Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Mikro Implantasjon i sebrafisk Embryo

Published: July 30, 2015 doi: 10.3791/52943
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

Abstract

Sebrafisk har dukket opp som en verdifull genetisk modellsystem for studier av utviklingsbiologi og sykdom. Sebrafisk deler en høy grad av genomisk konservering, så vel som likheter i cellulære, molekylære og fysiologiske prosesser, med andre virveldyr, inkludert mennesker. Under tidlig ontogeny, sebrafisk embryo er optisk transparent, slik at forskerne å visualisere dynamikken i organ hjelp av et enkelt stereomikroskop. Mikro implantasjon er en metode som gjør det mulig vev manipulasjon gjennom endring av faktorene i lokale miljøer. Dette gjør det mulig for forskere å analysere effektene av hvilket som helst antall signalmolekyler av interesse, slik som utskilles peptider, på bestemte romlige og tidsmessige punkter innenfor utvikling av embryo. Her har vi detalj en protokoll for å manipulere og implantat perler under tidlig sebrafisk utvikling.

Introduction

Utviklingsbiologi forskerne utnytte en lang rekke cellulære, molekylære og genetiske metoder for å avdekke de mekanismene som styrer hvordan en organisme er dannet. Blant disse metodene, er vev manipulasjon et viktig verktøy i å tyde komplekse spørsmål om celle skjebne, cellulær bevegelse, og organisering av vev. En måte å endre de lokale vev miljøer er gjennom den kirurgiske anvendelsen av mikroperler som brukes til å levere en fokal kilde for proteiner eller andre signalmolekyler 1. Denne type av eksperimentell manipulasjon har vært mye implementert i klassiske virveldyr embryologi modeller, slik som frosk og chick 2.

Sebrafisk er blitt et viktig virveldyr modellorganisme for studier av organ og gir også mange unike fordeler for sykdom modellering 3-5 som de deler med høy genetisk bevaring med mennesker 6. Spesielt, den optiske gjennomsiktighet og exintern utvikling av sebrafisk embryo tilbyr en uovertruffen synspunkt for observasjon av vev ontogeny 3-5. Gjennomføringen av store termin genetiske skjermer har generert en kraftig oppbevaringssted for sebrafisk mutantstammer for videre studier 7,8, og identifisering av alternative screeningteknikker som kan effektivt gjennomført med redusert skala i enkle laboratorier 9,10. Videre eksperimentelt arbeid med sebrafisk har blitt tilrettelagt gjennom fremskritt i transgene metoder og reversere genetiske tilnærminger 11,12, samt kjemiske genetikk 13-15.

Tissue manipulasjonsteknikker, slik som innføringen av mikroperler, ikke vært så vidt anvendt i sebrafisk, men likevel gi et nyttig verktøy for ytterligere å forstå cellesignalisering i løpet av utviklingen. Mikroperler implantasjon har blitt brukt til å avhøre prosesser av organdannelse i sebrafisk retina16,17, hjerte 18, hjerne 19-22, neural crest 23, og fin 24,25. I disse og andre studier har perlene er anvendt under utvikling for å forstå spredning av signalmolekyler 26, hvor gradienter påvirker cellemigrering 27 og 28 aksialt mønster. Mer nylig, har mikroperlene blitt benyttet for å evaluere restitusjon mekanismer i voksne sebrafisk 29. I utviklingsstudier, for eksempel, har sebrafisk mikro arbeid gitt innsikt i mekanismene for lem dannelse gjennom studier av brystfinnen 25. Sebrafisk brystfinnen bud er homolog med forbena knopp i muse 30 og dama 31. Virveldyr lem knopp har to viktige signal noder: sonen av polariserende aktivitet (ZPA) som etablerer anterior-til-posterior aksen gjennom uttrykket av Sonic pinnsvin (Shh) og nedstrøms Hox-gen mål,og den apikale ectodermal ryggen (AER) til stede på tuppen av greinen knopp, som virker å etablere proksimale til distale identitet lem gjennom uttrykk for fibroblastvekstfaktorer (FGF'er). Ved å implantere FGF dynket microbeads i sebrafisk Shh genetiske mutanter, etterforskere identifisert FGF som avgjørende for utviklingen av cellesyklusen og vekst av virveldyr lem 25. I tillegg til den FGF og Shh signaliserer kaskader som etablerer posisjons identitet, banebrytende studier med dama lem bud identifisert retinsyre (RA) som et molekyl som kan etterligne virkningen av polariserende region å etablere anterior til bakre identitet 32. Disse eksperimentene er involvert plassere små strimler av RA-gjennomvåt Whatman papir i chick lem å vurdere sifret mønster 32. Videre har forskere utført på andre elegante studier som anvender bruk av mikroperler, celletransplantasjon, og eksogenRA behandlinger i sebrafisk for å fastslå at RA fungerer for å gi langtrekkende posisjon signaler i sebrafisk hindbrain og mesoderm 28. Men i dag mange spørsmål gjenstår om rollene som signaliserte faktorer som FGF og RA i mange aspekter av virveldyr utvikling. Signaleringseffekter av RA, fungerer som en morphogen, påvirker mange organer 33, som for eksempel å utvikle hjerte 34 og nyrestamfedre, der RA spesifiserer proksimale nyreceller skriver skjebner 35-39. Videre forståelse av slike emner kan ha stor nytte av eksperimentelle studier med vev manipulasjon og mikro implantasjonsteknikk.

Mens færre studier har blitt utført med mikro implantasjon i sebrafisk, i forhold til modeller som chick, har de som har blitt gjennomført vært svært informativ. En årsak til det sparsommelige mikroperlens implantasjon basert-forskning i sebrafisk embryo er likely forestillingen om at det er vanskelige tekniske utfordringer, basert på størrelsen av embryoet, som utgjør et hinder for å kunne utføre slike manipulasjoner. Imidlertid kan mikro implantering i sebrafisk embryo læres med praksis og assistert gjennom visuell observasjon av teknikken, og dermed kan bli ivaretatt som et middel til å avhøre mekanismene for utvikling. Her viser vi nøyaktig påføring av et mikroperler inn i sebrafisk embryo, noe som kan benyttes for gjennomføring av en lang rekke analyser på vev og celledannelse morfogenese.

Protocol

Prosedyrene for arbeid med sebrafisk embryo som er beskrevet i denne protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Notre Dame.

1. Ringers løsning Forberedelse

  1. Foreta en oppløsning av 116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 3,6 mM CaCl2 og 5 mM HEPES med ultrarent H2O ved kontinuerlig omrøring for å unngå enhver saltutfelling.
  2. Etter tilsetning av salter og mens oppløsningen fremdeles under omrøring tilsettes 100 enheter / ml penicillin per og 100 ug streptomycin pr ml.
  3. Etter å legge alle antibiotika og salter, utføre filter sterilisering av løsningen og butikken i steril beholder.
    Merk: N-Phenylthiourea (1-fenyl-2-tiourea) eller PTU kan tilsettes til Ringer-løsning for å blokkere dannelsen av pigment i bead implantert embryoer uten negative konsekvenser for helsen embryo. For å forberede Ringers / pigmentering blokkering løsning, bruk en konsennen på 0,003% PTU. På grunn av den lave konsentrasjonen av PTU som skal legges det anbefales at et større volum av Ringers løsning gjøres, minst 1 L, for å unngå å legge ørsmå mengder av PTU pulver. Legg PTU under trinn 1.2, mens oppløsningen under omrøring.

2. Tricaine Solution Forberedelse

  1. Tilsett 2 g etyl-3-aminobenzoat metansulfonatsaltet (Tricaine) per liter oppløsning pluss 0,1 M Tris, fra en 1 M stam balansert til en pH-verdi på 9,5 og laget med ultrarent H2O
    Merk: Tricaine vil bli brukt til å avlive de sebrafisk embryo på ønsket tidspunkt å analysere perle implantasjon fenotyper.

3. E3 Solution Forberedelse

  1. Lag en løsning av 0,25 M NaCl, 10 mM KCl, 12,5 mM CaCl2, og 16,6 mM MgSO 4 til 1 liter ultrarent vann for å lage en L av E3.
  2. Tilsett 200 ul av metylenblått til E3 løsningen for å hindre soppvekst.

4. Pulling Nåler for mikro Transfer

  1. Bruk fire polert borsilikatglass med filament ved en OD: 1,0 mm ID: 0,5 mm ved en lengde på 10 cm.
  2. Plasser borosilicated glass inn i en mikropipette avtrekker å forberede fine nåler.
    Merk: Følgende fire dimensjonene kan brukes som et utgangspunkt for å trekke nålene: Varme = 540, Pull = 245, Velocity = 200, og Time = 125.
  3. Etter å ha tatt et tilstrekkelig antall nåler, butikk i dekket plast petriskåler, plassert på strimler av modelleire eller teip for å hindre bryte nålespissen, inntil bruk.
  4. Slik klipper nålespissen til boringen ønsket størrelse, bruke et par fine tang å score på slutten av nålen.
    Merk: Needle bore størrelse vil variere avhengig av mikrostørrelse blir benyttet samt brukerhåndtering preferanser. Et godt utgangspunkt er å håndverket bore størrelser i et område mellom 100 og 200 mikrometer hvis microbeads spenner 50-100 mikrometer vil bli utnyttet.
  5. Prior å bruke, sett trimmet nålen inn i kapillarrør holder til mote gjennomført mikro overføring instrument.

5. Whisker / Lash Tool Forberedelse

  1. Skaff en whisker, piske, eller andre små ennå fast stykke naturlig eller syntetisk hår filament. Skjær nær bunnen av filamentet ved en 45 ° vinkel. Følge whisker til en P-1000 mikropipette tips ved å bruke permanent klar tape lim.

6. mikro Implantasjon Tray Forberedelse

  1. Bland 2 g agarose med 100 ml E3 løsning for å gjøre en 2% agarosegel E3.
  2. Varm 2% agarose-løsning i 1 minutt og 30 sekunder i en 250 ml erlenmeyerkolbe, virvlende kolben hvert 30 sek, for å unngå at gel fra bobler.
  3. Ta lokket av en 60 mm x 15 mm petriskål og legg den i en større 150 mm x 15 mm tallerken med interiør vendt oppover.
  4. Hell den varme agarosegelen inn i 150 mm x 15 mm petriskål, og pass på å forankre nedlokket på mindre tallerken med pekefingeren.
    Merk: La et tynt lag av agarose under lokket på mindre fatet for å fjerne kondens som dannes når helle-gel; Dette vil gjøre det lettere å se perlene under et mikroskop disseksjon.
  5. Som agarosen kjøler, men før det stivner, plasserer et godt mold på gel. Dette vil gi rom for lettere plassering av embryoene.
  6. Bemerk: For å unngå bobler i brønnene, plassere formen langsomt i en vinkel til det er flytende på toppen av gelen.
  7. Ved hjelp av en microspatula, forsiktig fjerne godt mold når gelen har stivnet. Legg E3 løsning og oppbevares ved 4 ° C.

7. Embryo Collection

  1. Forbered parring kamre, atskilt med skillevegger, ved å fylle dem opp med system vann, og deretter plassere voksen sebrafisk hann (er) og kvinnelige (s) parene i kamrene O / N.
  2. Samle befruktede egg ved hjelp av en fin netting sil (embryonale stadier vil variere litt).
  3. Deponere de befruktede eggene i en ren, 10 cm diameter petriskål ved å snu silen opp ned og skylle den med en fin strøm av E3 til det ikke er egg igjen i silen, og det ca 25 ml E3 løsning i fatet.
  4. Etter samlingen, dele eggene i flere retter (ca 50-60 egg per parabol) for å unngå overbefolkning, noe som kan føre til utviklings asynchrony innenfor clutch og foreta innsamling ønskede ganger punkter vanskelig.
  5. Inkuber embryo i E3 løsning på 28,5 ° C for å muliggjøre utviklings vurdering i henhold til standarden sebrafisk iscenesettelsen serien 40.
    Merk: embryoer skal overføres til E3 / PTU på 24 timer etter befruktning (HPF) for å hindre pigment utvikling hvis manipulasjoner på eldre stadier nødvendig optisk klarhet.

8. Bead Implantasjon

  1. Inkuber mikroperlene i ønsket testmolekylet konsentrasjon eller det tilsvarende kjøretøy solution for den nødvendige tid i et passende volum.
    Merk: forskeren kan bruke sterile Petri-skåler som strekker seg 3-6 cm i diameter, eller multi-brønnplater, som begge muliggjør visualisering av mikroperlene i løsningen. Tiden kan variere, avhengig av type og mengde molekyl av interesse, og forskeren bør referere til produsent eller publisert anbefalinger for inkubasjonsvarigheten og andre aspekter som følsomhet for lys og temperatur.
  2. Når embryoene har nådd ønsket utviklings tidspunkt, fjerne embryoer fra sine chorions bruker fine tang.
  3. Inkuber embryoene i den filtrerte Ringer-løsning med antibiotika i 10 minutter for å akklimatisere dem til løsningen.
  4. Mens embryoene acclimating, overføre mikroperler inn i mikroplaten ligger innenfor implantasjon skuffen og skyll dem i Ringer løsning for 10 min.
    Merk: Implanter perlene innen 50 min etter å ha nådd dette punktet. Dette will redusere sannsynligheten for at en skal implanteres en vulst med en mindre konsentrasjon av molekylet av interesse.
  5. Array embryoene i brønnene på mikro implantasjon skuffen, ta vare å orientere dem slik at området av interesse der mikroperlens vil bli implantert er tilgjengelig.
  6. Lag et lite snitt på embryo ved hjelp av tungsten nål.
  7. Overføre en mikro på embryo ved hjelp av microcapillary overføringspipetten: deprimerende pære av pipette, dra forsiktig mikroperlens inn i kapillarkolonne, og slipp trykket for å overføre mikro på ønsket destinasjon.
  8. Bruk whisker / snert verktøy for å posisjonere mikro inne i embryo. Merk: Sørg for å plassere mikroperlens inn i vevet bort fra stedet av snittet så mikroperlens ikke vil bli utvist fra embryo som det gror.

Representative Results

Flere typer manipulasjon verktøy er nyttige for håndtering microbeads under forskningssøknader (figur 1). I tillegg kan en enkelt agarose mold med små brønner benyttes til å holde sebrafisk embryo, som er viktig for å utføre disse forsøkene på en riktig og effektiv måte (figur 1). Implantasjon av en mikroperler kan utføres ved den romlige posisjon og tidsmessige stadiet av interesse, noe som gjør det mulig for forskere å begrense et bestemt vindu handling for molekylet av interesse.

Her ble enkelt microbeads implantert i sebrafisk embryo på halen knopp scenen eller på senere tidspunkter i løpet somitogenesen stadier (figur 3). To forskjellige størrelser mikro, renset med Ringers løsning alene, ble anvendt i denne protokollen demonstrasjonen (figur 3A, 3B og 3C). Denne mikroperler implantering i fravær av en hvilken som helst konjugertsmå molekyler viser at perle implantasjon kan oppnås uten brutto morfologiske effekter under riktig utvikling av sebrafisk embryo (figur 4).

Den experimentalist kan oppstå problemer med manøvrering mikroperlens inn i punktering hull laget av en tungsten nål oppå embryo. For å oppnå bedre håndtering av mikroperlen når plassert på embryo av mikro-nål, kan en whisker / lash verktøyet brukes. Dette kan være laget med naturlig skur feline eller canine værhår, selv om andre naturlige eller syntetisk snert filamenter kan benyttes (figur 1). Et lett trykk på mikroperler med enten wolfram ålen eller whiskers-verktøyet skal se mikro synke ned i Ringers løsning av formen. Når mikroperlen har sunket ned i formen det skal flyttes over store avstander, eventuelt ved hjelp av wolfram nål og en gang på toppen av embryo nålen eller whiskers verktøyet kan brukes til posisjoneringn mikroperlens inn embryo. Suksessen til mikroperlen implantering umiddelbart kan avleses gjennom visualisering ved et stereomikroskop, da perlen vil forbli stabilt posisjonert i vevet. For å evaluere bead stilling over tid, kan hver embryo prøven avbildes gjennom live tidsforløpet fotografering eller kontrolleres med jevne mellomrom (som vist i figur 4) for å sikre at vulsten plassering ikke har forskjøvet seg over varigheten av forsøket på grunn av endogent vev morphogenesis. Forståelse av posisjonen av vulsten over tid er kritisk for den mest informert tolkningen av resultatene, slik som å evaluere effekten av et lite molekyl på et målvev eller utviklingsprosess.

Bruken av disse ovennevnte tiltakene vil gi et ideelt miljø for å imbed microbeads inn i sebrafisk embryo på ønsket tidspunkt og posisjon. I vår erfaring, uerfarne brukere av denne mikro implantasjon protokollen typisk fått ferdighet necessary å utføre konsekvent kirurgisk implantering av mikroperler inn i sebrafisk embryo etter ca én uke med praksis.

Figur 1
Figur 1. Verktøy som brukes til å utføre mikro implantasjon. (A) Perle implantasjon skuffen (venstre, 15 cm diameter) med embryo muggsopp (til venstre) og en mikro inkubasjon brett (på høyre, 6 cm diameter). Dette gjør det mulig å arbeide skuffen forskeren til å plassere embryoene i ønsket retning for mikro implantering, og for å få de fremstilte mikroperlene for implantering i umiddelbar nærhet på mikroskop stasjonen. Mikroperler bør inkuberes i lite molekyl (er) og / eller kjøretøy, og deretter skylles i en separat mikroplate (høyre) før den plasseres i vulsten implantasjon brett som er plassert under mikroskop stasjonen. (B) To par fin pinsett vil bli brukt til å fjerne choripå omgir hver sebrafisk embryo, og også for å bryte den enden av microcapillary nålen. (C) en wolfram nål blir benyttet for å lage en meget fin punktering i sebrafisk embryo som å plassere mikroperle. (D) microcapillary overføringspipetten vil bli brukt til å plukke opp og plassere en mikro på toppen av sebrafisk embryo nærheten av stedet for punktering. (E) Den whisker / vippe verktøyet lar den milde posisjonering av mikroperlens inn innsnitt området innenfor embryo som tidligere ble gjort av wolfram nål. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Skjematisk av mikroperler implanteringsoperasjon. (A) En mikro implantering brett med mikroperler soaking i ønsket vaskeløsningen er satt opp under en stereo stasjon, og embryoene posisjonert med vev vendt oppover. (B) ved hjelp av en wolfram nål, kan et lite snitt inn i embryo fremstilles med en liten men likevel kraftig bevegelse. (C) Ved hjelp av en microcapillary transfer pipette, kan den ønskede mikro bli plukket opp fra mikro inkubasjon kammeret i skuffen, som ligger på høyre side, og førte til venstre rommet hvor embryoet arbeidsområdet ligger. Mikroperlens skal deponeres i nærheten av området av snittet, deretter forsiktig plassert i innsnitt området gjort av tungsten nål med whisker / vippe verktøyet. Når en mikroperler blir manøvrert inn i det innsnitt området, bør det være gjemt i vevet (bort fra innsnittet) for å plassere mikro stabilt og forhindre påfølgende bevegelse ut av embryoet som utviklingen fortsetter. Please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Microbeads kan implanteres inn i embryoer på forskjellige utviklingsstadier. (A) sebrafisk embryoer ble implantert med en mikroperle (diameter på omtrent 50 um) i stammen på halen knopp trinnet. Når undersøkt ved 24 timer etter implantering vulst (hpbi), hadde embryoene utviklet seg normalt og viste mikro minimal bevegelse under passering av utviklings tid. (B) sebrafisk embryoer implantert med mikrokuler (med en diameter på omtrent 50 um) i plommesekken på 3 somitt trinn (ss) viste normal utvikling med relativt liten vulst bevegelse over tid. (C) større mikroperler (diameter ca. 70 mm) ble implantert i 7 ss embryoet på lignende måte viste normal senere utvikling, samt minimal hvis noen bevegelse fra implantasjonsstedet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Gross utvikling av sebrafisk embryo er uaffisert av tilstedeværelsen av en mikroperler gjennom 72 hpbi. Sebrafisk embryoer ble implantert med mikroperler fuktet i Ringers løsning (med en diameter på ca. 50 pm) ved 7 somitt trinn (ss). Hver mikro ble kirurgisk satt inn i bagasjerommet, mellom somites 3 ​​og 4. Tilstedeværelsen av perlen var ikke assosiert med utilslørt utviklingsmessige defekter ved 24 timer etter perle implantat (hpbi), 48 hpbi, eller 72 hpbi. Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Discussion

I løpet av det siste århundret, har forståelsen av kroppen plan mønster og organogenesen gått monumentale fremskritt. Vev manipulasjonsteknikker var kritisk i avdekke nøkkelinformasjon om disse vitale prosesser. Genetisk modifikasjon er en av de mest brukte metoder for å fastslå genfunksjon, og fremgangsmåter for mosaikk analyse, slik som celletransplantasjon, gi nyttige metoder for å forstå autonomi av genfunksjon. Mikro implantasjon gir en annen arena å avhøre hvordan bestemte molekyler endre dynamikken utviklings, da denne metoden gjør det mulig for forskeren å endre en lokal vev miljø ved å innføre signalmolekyler eller hemmere. En rekke forskjellige mikro er kommersielt tilgjengelige, som har varierende størrelse og andre fysiske egenskaper finnes (for eksempel ladning), slik at de kan anvendes til de forsøksbetingelser av interesse. Således, ved å implantere mikroperler som er fuktet i et protein eller kjemical av interesse i en organisme, kan forskere undersøke lokaliserte effekter under utvikling og finne assosiasjoner mellom genet eller molekylet av interesse, og spesielt biologisk fenotype (r).

Studier som en utført av Wada og kolleger brukte mikro implantasjon for å vurdere effekten av økt Hedgehog signalisering i skjelett mønster i fremre neurocranium (ANC) i sebrafisk 23. Tidligere studier har vist at Shh er nødvendig for ANC formasjonen 14. Identifiseres ved hjelp Hysj-belagt mikro forskere at dette signalet fremmer bruskdannelse i ANC. Mikroperlens implantasjon prosessen ble brukt til å demonstrere en klar sammenheng mellom Hedgehog signalering og bruskdannelse i ANC. En annen viktig eksempel på dette vevet manipulasjon teknikk i sebrafisk er observert i studier der forskere undersøkt transkripsjons kontroll av Erythroblastoma tjueseks (ETS) domene fskuespillere ETS-relaterte molekyl (Erm) og Polyoma Enhancer aktivator 3 (Pea3) av FGF signale under tidlig sebrafisk hjernens utvikling 19. Gjennom mikro implantasjon eksperimenter, var de i stand til å vise at Fgf8 og Fgf3 kan ectopically aktivere uttrykk for erm og pea3. Disse eksempler illustrerer anvendeligheten av mikroperler for å gi innsikt i den utviklingsmessige mekanismer som samarbeider under dannelse vev, som kan være godt kjennetegnes ved bruk av metoder for å vurdere genekspresjon 41. Således kan mikro transplantasjon være en levedyktig metode for å utforske andre vev, slik som det mellomliggende mesoderm (IM), som gir opphav til nyrene. Spesielt ville det hjelpe til nyreutviklingsstudier, for å undersøke hvordan ulike molekyler påvirker nephron segmentering 42 og tubulogenesis 43,44, prosesser som bare overfladisk forstått i dag. Videre har mikro implantering begynt å bli brukt til study regenereringsprosesser i sebrafisk 29] og kan tilpasses for bruk med en rekke organ restitusjon modeller, for eksempel følgende laser ablasjon av embryonale vev som nephron 45 eller sammen med metoder som har blitt formulert for å utføre forskning med de tilsvarende voksne strukturer 46-49. Endelig har mikro implantasjon potensiale til å bli brukt i modeller av human sykdom, slik som kreft eller vev degenerasjon 50,51 52,53.

I den foreliggende protokoll, vi demonstrere metoden for mikro implantasjon i sebrafisk embryo, som også har blitt tilsvarende beskrevet av andre forskere, men ikke vist gjennom video protokoller 1. Med minimal praksis kunne vi implantere mikroperler på en omtrentlig hastighet på 8-10 embryo / t, noe som er relatert gjennomførbarheten av denne prosedyren når forskeren har litt erfaring. Resultatene vist heri Resultatene viser at perler av forskjellige dimensions kan implanteres på tidlige stadier, og det med omhu, kan dette vevet manipulasjon teknikk gjennomføres med minimal fysisk avbrudd i embryo. En forbedring som bør fremheves er bruk av en whisker / lash-verktøyet for å plassere mikro inn i embryo. Denne forholdsvis billig og enkelt stykke utstyr er omtrent den samme diameter som den mikroperle, er lett å få tak i og bidrar til å fremskynde prosessen implantasjon. Den whisker / vippe kan kuttes til ønsket lengde for å produsere et fast ennå delikat perle-håndtering verktøy, avhengig av forsker fingerferdighet og preferanser. Til slutt, mens vi som beskrives her hvordan du fysisk manipulere microbeads og sebrafisk embryo å utføre implantering, denne protokollen ikke skissere konkrete behandlingsprosedyrer for ulike medikamenter eller peptider. Generelt bør kjemisk behandlede mikrokuler bli implantert i dyret med hensiktsmessighet, for å unngå uønskede virkninger på andre områder i organismen, og forskere bør være godt idannet om mulige sikkerhetsproblemer forbundet med slike kjemikalier før du starter sine studier.

I sum har vi vist en relativt enkel og effektiv mikro implantasjon metode med et bredt spekter av applikasjoner ved hjelp av materialer som er lett tilgjengelig i laboratoriet. Til syvende og sist, håper vi at denne håndboken vil hjelpe forskere med delikat natur sebrafisk vev manipulasjon.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH stipend DP2OD008470.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride American Bioanalytical AB01915
Potassium Chloride American Bioanalytical AB01652
Calcium Chloride American Bioanalytical AB00366
HEPES Sigma Life Science H4034
Penicillin-Streptomycin solution Sigma-Aldrich P4333-20ML
N-Phenylthiourea (PTU) Aldrich Chemistry P7629
Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine) Fluka Analytical A5040
Borosilicate glass Sutter Instruments Co. BF100-50-10
Flaming/Brown Micropipette puller Sutter Instruments Co. Mo. P097
UltraPure Agarose Invitrogen 15510-027
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506
Methylene Blue Sigma-Aldrich M9140
250 ml Erlenmeyer Flask Fischer Scientific FB-500-250
Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile Corning 430167
60 mm x 15 mm VWR 25373-085
100 mm x 15 mm VWR 25373-100
150 mm x 15 mm VWR 25373-187
Saint-Gobain Chemware Microspatula Fischer Scientific 21-401-50B
P-1000 Micropipette tips Fischer Scientific 2707402
Low Temperature Incubator Fischer Scientific 11 690 516DQ
Dimethly Sulfoxide American Bioanalytical AB00435
Microbeads (45-106 µm) Biorad 140-1454 AG1-X8
Microbeads (45 µm) Polysciences 7314
Micro Dissecting Tweezer Roboz Surgical Instruments Co. RS-5010
Tungsten Needle Roboz Surgical Instruments Co. RS-6065
Capillary tube holder Globe Scientific Inc.  51674

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lieschke, G. J., et al. Tissue micromanipulation in zebrafish embryos. Zebrafish, Methods in Molecular Biology. 546, (2009).
  2. Wilson, J., Tucker, A. S. Fgf and Bmp signals repress the expression of Bapx1 in the mandibular mesenchyme and control the position of the developing jaw joint. Dev Biol. 266, 138-150 (2004).
  3. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  4. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
  5. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341 (2012).
  6. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
  7. Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish. Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).
  8. Amsterdam, A., Hopkins, N. Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease. Trends Genet. 22, 473-478 (2006).
  9. Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl Res. 163, 65-78 (2014).
  10. Kroeger, P. T. Jr, Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization. J Vis Exp. 89, e51708 (2014).
  11. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21, 48-64 (2011).
  12. Auer, T. O., Del Bene, F. CRISPR/Cas9 and TALEN-mediated knock-in approaches in zebrafish. Methods. 69, 142-150 (2014).
  13. Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proc Natl Acad Sci USA. 97, 12965-12969 (2000).
  14. Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res C Embryo Today. 93, e52063 (2011).
  15. Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high–throughput using zebrafish embryos. J Vis Exp. , 52063 (2014).
  16. Hyatt, G. A., Schmitt, E. A., Marsh-Armstrong, N., McCaffery, P., Dräger, U. C., Dowling, J. E. Retinoic acid establishes ventral retinal characteristics. Development. 122, 195-204 (1996).
  17. Picker, A., Brand, M. Fgf signals from a novel signaling center determine axial patterning of the prospective neural retina. Development. 132, 4951-4962 (2005).
  18. Reifers, F., Walsh, E. C., Leger, S., Stainier, D. Y. R., Brand, M. Induction and differentiation of the zebrafish heart requires fibroblast growth factor 8 (fgf8/acerebellar.). Development. 127, 225-235 (2000).
  19. Raible, F., Brand, M. Tight transcriptional control of the ETS domain factors Erm and Pea3 by Fgf signaling during early zebrafish development. Mech Dev. 107, 105-117 (2001).
  20. Reim, G., Brand, M. spiel-ohne-grenzen/pou2. mediates regional competence to respond to Fgf8 during zebrafish early neural development. Development. 129, 917-933 (2002).
  21. Jaszai, J., Reifers, F., Picker, A., Langenberg, T., Brand, M. Isthmus-to-midbrain transformation in the absence of midbrain-hindbrain organizer activity. Development. 130, 6611-6623 (2003).
  22. Hirati, Y., Okamoto, H. Canopy1, a novel regulator of FGF signaling around the midbrain-hindbrain boundary in zebrafish. Curr Biol. 16, 421-427 (2006).
  23. Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
  24. Abe, G., Ide, H., Tamura, K. Function of FGF signaling in the developmental process of the median fin fold in zebrafish. Dev Biol. 304, 355-366 (2007).
  25. Prykhozhij, S. V., Neumann, C. J. Distinct roles of Shh and Fgf signaling in regulating cell proliferation during zebrafish pectoral fin development. BMC Dev Biol. 8, 91 (2008).
  26. Scholpp, S., Brand, M. Endocytosis controls spreading and effective signaling range of Fgf8 protein. Curr Biol. 14, 1834-1841 (2014).
  27. Hardt, S., et al. The Bmp gradient of the zebrafish gastrula guides migrating lateral cells by regulating cell-cell adhesion. Curr Biol. 17, 475-487 (2007).
  28. White, R. J., Nie, Q., Lander, A. D., Schilling, T. F. Complex regulation of cyp26a1 .creates a robust retinoic acid gradient in the zebrafish embryo. PLoS Biol. 5, e2522-e2523 (2007).
  29. Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53, 835-850 (2009).
  30. Niswander, L., Jeffrey, S., Martin, G. R., Tickle, C. A positive feedback loop coordinates growth and patterning in the vertebrate limb. Nature. 371, 609-612 (1994).
  31. Laufer, E., Nelson, C. E., Johnson, R. L., Morgan, B. A., Tabin, C. Sonic hedgehog and Fgf-4 act through a signaling cascade and feedback loop to integrate growth and patterning of the developing limb bud. Cell. 79, 993-1003 (1994).
  32. Tickle, C., Alberts, B., Wolpert, L., Lee, J. Local application of retinoic acid to the limb bud mimics the action of the polarizing region. Nature. 296, 564-566 (1982).
  33. Samarut, E., Fraher, D., Laudet, V., Gibert, Y. ZebRA: an overview of retinoic acid signaling during zebrafish development. Biochimica et Biophysica Acta. 1849, 73-83 (2015).
  34. Lengerke, C., et al. Interactions between Cdx genes and retinoic acid modulate early cardiogenesis. Dev Biol. 354, 134-142 (2011).
  35. Wingert, R. A., et al. The cdx and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
  36. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  37. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
  38. Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom., and Notch signaling. Dev Biol. 386, 111-122 (2014).
  39. Cheng, C. N., Wingert, R. A. Nephron proximal tubule patterning and corpuscles of Stannius formation are regulated by the sim1a. transcription factor and retinoic acid in the zebrafish. Dev Biol. 399, 100-116 (2015).
  40. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  41. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J Vis Exp. , e51604 (2014).
  42. Cheng, C. N., Wingert, R. A. Chapter 9: Renal system development in the zebrafish: a basic nephrogenesis model. Zebrafish: Topics in Reproduction & Development. Carver, E., Lessman, C. , Nova Scientific Publishers. (2014).
  43. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Zebrafish pronephros tubulogenesis and epithelial identity maintenance are reliant on the polarity proteins Prkc iota .and zeta. Dev Biol. 396, 183-200 (1016).
  44. McKee, R., Gerlach, G. F., Jou, J., Cheng, C. N., Wingert, R. A. Temporal and spatial expression of tight junction genes during zebrafish pronephros development. Gene Expr Patterns. 16, 104-113 (2014).
  45. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J Vis Exp. , e2845 (2011).
  46. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
  47. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. 54, e2839 (2011).
  48. McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. , e51644 (2014).
  49. McCampbell, K. K., Springer, K., Wingert, R. A. Atlas of cellular dynamics during zebrafish adult kidney regeneration. Stem Cells Int. In press, (2015).
  50. Lee, S. L., et al. Hypoxia-induced pathological angiogenesis mediates tumor cell dissemination, invasion, and metastasis in a zebrafish tumor model. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19485-19490 (2009).
  51. Rouhi, P., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat Prot. 5, 1911-1918 (2010).
  52. Cao, R., Jensen, L. D. E., Söll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy. PLoS One. 3, e2748 (1371).
  53. Cao, Z., et al. Hypoxia-induced retinopathy model in adult zebrafish. Nat Prot. 5, 1903-1910 (2010).

Tags

Developmental Biology sebrafisk embryo perle implantasjon vev manipulasjon utvikling organogenesen
Mikro Implantasjon i sebrafisk Embryo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gerlach, G. F., Morales, E. E.,… More

Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (101), e52943, doi:10.3791/52943 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter