Abstract
De zebravis heeft ontpopt als een waardevol genetisch modelsysteem voor de studie van de ontwikkelingsbiologie en ziekte. Zebravis hebben een hoge mate van conservering genoom, en overeenkomsten in cellulaire, moleculaire en fysiologische processen, met andere vertebraten waaronder de mens. Tijdens de vroege ontogenie, zebravis embryo's optisch transparant, voor onderzoekers die de dynamiek van organogenese op eenvoudige stereomicroscoop visualiseren. Microbead implantatie is een methode die weefselmanipulatie mogelijk maakt door het veranderen van elementen in de lokale omgeving. Dit stelt onderzoekers de effecten van een aantal signaalmoleculen plaats, zoals uitgescheiden peptiden op specifieke ruimtelijke en temporele punten in het ontwikkelende embryo testen. Hier hebben we detail een protocol voor hoe te manipuleren en implantaat kralen tijdens de vroege ontwikkeling van de zebravis.
Introduction
Ontwikkelingsbiologie onderzoekers maken gebruik van een breed scala van cellulaire, moleculaire en genetische methoden om de mechanismen die bepalen hoe een organisme wordt gevormd te ontdekken. Onder deze benaderingen, weefsel manipulatie is een belangrijk instrument in het ontcijferen van complexe vragen over het lot van de cel, cellulair beweging, en de organisatie van weefsels. Een manier om weefselbeschadiging omgevingen te veranderen is door het chirurgische toepassing van microbolletjes die worden gebruikt om een focale bron van eiwitten of andere signaalmoleculen 1 leveren. Dit soort experimentele manipulatie is op grote schaal toegepast in de klassieke gewervelde embryologie modellen, zoals de kikker en kuiken 2.
De zebravis is uitgegroeid tot een belangrijke gewervelde modelorganisme voor de studie van organogenese en biedt ook vele unieke voordelen voor de ziekte modelleren 3-5 als ze delen hoge genetische behoud met mensen 6. Vooral de optische transparantie en exinterne ontwikkeling van de zebravis embryo biedt een ongeëvenaarde gezichtspunt voor de observatie van weefsel ontogenie 3-5. De implementatie van grootschalige forward genetische screens heeft een krachtige repository van zebravis mutant stammen voor verdere studie 7,8, en de identificatie van alternatieve screening technieken die efficiënt kunnen worden uitgevoerd op verkleinde schaal in enkele laboratoria 9,10 gegenereerd. Verdere experimentele werk met de zebravis is vergemakkelijkt door de vooruitgang in de transgene methodologieën en reverse genetische benaderingen 11,12, evenals chemische genetica 13-15.
Tissue manipulatietechnieken, zoals de toepassing van microbolletjes, zijn niet zo breed toegepast in de zebravis, maar toch een bruikbare instrument om inzicht cell signaling tijdens de ontwikkeling. Microbead implantatie is gebruikt om de processen van vorming orgaan ondervragen bij de zebravis retina16,17, 18 hart, hersenen 19-22, neurale 23 en fin 24,25. In deze en andere studies, zijn kralen toegepast tijdens de ontwikkeling aan de verspreiding van signaalmoleculen 26, hoe hellingen beïnvloeden celmigratie 27 en axiale patroonvorming 28 begrijpen. Recenter zijn microbolletjes werden gebruikt voor regeneratie mechanismen evalueren zebravis volwassenen 29. In ontwikkelingsstudies bijvoorbeeld zebravis microbead werk heeft inzicht in de mechanismen van ledematen formatie die via studies van de borstvin 25. De zebravis borstvin bud is homoloog aan de voorpoot knop in de muis 30 en chick 31. De gewervelde ledematen knop heeft twee essentiële signalering knooppunten: de zone van polariserende activiteit (ZPA) dat de anterior-to-posterior as stelt door de uitdrukking van Sonic hedgehog (Shh) en downstream hoxgen targets,en de apicale ectodermale rand (AER) aanwezig op het uiteinde van de ledemaatknop, die dient om proximaal vast distale identiteit van het lid tot expressie van fibroblast groeifactoren (Fgfs). Door het implanteren Fgf gedrenkt microbolletjes in zebravis Shh genetische mutanten, onderzoekers Fgf geïdentificeerd als essentieel voor de progressie van de celcyclus en de groei van de vertebraat ledemaat 25. Naast de Fgf en Shh signaalcascades die positionele identiteit, baanbrekende studies op de chick ledemaatknop geïdentificeerd retinoïnezuur (RA) als een molecuul dat de werking van de polariserende regio kan nabootsen anterior identiteit 32 posterieur stellen. Deze betrokken plaatsen van kleine stroken van RA-doordrenkte Whatman papier in de kuiken ledematen experimenten om cijfers patroonvorming 32 beoordelen. Verder hebben onderzoekers andere elegante onderzoeken waarin het gebruik van microbolletjes uitgevoerd, celtransplantatie en exogeneRA behandelingen in de zebravis om vast te stellen dat de RA handelt over lange afstand positionele signalen te bieden binnen de zebravis achterhersenen en mesoderm 28. Echter, op dit moment veel vragen blijven bestaan over de rol van signalering factoren zoals Fgf en RA tijdens tal van aspecten van gewervelde ontwikkeling. De signalering effecten van RA, als een morfogeen, beïnvloeden veel organen 33, zoals het ontwikkelen van hart 34 en de renale progenitorcellen, waarbij RA specificeert proximale niercellen typen lot 35-39. Beter begrip van dergelijke onderwerpen aanzienlijk kunnen profiteren van experimentele studies met behulp van weefsel manipulatie en microbead implantatie technieken.
Hoewel minder studies uitgevoerd met microbeads implantatie in de zebravis, vergeleken met modellen zoals het kuiken, die zijn uitgevoerd hebben zeer informatief. Een reden voor de beperkte microbead implantatie gebaseerd onderzoek in de zebravis embryo likely het idee dat er moeilijke technische problemen, op basis van de grootte van de embryo, die een belemmering succesvol uitvoeren van dergelijke manipulaties. Echter, microbead implantatie in zebravisembryo's worden geleerd praktijk en ondersteund door middel van visuele waarneming van de techniek, en kan dus als een middel om de mechanismen van de ontwikkeling ondervragen worden voortgezet. Hier tonen we de precieze toepassing van een microkraal in het zebravis embryo, die kan worden gebruikt voor het uitvoeren van vele verschillende assays voor weefselvorming en cellulaire morfogenese.
Protocol
De procedures voor het werken met de zebravis embryo's beschreven in dit protocol werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Notre Dame.
1. Ringer's oplossing Voorbereiding
- Maak een oplossing van 116 mM NaCl, 2,9 mM KCI, 3,6 mM CaCl2, en 5 mM Hepes met ultrapuur H 2 O door voortdurende roeren om eventuele zout neerslaan te voorkomen.
- Na toevoeging van zouten en terwijl de oplossing wordt al roerend, 100 eenheden / penicilline per ml en 100 pg streptomycine per ml.
- Na toevoegen van alle antibiotica en zouten Voer filter steriliseren van de oplossing en bewaar in de steriele houder.
Opmerking: N-fenylthioureum (1-Fenyl-2-thioureum) of PTU kunnen worden toegevoegd aan Ringer's oplossing om de vorming van pigment in bead geïmplanteerde embryo zonder negatieve gevolgen voor de gezondheid embryo blokkeren. Om Ringer's / pigmentatie blokkerende oplossing te bereiden, gebruik dan een concenregistratie van 0,003% PTU. Vanwege de lage concentratie van PTU te voegen is het raadzaam dat een groter volume Ringer-oplossing worden gemaakt, ten minste 1 L, niet te verhogen minuscule hoeveelheden PTU poeder. Voeg PTU tijdens stap 1,2, terwijl de oplossing geroerd.
2. tricaïne Solution Voorbereiding
- Voeg 2 g ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaatzout (tricaïne) per L oplossing plus 0,1 M Tris, uit een 1 M voorraadoplossing gebalanceerd om een pH van 9,5 en die met ultrapuur H 2 O.
Opmerking: tricaïne zal gebruikt worden om de zebravis embryo's euthanaseren op het gewenste tijdstip tot hiel implantatie fenotypes test.
3. E3 oplossingspreparaat
- Voeg een oplossing van 0,25 M NaCl, 10 mM KCI, 12,5 mM CaCl2 en 16,6 mM MgSO 4-1 liter ultrazuiver water tot 1 liter E3 creëren.
- Voeg 200 ul van methyleenblauw aan de E3 oplossing om schimmelgroei te remmen.
4. trekken Naalden voor microbeads Transfer
- Gebruik brand gepolijst borosilicaatglas met filament in een OD: 1,0 mm, ID: 0,5 mm, een lengte van 10 cm.
- Plaats boorsilicaat glas in een micropipet trekker met fijne naalden te bereiden.
Opmerking: De volgende vier dimensies kan worden gebruikt als een startpunt om de naalden te trekken: Warmte = 540, Pull = 245, Velocity = 200, en Time = 125. - Na het trekken van een voldoende aantal naalden, opslag in behandelde plastic petrischalen, gepositioneerd op stroken klei of kleefband te voorkomen breken van de naald, tot gebruik.
- Om de naald op de gewenste boring trim, gebruik dan een paar fijne tang om het einde van de naald te scoren.
Opmerking: Naald boring is afhankelijk van de afmeting van microbead en benut gebruiker handling voorkeuren. Een goed uitgangspunt is om ambachtelijke boring maten in een range tussen 100 en 200 pm als microbeads variërend 50-100 urn zal worden benut. - Prior te gebruiken, plaatst u de bijgesneden naald in de capillair houder om de voltooide microbead overdracht instrument mode.
5. Bakkebaard / Lash Tool Voorbereiding
- Zorg voor een snorhaar, geselen, of andere kleine maar stevige stuk van natuurlijk of synthetisch haar gloeidraad. Knip dichtbij de basis van het filament in een 45 ° -hoek. Houd u de snorhaar een P-1000 micropipet tip met permanente heldere lijm.
6. microbeads Implantatie Tray Voorbereiding
- Meng 2 g agarose met 100 ml E3 oplossing een 2% agarosegel E3 maken.
- Verwarm de 2% agarose-oplossing gedurende 1 minuut en 30 seconden in een 250 ml Erlenmeyer kolf, omzwenken iedere 30 sec om de gel uit borrelen te voorkomen.
- Neem het deksel van een 60 mm x 15 mm petrischaal en plaats het in een grotere 150 mm x 15 mm gerecht met de binnenkant naar boven.
- Giet de hete agarosegel in de 150 mm x 15 mm petrischaal, en zorg ervoor dat verankeren neerhet deksel van de kleinere schaal met de wijsvinger.
Opmerking: Laat een dunne agarose onder het deksel van de kleinere schaal om condensatie zal vormen wanneer het gieten van de gel te verwijderen; dit zal de kralen gemakkelijker te zien onder een dissectie microscoop te maken. - Als agarose afkoelt, maar voordat het stolt, plaats een goed schimmel op de gel. Dit zal zorgen voor makkelijker plaatsing van de embryo's.
- Opmerking: Om luchtbellen in de putjes te gaan, moet de mal langzaam onder een hoek tot hij drijft bovenop de gel.
- Met behulp van een microspatula, verwijder voorzichtig de put mal zodra de gel is gestold. Voeg E3 oplossing en bewaar bij 4 ° C.
7. Embryo Collection
- Bereid paring kamers, gescheiden door verdelers, door ze te vullen met het systeem water, en vervolgens het plaatsen van volwassen zebravissen man (s) en vrouwelijke (s) paren in de kamers O / N.
- Verzamel bevruchte eieren met een fijn gaas zeef (embryonale stadium zal enigszins variëren).
- Breng de bevruchte eitjes in een schone, 10 cm diameter petrischaal door de zeef ondersteboven en spoelen met een fijne stroom E3 totdat er geen eieren meer in het filter, en er ongeveer 25 ml E3 oplossing in de schotel.
- Na het verzamelen, verdelen de eieren in verschillende gerechten (ongeveer 50-60 eieren per gerecht) tot overbevolking, die kunnen leiden tot ontwikkelingsstoornissen asynchronie binnen de koppeling en maken het verzamelen van de gewenste tijden punten moeilijk te vermijden.
- Incubeer embryo E3 oplossing bij 28,5 ° C tot ontwikkelingsbeoordeling staat volgens de standaard zebravis staging series 40.
Opmerking: De embryo's moeten worden overgedragen aan de E3 / PTU op 24 uur na de bevruchting (HPF) om pigment ontwikkeling te voorkomen als manipulaties op oudere stadia noodzakelijk optische helderheid.
8. Bead Implantatie
- Incubeer de microbolletjes in gewenste proefmolecuul concentratie of het overeenkomstige voertuig solution voor de benodigde tijd in een geschikt volume.
Opmerking: De onderzoeker kan steriele Petrischalen variërend 3-6 cm in diameter, of multi-well platen, die beide mogelijk maken visualisatie van de microkorrels in de oplossing te gebruiken. Kan variëren afhankelijk van het type en de hoeveelheid molecuul van belang en de onderzoeker moet verwijzen naar de fabrikant of gepubliceerde aanbevelingen voor incubatieduur en andere aspecten, zoals gevoeligheid voor licht en temperatuur. - Zodra de embryo's de gewenste ontwikkeling tijdstip hebben bereikt, verwijder de embryo's uit hun chorions met behulp van fijne pincet.
- Incubeer de embryo gefiltreerde Ringer oplossing met antibiotica gedurende 10 min om te wennen aan de oplossing.
- Terwijl de embryo's worden acclimatiseren, de overdracht van de microbolletjes in de microbead plaat genesteld binnen de implantatie lade en spoel ze in Ringer oplossing voor 10 min.
Opmerking: Implanteer de parels binnen 50 minuten na het bereiken van dit punt. Dit will verminderen de kans dat men een kraal zal implanteren met een kleinere concentratie van het molecuul van belang. - Array de embryo's in de putjes van de microbead implantatie lade, zorg ervoor dat ze zo te oriënteren op het gebied van belang waar de microbead zal worden ingeplant toegankelijk is.
- Maak een kleine incisie op het embryo met behulp van de wolfraam naald.
- Breng een microkraal op de embryo met de microcapillaire transferpipet: indrukken van de bol van de pipet, trek de microbeads in de capillaire kolom, waarna de druk op de microkraal overdracht be- reikt los.
- Gebruik de snorhaar / zweep instrument om de microbeads in het embryo te positioneren. Opmerking: Zorg ervoor dat de microbeads positioneren in het weefsel weg van de plaats van de incisie, zodat de microbead niet zullen worden verdreven uit het embryo als het geneest.
Representative Results
Verschillende soorten manipulatie gereedschappen zijn nuttig voor de behandeling microkralen in onderzoekstoepassingen (figuur 1). Bovendien kan een eenvoudige agarose mal met kleine putten worden gebruikt om de zebravis embryo, die essentieel is voor deze experimenten op een tijdige en efficiënte manier (figuur 1) bezit. De implantatie van een microbead kan worden uitgevoerd op de ruimtelijke positie en temporele fase plaats, waardoor onderzoekers om een specifiek venster van de actie verkleinen voor het molecuul van belang.
Hier werden afzonderlijke microkorrels geïmplanteerd in zebravis embryo's in de staart knopstadium of op latere tijdstippen gedurende somitogenesis fasen (figuur 3). Twee verschillende grootte microkorrels, gespoeld met Ringer's oplossing alleen werden in dit protocol demonstratie (Figuur 3A, 3B en 3C). Dit microbeads implantatie in de afwezigheid van enige geconjugeerdekleine moleculen toont aan dat bead implantatie mogelijk is zonder grove morfologische effecten tijdens de goede ontwikkeling van de zebravis embryo (figuur 4).
De experimentator kan problemen ondervindt bij het manoeuvreren van de microbeads in de punctie gat gemaakt door een wolfraam naald boven het embryo. Om een betere afhandeling van de microbeads eenmaal op de embryo geplaatst door de micro-naald te bereiken, kan een snorhaar / zweep hulpmiddel worden gebruikt. Dit kan worden vervaardigd met natuurlijk schuur katten of honden bakkebaarden, hoewel andere natuurlijke of synthetische lash filamenten kunnen worden gebruikt (figuur 1). Een zachte druk op de microbeads met ofwel de wolfraam naald of de snorhaar instrument moet zien de microbeads zinken in de Ringer-oplossing van de mal. Zodra de microbeads is verzonken in de mal moet grote afstanden te verplaatsen indien nodig met de wolfraam naald en eenmaal boven het embryo de naald of whisker gereedschap kan worden gebruikt om position de microbeads in de embryo. Het succes van de microbead implantatie kan direct worden gemeten door visualisatie van een stereomicroscoop, aangezien de korrel blijft stabiel gepositioneerd in het weefsel. Tot hiel positie tijd kan meten, kan elke embryo monster te beelden via live tijdsverloop photography of gecontroleerde periodiek (zoals weergegeven in figuur 4), zodat de kraal Locatie niet is verschoven over de duur van het experiment door endogeen weefsel morfogenese. Begrip van de positionering van de parel in de tijd is van cruciaal belang voor de hoogte interpretatie van de resultaten, zoals een evaluatie van het effect van een molecuul op een doelweefsel of ontwikkelingsproces.
Het gebruik van deze bovenstaande stappen zal een ideale omgeving om microbolletjes verankeren in de zebravis embryo op een gewenst tijdstip en plaats te bieden. In onze ervaring, beginnende gebruikers van deze microbead implantatie protocol meestal kreeg de vaardigheid necessary consistente chirurgische implantatie van microbolletjes te voeren in de zebravis embryo na ongeveer één week van de praktijk.
Figuur 1. Gereedschap gebruikt microbead implantatie uitgevoerd. (A) De kraal implantatie tray (links, 15 cm diameter) met embryo mallen (links) en een microkorrel incubatie tray (LV 6 cm diameter). Deze werken tray kan de onderzoeker de embryo's in de gewenste richting voor microbead implantatie plaatsen, en de bereide microbolletjes voor implantatie in de nabijheid van de microscoop station hebben. Microkralen worden geïncubeerd in kleine molecule (s) en / of drager en daarna gespoeld in een afzonderlijke microkorrel plaat (rechts) voordat deze in de kraal implantatie lade die is gepositioneerd onder de microscoop station. (B) Twee paar fijne tang worden gebruikt om de Chori verwijderenon rondom elke zebravis embryo en ook het einde van het microcapillaire naald breken. (C) Een wolfraam naald wordt gebruikt om een zeer fijne punctie belandt in het zebravis embryo waarin het microkorrel positioneren. (D) De microcapillaire pipet wordt gebruikt voor ophalen en achtereenvolgens een microbead bovenop de zebravis embryo dichtbij de plaats van de punctie. (E) De snorhaar / zweep tool zal de zachte positionering van de microbeads in de incisie plaats binnen de embryo die eerder werd gemaakt door de wolfraam naald mogelijk te maken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Schematische voorstelling van de microbead implantatieprocedure. (A) A microbead implantatie dienblad met microkorrels soaking in de gewenste wasoplossing is opgericht in het kader van een stereomicroscoop station, en de embryo's geplaatst met weefsel naar boven. (B) Een wolfraam naald, kan een kleine incisie in het embryo worden met een lichte maar krachtige beweging. (C) met behulp van een microcapillaire transferpipet, kan de gewenste microbead worden opgehaald van de microbead incubatiekamer in de lade, gelegen aan de rechterkant, en aan de linkerzijde compartiment waar het embryo werkgebied ligt gebracht. The microbeads moet worden gedeponeerd bij de plaats van de incisie, dan voorzichtig gepositioneerd in de incisie door de wolfraam naald met de whisker / zweep tool. Zodra een microkraal wordt gemanoeuvreerd de incisie moet worden opgeborgen in het weefsel (weg van de incisie) stabiel positioneren van de microbead en voorkomt daaropvolgende beweging van de embryo ontwikkeling gaat. Please klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Microkralen kunnen worden geïmplanteerd in embryo's in verschillende ontwikkelingsstadia. (A) Zebravis embryo's werden geïmplanteerd met microkorrel (diameter van ongeveer 50 pm) in de romp aan de staart knopstadium. Wanneer onderzocht bij de 24 uur na kraal implantaat (hpbi), had de embryo's normaal ontwikkeld en de microbead toonde minimale beweging tijdens het verstrijken van de ontwikkelingstijd. (B) Zebravis embryo's geïmplanteerd microkorrels (met een diameter van ongeveer 50 pm) in de dooierzak in het 3 somiet fase (ss) weergegeven normale ontwikkeling met relatief kleine kraal beweging in de tijd. (C) groter microkorrels (diameter van ongeveer 70 pm) werden geïmplanteerd in de 7 ss embryo soortgelijke vertoonden normale verdere ontwikkeling, alsook minimal eventuele verplaatsing van de plaats van de implantatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Gross ontwikkeling van de zebravis embryo onverstoord door de aanwezigheid van een microbead tot 72 hpbi. Zebravis embryo's werden geïmplanteerd met microbolletjes gedrenkt in Ringer's oplossing (met een diameter van ongeveer 50 um) en 7 somiet fase (ss). Elk microbeads werd operatief ingebracht in de kofferbak, tussen somieten 3 en 4. De aanwezigheid van de kraal werd niet geassocieerd met openlijke defecten in de ontwikkeling bij 24 uur na kraal implantaat (hpbi), 48 hpbi, of 72 hpbi. Klik hier om te bekijken grotere versie van deze figuur.
Discussion
In de afgelopen eeuw is het begrip van lichaam plannen patroonvorming en organogenese monumentale vooruitgang ondergaan. Tissue manipulatietechnieken waren kritisch in het blootleggen van de belangrijkste informatie over deze vitale processen. Genetische modificatie is een van de meest gebruikte methoden voor het vaststellen van genfunctie en werkwijzen mozaïek analyse zoals celtransplantatie, bruikbare benaderingen worden zelfstandig genfunctie te begrijpen. Microbeads implantatie biedt een andere plek om te ondervragen hoe bepaalde moleculen veranderen ontwikkelingsdynamiek, omdat deze methode kan de onderzoeker om te veranderen van een lokaal weefsel milieu door de invoering van signaalmoleculen of remmers. Een reeks verschillende microkorrels zijn commercieel verkrijgbaar, dat verschillende afmetingen en andere fysische eigenschappen zijn (bijvoorbeeld lading) zodanig dat deze kunnen worden toegepast om de experimentele condities plaats. Aldus, door het implanteren van microbolletjes die zijn gedrenkt in een eiwit of chemischcal van belang in een organisme, kunnen onderzoekers gelokaliseerde effecten tijdens de ontwikkeling te onderzoeken en vinden associaties tussen het gen of molecuul van belang en bijzondere biologische fenotype (s).
Studies zoals die uitgevoerd door Wada en collega's gebruikt microbead implantatie om het effect van verhoogde Hedgehog signalering in het skelet patroonvorming in de voorste neurocranium (ANC) in zebravis 23 bepalen. Eerdere studies hebben aangetoond dat Shh noodzakelijk is voor de vorming van 14 ANC. Met behulp van Shh-gecoate microbolletjes onderzoekers geïdentificeerd dat dit signaal bevordert de vorming van kraakbeen in het ANC. De microbeads implantatie proces werd gebruikt om een duidelijk verband tussen Hedgehog signalering en vorming van kraakbeen in het ANC te tonen. Een ander belangrijk voorbeeld van dit weefsel manipulatie techniek in de zebravis is waargenomen in studies waar wetenschappers onderzochten de transcriptionele controle van de Erythroblastoma zesentwintig (ETS) domein facteurs ETS-gerelateerde molecuul (ERM) en Polyoma enhancer activator 3 (Pea3) door Fgf signalering tijdens de vroege ontwikkeling van de hersenen zebravis 19. Door microbeads implantatie experimenten, waren ze in staat om te laten zien dat Fgf8 en Fgf3 ectopisch kunnen activeren uitdrukking van erm en pea3. Deze voorbeelden illustreren het nut van microbolletjes aan inzicht in de ontwikkelingsmechanismen die samenwerken tijdens weefselvorming, die kunnen worden goed gekenmerkt door het gebruik van werkwijzen om genexpressie 41 te beoordelen. Aldus kan microbead transplantatie een levensvatbare methode voor andere weefsels, zoals de tussenliggende mesoderm (IM) dat tot de nier geeft verkennen. Concreet zou het helpen bij renale ontwikkelingsstudies, om te onderzoeken hoe de verschillende moleculen beïnvloeden nefron segmentatie 42 en tubulogenesis 43,44, processen die slechts oppervlakkig worden begrepen op dit moment. Voorts heeft microbead implantatie begonnen was gebruikt study regeneratieprocessen in zebravis 29] en kunnen worden aangepast voor gebruik met een willekeurig aantal orgaanregeneratie modellen, zoals na laserablatie van embryonale weefsels zoals het nefron 45 of in combinatie met methoden die zijn opgesteld om onderzoek te doen met de corresponderende volwassen structuren 46-49. Tenslotte microkraal implantatie heeft het potentieel om te worden gebruikt in modellen van menselijke ziekte, zoals kanker of weefsel degeneratie 50,51 52,53.
In het huidige protocol, tonen we de methode van microbead implantatie in de zebravis embryo's, die ook op soortgelijke wijze is beschreven door andere onderzoekers, maar niet weergegeven door middel van video-protocollen 1. Met minimale praktijk waren we in staat om microbolletjes te implanteren in een tempo van ongeveer 8-10 embryo / uur, die de haalbaarheid van deze procedure heeft betrekking zodra de onderzoeker heeft wat ervaring. De hierin getoonde resultaten demonstreren dat kralen van verschillende dimensions geïmplanteerd kan worden in een vroeg stadium en die voorzichtig, kan deze weefselmanipulatie techniek met minimale fysieke verstoring van de embryo voeren. Een verbetering die moet worden benadrukt is het gebruik van een haar / zweep instrument om de microkraal te positioneren in de embryo. Deze relatief goedkope en eenvoudige uitrustingsstuk ongeveer dezelfde diameter als de microbeads, gemakkelijk te verkrijgen en versnelt het implantatieproces. De snorhaar / zweep kan naar een gewenste lengte worden gesneden om een stevige produceren nog delicate kraal behandeling tool, afhankelijk van de onderzoeker behendigheid en voorkeur. Tot slot, terwijl we hier hoe fysiek manipuleren microbolletjes en zebravis embryo's te implanteren voeren beschreven, dit protocol geen specifieke behandeling procedures voor verschillende drugs of peptiden te schetsen. In het algemeen moeten chemisch behandeld microkralen worden geïmplanteerd in het dier met wenselijk om ongewenste effecten in andere gebieden van het organisme te voorkomen en onderzoekers moeten goed ingevormd over de mogelijke bezorgdheid over de veiligheid in verband met een dergelijke chemicaliën voor het begin van hun studie.
Samengevat, hebben we een betrekkelijk eenvoudige en efficiënte microbead implantatie methode uiteenlopende toepassingen gebruikt materialen die gemakkelijk beschikbaar in het laboratorium worden gedemonstreerd. Uiteindelijk hopen we dat deze handleiding onderzoekers zal helpen met het delicate karakter van de zebravis weefsel manipulatie.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie DP2OD008470.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | American Bioanalytical | AB01915 | |
| Potassium Chloride | American Bioanalytical | AB01652 | |
| Calcium Chloride | American Bioanalytical | AB00366 | |
| HEPES | Sigma Life Science | H4034 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Sigma-Aldrich | P4333-20ML | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Aldrich Chemistry | P7629 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine) | Fluka Analytical | A5040 | |
| Borosilicate glass | Sutter Instruments Co. | BF100-50-10 | |
| Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments Co. | Mo. P097 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| 250 ml Erlenmeyer Flask | Fischer Scientific | FB-500-250 | |
| Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile | Corning | 430167 | |
| 60 mm x 15 mm | VWR | 25373-085 | |
| 100 mm x 15 mm | VWR | 25373-100 | |
| 150 mm x 15 mm | VWR | 25373-187 | |
| Saint-Gobain Chemware Microspatula | Fischer Scientific | 21-401-50B | |
| P-1000 Micropipette tips | Fischer Scientific | 2707402 | |
| Low Temperature Incubator | Fischer Scientific | 11 690 516DQ | |
| Dimethly Sulfoxide | American Bioanalytical | AB00435 | |
| Microbeads (45-106 µm) | Biorad | 140-1454 AG1-X8 | |
| Microbeads (45 µm) | Polysciences | 7314 | |
| Micro Dissecting Tweezer | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | |
| Tungsten Needle | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6065 | |
| Capillary tube holder | Globe Scientific Inc. | 51674 |
References
- Lieschke, G. J., et al.
- Wilson, J., Tucker, A. S. Fgf and Bmp signals repress the expression of Bapx1 in the mandibular mesenchyme and control the position of the developing jaw joint. Dev Biol. 266, 138-150 (2004).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341 (2012).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
- Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish. Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).
- Amsterdam, A., Hopkins, N. Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease. Trends Genet. 22, 473-478 (2006).
- Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl Res. 163, 65-78 (2014).
- Kroeger, P. T. Jr, Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization. J Vis Exp. 89, e51708 (2014).
- Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21, 48-64 (2011).
- Auer, T. O., Del Bene, F. CRISPR/Cas9 and TALEN-mediated knock-in approaches in zebrafish. Methods. 69, 142-150 (2014).
- Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proc Natl Acad Sci USA. 97, 12965-12969 (2000).
- Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res C Embryo Today. 93, e52063 (2011).
- Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high–throughput using zebrafish embryos. J Vis Exp. , 52063 (2014).
- Hyatt, G. A., Schmitt, E. A., Marsh-Armstrong, N., McCaffery, P., Dräger, U. C., Dowling, J. E. Retinoic acid establishes ventral retinal characteristics. Development. 122, 195-204 (1996).
- Picker, A., Brand, M. Fgf signals from a novel signaling center determine axial patterning of the prospective neural retina. Development. 132, 4951-4962 (2005).
- Reifers, F., Walsh, E. C., Leger, S., Stainier, D. Y. R., Brand, M. Induction and differentiation of the zebrafish heart requires fibroblast growth factor 8 (fgf8/acerebellar.). Development. 127, 225-235 (2000).
- Raible, F., Brand, M. Tight transcriptional control of the ETS domain factors Erm and Pea3 by Fgf signaling during early zebrafish development. Mech Dev. 107, 105-117 (2001).
- Reim, G., Brand, M. spiel-ohne-grenzen/pou2. mediates regional competence to respond to Fgf8 during zebrafish early neural development. Development. 129, 917-933 (2002).
- Jaszai, J., Reifers, F., Picker, A., Langenberg, T., Brand, M.
- Hirati, Y., Okamoto, H. Canopy1, a novel regulator of FGF signaling around the midbrain-hindbrain boundary in zebrafish. Curr Biol. 16, 421-427 (2006).
- Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
- Abe, G., Ide, H., Tamura, K. Function of FGF signaling in the developmental process of the median fin fold in zebrafish. Dev Biol. 304, 355-366 (2007).
- Prykhozhij, S. V., Neumann, C. J. Distinct roles of Shh and Fgf signaling in regulating cell proliferation during zebrafish pectoral fin development. BMC Dev Biol. 8, 91 (2008).
- Scholpp, S., Brand, M. Endocytosis controls spreading and effective signaling range of Fgf8 protein. Curr Biol. 14, 1834-1841 (2014).
- Hardt, S., et al. The Bmp gradient of the zebrafish gastrula guides migrating lateral cells by regulating cell-cell adhesion. Curr Biol. 17, 475-487 (2007).
- White, R. J., Nie, Q., Lander, A. D., Schilling, T. F. Complex regulation of cyp26a1 .creates a robust retinoic acid gradient in the zebrafish embryo. PLoS Biol. 5, e2522-e2523 (2007).
- Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53, 835-850 (2009).
- Niswander, L., Jeffrey, S., Martin, G. R., Tickle, C. A positive feedback loop coordinates growth and patterning in the vertebrate limb. Nature. 371, 609-612 (1994).
- Laufer, E., Nelson, C. E., Johnson, R. L., Morgan, B. A., Tabin, C. Sonic hedgehog and Fgf-4 act through a signaling cascade and feedback loop to integrate growth and patterning of the developing limb bud. Cell. 79, 993-1003 (1994).
- Tickle, C., Alberts, B., Wolpert, L., Lee, J. Local application of retinoic acid to the limb bud mimics the action of the polarizing region. Nature. 296, 564-566 (1982).
- Samarut, E., Fraher, D., Laudet, V., Gibert, Y. ZebRA: an overview of retinoic acid signaling during zebrafish development. Biochimica et Biophysica Acta. 1849, 73-83 (2015).
- Lengerke, C., et al. Interactions between Cdx genes and retinoic acid modulate early cardiogenesis. Dev Biol. 354, 134-142 (2011).
- Wingert, R. A., et al. The cdx and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
- Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom., and Notch signaling. Dev Biol. 386, 111-122 (2014).
- Cheng, C. N., Wingert, R. A. Nephron proximal tubule patterning and corpuscles of Stannius formation are regulated by the sim1a. transcription factor and retinoic acid in the zebrafish. Dev Biol. 399, 100-116 (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J Vis Exp. , e51604 (2014).
- Cheng, C. N., Wingert, R. A. Chapter 9: Renal system development in the zebrafish: a basic nephrogenesis model. Zebrafish: Topics in Reproduction & Development. Carver, E., Lessman, C. , Nova Scientific Publishers. (2014).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Zebrafish pronephros tubulogenesis and epithelial identity maintenance are reliant on the polarity proteins Prkc iota .and zeta. Dev Biol. 396, 183-200 (1016).
- McKee, R., Gerlach, G. F., Jou, J., Cheng, C. N., Wingert, R. A. Temporal and spatial expression of tight junction genes during zebrafish pronephros development. Gene Expr Patterns. 16, 104-113 (2014).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J Vis Exp. , e2845 (2011).
- McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A.
- McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. , e51644 (2014).
- McCampbell, K. K., Springer, K., Wingert, R. A. Atlas of cellular dynamics during zebrafish adult kidney regeneration. Stem Cells Int. In press, (2015).
- Lee, S. L., et al. Hypoxia-induced pathological angiogenesis mediates tumor cell dissemination, invasion, and metastasis in a zebrafish tumor model. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19485-19490 (2009).
- Rouhi, P., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat Prot. 5, 1911-1918 (2010).
- Cao, R., Jensen, L. D. E., Söll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy. PLoS One. 3, e2748 (1371).
- Cao, Z., et al. Hypoxia-induced retinopathy model in adult zebrafish. Nat Prot. 5, 1903-1910 (2010).
