Abstract
Zebrafisken er opstået som en værdifuld genetisk model for studiet af udviklingsmæssige biologi og sygdom. Zebrafisk deler en høj grad af genomisk bevarelse, samt ligheder i cellulære, molekylære og fysiologiske processer, med andre hvirveldyr, herunder mennesker. Under tidlig ontogeni, zebrafisk embryoner er optisk transparent, så forskerne at visualisere dynamikken i organogenesen hjælp af en simpel stereomikroskop. Mikroperle implantation er en metode, der muliggør væv manipulation gennem ændring af faktorer i det lokale miljø. Dette gør det muligt for forskerne at analysere virkningerne af et vilkårligt antal signalmolekyler af interesse, såsom udskilte peptider, på bestemte rumlige og tidsmæssige punkter inden det udviklende foster. Her har vi detaljeret en protokol for, hvordan man kan manipulere og implantat perler i den tidlige zebrafisk udvikling.
Introduction
Udviklingsmæssige biologi forskere udnytte en bred vifte af cellulære, molekylære og genetiske metoder til at afdække de mekanismer, der styrer, hvordan en organisme er dannet. Blandt disse tilgange, væv manipulation er et centralt redskab i decifrere komplekse spørgsmål om celle skæbne, cellulær bevægelse, og tilrettelæggelsen af væv. En måde at ændre lokale væv miljøer er gennem kirurgisk anvendelse af mikroperler, der anvendes til at levere en fokal kilde til proteiner eller andre signalmolekyler 1. Denne type af eksperimentel manipulation er blevet bredt implementeret i klassiske hvirveldyr embryologi modeller, såsom frøen og chick 2.
Zebrafisken er blevet en vigtig hvirveldyr model organisme for studiet af organogenesen og giver også mange unikke fordele for sygdom modellering 3-5, da de deler høj genetisk bevarelse med mennesker 6. Især den optiske transparens og exekstern udvikling af zebrafisk embryo tilbyder en uovertruffen synspunkt til observation af væv ontogenese 3-5. Gennemførelsen af store forward genetiske skærme har genereret en kraftig repository af zebrafisk mutantstammer for yderligere undersøgelse 7,8, og identifikation af alternative screening teknikker, der effektivt kan udføres ved reduceret skala i enkelte laboratorier 9,10. Yderligere eksperimentelt arbejde med zebrafisk er blevet lettet gennem fremskridt inden transgene metoder og omvendt genetiske tilgange 11,12, samt kemiske genetik 13-15.
Tissue manipulation teknikker, såsom gennemførelsen af mikroperler, ikke har været så bredt anvendt i zebrafisk, men ikke desto mindre et nyttigt redskab til yderligere at forstå cellesignalering under udvikling. Mikroperle implantation er blevet anvendt til at udspørge de processer af dannelse orgel i zebrafisk nethinden16,17, hjerte 18, hjerne 19-22, neural crest 23 og fin 24,25. I disse og andre undersøgelser, har perler været anvendt under udviklingen at forstå udbredelsen af signalmolekyler 26, hvordan gradienter påvirker cellemigration 27 og aksial mønster 28. Mere for nylig er mikroperler blevet anvendt til at evaluere restitution mekanismer i zebrafisk voksne 29. I udviklingsmæssige undersøgelser, for eksempel, har zebrafisk microbead arbejde forudsat indsigt i mekanismerne i lemmer dannelse gennem studier af brystfinnen 25. Zebrafisk brystfinner fin opløbet er homolog til forben opløbet i musen 30 og chick 31. Hvirveldyrs knopskydninger har to væsentlige signalsystemer knuder: zonen med polariserende aktivitet (ZPA), der fastlægger den anteriore-til-posterior akse gennem ekspression af Sonic hedgehog (Shh) og nedstrøms Hox genmål,og den apikale ectodermale ryg (AER) til stede ved spidsen af knopskydninger, som virker til at etablere proximal til distal identitet af benet gennem ekspression af fibroblastvækstfaktorer (FGF'er). Ved at implantere Fgf gennemvædet mikroperler i zebrafisk Shh genetiske mutanter, efterforskere identificeret Fgf som afgørende for progression af cellecyklus og vækst i hvirveldyr lemmer 25. Ud over den FGF og Shh signalering kaskader, der etablerer positionel identitet, banebrydende undersøgelser under anvendelse af chick knopskydninger identificeret retinsyre (RA) som et molekyle, der kan efterligne virkningen af den polariserende region at etablere anterior til posterior identitet 32. Disse forsøg involverede at placere små strimler af RA-gennemblødt Whatman papir i chick lem at vurdere cifret mønsterdannelse 32. Yderligere har forskere udført andre elegante undersøgelser under anvendelse anvendelsen af mikroperler, celletransplantation, og exogentRA behandlinger i zebrafisk at fastslå, at RA virker til at levere langtrækkende positionelle signaler inden for zebrafisk baghjerne og mesoderm 28. På nuværende forbliver dog mange spørgsmål om roller signalering faktorer som Fgf og RA under mange aspekter af hvirveldyr udvikling. Signaleringen virkninger af RA, som en morfogen, påvirke mange organer 33, såsom udvikling af hjerte 34 og de renale stamceller hvor RA angiver proksimale nyreceller skrive skæbner 35-39. Yderligere forståelse af emner kunne drage fordel væsentligt fra eksperimentelle undersøgelser ved hjælp af væv manipulation og microbead implantation teknikker.
Mens færre undersøgelser er blevet udført med mikroperle implantation i zebrafisk, sammenlignet med modeller som chick, har de, der er blevet udført været yderst informativ. En årsag til den mangel på mikroperle implantation baseret-forskning i zebrafisk embryo er likely forestillingen om, at der er vanskelige tekniske udfordringer, baseret på størrelsen af embryonet, som udgør en hindring for vellykket udføre sådanne manipulationer. Dog kan microbead implantation i zebrafisk embryoner skal læres med praksis og assisteret ved visuel observation af teknikken, og derfor kan forfølges som et middel til at afhøre mekanismerne i udvikling. Her viser vi den præcise anvendelse af en mikroperle i zebrafisk embryo, som kan udnyttes til udførelse af en lang række forskellige assays på vævsdannelse og cellulær morfogenese.
Protocol
Procedurerne for at arbejde med zebrafisk embryoner beskrevet i denne protokol, blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg ved University of Notre Dame.
1. Ringers opløsning Forberedelse
- Lav en opløsning af 116 mM NaCl, 2,9 mM KCI, 3,6 mM CaCl2 og 5 mM Hepes med ultrarent H2O gennem kontinuerlig omrøring for at undgå enhver salt udfældning.
- Efter tilsætning af salte og medens opløsningen stadig omrøring, tilsættes 100 enheder / penicillin pr ml og 100 ug streptomycin pr ml.
- Efter tilsætning alle antibiotika og salte, udføre filter sterilisering af løsningen og butik i steril beholder.
Bemærk: N-phenylthiourinstof (1-phenyl-2-thiourinstof) eller PTU kan føjes til Ringers opløsning til at blokere dannelsen af pigment i perle implanterede embryoer uden negative følger for embryo sundhed. For at forberede Ringers / pigmentering blokerende opløsning, brug en koncenring af 0,003% PTU. På grund af den lave koncentration af PTU skal tilføjes det tilrådes, at en større mængde af Ringers opløsning ske, mindst 1 L, for at undgå at tilføje miniscule mængder af PTU pulver. Tilføj PTU under trin 1.2, mens opløsningen omrøring.
2. tricaine Fremstilling af opløsning
- Tilsættes 2 g ethyl-3-aminobenzoat-methansulfonat salt (tricaine) per liter af en opløsning plus 0,1 M Tris, fra en 1 M stamopløsning balanceret til et pH på 9,5 og lavet med ultrarent H2O
Bemærk: tricaine vil blive anvendt til at aflive de zebrafisk embryoner på det ønskede tidspunkt til analyse perle implantation fænotyper.
3. E3 Fremstilling af opløsning
- Lav en opløsning af 0,25 M NaCl, 10 mM KCI, 12,5 mM CaCl2, og 16,6 mM MgSO4 til 1 I ultrarent vand til at skabe 1 L E3.
- Tilsæt 200 pi methylenblåt til E3 løsning til at inhibere svampevækst.
4. Pulling Nåle til microbead Transfer
- Brug flammepoleret borosilikatglas med filament ved en OD: 1,0 mm, ID: 0,5 mm, med en længde på 10 cm.
- Placer borsilicatglas glas i en mikropipette aftrækker til at forberede fine nåle.
Bemærk: Følgende fire dimensioner kan bruges som udgangspunkt til at trække nålene: Varme = 540, Pull = 245, Velocity = 200, og Time = 125. - Efter trækker et passende antal nåle, opbevares i overdækket plast petriskåle, placeret på strimler af modellervoks eller tape for at forhindre bryde nålespidsen, indtil brug.
- At trimme nålespidsen til den ønskede boring størrelse, skal du bruge et par fine pincet til at score i slutningen af nålen.
Bemærk: Nål boring størrelse vil variere afhængigt af mikroperlen størrelse bliver udnyttet såvel som bruger håndtering præferencer. Et godt udgangspunkt er at håndværk bore størrelser i et interval mellem 100 og 200 um, hvis mikroperler spænder fra 50 til 100 um vil blive udnyttet. - Prior til at bruge, skal du indsætte den trimmede nål i holderen kapillarrøret til mode den færdige instrument microbead overførsel.
5. Whisker / Lash Tool Forberedelse
- Anskaf en knurhår, øjenvippe eller anden lille, men fast stykke af naturlig eller syntetisk hår glødetråd. Skåret nær bunden af glødetråden i en 45 ° vinkel. Overhold den knurhår til en P-1000 mikropipettespids hjælp permanent klar selvklæbende lim.
6. mikroperle Implantation Bakke Forberedelse
- Bland 2 g agarose med 100 ml E3 løsning til at lave en 2% E3 agarosegel.
- Varm 2% agaroseopløsning i 1 minut og 30 sekunder i en 250 ml Erlenmeyer-kolbe, hvirvlende kolben hver 30 sek for at undgå gelen fra sprudlede.
- Tag låget af en 60 mm x 15 mm petriskål og placere den i en større 150 mm x 15 mm skål med det indvendige opad.
- Hæld den varme agarosegel i 150 mm x 15 mm petriskål, og sørg for at forankre nedlåget af mindre parabol med pegefingeren.
Bemærk: Lad et tyndt lag af agarose under låget af mindre parabol at fjerne kondens, der vil dannes, når gelen hældes; dette vil gøre perlerne nemmere at se under en dissektion mikroskop. - Som agarosen køler, men før den størkner, placere en brønd mug på gelen. Dette vil give mulighed for lettere placering af embryoner.
- Bemærk: For at undgå bobler i brøndene, placere formen langsomt i en vinkel, indtil det er flydende på toppen af gelen.
- Ved hjælp af en microspatel, forsigtigt fjerne godt mug, når gelen er størknet. Tilføj E3-opløsning og opbevares ved 4 ° C.
7. Embryo Collection
- Forbered parring kamre, adskilt af skillevægge, ved at fylde dem op med systemet vand, og derefter placere voksne zebrafisk mandlige (r) og kvindelige (er) par i kamrene O / N.
- Saml befrugtede æg ved hjælp af en fin trådnet si (embryonale stadier vil variere lidt).
- Deponere de befrugtede æg i en ren, diameter 10 cm petriskål ved at dreje sien hovedet og skylle den med en fin strøm af E3 indtil der ikke er æg tilbage i sien, og der ca. 25 ml E3 opløsning i skålen.
- Efter indsamling, opdele æggene i flere retter (ca. 50-60 æg pr skål) for at undgå overbelægning, der kan føre til udviklingsmæssige asynkron inden koblingen og gøre at indsamle de ønskede gange punkter vanskelig.
- Inkuber embryoner i E3-opløsning ved 28,5 ° C for at aktivere udviklingsmæssige vurdering i henhold til standarden zebrafisk iscenesættelse serie 40.
Bemærk: embryoer skal overføres til E3 / PTU ved 24 timer efter befrugtning (HPF) for at forhindre pigment udvikling, hvis manipulationer på ældre stadier nødvendiggør optisk klarhed.
8. Bead Implantation
- Inkubér mikroperlerne i ønsket test molekyle koncentration eller tilsvarende køretøj solution for den nødvendige tid i en passende størrelse.
Bemærk: Forskeren kan anvende sterile petriskåle spænder 3-6 cm i diameter, eller multi-brønds plader, som begge muliggør visualisering af mikroperler i opløsningen. Kan variere afhængigt af typen og mængden af molekyle af interesse, og forskeren bør henvise til producenten eller offentliggjorte anbefalinger for varighed af inkubationen og andre aspekter såsom følsomhed over for lys og temperatur. - Når embryonerne har nået det ønskede udviklingsmæssige tidspunkt, flytte embryoner fra deres chorions hjælp fine pincet.
- Inkubér embryonerne i den filtrerede Ringer-opløsning med antibiotika i 10 min for at akklimatisere dem til opløsningen.
- Mens embryonerne akklimatiserer, overføre mikroperlerne ind mikroperlen pladen beliggende inden implantation bakken, og skyl dem i Ringer-opløsning i 10 min.
Bemærk: Implantér perlerne indenfor 50 min efter at dette punkt. Denne wsyg mindske sandsynligheden for, at man vil implantere en kugle med en mindre koncentration af molekylet af interesse. - Array embryonerne i brøndene på mikroperlen implantation bakken, idet man orientere dem, så interesseområdet, hvor mikroperlen vil blive implanteret er tilgængelig.
- Lave et lille snit på embryoet ved hjælp af wolfram nål.
- Overfør en mikroperle på embryo ved hjælp af mikrokapillær overførsel pipette: deprimerende pæren af pipetten, træk forsigtigt mikroperlen i kapillarkolonne, og slip derefter tryk til at overføre mikroperlen på den ønskede destination.
- Brug knurhår / øjenvippe værktøj til at placere microbead inde embryoet. Bemærk: Sørg for at placere microbead i vævet væk fra det sted, indsnit, så mikroperlen ikke bliver bortvist fra foster, som det heler.
Representative Results
Flere typer af manipulation værktøjer er nyttige til håndtering af mikroperler under forskningsansøgninger (Figur 1). Desuden kan en simpel agarose form med små brønde anvendes til at holde zebrafisk embryo, hvilket er afgørende for at udføre disse eksperimenter på en rettidig og effektiv måde (figur 1). Implantation af en mikroperle kan udføres på den rumlige position og tidsmæssige fase af interesse, som gør det muligt for forskerne at indsnævre et bestemt vindue i aktion for molekylet af interesse.
Her var enkeltdoser mikroperler implanteret i zebrafisk embryoner på halen knopstadiet eller på senere tidspunkter under somitogenesis faser (figur 3). To forskellige størrelser mikroperler, skyllet med Ringers opløsning alene, blev anvendt i denne protokol demonstration (figur 3A, 3B og 3C). Denne microbead implantation i mangel af konjugeretsmå molekyler viser, at perle implantation kan opnås uden grove morfologiske virkninger under den rette udvikling af zebrafisk embryo (figur 4).
Den experimentalist kan støde vanskeligheder med manøvrering mikroperlen ind i punktering hul lavet af en wolfram nål toppen embryoet. At opnå en bedre håndtering af mikroperlen når det først er embryonet ved mikro-nål, kan en bakkenbart / lash værktøj anvendes. Dette kan være udformet med naturligt kaste katte eller hunde whiskers, selv om andre naturlige eller syntetiske lash filamenter kan udnyttes (figur 1). En blid tryk på mikroperlen med enten wolfram nål eller knurhår værktøjet skal se mikroperlen synke ned i Ringers opløsning af formen. Når mikroperlen er sunket ind i formen bør det flyttes store afstande om nødvendigt ved hjælp af wolfram nål og en gang på toppen embryoet nålen eller trikit værktøj kan bruges til position mikroperlen ind i embryo. Succesen med mikroperlen implantation umiddelbart kan måles gennem visualisering på et stereomikroskop, som vulsten vil forblive stabilt placeret i vævet. At evaluere bead position over tid, kan hver prøve embryo skal afbildes via live tidsforløbet fotografering eller kontrolleres med periodiske intervaller (som afbildet i figur 4) for at sikre, at vulsten placering ikke har flyttet over varigheden af eksperimentet skyldes endogen væv morfogenese. Forståelse af positionen af perlen over tid er kritisk for den mest informeret fortolkning af resultaterne, såsom evaluering af effekten af et lille molekyle på et målvæv eller udviklingsproces.
Brugen af disse ovenstående trin vil give et ideelt miljø til at imbed mikroperler i zebrafisk embryo på et ønsket tidspunkt og position. Det er vores erfaring, nybegyndere i denne microbead implantation protokol typisk fået dygtighed nevendigt at udføre konsekvent kirurgisk implantation af mikroperler i zebrafisk embryo efter ca. en enkelt uge af praksis.
Figur 1. Anvendt værktøj til at udføre mikroperle implantation. (A) Perlen implantation bakke (venstre, 15 cm i diameter) med embryo forme (til venstre) og en mikroperle inkubation bakke (på højre, 6 cm i diameter). Denne arbejdsgruppe bakke gør det muligt for forskeren at placere embryoner i den ønskede retning for mikroperlen implantation, og for at have de forberedte mikrokugler til implantation i umiddelbar nærhed på mikroskopet station. Mikroperler skal inkuberes i lille molekyle (r) og / eller køretøj, og derefter skyllet i et separat mikroperle plade (til højre), før de bringes ind i perlen implantation bakke, der er placeret under mikroskop station. (B) To par fine tænger vil blive anvendt til at fjerne Choripå omgiver hver zebrafisk embryo og også at bryde enden af mikrokapillær nål. (C) En wolfram nål vil blive anvendt til at foretage en meget fin punktering i zebrafisk embryo til at positionere mikroperlen. (D) Den mikrokapillær overførsel pipette vil blive brugt til at samle op og placere en mikroperle oven på zebrafisk embryo nær det sted, hvor punktering. (E) Den knurhår / lash værktøj vil give den blide positionering af microbead i incisionssted inden fosteret, der tidligere blev foretaget af wolfram nål. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Skematisk af mikroperlen implantation procedure. (A) En mikroperle implantation bakke med mikroperler soaking i den ønskede vaskeopløsning er sat op under et stereomikroskop station, og fostrene placeret med væv opad. (B) Ved anvendelse af en wolfram nål, kan et lille snit i embryoet gøres med en lille endnu kraftfuld bevægelse. (C) Ved hjælp af en mikrokapillær overførsel pipette, kan den ønskede mikroperle blive hentet op fra mikroperlen rugekammeret i bakken, som ligger til højre, og bragt til venstre rum, hvor embryoet arbejdsområde er beliggende. Mikroperlen bør deponeres nær stedet for indsnittet, derefter forsigtigt placeret i indsnittet stedet foretaget af wolfram nål ved hjælp af whisker / lash værktøj. Når en mikroperle manøvreres ind incisionssted skal det gemt i vævet (væk fra indsnittet) stabilt at positionere mikroperlen og forhindre efterfølgende bevægelse ud af embryonet som udviklingen fortsætter. Please klik her for en større version af dette tal.
Figur 3. Mikroperler kan implanteres i embryoner på forskellige udviklingsstadier. (A) zebrafisk embryoer blev implanteret med en mikroperle (diameter på ca. 50 um) ind i bagagerummet på halen knopstadiet. Når undersøgt på 24 timer efter perle implantat (hpbi), havde embryonerne udviklet normalt, og mikroperlen viste minimal bevægelse under passagen af udviklingsmæssige tid. (B) zebrafisk embryoner implanteret med mikroperler (med en diameter på ca. 50 um) ind i blommesækken på 3 somite etape (ss) vises normal udvikling med relativt mindre vulst bevægelse over tid. (C) Større mikroperler (diameter på ca. 70 um) blev implanteret i den 7 ss embryo ligeledes viste normal efterfølgende udvikling, såvel som minimal hvis nogen bevægelse fra det sted, implantation. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Gross udviklingen af zebrafisk embryo er uforstyrret ved tilstedeværelsen af en mikroperle gennem 72 hpbi. Zebrafisk embryoer blev implanteret med mikroperler gennemvædet med Ringers opløsning (med en diameter på ca. 50 um) på 7 somite etape (ss). Hver mikroperle blev kirurgisk indsat i bagagerummet, mellem somitter 3 og 4. Tilstedeværelsen af perlen var ikke forbundet med åbenlyse udviklingsmæssige defekter på 24 timer efter perle implantat (hpbi), 48 hpbi eller 72 hpbi. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Discussion
I løbet af det sidste århundrede, har forståelsen af kroppens plan mønster og organogenesen gennemgået monumentale fremskridt. Tissue manipulation teknikker var kritiske i at afdække centrale oplysninger om disse vitale processer. Genetisk modifikation er en af de mest anvendte metoder til at fastslå genfunktion, og metoder til mosaik analyse, såsom celle transplantation, giver nyttige tilgange til at forstå autonomi genfunktion. Mikroperle implantation giver et andet sted at afhøre hvordan bestemte molekyler ændrer udviklingsmæssige dynamik, som denne metode gør det muligt for forskeren at ændre et lokalt væv miljø ved at indføre signalmolekyler eller inhibitorer. En række forskellige mikroperler er kommercielt tilgængelige, der har forskellig størrelse og andre fysiske egenskaber eksisterer (f.eks ladning), således at de kan anvendes til de eksperimentelle betingelser af interesse. Således, ved at implantere mikroperler, der er gennemvædet med et protein eller kemiskcal af interesse i en organisme, kan forskerne undersøge lokaliserede virkninger under udviklingen og finde associationer mellem genet eller molekyle af interesse og særlig biologisk fænotype (r).
Undersøgelser som den udføres af Wada og kolleger brugt mikroperle implantation for at vurdere effekten af øget Hedgehog signalering i skelet mønster i den forreste neurocranium (ANC) i zebrafisk 23. Tidligere undersøgelser har vist, at Shh er nødvendig for ANC formation 14. Ved hjælp Shh-coatede mikroperler forskere konstateret, at dette signal fremmer bruskdannelse i ANC. Mikroperlen implantation proces blev brugt til at vise en klar forbindelse mellem Hedgehog signalering og brusk dannelse i ANC. Observeres andet centralt eksempel på dette væv manipulation teknik zebrafisk i undersøgelser, hvor forskerne undersøgte transkriptionskontrol af Erythroblastoma Twenty-Six (ETS) domæne fskuespillere ETS-relateret molekyle (ERM) og polyomaenhanceren aktivator 3 (Pea3) ved Fgf signalering i den tidlige zebrafisk hjernens udvikling 19. Gennem mikroperle implantation eksperimenter, de var i stand til at vise, at FGF8 og Fgf3 ektopisk kan aktivere udtryk for erm og pea3. Disse eksempler illustrerer anvendeligheden af mikroperler at give indsigt i de udviklingsmæssige mekanismer, der samarbejder under vævsdannelse, som kan velkarakteriserede ved anvendelse af metoder til at vurdere genekspression 41. Således kan microbead transplantation være en levedygtig metode til at undersøge andre væv, såsom det mellemliggende mesoderm (IM), der giver anledning til nyren. Konkret vil det støtte i renale udviklingsmæssige undersøgelser, for at undersøge, hvordan forskellige molekyler påvirker nephron segmentering 42 og tubulogenesis 43,44, processer, der kun overfladisk forstået på nuværende tidspunkt. Endvidere har mikroperle implantation begyndt at blive anvendt til study restitution processer i zebrafisk 29] og kan tilpasses til anvendelse med et vilkårligt antal organregenerering modeller, såsom følgende laserablation af embryonale væv såsom nephron 45 eller i forbindelse med metoder, som er formuleret til at udføre forskning med de tilsvarende voksne strukturer 46-49. Endelig microbead implantation har potentialet til at blive anvendt i modeller for human sygdom, såsom cancer 50,51 eller væv degeneration 52,53.
I nærværende protokol, viser vi metoden til mikroperle implantation i zebrafisk embryoner som også er blevet tilsvarende beskrevet af andre forskere, men ikke vist gennem video-protokoller 1. Med minimal praksis kunne vi implantere mikroperler ved en omtrentlig hastighed på 8-10 embryoner / hr, som vedrører muligheden for denne procedure, når forskeren har en vis erfaring. De viste heri resultater viser, at perler af forskellige dimensions kan implanteres på tidlige stadier, og at med omhu, kan dette væv manipulation teknik implementeres med minimal fysisk forstyrrelse embryoet. Én forbedring, der skal understreges, er anvendelsen af en bakkenbart / lash værktøj til at positionere mikroperlen i embryoet. Denne relativt billig og enkel stykke udstyr er omtrent den samme diameter som mikroperle, er let at opnå og hjælper fremskynde implantation proces. Den whisker / lash kan skæres til en ønsket længde for at frembringe en fast endnu delikat perle-håndtering værktøj, afhængigt af forsker fingerfærdighed og præference. Endelig mens vi beskrev her, hvordan man fysisk manipulere mikrokugler og zebrafisk embryoner til at udføre implantation, denne protokol ikke skitsere specifikke håndtering procedurer for forskellige lægemidler eller peptider. Generelt bør kemisk behandlede mikroperler implanteres i dyret med hensigtsmæssighed, for at undgå uønskede virkninger på andre områder af organismen, og forskere skal være godt idannet om de mulige sikkerhedsproblemer forbundet med sådanne kemikalier inden initiering deres studier.
Sammenfattende har vi vist en relativt enkel og effektiv mikroperle implantation metode med en lang række applikationer, der anvender materialer, som er let tilgængelige i laboratoriet. I sidste ende håber vi, at denne manual vil hjælpe forskere med den fine karakter af zebrafisk væv manipulation.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud DP2OD008470.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | American Bioanalytical | AB01915 | |
| Potassium Chloride | American Bioanalytical | AB01652 | |
| Calcium Chloride | American Bioanalytical | AB00366 | |
| HEPES | Sigma Life Science | H4034 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma-Aldrich | P4333-20ML | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Aldrich Chemistry | P7629 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine) | Fluka Analytical | A5040 | |
| Borosilicate glass | Sutter Instruments Co. | BF100-50-10 | |
| Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments Co. | Mo. P097 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| 250 ml Erlenmeyer Flask | Fischer Scientific | FB-500-250 | |
| Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile | Corning | 430167 | |
| 60 mm x 15 mm | VWR | 25373-085 | |
| 100 mm x 15 mm | VWR | 25373-100 | |
| 150 mm x 15 mm | VWR | 25373-187 | |
| Saint-Gobain Chemware Microspatula | Fischer Scientific | 21-401-50B | |
| P-1000 Micropipette tips | Fischer Scientific | 2707402 | |
| Low Temperature Incubator | Fischer Scientific | 11 690 516DQ | |
| Dimethly Sulfoxide | American Bioanalytical | AB00435 | |
| Microbeads (45-106 µm) | Biorad | 140-1454 AG1-X8 | |
| Microbeads (45 µm) | Polysciences | 7314 | |
| Micro Dissecting Tweezer | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | |
| Tungsten Needle | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6065 | |
| Capillary tube holder | Globe Scientific Inc. | 51674 |
References
- Lieschke, G. J., et al. Tissue micromanipulation in zebrafish embryos. Zebrafish, Methods in Molecular Biology. 546, (2009).
- Wilson, J., Tucker, A. S. Fgf and Bmp signals repress the expression of Bapx1 in the mandibular mesenchyme and control the position of the developing jaw joint. Dev Biol. 266, 138-150 (2004).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
- Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish. Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).
- Amsterdam, A., Hopkins, N. Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease. Trends Genet. 22, 473-478 (2006).
- Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl Res. 163, 65-78 (2014).
- Kroeger, P. T. Jr, Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization. J Vis Exp. 89, e51708 (2014).
- Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21, 48-64 (2011).
- Auer, T. O., Del Bene, F. CRISPR/Cas9 and TALEN-mediated knock-in approaches in zebrafish. Methods. 69, 142-150 (2014).
- Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proc Natl Acad Sci USA. 97, 12965-12969 (2000).
- Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res C Embryo Today. 93, e52063 (2011).
- Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high–throughput using zebrafish embryos. J Vis Exp. , 52063 (2014).
- Hyatt, G. A., Schmitt, E. A., Marsh-Armstrong, N., McCaffery, P., Dräger, U. C., Dowling, J. E. Retinoic acid establishes ventral retinal characteristics. Development. 122, 195-204 (1996).
- Picker, A., Brand, M. Fgf signals from a novel signaling center determine axial patterning of the prospective neural retina. Development. 132, 4951-4962 (2005).
- Reifers, F., Walsh, E. C., Leger, S., Stainier, D. Y. R., Brand, M. Induction and differentiation of the zebrafish heart requires fibroblast growth factor 8 (fgf8/acerebellar.). Development. 127, 225-235 (2000).
- Raible, F., Brand, M. Tight transcriptional control of the ETS domain factors Erm and Pea3 by Fgf signaling during early zebrafish development. Mech Dev. 107, 105-117 (2001).
- Reim, G., Brand, M. spiel-ohne-grenzen/pou2. mediates regional competence to respond to Fgf8 during zebrafish early neural development. Development. 129, 917-933 (2002).
- Jaszai, J., Reifers, F., Picker, A., Langenberg, T., Brand, M. Isthmus-to-midbrain transformation in the absence of midbrain-hindbrain organizer activity. Development. 130, 6611-6623 (2003).
- Hirati, Y., Okamoto, H. Canopy1, a novel regulator of FGF signaling around the midbrain-hindbrain boundary in zebrafish. Curr Biol. 16, 421-427 (2006).
- Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
- Abe, G., Ide, H., Tamura, K. Function of FGF signaling in the developmental process of the median fin fold in zebrafish. Dev Biol. 304, 355-366 (2007).
- Prykhozhij, S. V., Neumann, C. J. Distinct roles of Shh and Fgf signaling in regulating cell proliferation during zebrafish pectoral fin development. BMC Dev Biol. 8, 91 (2008).
- Scholpp, S., Brand, M. Endocytosis controls spreading and effective signaling range of Fgf8 protein. Curr Biol. 14, 1834-1841 (2014).
- Hardt, S., et al. The Bmp gradient of the zebrafish gastrula guides migrating lateral cells by regulating cell-cell adhesion. Curr Biol. 17, 475-487 (2007).
- White, R. J., Nie, Q., Lander, A. D., Schilling, T. F. Complex regulation of cyp26a1 .creates a robust retinoic acid gradient in the zebrafish embryo. PLoS Biol. 5, e2522-e2523 (2007).
- Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53, 835-850 (2009).
- Niswander, L., Jeffrey, S., Martin, G. R., Tickle, C. A positive feedback loop coordinates growth and patterning in the vertebrate limb. Nature. 371, 609-612 (1994).
- Laufer, E., Nelson, C. E., Johnson, R. L., Morgan, B. A., Tabin, C. Sonic hedgehog and Fgf-4 act through a signaling cascade and feedback loop to integrate growth and patterning of the developing limb bud. Cell. 79, 993-1003 (1994).
- Tickle, C., Alberts, B., Wolpert, L., Lee, J. Local application of retinoic acid to the limb bud mimics the action of the polarizing region. Nature. 296, 564-566 (1982).
- Samarut, E., Fraher, D., Laudet, V., Gibert, Y. ZebRA: an overview of retinoic acid signaling during zebrafish development. Biochimica et Biophysica Acta. 1849, 73-83 (2015).
- Lengerke, C., et al. Interactions between Cdx genes and retinoic acid modulate early cardiogenesis. Dev Biol. 354, 134-142 (2011).
- Wingert, R. A., et al. The cdx and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
- Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom., and Notch signaling. Dev Biol. 386, 111-122 (2014).
- Cheng, C. N., Wingert, R. A. Nephron proximal tubule patterning and corpuscles of Stannius formation are regulated by the sim1a. transcription factor and retinoic acid in the zebrafish. Dev Biol. 399, 100-116 (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J Vis Exp. , e51604 (2014).
- Cheng, C. N., Wingert, R. A. Chapter 9: Renal system development in the zebrafish: a basic nephrogenesis model. Zebrafish: Topics in Reproduction & Development. Carver, E., Lessman, C. , Nova Scientific Publishers. (2014).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Zebrafish pronephros tubulogenesis and epithelial identity maintenance are reliant on the polarity proteins Prkc iota .and zeta. Dev Biol. 396, 183-200 (1016).
- McKee, R., Gerlach, G. F., Jou, J., Cheng, C. N., Wingert, R. A. Temporal and spatial expression of tight junction genes during zebrafish pronephros development. Gene Expr Patterns. 16, 104-113 (2014).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J Vis Exp. , e2845 (2011).
- McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. 54, e2839 (2011).
- McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. , e51644 (2014).
- McCampbell, K. K., Springer, K., Wingert, R. A. Atlas of cellular dynamics during zebrafish adult kidney regeneration. Stem Cells Int. In press, (2015).
- Lee, S. L., et al. Hypoxia-induced pathological angiogenesis mediates tumor cell dissemination, invasion, and metastasis in a zebrafish tumor model. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19485-19490 (2009).
- Rouhi, P., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat Prot. 5, 1911-1918 (2010).
- Cao, R., Jensen, L. D. E., Söll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy. PLoS One. 3, e2748 (1371).
- Cao, Z., et al. Hypoxia-induced retinopathy model in adult zebrafish. Nat Prot. 5, 1903-1910 (2010).
