجنة الزرد

Published: July 30, 2015 doi: 10.3791/52943
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

Abstract

برزت الزرد كنظام نموذج الجيني قيمة لدراسة البيولوجيا التطورية والأمراض. الزرد تبادل درجة عالية من الحفظ الجيني، فضلا عن التشابه في العمليات الخلوية والجزيئية والفيزيولوجية، والفقاريات الأخرى بما في ذلك البشر. أثناء تطور الجنين في وقت مبكر والأجنة الزرد شفافة بصريا، مما يسمح للباحثين لتصور ديناميات توالد باستخدام stereomicroscope بسيط. زرع Microbead هو الطريقة التي تمكن التلاعب الأنسجة من خلال تغيير العوامل في البيئات المحلية. هذا يسمح للباحثين لفحص آثار أي عدد من الجزيئات يشير المصالح، مثل الببتيدات يفرز عند نقاط المكانية والزمانية محددة داخل الجنين النامي. هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول لكيفية التعامل مع وحبات الزرع خلال تطوير الزرد في وقت مبكر.

Introduction

الباحثين البيولوجيا التطورية تستخدم مجموعة واسعة من وسائل الخلوية والجزيئية والجينية للكشف عن الآليات التي تتحكم في كيفية تشكيل كائن حي. من بين هذه المناهج، والتلاعب الأنسجة هو أداة رئيسية في فك رموز أسئلة معقدة حول مصير الخلية، والحركة الخلوية، وتنظيم الأنسجة. طريقة واحدة لتغيير البيئات الأنسجة المحلية من خلال تطبيق الجراحي للبلي التي تستخدم لتوصيل مصدر البؤري من البروتينات أو غيرها من الجزيئات يشير الى 1. وقد نفذت على نطاق واسع هذا النوع من التلاعب التجريبية في الكلاسيكية نماذج علم الأجنة الفقارية، مثل الضفادع وفرخ 2.

أصبح الزرد كائن نموذجا الفقاريات المهم لدراسة توالد ويوفر أيضا العديد من المزايا الفريدة لنمذجة مرض 3-5 كما أنهما يشتركان الحفظ وراثية عالية مع البشر 6. ولا سيما الشفافية البصرية والسابقينتطوير ternal الجنين الزرد تقدم وجهة نظر لا مثيل لها لمراقبة الأنسجة تطور الجنين 3-5. وقد ولدت تنفيذ شاشات الوراثية إلى الأمام على نطاق واسع مستودع قوية من سلالات متحولة الزرد لمزيد من الدراسة 7،8، وتحديد أساليب الفحص البديلة التي يمكن أن تتم بكفاءة على نطاق أضيق في المختبرات واحدة 9،10. مزيد من العمل التجريبي مع الزرد وقد سهلت من خلال التقدم في منهجيات المعدلة وراثيا وعكس النهج الوراثية 11،12، وكذلك الوراثة الكيميائية 13-15.

تقنيات التلاعب الأنسجة، مثل تنفيذ بلي، لم تكن كما تستخدم على نطاق واسع في الزرد، ولكن مع ذلك توفر أداة مفيدة لزيادة فهم الإشارات الخلوية خلال التنمية. وقد استخدم Microbead زرع للتحقيق في عمليات تشكيل جهاز في شبكية العين الزرد16،17، 18 القلب والدماغ 19-22، العصبية قمة 23، وزعنفة 24،25. في هذه الدراسات وغيرها، وقد تم تطبيق الخرز أثناء التطور في فهم انتشار الجزيئات مما يشير 26، وكيف تؤثر التدرجات الهجرة الخلية 27 و 28 محوري الزخرفة. وفي الآونة الأخيرة، وقد استخدمت بلي لتقييم آليات التجديد في الزرد البالغين 29. في الدراسات التنموية، على سبيل المثال، وفرت العمل microbead الزرد نظرة ثاقبة آليات تشكيل أطرافهم من خلال دراسات من الزعنفة الصدرية 25. برعم الزعنفة الصدرية الزرد هو مثلي إلى برعم forelimb في الماوس 30 و 31 فرخ. برعم الفقاريات أطرافهم واثنين من العقد إشارة أساسية: منطقة النشاط الاستقطاب (ZPA) التي تنص على محور الأمامي-لاحق من خلال التعبير عن القنفذ الصوتي (Shh على) والأهداف هوكس الجين المصب،ومرتفعات الأدمة القمي (AER) الحالي في طرف برعم الطرف، الذي يعمل على إنشاء الأقرب إلى هوية البعيدة من الأطراف من خلال التعبير عن عوامل النمو الأرومية الليفية (FGFs). وبزرع بلي صندوق الأجيال القادمة غارقة في المسوخ الوراثية SHH الزرد والمحققين حددت جمعية جيل المستقبل أمر ضروري لتقدم دورة الخلية ونمو الأطراف الفقارية 25. بالإضافة الى جمعية جيل المستقبل وShh على إشارات أجهزة الطرد المركزي التي تحدد هوية الموضعية، ودراسات رائدة باستخدام برعم فرخ الطرف حددت حمض الريتينويك (RA) كناقل التي يمكن أن تحاكي العمل في المنطقة الاستقطاب لإنشاء الأمامية إلى الخلفية هوية 32. هذه التجارب المعنية وضع شرائح صغيرة من RA غارقة ورقة هتما في أطرافهم فرخ لتقييم أرقام الزخرفة 32. وعلاوة على ذلك، فقد أجرى الباحثون دراسات أخرى أنيقة توظيف استخدام بلي، زرع الخلايا، والخارجيةالعلاجات RA في الزرد لتحديد أن RA يعمل على توفير بعيدة المدى العظة الموضعية داخل الدماغ المؤخر الزرد والأديم المتوسط ​​28. ومع ذلك، في الوقت الحاضر العديد من الأسئلة تبقى حول أدوار يشير العوامل مثل جمعية جيل المستقبل وRA خلال العديد من جوانب التنمية الفقاريات. آثار يشير من RA، بوصفها محدثة التخلق تأثير والعديد من الأجهزة 33، مثل القلب النامية البالغ عددها 34 والأسلاف الكلى، حيث يحدد RA خلايا الكلى القريبة نوع مصائر 35-39. مزيد من الفهم لهذه الموضوعات يمكن أن تستفيد كثيرا من الدراسات التجريبية باستخدام تقنيات التلاعب الأنسجة وmicrobead الزرع.

في حين تم إجراء عدد أقل من الدراسات مع microbead زرع في الزرد، بالمقارنة مع نماذج مثل الفرخ، وتلك التي نفذت كانت مفيدة للغاية. أحد أسباب ندرة microbead زرع المستندة إلى الأبحاث في الجنين الزرد هو likelذ فكرة أن هناك تحديات فنية صعبة، استنادا إلى حجم الجنين، والتي تشكل عائقا أمام أداء مثل هذه التلاعبات بنجاح. ومع ذلك، زرع microbead في الأجنة الزرد التي يمكن استخلاصها مع الممارسة والمساعدة من خلال الملاحظة البصرية لهذه التقنية، وبالتالي يمكن متابعتها باعتبارها وسيلة لاستجواب آليات التنمية. هنا، علينا أن نظهر أن التطبيق الدقيق لmicrobead في الجنين الزرد، والتي يمكن استخدامها لإجراء مجموعة واسعة من فحوصات على تكوين الأنسجة والتشكل الخلوي.

Protocol

تمت الموافقة على إجراءات للعمل مع الأجنة الزرد الموصوفة في هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة نوتردام.

إعداد الحل 1. رينغر

  1. جعل حل من 116 ملي كلوريد الصوديوم، و 2.9 ملي بوكل، 3.6 ملي CaCl 2، و 5 ملي HEPES مع عالى النقاء H 2 O من خلال التحريك المستمر لتفادي أي ترسيب الملح.
  2. بعد إضافة الأملاح وبينما الحل لا يزال يتحرك، إضافة 100 وحدة / مل البنسلين في و 100 ميكروغرام لكل مل الستربتومايسين.
  3. بعد إضافة جميع المضادات الحيوية والأملاح، نفذ التعقيم مرشح من الحل وتخزينها في حاوية معقمة.
    ملاحظة: N-الفنيل (1-فينيل-2-ثيوريا) أو PTU يمكن أن تضاف إلى الحل رينغر لمنع تشكيل الصباغ في حبة الأجنة مزروع من دون عواقب سلبية على صحة الجنين. لإعداد / تصبغ عرقلة الحل رينغر، واستخدام تركيزاتtration من 0.003٪ PTU. نظرا لتركيز منخفض من PTU التي يمكن ان تضاف ينصح بأن حجم أكبر من الحل رينغر يتم، على الأقل 1 L، لتجنب إضافة كميات ضئيلة من مسحوق PTU. إضافة PTU خلال الخطوة 1.2، في حين أن الحل هو التحريك.

2. تريكين إعداد الحل

  1. إضافة 2 غرام من إيثيل 3-أمينوبنزوات الملح methanesulfonate (تريكين) لكل لتر من محلول زائد 0.1 M تريس، من 1 M الأسهم متوازن لدرجة الحموضة من 9.5 و المصنوع من عالى النقاء H 2 O.
    ملاحظة: سيتم استخدام تريكين إلى الموت ببطء الأجنة الزرد في نقطة الوقت المطلوب لفحص حبة الظواهر الزرع.

3. E3 إعداد الحل

  1. جعل حل من 0،25 M كلوريد الصوديوم، و 10 ملي بوكل، 12.5 ملي CaCl 2، و 16.6 ملي MgSO 4-1 لتر من الماء عالى النقاء لخلق 1 لتر من E3.
  2. إضافة 200 ميكرولتر من الميثيلين الأزرق إلى حل E3 لمنع نمو الفطريات.

4. إبر سحب لنقل Microbead

  1. استخدام النار مصقول البورسليكات الزجاج مع خيوط في لOD: 1.0 مم، ID: 0.5 ملم، بطول 10 سم.
  2. وضع الزجاج borosilicated إلى مجتذب micropipette لإعداد إبر رفيعة.
    ملاحظة: الأبعاد الأربعة التالية يمكن استخدامها كنقطة انطلاق لسحب الإبر: الحرارة = 540، سحب = 245، السرعة = 200، والوقت = 125.
  3. بعد سحب عدد كاف من الإبر، وتخزينها في البلاستيك مغطى أطباق بتري المتمركزة على شرائط من الصلصال أو شريط لاصق لمنع كسر رأس الإبرة، حتى الاستخدام.
  4. لخفض رأس إبرة لحجم تجويف المطلوب، استخدام زوج من ملقط غرامة ليسجل نهاية الإبرة.
    ملاحظة: سوف إبرة حجم تتحمل تختلف تبعا لحجم microbead يجري استخدامها وكذلك تفضيلات التعامل مع المستخدم. وهناك نقطة انطلاق جيدة لأحجام الحرفية تحمل في نطاق بين 100 و 200 ميكرون إذا كان سيتم استخدام بلي تتراوح 50-100 ميكرون.
  5. PRIOص الاستخدام، وادخال الإبرة قلصت إلى حامل الأنابيب الشعرية إلى صياغة وثيقة نقل microbead الانتهاء.

5. الشارب / لاش إعداد أداة

  1. الحصول على الخط الطولي، السوط، أو غيرها من قطعة صغيرة بعد شركة من الطبيعي أو الاصطناعي خيوط الشعر. قطع بالقرب من قاعدة للخيوط في زاوية 45 درجة. تلتزم الخط الطولي لmicropipette غيض-P 1000 باستخدام دائم لاصق الغراء واضح.

6. Microbead زرع صينية التحضير

  1. خلط 2 غرام من الاغاروز مع 100 مل من محلول E3 لجعل 2٪ E3 agarose هلام.
  2. تسخين الحل الاغاروز 2٪ لمدة 1 دقيقة و 30 ثانية في 250 مل دورق مخروطي، يحوم القارورة كل 30 ثانية من أجل تجنب جل من السطح من جديد.
  3. تتخذ غطاء لمدة 60 مم × 15 مم طبق بتري وضعه في أكبر 150 مم × 15 مم الطبق مع الداخلية التي تواجه التصاعدي.
  4. صب جل الاغاروز الساخن إلى 150 مم × 15 مم طبق بتري، والتأكد من أن يرسو أسفلغطاء للطبق أصغر مع السبابة.
    ملاحظة: السماح طبقة رقيقة من الاغاروز تحت غطاء من طبق أصغر لإزالة التكثيف التي ستشكل عند صب جل. وهذا سيجعل حبات السهل أن نرى تحت المجهر تشريح.
  5. كما يبرد الاغاروز، ولكن قبل أن يتصلب، ضع القالب بشكل جيد على هلام. وهذا سوف يسمح لوضع أسهل من الأجنة.
  6. ملاحظة: من أجل تجنب فقاعات في الآبار، ضع القالب ببطء في زاوية حتى يعوم على الجزء العلوي من هلام.
  7. باستخدام microspatula، وإزالة بعناية القالب جيدا مرة واحدة وقد عزز الجل. إضافة E3 الحل وتخزينها في 4 ° C.

7. الأجنة مجموعة

  1. إعداد غرف التزاوج، مفصولة فواصل، عن طريق ملء لهم حتى مع الماء النظام، ومن ثم وضع الذكور البالغين الزرد (ق) والإناث (ق) أزواج في غرف O / N.
  2. جمع البيض المخصب باستخدام غرامة سلكية مصفاة (المراحل الجنينية سوف تختلف قليلا).
  3. إيداع البويضة الملقحة في، 10 سم طبق بتري قطر نظيفة من خلال تحويل مصفاة رأسا على عقب والشطف مع تيار غرامة E3 حتى لا توجد البيض تترك في مصفاة، وهناك ما يقرب من 25 مل من محلول E3 في الطبق.
  4. بعد جمع وتقسيم البيض في عدة أطباق (حوالي 50-60 بيضة في طبق) لتجنب الاكتظاظ، والتي قد تؤدي إلى اتواقت التنموي داخل مخلب وجعل جمع المرجوة الأوقات نقاط صعبة.
  5. احتضان الأجنة في حل E3 في 28.5 ° C لتمكين التقييم التنموي وفقا لمعيار الزرد سلسلة انطلاق 40.
    ملاحظة: يجب أن يتم نقل الأجنة إلى E3 / PTU في 24 التسميد آخر ساعة (HPF) لمنع تطور الصباغ إذا التلاعب في مراحل قديمة تتطلب الوضوح البصري.

8. حبة زرع

  1. احتضان بلي في المطلوب تركيز جزيء اختبار أو ليالي السيارة المقابلةolution للمرة المطلوبة في حجم مناسب.
    ملاحظة: الباحثة يمكن استخدام أطباق بتري معقمة تتراوح بين 3-6 سم في القطر، أو لوحات متعددة أيضا، وكلاهما تمكين التصور من بلي في الحل. قد تختلف الوقت اعتمادا على نوع وكمية من جزيء من الفائدة، والباحث يجب الرجوع إلى الشركة المصنعة أو توصيات تنشر لمدة الحضانة وغيرها من الجوانب مثل الحساسية للضوء والحرارة.
  2. مرة واحدة وقد وصلت الأجنة في نقطة زمنية التنموية المرجوة، وإزالة الأجنة من chorions الخاصة بهم باستخدام ملقط غرامة.
  3. احتضان الأجنة في حل قارع الأجراس التي تمت تصفيتها مع المضادات الحيوية لمدة 10 دقيقة حتى يتأقلم منهم إلى الحل.
  4. في حين أن الأجنة والتأقلم، ونقل بلي في لوحة microbead التي تقع داخل علبة زرع وشطف لهم في حل قارع الأجراس لمدة 10 دقيقة.
    ملاحظة: زرع حبات بعد 50 دقيقة بعد الوصول إلى هذه النقطة. هذا ثسوء تقليل احتمال أن أحدا لن زرع حبة مع تركيز أقل من جزيء من الفائدة.
  5. مجموعة من الأجنة في آبار من الدرج microbead الزرع، مع الحرص على توجيههم حتى مجال الاهتمام حيث سيتم زرع microbead يمكن الوصول إليه.
  6. إجراء شق صغير على الجنين باستخدام إبرة التنغستن.
  7. نقل microbead على الجنين باستخدام ماصة نقل microcapillary: الاكتئاب لمبة من ماصة، وسحب بلطف microbead في العمود الشعري، ومن ثم الافراج عن الضغط لنقل microbead في الوجهة المطلوبة.
  8. استخدام أداة الطولي / السوط لوضع microbead داخل الجنين. ملاحظة: تأكد من وضع microbead في الأنسجة بعيدا من موقع شق ذلك لن يتم طرد microbead من الجنين لأنه يشفي.

Representative Results

عدة أنواع من أدوات التلاعب مفيدة للتعامل مع بلي خلال التطبيقات البحثية (الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك، قالب الاغاروز بسيط مع آبار صغيرة يمكن استخدامها لعقد الجنين الزرد، وهو أمر حيوي لتنفيذ هذه التجارب في الوقت المناسب وبطريقة فعالة (الشكل 1). وغرس microbead لا يمكن أن يؤديها في موقف المكانية والزمانية مرحلة من الفائدة، الذي يسمح للباحثين لتضييق نافذة معينة من العمل لجزيء من الفائدة.

هنا، تم زرع بلي واحدة في الأجنة الزرد في مرحلة ذيل برعم أو في نقاط زمنية لاحقة خلال مراحل somitogenesis (الشكل 3). اثنين بلي مختلفة الحجم، تشطف مع حل قارع الأجراس وحده، تم استخدامها في هذه التظاهرة بروتوكول (الشكل 3A، 3B و 3C). هذا الزرع microbead في غياب أي مترافقجزيئات صغيرة تبين أن حبة زرع لا يمكن أن يتحقق من دون آثار المورفولوجية الجسيمة خلال التنمية السليمة للجنين الزرد (الشكل 4).

والتجريبي قد تواجه صعوبات في المناورة microbead في حفرة ثقب التي أدلى بها إبرة التنغستن فوق الجنين. لتحقيق أفضل معالجة للmicrobead مرة واحدة وضعت على الجنين عن طريق إبرة صغيرة، يمكن استخدام الخط الطولي / أداة الرموش. وهذا يمكن أن تصاغ مع تسليط طبيعي القطط أو الكلاب شعيرات، على الرغم من غيرها من شعيرات الرموش الطبيعية أو الاصطناعية يمكن استخدامها (الشكل 1). ودفع لطيف من microbead مع أي الإبرة التنغستن أو أداة الطولي يجب أن نرى microbead تغرق في حل رينغر من العفن. مرة واحدة وقد غرقت microbead في القالب كان ينبغي نقلها لمسافات كبيرة إذا لزم الأمر باستخدام إبرة التنغستن ومرة ​​واحدة فوق الجنين الأداة إبرة أو الطولي يمكن استخدامها لpositioن microbead إلى الجنين. نجاح زرع microbead يمكن قياس على الفور من خلال التصور في stereomicroscope، وحبة ستبقى في وضع مستقر في الأنسجة. لتقييم الموقف حبة مع مرور الوقت، ولا يمكن تصوير كل عينة الجنين من خلال العيش الوقت دورة التصوير الفوتوغرافي أو التحقق في فترات دورية (كما هو مبين في الشكل 4) لضمان أن موقع حبة لم تحول خلال مدة التجربة بسبب الأنسجة الذاتية التشكل. فهم موقف حبة مع مرور الوقت أمر بالغ الأهمية لتفسير أكثر استنارة من النتائج، مثل تقييم تأثير جزيء صغير على النسيج المستهدف أو العملية التنموية.

فإن استخدام هذه الخطوات المذكورة أعلاه توفر بيئة مثالية حيث لإطمر بلي في الجنين الزرد في الوقت المطلوب والموقف. في تجربتنا، مستخدمين المبتدئين من هذا البروتوكول microbead زرع اكتسبت عادة في شمال شرق المهارةcessary لأداء زرع الجراحية ثابت من بلي في الجنين الزرد بعد حوالي أسبوع واحد من الممارسة.

الشكل 1
الشكل 1. الأدوات المستخدمة لأداء microbead الزرع. (A) علبة زرع حبة (يسار، 15 سم القطر) مع قوالب الجنين (على اليسار) وعلبة microbead الحضانة (على اليمين، 6 سم القطر). هذا صينية تعمل تمكن الباحث لوضع الأجنة في الاتجاه المطلوب لmicrobead الزرع، وأن تكون لديهم بلي مستعدة لزرع على مقربة في محطة المجهر. وينبغي حضنت بلي في جزيء صغير (ق) و / أو السيارة ثم تشطف في لوحة microbead منفصلة (اليمين) قبل وضعها في علبة زرع حبة أن يتم وضع تحت المجهر محطة. (B) وسوف تستخدم اثنين من أزواج من ملقط غرامة لإزالة تشوريعلى المحيطة بكل الجنين الزرد وأيضا لكسر نهاية الإبرة microcapillary. سيتم توظيف (C) A التنغستن إبرة لجعل ثقب دقيق جدا في الجنين الزرد التي لوضع microbead. (D) وسيتم استخدام ماصة نقل microcapillary لالتقاط ووضع على microbead على رأس الجنين الزرد بالقرب من موقع للثقب. (E) والطولي / أداة السوط سيتيح تحديد المواقع لطيف من microbead في موقع شق داخل الجنين التي تم إجراؤها من قبل الإبرة التنغستن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. تخطيطي لإجراء microbead الزرع. (A) A غرس صينية microbead مع بلي soakiنانوغرام في محلول الغسيل المطلوبة تم إعدادها في إطار محطة stereomicroscope، والأجنة وضعه مع الأنسجة متجهة لأعلى. (B) عن طريق إبرة التنغستن، شق صغير في الجنين ويمكن إجراء مع حركة قوية بعد طفيفة. (C) باستخدام ماصة نقل microcapillary، يمكن التقاطها في microbead المرغوب فيه من الغرفة microbead حضانة في علبة، وتقع على الحق، وتقديمهم إلى المقصورة اليسرى حيث يقع في منطقة العمل الجنين. يجب أن تودع في microbead بالقرب من موقع الشق، ثم وضعه برفق في موقع شق أدلى بها الإبرة التنغستن باستخدام الطولي / أداة الرموش. بمجرد ناور على microbead في موقع شق، ينبغي مطوي في الأنسجة (بعيدا عن شق) لوضع مستقر وmicrobead ومنع حركة لاحقة من الجنين مع استمرار التنمية. Pتأجير انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
يمكن زرع الشكل 3. بلي إلى الأجنة في مراحل النمو المختلفة. تم زرعها (A) الأجنة الزرد مع microbead (قطرها حوالي 50 ميكرون) في الجذع في مرحلة ذيل مهدها. عندما بحثت في ال 24 ساعة آخر حبة زرع (hpbi)، والأجنة وضعت بشكل طبيعي وأظهرت microbead الحد الأدنى من الحركة أثناء مرور الوقت التنموي. (B) الأجنة الزرد مزروع مع بلي (التي يبلغ قطرها حوالي 50 ميكرون) في الكيس المحي في المرحلة 3 الجسيدة (ق ق) المعروضة التطور الطبيعي لحركة حبة صغيرة نسبيا مع مرور الوقت. (C) بلي أكبر (قطرها حوالي 70 ميكرون) زرعت في جنين 7 SS أظهرت بالمثل تطور لاحق العادية، وكذلك مصغرةالقانون النموذجي للتحكيم إن وجدت الحركة من موقع الزرع. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. تطوير الإجمالي للجنين الزرد هو رابط الجأش التي كتبها وجود microbead خلال 72 hpbi. تم زرع الأجنة الزرد مع بلي غارقة في حل رينغر (التي يبلغ قطرها حوالي 50 ميكرون) في المرحلة 7 الجسيدة (SS). تم إدراج كل microbead جراحيا في الجذع، وبين القطع البدنية النمطية 3 و 4. لم يترافق وجود حبة مع العيوب الظاهرة التنموية في 24 ساعة آخر حبة زرع (hpbi)، 48 hpbi، أو 72 hpbi. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

على مدى القرن الماضي، وفهم خطة الهيئة الزخرفة وتوالد شهدت تقدما هائلة. وكانت تقنيات التلاعب الأنسجة الحيوية في الكشف عن المعلومات الأساسية عن هذه العمليات الحيوية. التعديل الوراثي هو واحد من أكثر الطرق شيوعا للتحقق من وظيفة الجين، وطرق التحليل فسيفساء، مثل زرع الخلايا، وتوفر مناهج مفيدة لفهم استقلالية وظيفة الجين. يوفر زرع Microbead مكان آخر لاستجواب كيف جزيئات خاصة تغيير ديناميات النمو، كما تمكن هذه الطريقة الباحث إلى تغيير بيئة الأنسجة المحلية من خلال تقديم إشارات جزيئات أو مثبطات. وهناك مجموعة من بلي مختلفة متاحة تجاريا، والتي أحجام مختلفة وغيرها من الخصائص الفيزيائية وجود (على سبيل المثال، تهمة) بحيث أنها يمكن أن تستخدم للظروف تجريبية من الفائدة. وبالتالي، من خلال زرع بلي التي هي غارقة في البروتين أو كيماويةكال المصالح داخل كائن حي، يمكن للباحثين التحقيق في آثار محلية خلال تطوير وإيجاد صلة بين الجينات أو جزيء من الفائدة وبشكل خاص النمط الظاهري البيولوجي (ق).

دراسات مثل تلك التي تقوم بها وادا وزملاؤه تستخدم microbead زرع من أجل تقييم تأثير زيادة الإشارات القنفذ في الزخرفة الهيكل العظمي في neurocranium الأمامي (ANC) في الزرد 23. وقد أظهرت دراسات سابقة أن Shh على مطلوب لتكوين حزب المؤتمر الوطني الافريقي 14. حددت باستخدام بلي Shh على المغلفة الباحثون أن هذه الإشارة تشجع تكوين الغضاريف في حزب المؤتمر الوطني الافريقي. تم استخدام عملية زرع microbead على إثبات وجود صلة واضحة بين القنفذ الإشارات وتكوين الغضاريف في حزب المؤتمر الوطني الافريقي. لوحظ آخر مثال رئيسي لهذه التقنية التلاعب الأنسجة في الزرد في الدراسات حيث يدرس العلماء سيطرة النسخي من ورم أرومات الحمر السادسة والعشرون (ETS) و مجالجزيء المتعلقة ETS الجهات الفاعلة (إدارة مخاطر المؤسسات) وتورام محسن المنشط 3 (Pea3) من خلال جمعية جيل المستقبل الإشارات في وقت مبكر خلال نمو الدماغ الزرد 19. من خلال microbead تجارب زرع، أنهم كانوا قادرين على إظهار أن Fgf8 وFgf3 يمكن تنشيط ectopically التعبير عن إدارة مخاطر المؤسسات وpea3. وتوضح هذه الأمثلة فائدة بلي لتوفير نظرة ثاقبة الآليات التنموية التي تتعاون أثناء تكوين الأنسجة، والتي يمكن وصفها بشكل جيد من خلال استخدام أساليب لتقييم التعبير الجيني 41. وبالتالي، يمكن زرع microbead أن يكون وسيلة فعالة لاستكشاف الأنسجة الأخرى، مثل الأديم المتوسط ​​وسيط (IM) والذي يؤدي إلى الكلى. على وجه التحديد، فإنه يساعد في الدراسات التنموية الكلى، لمعرفة كيف جزيئات مختلفة تؤثر كليون تجزئة 42 و tubulogenesis 43،44، والعمليات التي يتم فهمها بشكل سطحي فقط في الوقت الحاضر. وعلاوة على ذلك، بدأت microbead زرع لاستخدامها في مسمارويمكن تكييف العمليات ذ تجديد في الزرد 29] وللاستخدام مع أي عدد من النماذج تجديد الجهاز، مثل التالية الاستئصال بالليزر من الأنسجة الجنينية مثل كليون 45 أو بالاشتراك مع الأساليب التي صيغت لإجراء الأبحاث مع الهياكل الكبار المقابلة 46-49. أخيرا، microbead زرع لديه القدرة على أن تستخدم في نماذج من الأمراض التي تصيب البشر، مثل السرطان 50،51 أو الأنسجة انحطاط 52،53.

في هذا البروتوكول، ونحن لشرح طريقة زرع microbead في الأجنة الزرد، والتي كما وصفت بالمثل من قبل باحثين آخرين، ولكن لا يظهر من خلال بروتوكولات فيديو 1. مع الحد الأدنى من الممارسة تمكنا من زرع بلي بمعدل تقريبي من 8-10 الأجنة / ساعة، والتي تتعلق جدوى هذا الإجراء مرة واحدة الباحث لديه بعض الخبرة. وتبين النتائج الموضحة في هذه الوثيقة تثبت أن حبات من مختلف ديمكن زرع imensions في مراحل مبكرة، وذلك مع الرعاية، ويمكن تطبيق هذا الأسلوب التلاعب الأنسجة مع أقل قدر من الاضطراب الجسدي إلى الجنين. واحد التحسن الذي ينبغي التأكيد هو استخدام أداة الطولي / السوط لوضع microbead إلى الجنين. هذه القطعة غير مكلفة نسبيا وبسيطة من المعدات عن نفس القطر كما microbead، من السهل الحصول على ويساعد على تسريع عملية الزرع. يمكن قطع الخط الطولي / السوط إلى الطول المطلوب لإنتاج الشركة بعد الدقيقة أداة التعامل مع حبة، وهذا يتوقف على مهارة الباحث والتفضيل. وأخيرا، في حين وصفنا هنا كيفية التعامل مع جسديا بلي والأجنة الزرد لأداء زرع، وهذا البروتوكول لا تحدد إجراءات التعامل مع محددة للمخدرات أو الببتيدات مختلفة. بشكل عام، يجب زرع بلي المعالجة كيميائيا في الحيوان مع النفعية، لتجنب الآثار غير المرغوب فيها في مناطق أخرى من الحي، وينبغي أن يكون الباحثون أيضا فيشكلت حول مخاوف تتعلق بالسلامة المحتملة المرتبطة أي من هذه المواد الكيميائية قبل بدء دراستهم.

باختصار، لقد أثبتنا طريقة بسيطة وفعالة نسبيا microbead زرع مع مجموعة واسعة من التطبيقات التي تستخدم المواد التي تتوافر بسهولة في المختبر. في نهاية المطاف، ونحن نأمل ان يكون هذا الدليل سوف يساعد الباحثين مع طبيعة حساسة من التلاعب الأنسجة الزرد.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل عن طريق منح DP2OD008470 المعاهد الوطنية للصحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride American Bioanalytical AB01915
Potassium Chloride American Bioanalytical AB01652
Calcium Chloride American Bioanalytical AB00366
HEPES Sigma Life Science H4034
Penicillin-Streptomycin solution Sigma-Aldrich P4333-20ML
N-Phenylthiourea (PTU) Aldrich Chemistry P7629
Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine) Fluka Analytical A5040
Borosilicate glass Sutter Instruments Co. BF100-50-10
Flaming/Brown Micropipette puller Sutter Instruments Co. Mo. P097
UltraPure Agarose Invitrogen 15510-027
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506
Methylene Blue Sigma-Aldrich M9140
250 ml Erlenmeyer Flask Fischer Scientific FB-500-250
Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile Corning 430167
60 mm x 15 mm VWR 25373-085
100 mm x 15 mm VWR 25373-100
150 mm x 15 mm VWR 25373-187
Saint-Gobain Chemware Microspatula Fischer Scientific 21-401-50B
P-1000 Micropipette tips Fischer Scientific 2707402
Low Temperature Incubator Fischer Scientific 11 690 516DQ
Dimethly Sulfoxide American Bioanalytical AB00435
Microbeads (45-106 µm) Biorad 140-1454 AG1-X8
Microbeads (45 µm) Polysciences 7314
Micro Dissecting Tweezer Roboz Surgical Instruments Co. RS-5010
Tungsten Needle Roboz Surgical Instruments Co. RS-6065
Capillary tube holder Globe Scientific Inc.  51674

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lieschke, G. J., et al. Tissue micromanipulation in zebrafish embryos. Zebrafish, Methods in Molecular Biology. 546, (2009).
  2. Wilson, J., Tucker, A. S. Fgf and Bmp signals repress the expression of Bapx1 in the mandibular mesenchyme and control the position of the developing jaw joint. Dev Biol. 266, 138-150 (2004).
  3. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  4. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
  5. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341 (2012).
  6. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
  7. Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish. Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).
  8. Amsterdam, A., Hopkins, N. Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease. Trends Genet. 22, 473-478 (2006).
  9. Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl Res. 163, 65-78 (2014).
  10. Kroeger, P. T. Jr, Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization. J Vis Exp. 89, e51708 (2014).
  11. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21, 48-64 (2011).
  12. Auer, T. O., Del Bene, F. CRISPR/Cas9 and TALEN-mediated knock-in approaches in zebrafish. Methods. 69, 142-150 (2014).
  13. Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proc Natl Acad Sci USA. 97, 12965-12969 (2000).
  14. Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res C Embryo Today. 93, e52063 (2011).
  15. Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high–throughput using zebrafish embryos. J Vis Exp. , 52063 (2014).
  16. Hyatt, G. A., Schmitt, E. A., Marsh-Armstrong, N., McCaffery, P., Dräger, U. C., Dowling, J. E. Retinoic acid establishes ventral retinal characteristics. Development. 122, 195-204 (1996).
  17. Picker, A., Brand, M. Fgf signals from a novel signaling center determine axial patterning of the prospective neural retina. Development. 132, 4951-4962 (2005).
  18. Reifers, F., Walsh, E. C., Leger, S., Stainier, D. Y. R., Brand, M. Induction and differentiation of the zebrafish heart requires fibroblast growth factor 8 (fgf8/acerebellar.). Development. 127, 225-235 (2000).
  19. Raible, F., Brand, M. Tight transcriptional control of the ETS domain factors Erm and Pea3 by Fgf signaling during early zebrafish development. Mech Dev. 107, 105-117 (2001).
  20. Reim, G., Brand, M. spiel-ohne-grenzen/pou2. mediates regional competence to respond to Fgf8 during zebrafish early neural development. Development. 129, 917-933 (2002).
  21. Jaszai, J., Reifers, F., Picker, A., Langenberg, T., Brand, M. Isthmus-to-midbrain transformation in the absence of midbrain-hindbrain organizer activity. Development. 130, 6611-6623 (2003).
  22. Hirati, Y., Okamoto, H. Canopy1, a novel regulator of FGF signaling around the midbrain-hindbrain boundary in zebrafish. Curr Biol. 16, 421-427 (2006).
  23. Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
  24. Abe, G., Ide, H., Tamura, K. Function of FGF signaling in the developmental process of the median fin fold in zebrafish. Dev Biol. 304, 355-366 (2007).
  25. Prykhozhij, S. V., Neumann, C. J. Distinct roles of Shh and Fgf signaling in regulating cell proliferation during zebrafish pectoral fin development. BMC Dev Biol. 8, 91 (2008).
  26. Scholpp, S., Brand, M. Endocytosis controls spreading and effective signaling range of Fgf8 protein. Curr Biol. 14, 1834-1841 (2014).
  27. Hardt, S., et al. The Bmp gradient of the zebrafish gastrula guides migrating lateral cells by regulating cell-cell adhesion. Curr Biol. 17, 475-487 (2007).
  28. White, R. J., Nie, Q., Lander, A. D., Schilling, T. F. Complex regulation of cyp26a1 .creates a robust retinoic acid gradient in the zebrafish embryo. PLoS Biol. 5, e2522-e2523 (2007).
  29. Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53, 835-850 (2009).
  30. Niswander, L., Jeffrey, S., Martin, G. R., Tickle, C. A positive feedback loop coordinates growth and patterning in the vertebrate limb. Nature. 371, 609-612 (1994).
  31. Laufer, E., Nelson, C. E., Johnson, R. L., Morgan, B. A., Tabin, C. Sonic hedgehog and Fgf-4 act through a signaling cascade and feedback loop to integrate growth and patterning of the developing limb bud. Cell. 79, 993-1003 (1994).
  32. Tickle, C., Alberts, B., Wolpert, L., Lee, J. Local application of retinoic acid to the limb bud mimics the action of the polarizing region. Nature. 296, 564-566 (1982).
  33. Samarut, E., Fraher, D., Laudet, V., Gibert, Y. ZebRA: an overview of retinoic acid signaling during zebrafish development. Biochimica et Biophysica Acta. 1849, 73-83 (2015).
  34. Lengerke, C., et al. Interactions between Cdx genes and retinoic acid modulate early cardiogenesis. Dev Biol. 354, 134-142 (2011).
  35. Wingert, R. A., et al. The cdx and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
  36. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  37. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
  38. Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom., and Notch signaling. Dev Biol. 386, 111-122 (2014).
  39. Cheng, C. N., Wingert, R. A. Nephron proximal tubule patterning and corpuscles of Stannius formation are regulated by the sim1a. transcription factor and retinoic acid in the zebrafish. Dev Biol. 399, 100-116 (2015).
  40. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  41. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J Vis Exp. , e51604 (2014).
  42. Cheng, C. N., Wingert, R. A. Chapter 9: Renal system development in the zebrafish: a basic nephrogenesis model. Zebrafish: Topics in Reproduction & Development. Carver, E., Lessman, C. , Nova Scientific Publishers. (2014).
  43. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Zebrafish pronephros tubulogenesis and epithelial identity maintenance are reliant on the polarity proteins Prkc iota .and zeta. Dev Biol. 396, 183-200 (1016).
  44. McKee, R., Gerlach, G. F., Jou, J., Cheng, C. N., Wingert, R. A. Temporal and spatial expression of tight junction genes during zebrafish pronephros development. Gene Expr Patterns. 16, 104-113 (2014).
  45. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J Vis Exp. , e2845 (2011).
  46. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
  47. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. 54, e2839 (2011).
  48. McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. , e51644 (2014).
  49. McCampbell, K. K., Springer, K., Wingert, R. A. Atlas of cellular dynamics during zebrafish adult kidney regeneration. Stem Cells Int. In press, (2015).
  50. Lee, S. L., et al. Hypoxia-induced pathological angiogenesis mediates tumor cell dissemination, invasion, and metastasis in a zebrafish tumor model. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19485-19490 (2009).
  51. Rouhi, P., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat Prot. 5, 1911-1918 (2010).
  52. Cao, R., Jensen, L. D. E., Söll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy. PLoS One. 3, e2748 (1371).
  53. Cao, Z., et al. Hypoxia-induced retinopathy model in adult zebrafish. Nat Prot. 5, 1903-1910 (2010).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 101، الزرد، جنين، حبة زرع، والتلاعب الأنسجة، والتنمية، وتوالد
Microbead زرع الأجنة الزرد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gerlach, G. F., Morales, E. E.,… More

Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (101), e52943, doi:10.3791/52943 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter