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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Microbead Implantação no embrião de peixe-zebra

Published: July 30, 2015 doi: 10.3791/52943
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

Abstract

O peixe-zebra tem emergido como um sistema modelo genético valiosa para o estudo da biologia do desenvolvimento e da doença. Zebrafish compartilhar um elevado grau de conservação do genoma, bem como semelhanças em processos celulares, moleculares, fisiológicos e, com outros vertebrados, incluindo os seres humanos. Durante a ontogenia precoce, embriões de peixe-zebra são opticamente transparentes, permitindo aos pesquisadores visualizar a dinâmica da organogênese usando um microscópio estereoscópico simples. Microbead implante é um método que permite a manipulação do tecido através da alteração de factores no ambiente local. Isto permite que os investigadores para testar os efeitos de qualquer número de moléculas sinalizadoras de interesse, tais como péptidos segregados, em pontos espaciais e temporais específicos dentro do embrião em desenvolvimento. Aqui, nós detalhe um protocolo para a manipular e grânulos de implantes durante o desenvolvimento do peixe-zebra cedo.

Introduction

Pesquisadores Developmental Biology utilizar uma vasta gama de métodos celulares, moleculares e genéticas para descobrir os mecanismos que controlam como um organismo é formado. Entre essas abordagens, manipulação de tecidos é uma ferramenta chave para decifrar questões complexas sobre o destino da célula, movimento celular, ea organização dos tecidos. Uma maneira de alterar a ambientes de tecidos locais é através da aplicação cirúrgica de microesferas que são usados ​​para fornecer uma fonte de foco de proteínas ou outras moléculas de sinalização 1. Esse tipo de manipulação experimental tem sido amplamente implementado em modelos embriologia vertebrados clássicos, como a rã e pintainho 2.

O peixe-zebra tornou-se um importante organismo modelo vertebrado para o estudo da organogênese e também fornece muitas vantagens únicas para a modelagem de doença 3-5 como eles compartilham alta conservação genética com os seres humanos 6. Em particular, a transparência óptica e external desenvolvimento do embrião de peixe-zebra oferece um ponto de vista inigualável para a observação da ontogenia do tecido 3-5. A aplicação de telas genéticos para a frente em grande escala tem gerado um repositório poderoso de estirpes mutantes de peixe-zebra para o estudo mais aprofundado 7,8, e a identificação de técnicas de rastreio alternativos que podem ser eficazmente conduzido à escala reduzida em laboratórios 9,10 individuais. Mais trabalho experimental com peixe-zebra foi facilitada através de avanços nas metodologias de transgênicos e reverter abordagens genéticas 11,12, bem como a genética químicos 13-15.

Técnicas de manipulação de tecidos, tais como a aplicação de micro-esferas, não têm sido tão amplamente empregue no peixe-zebra, mas não obstante constituem uma ferramenta útil para entender melhor a sinalização celular durante o desenvolvimento. Microbead implantação tem sido utilizado para interrogar os processos de formação de órgãos na retina de peixe-zebra16,17, coração 18, 19-22 cérebro, crista neural 23, e fin 24,25. Nestes e em outros estudos, os grânulos foram aplicados durante o desenvolvimento para compreender a difusão de moléculas de sinalização 26, como gradientes afectar a migração de células 27 e 28 axial patterning. Mais recentemente, foram utilizadas microesferas para avaliar os mecanismos de regeneração em adultos zebrafish 29. Em estudos de desenvolvimento, por exemplo, o trabalho microbead peixe-zebra forneceu insights sobre os mecanismos de formação dos membros por meio de estudos da nadadeira peitoral 25. O broto barbatana peitoral peixe-zebra é homóloga à bud membro anterior no rato 30 e 31 de pintinho. O botão do membro vertebrado tem dois nós de sinalização essenciais: a zona de actividade polarizadora (ZPA), que estabelece o eixo anterior-posterior, para, através da expressão de hedgehog Sonic (Shh) e alvos de genes Hox a jusante,e a crista ectodérmica apical (AER) presente na ponta do botão do membro, que actua para estabelecer a identidade proximal distal do membro através da expressão de factores de crescimento de fibroblastos (FGFs). por implante de micropérolas Fgf embebidos em mutantes de peixe-zebra Shh genéticos, investigadores identificado Fgf como essencial para a progressão do ciclo celular e o crescimento do membro 25 de vertebrado. Em adição ao Fgf e Shh cascatas de sinalização que estabelecem identidade posicional, estudos pioneiros utilizando o botão pintainho membro identificado de ácido retinóico (RA) como uma molécula que pode mimetizar a acção da região de polarização para estabelecer a identidade anterior para posterior 32. Esses experimentos envolvidos colocando pequenas tiras de papel Whatman RA-embebido no membro pintainho para avaliar dígito padronização 32. Além disso, os investigadores realizaram outros estudos elegantes que empregam o uso de microesferas, o transplante de células, e exógenoTratamentos da AR em peixe-zebra para determinar que a AR age para fornecer longo alcance pistas posicionais dentro da hindbrain peixe-zebra e mesoderme 28. No entanto, actualmente muitas questões permanecem sobre os papéis de fatores como Fgf e RA sinalização durante vários aspectos do desenvolvimento dos vertebrados. Os efeitos de sinalização de AR, na qualidade de um morfogénio, impactar muitos órgãos 33, tais como o coração em desenvolvimento 34 e os progenitores renais, onde RA especifica células renais proximais tipo destinos 35-39. Ainda mais a compreensão de temas poderiam beneficiar significativamente a partir de estudos experimentais utilizando técnicas de manipulação de tecidos e implantação microbead.

Embora poucos estudos têm sido realizados com o implante de microesferas no peixe-zebra, quando comparado com modelos como o pintainho, aqueles que foram realizadas foram altamente informativa. Uma das razões para a escassez de implantação microbead baseada em investigação no embrião de peixe-zebra é likely a noção de que existem desafios técnicos difíceis, com base no tamanho do embrião, o que constitui um impedimento para a execução de tais manipulações com sucesso. No entanto, a implantação de embriões de peixe-zebra microbead pode ser aprendido com a prática e assistida através da observação visual da técnica, e, portanto, pode ser perseguido como um meio para interrogar os mecanismos de desenvolvimento. Aqui, demonstramos a aplicação precisa de uma micropérola no embrião do peixe-zebra, o qual pode ser utilizado para a realização de uma ampla variedade de ensaios de formação de tecido e morfogénese celular.

Protocol

Os procedimentos para trabalhar com embriões de peixe-zebra descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional na Universidade de Notre Dame.

Preparação de Solução de Ringer 1.

  1. Adicione uma solução de NaCl 116 mM, KCl 2,9 mM, 3,6 mM de CaCl 2, 5 mM de Hepes e com ultrapura H 2 O por meio de agitação contínua para evitar qualquer precipitação de sal.
  2. Após a adição de sais e enquanto a solução ainda está agitação, adicionar 100 unidades / ml de penicilina e por 100 g de estreptomicina por ml.
  3. Depois de adicionar todos os antibióticos e sais, realizar a esterilização filtro da solução e guarde em recipiente estéril.
    Nota: N-feniltioureia (1-fenil-2-tioureia) ou PTU pode ser adicionado à solução de Ringer para bloquear a formação de pigmento na grânulo embriões implantados sem consequências negativas para a saúde do embrião. Para preparar solução de bloqueio / pigmentação de Ringer, use uma concentração de 0,003% PTU. Devido à baixa concentração de UTP a ser adicionado é aconselhável que um maior volume de Solução de Ringer ser feita, pelo menos, um L, para evitar a adição de quantidades minúsculas de pó PTU. Adicionar PTU durante a etapa 1.2, enquanto a solução é agitação.

2. Preparação de Solução tricaina

  1. Adicionar 2 g de cloridrato de 3-aminobenzoato de sal metanossulfonato de (tricaina) por L de solução mais 0,1 M de Tris, a partir de um estoque 1 M equilibrada para um pH de 9.5 e fez ultrapura com H 2 O.
    Nota: tricaina será usado para sacrificar os embriões de peixe-zebra no ponto de tempo desejado para ensaiar fenótipos implantação do grânulo.

3. Preparação de Solução E3

  1. Adicione uma solução de 0,25 M de NaCl, 10 mM de KCl, 12,5 mM de CaCl2, e 16,6 mM de MgSO 4 para 1 L de água ultrapura para criar 1 L de E3.
  2. Adicionar 200 ul de azul de metileno à solução de E3 para inibir o crescimento de fungos.

4. Needles que puxam para Microbead Transferência

  1. Use fogo polido vidro de borosilicato com filamento a uma DO: 1,0 mm ID: 0,5 mm, com um comprimento de 10 cm.
  2. Coloque vidro borosilicated em um extrator micropipeta para preparar agulhas finas.
    Nota: Os quatro dimensões que se seguem podem ser utilizados como um ponto de partida para puxar as agulhas: Calor = 540, Pull = 245, velocidade = 200, Tempo e = 125.
  3. Depois de puxar um número adequado de agulhas, armazenar em plástico coberto placas de petri, posicionados em tiras de massa de modelar ou fita adesiva para evitar a quebra da ponta da agulha, até o uso.
  4. Para cortar a ponta da agulha para o diâmetro desejado, usar um par de fórceps finos para marcar a extremidade da agulha.
    Nota: diâmetro da agulha pode variar, dependendo do tamanho micropérola a ser utilizado, bem como as preferências de manuseamento utilizador. Um bom ponto de partida é diâmetros ofício em um intervalo entre 100 e 200 mm se microesferas que vão 50-100 mm será utilizado.
  5. Prior de usar, inserir a agulha aparado no suporte do tubo capilar para formar o instrumento de transferência microbead concluída.

5. Bigode / Lash ferramenta de preparação

  1. Obter um triz, chicote, ou outra peça ainda pequena empresa de filamento de cabelo natural ou sintético. Cortar perto da base do filamento num ângulo de 45 °. Aderir a suiça a uma ponta micropipeta P-1000 usando cola permanente adesivo transparente.

6. Microbead Implantação Bandeja Preparação

  1. Misturar 2 g de agarose com 100 ml de solução de E3 para fazer um 2% de gel de agarose E3.
  2. Aquece-se a solução de agarose a 2% durante 1 minuto e 30 segundos num balão de Erlenmeyer de 250 mL, agitando o frasco a cada 30 segundos, a fim de evitar que o gel de borbulhando.
  3. Tirar a tampa de 60 mm x 15 milímetros placa de Petri e coloca-se numa maior 150 milímetros x 15 milímetros prato com o interior voltado para cima.
  4. Despeje o gel de agarose quente na 150 milímetros x 15 mm placa de Petri, certificando-se de ancorar-sea tampa da placa de menor com o dedo indicador.
    Nota: Permitir uma fina camada de agarose de baixo da tampa do prato menor para remover a condensação que se formam quando se vaza o gel; isso fará com que as contas mais fáceis de ver sob um microscópio de dissecção.
  5. Como a agarose arrefece, mas antes que solidifique, colocar um molde bem no gel. Isto irá permitir a fácil colocação dos embriões.
  6. Nota: A fim de evitar bolhas nos poços, coloca o molde lentamente num ângulo até ser flutuante no topo do gel.
  7. Usando um microspatula, remova cuidadosamente o bem molde uma vez que o gel tem solidificado. Adicionar solução E3 e armazenar a 4 ° C.

Coleção 7. Embryo

  1. Prepare câmaras de acasalamento, separadas por divisórias, preenchendo-os com água do sistema, e em seguida, colocando adulto do sexo feminino (s) pares do sexo masculino (s) peixe-zebra e nas câmaras O / N.
  2. Recolher os ovos fertilizados usando um filtro fino de malha de arame (estágios embrionários irá variar um pouco).
  3. Depositar os ovos fertilizados em um ambiente limpo, 10 centímetros de diâmetro petri prato girando o filtro de cabeça para baixo e enxaguá-lo com um bom fluxo de E3 até que não haja ovos deixados no coador, e há cerca de 25 ml de solução E3 no prato.
  4. Após a coleta, dividir os ovos em vários pratos (aproximadamente 50-60 ovos por placa) para evitar a superlotação, o que pode levar a assincronia de desenvolvimento dentro da embreagem e fazer a coleta desejados pontos vezes difícil.
  5. Incubar embriões em solução E3 a 28,5 ° C para permitir a avaliação do desenvolvimento de acordo com a série de paragem peixe-zebra padrão 40.
    Nota: Os embriões devem ser transferidos para E3 / PTU às 24 horas pós fecundação (hpf) para prevenir o desenvolvimento de pigmento se manipulações em estágios mais velhos necessitam de clareza óptica.

8. Bead Implantação

  1. Incubam-se as microesferas em concentração molécula de ensaio ou o veículo desejado s correspondentesolution durante o tempo necessário num volume apropriado.
    Nota: O pesquisador pode utilizar placas de Petri esterilizadas que variam de 3-6 cm de diâmetro, ou placas de multi-poços, os quais permitem a visualização das microesferas dentro da solução. O tempo pode variar dependendo do tipo e quantidade de molécula de interesse e o investigador deve referir-se ao fabricante ou recomendações publicadas para a duração de incubação e outros aspectos, tais como a sensibilidade à luz e temperatura.
  2. Uma vez que os embriões atingiram o ponto de tempo de desenvolvimento desejado, remova os embriões de suas córions usando uma pinça fina.
  3. Incubar os embriões na solução de Ringer filtrada com antibióticos, durante 10 min a aclimatar-los para a solução.
  4. Enquanto os embriões são aclimatação, transferir as microesferas para a placa micropérola situado dentro da bandeja de implantação e lavá-los em solução de Ringer durante 10 minutos.
    Nota: Implante as contas dentro de 50 min após chegar a este ponto. Esta wdoente diminuir a probabilidade de que uma vai implantar um grânulo com uma menor concentração da molécula de interesse.
  5. Disposição dos embriões nas cavidades da bandeja de implantação microbead, tendo o cuidado de orientá-los para que a área de interesse, onde o microbead será implantado está acessível.
  6. Fazer uma pequena incisão no embrião usando a agulha de tungsténio.
  7. Transferir um microbead para o embrião usando a pipeta de transferência microcapilar: pressionando o bulbo da pipeta, puxe o microbead na coluna capilar, e, em seguida, liberar a pressão para transferir o microbead no destino desejado.
  8. Use a ferramenta da suiça / chicote para posicionar o microbead dentro do embrião. Nota: Certifique-se de posicionar o microbead para o tecido longe do local da incisão para que o microbead não será expulso do embrião como ele cura.

Representative Results

Vários tipos de ferramentas de manipulação são úteis para o tratamento de microesferas durante aplicações de pesquisa (Figura 1). Além disso, um molde de agarose simples com pequenos poços podem ser utilizados para manter o embrião do peixe-zebra, o que é vital para realizar estas experiências de uma maneira rápida e eficiente (Figura 1). A implantação de uma micropérola pode ser realizada na posição espacial e temporal da fase de interesse, o que permite limitar os investigadores a uma janela de acção específico para a molécula de interesse.

Aqui, microesferas individuais foram implantadas em embriões de peixe zebra na fase de botão de cauda ou em pontos de tempo posteriores durante fases somitogénese (Figura 3). Dois microesferas de diferentes tamanhos, lavadas com solução de Ringer sozinho, foram utilizados neste protocolo de demonstração (figura 3A, 3B e 3C). Este implante micropérola na ausência de qualquer conjugadomoléculas pequenas demonstra que o implante de grânulo pode ser conseguida sem efeitos morfológicos brutas durante o desenvolvimento correcto do embrião do peixe-zebra (Figura 4).

O experimentalista podem encontrar dificuldades à manobra da microbead no buraco punção feita por uma agulha de tungstênio sobre o embrião. Para conseguir um melhor manuseamento do micropérola uma vez colocado no embrião com a micro-agulha, um / chicote suiça ferramenta pode ser usada. Isto pode ser trabalhada com naturalmente derramado felino ou canino bigodes, embora outros filamentos lash natural ou sintético pode ser utilizado (Figura 1). Um empurrãozinho da microbead quer com a agulha de tungstênio ou a ferramenta suiça deve ver o microbead afundar em solução de Ringer do molde. Uma vez que a micropérola se afundou no molde deve ser movido grandes distâncias, se necessário, utilizando a agulha de tungsténio e uma vez sobre o embrião a ferramenta ou de filamentos emaranhados de agulha pode ser usado para position O microbead no embrião. O sucesso da implantação microesferas pode ser imediatamente avaliada através da visualização em um estereomicroscópio, tal como o rebordo irá permanecer estavelmente posicionado no tecido. Para avaliar a posição do grânulo ao longo do tempo, cada amostra embrião pode ser trabalhada por meio da fotografia curso de tempo vivo ou verificado a intervalos regulares (como representado na Figura 4) para assegurar que a localização do grânulo não se deslocou ao longo da duração da experiência, devido ao tecido endógeno morfogênese. Compreendendo a posição do cordão ao longo do tempo é crítica para a interpretação mais informado dos resultados, tais como a avaliação do efeito de uma molécula pequena sobre um tecido-alvo ou processo de desenvolvimento.

A utilização destes passos acima irá proporcionar um ambiente ideal para encaixar microesferas no embrião do peixe-zebra de cada vez e posição desejada. Em nossa experiência, os usuários novatos deste protocolo implantação microbead tipicamente ganhou a habilidade necessário para executar a implantação cirúrgica consistente de microesferas no embrião de peixe-zebra após cerca de uma semana de prática.

Figura 1
Figura 1. As ferramentas usadas para realizar o implante micropérola. (A) A bandeja de implantação talão (esquerda, 15 cm de diâmetro) com moldes de embrião (à esquerda) e uma bandeja de incubação micropérola (no lado direito, a 6 cm de diâmetro). Este tabuleiro de trabalho permite ao investigador para colocar os embriões na orientação desejada para a implantação microesferas, e ter as microesferas preparadas para implantação em estreita proximidade na estação de microscópio. Microesferas devem ser incubadas em pequena molécula (s) e / ou o veículo e depois foi enxaguada numa placa separada micropérola (direita) antes da sua colocação na bandeja implantação do grânulo que está posicionado por baixo da estação de microscópio. (B) Dois pares de uma pinça fina vai ser utilizado para remover o choriem torno de cada embrião do peixe-zebra e também para quebrar a extremidade da agulha microcapilar. (C) Uma agulha de tungsténio serão empregues para fazer um furo muito fina no embrião do peixe-zebra, em que posicionar o microesferas. (D) A transferência pipeta microcapilar será usado para pegar e posicionar uma microbead em cima do embrião de peixe-zebra perto do local da punção. (E) A suiça / ferramenta de cílios vai permitir o posicionamento suave do microbead no local da incisão dentro do embrião que foi anteriormente feita pela agulha de tungstênio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Esquema do procedimento de implante micropérola. (A) Um tabuleiro de implantação micropérola com micropérolas Soaking na solução de lavagem desejado está configurado sob uma estação de microscópio estereoscópico, e os embriões posicionado com o tecido voltado para cima. (B) Utilizando uma agulha de tungsténio, de uma pequena incisão no embrião pode ser feita com um ligeiro movimento ainda forte. (C) Com uma pipeta microcapilar transferência, a micropérola desejado pode ser retirado da câmara de microesferas de incubação na bandeja, localizada no lado direito, e trazido para a esquerda do compartimento onde a área de trabalho do embrião está situado. A micropérola deve ser depositado perto do local da incisão, e depois delicadamente posicionado no local de incisão feita pela agulha de tungsténio usando a ferramenta / chicote suiça. Uma vez que uma micropérola é manobrado para o local da incisão, ela deve ser dobrado para o tecido (distância a partir da incisão) para posicionar de forma estável e a micropérola impedir o movimento subsequente para fora do embrião, o desenvolvimento continua. Plocação clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. microesferas pode ser implantado em embriões em diferentes estádios de desenvolvimento. (A) Zebrafish embriões foram implantados com um microesferas (diâmetro de aproximadamente 50 mm) para o tronco na fase cauda broto. Quando examinados no 24 horas após o implante do talão (hpbi), os embriões tinham desenvolvido normalmente e a micropérola mostrou movimento mínimo durante a passagem do tempo de desenvolvimento. (B) Zebrafish embriões implantados com microesferas (com um diâmetro de aproximadamente 50 mm) para o saco vitelino no estádio 3 somito (ss) exibido desenvolvimento normal com o movimento do grânulo relativamente menor ao longo do tempo. (C) microesferas maiores (diâmetro de aproximadamente 70 mm) foram implantados no embrião 7 ss semelhante mostrou subsequente desenvolvimento normais, assim como mini-mal se qualquer movimento a partir do local de implantação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. desenvolvimento bruta do embrião do peixe-zebra é perturbado pela presença de uma micropérola através de 72 hpbi. Zebrafish embriões foram implantados com microesferas embebidas em solução de Ringer (com um diâmetro de cerca de 50 um) na fase 7 somito (ss). Cada microbead foi cirurgicamente inserida no tronco, entre somites 3 ​​e 4. A presença do talão não foi associada com defeitos evidentes de desenvolvimento em 24 horas após talão implante (hpbi), 48 hpbi, ou 72 hpbi. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Ao longo do século passado, a compreensão do plano de padronização corpo e organogênese tem sofrido avanços monumentais. Técnicas de manipulação de tecidos foram críticos em revelar informações importantes sobre esses processos vitais. A modificação genética é um dos métodos mais utilizados para determinar a função do gene, e métodos de análise de mosaico, tais como o transplante de células, fornecer abordagens úteis para compreender a autonomia da função do gene. Implantação Microbead fornece um outro local para interrogar como as moléculas especial alterar a dinâmica de desenvolvimento, já que este método permite que o pesquisador de alterar um ambiente tecidual local através da introdução de moléculas ou inibidores da sinalização. Uma gama de diferentes micro-esferas estão comercialmente disponíveis, que têm diferentes tamanhos e outras propriedades físicas existem (por exemplo, carga) de tal modo que eles podem ser utilizados para as condições experimentais de interesse. Assim, através da implantação de microesferas que são embebidos numa proteína ou químicocal de interesse dentro de um organismo, os pesquisadores podem investigar os efeitos localizados durante o desenvolvimento e encontrar associações entre o gene ou molécula de interesse e especial fenótipo biológico (s).

Estudos como o realizado por Wada e seus colegas usaram implantação microbead a fim de avaliar o efeito do aumento de sinalização Hedgehog no padrão esquelético no neurocranium anterior (ANC) em peixes-zebra 23. Estudos anteriores demonstraram que Shh é necessária para a formação de 14 ANC. Usando microesferas Shh-revestidos pesquisadores identificaram que este sinal promove a formação de cartilagem no ANC. O processo de implantação microbead foi utilizado para demonstrar uma ligação clara entre a sinalização Hedgehog e formação de cartilagem no ANC. Outro exemplo chave desta técnica de manipulação de tecidos em peixes-zebra é observada em estudos em que os cientistas investigaram o controlo transcricional do eritroblastoma Vinte e seis (ETS) f domíniomolécula relacionada com a ETS atores (ERM) e Polioma potenciador ativador 3 (Pea3) por sinalização Fgf durante o início do desenvolvimento do cérebro do peixe-zebra 19. Através de experiências de implantação microbead, eles foram capazes de mostrar que Fgf8 e Fgf3 pode ectopically activar a expressão de erm e pea3. Estes exemplos ilustram a utilidade das microesferas para proporcionar perspectivas sobre os mecanismos de desenvolvimento que colaboram durante a formação do tecido, que podem ser bem caracterizados pelo uso de métodos para avaliar a expressão do gene 41. Assim, o transplante de microesferas pode ser um método viável para explorar outros tecidos, tais como a mesoderme intermediária (IM), que dá origem ao rim. Especificamente, ele iria ajudar em estudos de desenvolvimento renais, para investigar como diferentes moléculas afetam nephron segmentação 42 e tubulogenesis 43,44, processos que estão apenas superficialmente compreendidas no presente. Além disso, o implante micropérola começou a ser utilizado para estuy processos de regeneração em peixes-zebra 29] e pode ser adaptado para utilização com qualquer número de modelos de regeneração de órgãos, tais como após a ablação a laser dos tecidos embrionários como o nefrónio 45 ou em conjunto com os métodos que têm sido formuladas para realizar pesquisas com as estruturas correspondentes adultos 46-49. Finalmente, o implante micropérola tem o potencial de ser utilizados em modelos de doenças humanas, tais como cancro ou tecido degeneração 50,51 52,53.

No presente protocolo, que demonstram o método de implantação micropérola em embriões de peixe-zebra, o que também foi descrito de forma semelhante por outros investigadores, mas não mostrado, através de protocolos de vídeo 1. Com a prática mínima fomos capazes de implantar microbeads a uma taxa aproximada de 8-10 embriões / h, que se refere a viabilidade deste processo uma vez que o pesquisador tem alguma experiência. Os resultados aqui apresentados demonstram que os grânulos de vários dimensions pode ser implantado em fases iniciais, e que, com cuidado, esta técnica de manipulação de tecidos pode ser implementado com um mínimo de ruptura física do embrião. Uma melhoria que devem ser enfatizados é a utilização de uma ferramenta suiça / chicote para posicionar a micropérola no embrião. Esta peça relativamente simples e barata do equipamento é aproximadamente o mesmo diâmetro que a micropérola, é fácil de obter e ajuda a acelerar o processo de implantação. A suiça / chicote pode ser cortado para um comprimento desejado para produzir um firme ainda ferramenta de manipulação de cordão delicado, dependendo destreza pesquisador e preferência. Finalmente, enquanto nós aqui descrita como manipular fisicamente microbeads e embriões de peixe-zebra para realizar o implante, este protocolo não descrevem os procedimentos de manipulação específicas para diferentes drogas ou peptídeos. Em geral, microesferas tratados quimicamente deve ser implantado no animal com a conveniência, para evitar efeitos indesejados em outras áreas do organismo, e os investigadores devem ser bastanteformada sobre os possíveis problemas de segurança associados a tais produtos químicos antes de iniciar seus estudos.

Em suma, nós demonstramos um método de implantação micropérola relativamente simples e eficaz com uma ampla gama de aplicações, usando materiais que estão prontamente disponíveis no laboratório. Finalmente, nós esperamos que este manual vai ajudar pesquisadores com a natureza delicada da manipulação dos tecidos do peixe-zebra.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder DP2OD008470.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride American Bioanalytical AB01915
Potassium Chloride American Bioanalytical AB01652
Calcium Chloride American Bioanalytical AB00366
HEPES Sigma Life Science H4034
Penicillin-Streptomycin solution Sigma-Aldrich P4333-20ML
N-Phenylthiourea (PTU) Aldrich Chemistry P7629
Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine) Fluka Analytical A5040
Borosilicate glass Sutter Instruments Co. BF100-50-10
Flaming/Brown Micropipette puller Sutter Instruments Co. Mo. P097
UltraPure Agarose Invitrogen 15510-027
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506
Methylene Blue Sigma-Aldrich M9140
250 ml Erlenmeyer Flask Fischer Scientific FB-500-250
Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile Corning 430167
60 mm x 15 mm VWR 25373-085
100 mm x 15 mm VWR 25373-100
150 mm x 15 mm VWR 25373-187
Saint-Gobain Chemware Microspatula Fischer Scientific 21-401-50B
P-1000 Micropipette tips Fischer Scientific 2707402
Low Temperature Incubator Fischer Scientific 11 690 516DQ
Dimethly Sulfoxide American Bioanalytical AB00435
Microbeads (45-106 µm) Biorad 140-1454 AG1-X8
Microbeads (45 µm) Polysciences 7314
Micro Dissecting Tweezer Roboz Surgical Instruments Co. RS-5010
Tungsten Needle Roboz Surgical Instruments Co. RS-6065
Capillary tube holder Globe Scientific Inc.  51674

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lieschke, G. J., et al. Tissue micromanipulation in zebrafish embryos. Zebrafish, Methods in Molecular Biology. 546, (2009).
  2. Wilson, J., Tucker, A. S. Fgf and Bmp signals repress the expression of Bapx1 in the mandibular mesenchyme and control the position of the developing jaw joint. Dev Biol. 266, 138-150 (2004).
  3. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  4. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
  5. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341 (2012).
  6. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
  7. Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish. Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).
  8. Amsterdam, A., Hopkins, N. Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease. Trends Genet. 22, 473-478 (2006).
  9. Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl Res. 163, 65-78 (2014).
  10. Kroeger, P. T. Jr, Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization. J Vis Exp. 89, e51708 (2014).
  11. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21, 48-64 (2011).
  12. Auer, T. O., Del Bene, F. CRISPR/Cas9 and TALEN-mediated knock-in approaches in zebrafish. Methods. 69, 142-150 (2014).
  13. Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proc Natl Acad Sci USA. 97, 12965-12969 (2000).
  14. Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res C Embryo Today. 93, e52063 (2011).
  15. Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high–throughput using zebrafish embryos. J Vis Exp. , 52063 (2014).
  16. Hyatt, G. A., Schmitt, E. A., Marsh-Armstrong, N., McCaffery, P., Dräger, U. C., Dowling, J. E. Retinoic acid establishes ventral retinal characteristics. Development. 122, 195-204 (1996).
  17. Picker, A., Brand, M. Fgf signals from a novel signaling center determine axial patterning of the prospective neural retina. Development. 132, 4951-4962 (2005).
  18. Reifers, F., Walsh, E. C., Leger, S., Stainier, D. Y. R., Brand, M. Induction and differentiation of the zebrafish heart requires fibroblast growth factor 8 (fgf8/acerebellar.). Development. 127, 225-235 (2000).
  19. Raible, F., Brand, M. Tight transcriptional control of the ETS domain factors Erm and Pea3 by Fgf signaling during early zebrafish development. Mech Dev. 107, 105-117 (2001).
  20. Reim, G., Brand, M. spiel-ohne-grenzen/pou2. mediates regional competence to respond to Fgf8 during zebrafish early neural development. Development. 129, 917-933 (2002).
  21. Jaszai, J., Reifers, F., Picker, A., Langenberg, T., Brand, M. Isthmus-to-midbrain transformation in the absence of midbrain-hindbrain organizer activity. Development. 130, 6611-6623 (2003).
  22. Hirati, Y., Okamoto, H. Canopy1, a novel regulator of FGF signaling around the midbrain-hindbrain boundary in zebrafish. Curr Biol. 16, 421-427 (2006).
  23. Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
  24. Abe, G., Ide, H., Tamura, K. Function of FGF signaling in the developmental process of the median fin fold in zebrafish. Dev Biol. 304, 355-366 (2007).
  25. Prykhozhij, S. V., Neumann, C. J. Distinct roles of Shh and Fgf signaling in regulating cell proliferation during zebrafish pectoral fin development. BMC Dev Biol. 8, 91 (2008).
  26. Scholpp, S., Brand, M. Endocytosis controls spreading and effective signaling range of Fgf8 protein. Curr Biol. 14, 1834-1841 (2014).
  27. Hardt, S., et al. The Bmp gradient of the zebrafish gastrula guides migrating lateral cells by regulating cell-cell adhesion. Curr Biol. 17, 475-487 (2007).
  28. White, R. J., Nie, Q., Lander, A. D., Schilling, T. F. Complex regulation of cyp26a1 .creates a robust retinoic acid gradient in the zebrafish embryo. PLoS Biol. 5, e2522-e2523 (2007).
  29. Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53, 835-850 (2009).
  30. Niswander, L., Jeffrey, S., Martin, G. R., Tickle, C. A positive feedback loop coordinates growth and patterning in the vertebrate limb. Nature. 371, 609-612 (1994).
  31. Laufer, E., Nelson, C. E., Johnson, R. L., Morgan, B. A., Tabin, C. Sonic hedgehog and Fgf-4 act through a signaling cascade and feedback loop to integrate growth and patterning of the developing limb bud. Cell. 79, 993-1003 (1994).
  32. Tickle, C., Alberts, B., Wolpert, L., Lee, J. Local application of retinoic acid to the limb bud mimics the action of the polarizing region. Nature. 296, 564-566 (1982).
  33. Samarut, E., Fraher, D., Laudet, V., Gibert, Y. ZebRA: an overview of retinoic acid signaling during zebrafish development. Biochimica et Biophysica Acta. 1849, 73-83 (2015).
  34. Lengerke, C., et al. Interactions between Cdx genes and retinoic acid modulate early cardiogenesis. Dev Biol. 354, 134-142 (2011).
  35. Wingert, R. A., et al. The cdx and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
  36. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  37. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
  38. Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom., and Notch signaling. Dev Biol. 386, 111-122 (2014).
  39. Cheng, C. N., Wingert, R. A. Nephron proximal tubule patterning and corpuscles of Stannius formation are regulated by the sim1a. transcription factor and retinoic acid in the zebrafish. Dev Biol. 399, 100-116 (2015).
  40. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  41. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J Vis Exp. , e51604 (2014).
  42. Cheng, C. N., Wingert, R. A. Chapter 9: Renal system development in the zebrafish: a basic nephrogenesis model. Zebrafish: Topics in Reproduction & Development. Carver, E., Lessman, C. , Nova Scientific Publishers. (2014).
  43. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Zebrafish pronephros tubulogenesis and epithelial identity maintenance are reliant on the polarity proteins Prkc iota .and zeta. Dev Biol. 396, 183-200 (1016).
  44. McKee, R., Gerlach, G. F., Jou, J., Cheng, C. N., Wingert, R. A. Temporal and spatial expression of tight junction genes during zebrafish pronephros development. Gene Expr Patterns. 16, 104-113 (2014).
  45. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J Vis Exp. , e2845 (2011).
  46. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
  47. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. 54, e2839 (2011).
  48. McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. , e51644 (2014).
  49. McCampbell, K. K., Springer, K., Wingert, R. A. Atlas of cellular dynamics during zebrafish adult kidney regeneration. Stem Cells Int. In press, (2015).
  50. Lee, S. L., et al. Hypoxia-induced pathological angiogenesis mediates tumor cell dissemination, invasion, and metastasis in a zebrafish tumor model. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19485-19490 (2009).
  51. Rouhi, P., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat Prot. 5, 1911-1918 (2010).
  52. Cao, R., Jensen, L. D. E., Söll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy. PLoS One. 3, e2748 (1371).
  53. Cao, Z., et al. Hypoxia-induced retinopathy model in adult zebrafish. Nat Prot. 5, 1903-1910 (2010).

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Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (101), e52943, doi:10.3791/52943 (2015).

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