Abstract
L'olfaction est hautement conservée entre les espèces et est nécessaire pour la reproduction et la survie.
Chez les humains, l'olfaction est également l'un des sens qui est affectée au vieillissement et est un fort prédicteur de maladies neurodégénératives. Ainsi, le test de l'olfaction est utilisé comme une méthode de diagnostic non invasif pour détecter des déficits neurologiques dès le début. Afin de comprendre les mécanismes sous-jacents olfactive susceptibilité du réseau, la recherche olfactive chez les rongeurs a pris de l'ampleur dans la dernière décennie.
Ici, nous présentons un temps méthode de test olfactif très simple, efficace et reproductible de la perception des odeurs innée et la sensibilité chez la souris, sans la nécessité de toute restriction de la nourriture ou de l'eau avant. Les tests sont effectués dans un environnement familier pour les souris, exiger que les senteurs et une session de 2 min d'exposition odorant. L'analyse est effectuée, post-hoc, en utilisant les commandes assistées par ordinateur sur ImageJ et peut être, par conséquent,, Réalisée à partir de début à la fin par un chercheur.
Ce protocole ne nécessite aucune configuration matérielle ou spéciale et est indiqué pour tout laboratoire intéressé à tester la perception olfactive et de la sensibilité.
Introduction
L'olfaction est l'une des fonctions sensorielles les plus développés et les plus importants chez les mammifères. Toute dépréciation de l'activité olfactive peut affecter l'apport alimentaire, le comportement social et, dans le pire des cas, même la survie. Chez les humains, la dégradation olfactive dépend 1 ans et est considéré comme un puissant prédicteur de troubles neurologiques 2 - 6. Le test d'identification olfactif développé par l'Université de Pennsylvanie représente actuellement l'un des tests diagnostiques les plus utilisés, non invasives et quantifiables qui permettent d'évaluer les déficits neurologiques précoces 7 et de prédire avec une forte probabilité de la progression de la démence 8,9.
L'accessibilité du système olfactif et l'importance de l'olfaction chez les rongeurs, a suscité une ligne intense de recherche portant sur les mécanismes sous-jacents des fonctions olfactives 10. Nous avons précédemment montré que la perte de fonction de la signalisation de réceptou Notch1 affecte éviter olfactive 11. Dans ce protocole, nous utilisons des souris dépourvues du ligand de signalisation, Jagged1, dans les neurones ou cellules gliales pour étudier la performance olfactive.
Innate olfaction est définie par trois paramètres que la perception, de la discrimination entre les odeurs et la sensibilité olfactive 4. Les tests olfactifs chez les rongeurs peut être fait dans une variété de façons et certaines études comportementales faire usage de olfactomètres, qui fournissent l'odeur de l'animal à une concentration spécifique de la vapeur et dans un laps de temps précis 12-14. Néanmoins, cette instrumentation est coûteux et pourraient être disponibles uniquement dans des installations spécialisées. Dans notre travail, nous fournissons un protocole de test olfactif simple, rapide et reproductible, qui est effectuée à l'aide des parfums volatils. Les tests décrits mesure la perception à un appât ou une odeur répulsive et évaluer la discrimination entre le parfum et 11,15,16 de l'eau. En utilisant la même configuration, we peut également mesurer la sensibilité d'une odeur à différentes concentrations 16,17. Le traitement vidéo assistée par ordinateur post-hoc, inspiré par le travail de la page et ses collègues 18, fournit des résultats impartiaux, sans la nécessité d'aveuglement expérimentale et permettant pour une personne seule à réaliser toute l'expérience.
Ce protocole est destiné à fournir un point de départ pour étudier le comportement olfactive chez la souris.
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Protocol
Toutes les procédures sur les animaux sont conformes à la directive européenne 2010/63 / UE sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques et sont approuvés par le comité local de protection des animaux (Canton de Fribourg, Suisse).
1. Préparation d'un animal
- Les animaux de laboratoire
- Réaliser des expériences sur des hommes adultes de type sauvage et des souris transgéniques (C57BL / 6 de fond) de 3-5 mois d'âge. Les trois groupes de souris sauvages correspondent à des contrôles de type même portée (groupe A, Jagged1 flox / flox 19) et deux lignes conditionnelles de souris KO (groupe B, et C Jagged1ncKO, Jagged1gcKO).
- Les souris domestiques dans des conditions standard de laboratoire dans une pièce bien aérée, avec un cycle d'obscurité / de lumière contrôlée 12 h et fournissent de la nourriture et de l'eau ad libitum.
2. Installation expérimentale
- Arène expérimentale
- Pour l'arène expérimentale, utiliser une cage de la souris stérilisée (36 cm longueur x 20,5 cm largeur x 13,5 cm de hauteur) (figure 1A).
- Attribuez à chaque souris dans une cage numérotée avec une literie fraîche, 3 cm de haut. Si des cages sont réutilisés, comme dans le test de sensibilité aux odeurs, prendre les mesures suivantes afin d'éviter la contamination croisée entre les odeurs et les souris.
- Marquez le côté de l'eau.
- Nettoyez les parois étroites des cages avec deux papiers tissus pulvérisés avec 70% d'éthanol, un pour chaque côté.
- Accumuler des cages en fonction du génotype des souris et stocker temporairement sous une hotte laminaire.
- Caméra
- Monter un appareil photo sur un trépied personnalisé avec l'objectif à 58 cm du fond de la cage (figure 1A). Fixer la position du trépied et la cage et délimiter avec des marques pour permettre à la caméra à être centrée sur la partie supérieure de la cage.
- Enregistrer des vidéos à 320 pixels x 240 pixels, 15.08 images par seconde que les fichiers MOV.
- Odeurs
- Reprendre le scents, lorsque cela est indiqué, dans le solvant dans lequel ils sont solubles.
- Pour le test de préférence de beurre d'arachide utilisation. Remettre en suspension le beurre d'arachide dans l'huile d'arachide (10% p / v).
- Pour éviter l'utilisation de test pur 2-méthylbutyrique (2 Mo) d'acide (98%).
- Pour le test de sensibilité, utiliser l'urine des femmes de la même colonie de souris et le fond (C57BL / 6).
- Pour plus de commodité recueillir l'urine 1-2 jours avant le test olfactif. Retenir et maintenez la souris sous le capot avec son ventre dessus de la grille de la cage. Sous la grille de la cage placer un plat de Pétri en plastique pour recueillir les gouttes d'urine.
- Recueillir l'urine de chaque femelle dans un tube de 1,5 ml et mélanger tous les échantillons d'urine pour normaliser la variabilité entre les animaux. Stocker à -20 ° C jusqu'à utilisation.
- Le jour de l'expérience, dégeler l'urine et d'effectuer 4 dilutions dans l'eau distillée deux fois à un facteur de dilution de 10 (1:10, 1: 100, 1: 1000; 1: 10 000).
3. Test olfactive
Note: Dans le présent Protocole odeurs ont été délibérément choisies qui sont perçus comme attractifs forts (beurre d'arachide et d'urine féminine) ou répulsif forte (acide 2-MB) 15. Il est important de procéder à la préférence et des tests de sensibilité aux odeurs agréables avant le test d'évitement pour éliminer la possibilité d'une interférence avec le comportement olfactif. Néanmoins, pour des raisons de simplicité, dans ce domaine, test de préférence et l'évitement papier seront tous deux décrits dans le cadre du test de perception. Chaque session de comportement commence par une phase d'accoutumance.
- L'accoutumance Phase
- Placez l'animal dans la cage attribué propre et laissez-le explorer pendant 5 min (figure 1B). Etant donné que l'environnement de la cage expérimentale est familier à la cage d'accueil, ce court laps de temps est suffisant pour permettre une accoutumance.
- Si le test de sensibilité est achevé en un jour, effectuer accoutumance qu'une seule fois avant l'application de l'odeur dilué plus élevé. Si le test de sensibilité est effectuée à des jours différents, chaque jour sur une période d'habituation d'une nouvelle cage propre est nécessaire.
- Perception test
- Après l'accoutumance, activer l'appareil photo et la pipette juste 60 pi de l'odeur agréable (beurre d'arachide) et 60 pi de l'odeur neutre (eau du robinet) sur les parois opposées de la cage à environ 10 cm du bas (figure 1C).
- Laissez la souris explorer les odeurs pendant 2 min (figure 1D). Ensuite, éteignez l'appareil photo.
- À ce stade, procéder à la prochaine souris à partir de la phase d'habituation. Effectuer le test d'évitement exactement de la même manière en appliquant 60 ul de l'odeur répulsive (acide 2-MB) et 60 pi d'eau.
- Test de sensibilité
- Évaluer le seuil d'attraction de souris mâles à des concentrations croissantes de l'urine des femmes dans l'ordre suivant: 1: 10.000; 1: 1000; 1: 100; 1:10 et l'urine pure.
- Après l'accoutumance, exposer chaque souris à la dilution la plus élevée à la pipette par l'expérimentateur, comme décrit précédemment en 3.2.1.
- Notez le comportement exploratoire d'urine rapport à l'eau, dans un laps de temps de 2 min sur une caméra vidéo. Après que toutes les cohortes de souris sont testés pour la dilution la plus élevée (1: 10.000), à exposer une plus grande concentration de l'urine, comme indiqué ci-dessus.
Analyse des données 4. post-hoc
Note: Tous les tests comportementaux décrits sont traitées post hoc en suivant les instructions d'analyse de données.
- Ouvrir des fichiers MOV dans ImageJ pour les systèmes Windows
- Installer Quick Time pour Java en utilisant les paramètres personnalisés à partir http://www.apple.com/quicktime/download.
- Installez le plugin Quick Time à partir du site ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/qt-capture.html).
- Importez le QTJava.zip (C: Program Files QuickTime QTSystem) dans les extensomètres de la bibliothèqueion de ImageJ (.ImageJ jre lib ext).
- Copiez aussi le QTJava.zip dans le dossier plugins et renommez-le comme QTJava.jar.
- Installez les six scripts attachés dans le dossier Macros (ImageJ plugins Macros).
- Ouvrir ImageJ et compiler et exécuter le plugin Quick Time, par la suite, à proximité ImageJ.
- Rouvrez ImageJ et ouvrez le fichier MOV en utilisant Fichier> Importation> utilisant Quick Time.
- Ajustement de la vidéo
- Une fois que le fichier vidéo est ouvert dans ImageJ, couper la vidéo pour obtenir une exploration de 2 min constante à partir du moment de l'expérimentateur a pipette les substances odorantes dans la cage (T0). Identifier la trame correspondant à T0 et retirer les images précédentes en utilisant des incréments de 1 (ImageJ image Stacks ToolsSlice décapant). Utilisez la même commande pour supprimer tous les cadres supérieurs à l'exploration de 2 min.
- Assurez-vous que la cage est centré et si nécessaire utiliser l'Image> Transformation> commande Rotation pour l'aligner.
- Voiro Traitement
Remarque: Le traitement vidéo est entièrement assistée par ordinateur et utilise des commandes macros accompagnant ce papier.- Afin de limiter la région sur la cage d'un x 218 pixels taille 127 pixels exécuter l'étape 1 de la macro Plugin> Macros> Exécuter la commande. Déplacez le rectangle fixe sur la cage (Figure 2, Etape 1).
- Recadrer la zone de la cage sur la région d'intérêt (ROI) en utilisant la macro Étape 2 (Figure 2, Etape 2).
- Utilisez l'Étape 3 macro pour extraire l'image de la souris à partir de l'arrière-plan par l'attribution d'un signal de seuil, supprimant les impuretés et en filtrant la variance du signal. Les valeurs de sortie dans le complot de l'axe Z indiquent les valeurs de gris moyen, correspondant à l'intensité de l'ombre de la souris se déplaçant dans le ROI de la «chambre de l'eau" lors de l'exploration de 2 min. Copiez les résultats dans une feuille de calcul nommée selon le ROI dans un fichier tableur (Figure 2, Étape 3).
- Utilisez l'Étape 4 macroextraire les valeurs de gris moyen de la souris dans la "chambre de l'odeur" de retour sur investissement. Copiez les résultats dans une feuille de calcul nommée selon le ROI dans le même fichier de tableur comme dans 4.3.3 (Figure 2, Étape 4).
- Afin de restreindre davantage l'analyse du mouvement de la souris dans le ROI "périmètre de l'eau" utiliser l'Étape 5 macro. Copiez le résultat sur la feuille de calcul nommée selon le ROI dans le même fichier de tableur comme dans 4.3.3 (Figure 2, étape 5).
- Pour limiter l'analyse du mouvement de la souris dans le ROI "périmètre de l'odeur" utiliser l'Étape 6 macro. Copiez le résultat sur la feuille de calcul nommé d'après le fichier de feuille de calcul ROI comme dans 4.3.3 (Figure 2, Étape 6).
- Traiter toutes les vidéos et vérifier la cohérence dans le nombre d'images par les animaux. Ici, enregistrer tous les animaux pour 1810 trames correspondant à une session d'exploration de 2 min.
- Pour chaque animal, et pour chaque ROI sorte cadres avec VA gris moyenLues supérieur à 0. Diviser le nombre d'images par les valeurs correspondant à 1 seconde et obtenir les secondes passées dans chaque ROI.
5. Analyse statistique
- Pour chaque test de vérifier l'homogénéité de la variance dans les groupes / génotypes par le test de Bartlett en utilisant la formule disponible sur http://www.real-statistics.com/one-way-analysis-of-variance-anova/homogeneity-variances/.
- Dans le test de l'attraction et l'évitement, réaliser des comparaisons entre les moments passés avec de l'eau par rapport à l'odeur dans un groupe utilisant le test t de Student non-directionnelle en supposant que les écarts égaux ou inégaux en fonction des résultats du test de Bartlett. Comparer les moments passés avec les odeurs soustraites par le temps passé avec de l'eau entre les génotypes par une analyse de la variance avec le test post-hoc de Bonferroni.
- Dans le test de sensibilité analyser les comparaisons du temps passé avec l'odeur soustrait du temps passé avec Water chez les groupes à un dilutions spécifiques d'urine par une analyse de variance avec le test post-hoc de Bonferroni. Comparer la sensibilité parmi les groupes à des concentrations d'odeurs en croissance de 2-Way ANOVA avec des répétitions avec le test post-hoc de Bonferroni.
- Interaction entre les génotypes et les traitements dans le test de l'attraction et l'évitement sont étudiées par 2 ANOVA avec le test post-hoc de Bonferroni.
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Representative Results
Le test de perception mesure l'attraction au beurre d'arachide et d'éviter à l'acide 2-MB. Trois groupes de souris ont été testés et le temps passé dans le "périmètre d'odeur" sont quantifiées par rapport à l'eau. Dans le test de préférence, le groupe témoin présente une préférence significative de l'odeur par rapport à l'eau (8 t = 2,52, p <0,05). D'autre part, le groupe B ne montre aucune activité significative au beurre d'arachide et passe plus de temps avec de l'eau (6 t = 3,22, p <0,05). Ainsi, il se comporte différemment d'un groupe de commande (F 1,7 = 26,39, p <0,005). En outre, le groupe C ne montre pas de discrimination et passe près en même temps avec de l'eau et le beurre d'arachide (8 t = 0,78, p = 0,45). Dans l'ensemble, les trois groupes se comportent différemment (F 2,9 = 19,83, p <0,005) et il ya une interaction significative entre le génotype et le traitement (le beurre d'arachide et de l'eau) (F 2,1 = 4,90, p <0,005) ( En réponse à l'acide 2-MB le groupe de contrôle affiche un réflexe d'évitement et, par conséquent passe plus de temps avec de l'eau (8 t = 2,67, p <0,05). De même, le groupe B représente un réflexe d'évitement prononcé à 2-acide MB (t 6 = 3,71, p <0,01). D'autre part, le groupe C ne discrimine pas entre les deux odeurs et passe des périodes comparables avec 2 Mo de l'acide et de l'eau (8 t = 2,2, p = 0,6) (figure 3B). Dans l'ensemble, la comparaison de la réponse d'évitement des trois groupes ne pas afficher un comportement différent significative (F 2, 9 = 0,76, p = 0,49) par suite il n'y a aucune interaction entre le traitement et le génotype (F 1, 2 = 0,52, p = 0,63). Dans le test de sensibilité olfactive à l'urine des femmes, la courbe affiche la préférence à l'urine à des concentrations différentes par rapport à l'eau (de préférence index = temps passé avec l'urine soustraite par le temps passé avec l'eau). Dans èmeest test, nous observons que groupe témoin A a un seuil d'attraction à l'urine à une dilution de 1: 1000 et affiche de plus en plus l'attraction à l'urine avec des concentrations croissantes. Groupe B et C affichent une 100 fois seuil plus élevé à l'attraction (1:10) par rapport au groupe A (F = 2,9 4,78, p <0,05). Groupe B et C affichage des courbes de sensibilité comparables (F 1,19 = 0,36, p = 0,55). La comparaison de la sensibilité entre les groupes, il semble que le groupe A a une plus grande sensibilité à l'urine femelle par rapport au groupe B et C (F 2,19 = 7,12; p <0,01) (Figure 4). 
Figure 1: Représentation de la configuration utilisée pour effectuer les tests olfactifs. (A) Caméra-dessus de la cage. (B) Les souris sont placées dans une cage pour une période d'habituation de 5 minutes. (C) Le odorants sont déposés à la pipette sur la paroi de la cage. (D) L'activité exploratoire d'une substance odorante est testée par rapport à l'eau dans une fenêtre de 2 min. 
Figure 2:.. Workflow de traitement vidéo assistée par ordinateur en utilisant des commandes macros dans ImageJ L'exemple se réfère à une souris du groupe A exposée à l'urine à une dilution de 1:10 S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. 
Figure 3:. Les résultats représentatifs de tests de préférence et d'évitement olfactives Les souris des trois groupes (n = 5 pour le groupe A, n = 4 pour le groupe B et n = 5 pour le groupe C) ont été exposés à (A) d'arachide, maister et de l'acide (B) de 2 Mo pour une session d'exploration de 2 min. Le temps total d'explorer l'odeur (cercles noirs) par rapport à l'eau (cercles gris) est représenté. Des différences significatives dans le comportement olfactif entre les groupes sont indiqués par des barres horizontales noires et des astérisques. Des différences significatives dans les temps entre l'odeur et de l'eau au sein des groupes reniflant sont indiqués par des barres horizontales et astérisques gris. * P <0,05, ** P <0,01, P <0,01 *** (barres horizontales grises, test t de Student; barre horizontale noire, une analyse de la variance). Les barres d'erreur sont des erreurs types de la moyenne (SEM). 
Figure 4:. Les résultats représentatifs des tests de sensibilité aux concentrations de l'urine féminine croissante La courbe d'indice de préférence, donnée par le temps d'exploration avec de l'urine à des concentrations différentes soustraites par le temps passé avec l'eau, montre que le groupeA (n = 5) a la plus forte sensibilité à l'urine par rapport au groupe B (n = 4) et C (n = 5). * P <0,05 (barres horizontales noires, une analyse de la variance). Les barres d'erreur sont SEM.
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Discussion
Les critères proposés dans ce protocole permettent d'évaluer différents aspects du comportement olfactive innée chez la souris: la perception des odeurs, de la discrimination entre les odeurs par rapport à l'eau et la sensibilité aux odeurs. Ce protocole peut être appliqué à toute odeur selon la préférence et de l'échelle d'évitement 15 précédemment montré. Depuis le protocole est basé sur l'activité exploratoire, il est important que les souris ne présentent pas de déficience motrice ou de l'anxiété qui peut affecter leur mouvement et d'interférer avec l'exploration olfactive. Les essais décrits sont destinés à des souris mâles adultes mais ils peuvent être adaptés pour enquêter sur l'olfaction également chez les femelles adultes ou les souris âgées.
Avant de commencer une telle étude enquête olfaction chez la souris, il est important de prêter attention aux aspects suivants: 1) effectuer chaque test à un intervalle d'au moins 3 jours. Évitement doit être testé en dernier pour minimiser les interférences de la mémoire olfactive 20; 2) effectuer du eXperiments au même moment de la journée, de préférence en fin de journée, lorsque les souris sont dans leur cycle actif 21 et utilisent une source de lumière tamisée. En outre, la planification de l'essai olfactif aux définies fois pour les contrôles possibles changements circadiens dans les fonctions olfactives 22; 3) avant de commencer le test d'évitement, qui utilise odorants répulsifs, comme des acides, apporter un cage à l'époque dans la suite expérimental et garder la cage sous une hotte laminaire. Cette étape est importante pour éviter l'accoutumance à la substance odorante et obtenir une réponse plus homogène dans le même groupe; 4) séparer temporairement les souris qui ont été testés jusqu'à ce que toutes les souris de la même cage sont exposées à la substance odorante, pour minimiser la contamination odorant; 5) utiliser des animaux de la même souche, puisque les différentes souches peuvent se comporter de façon hétérogène lorsqu'il est exposé à une substance odorante 23; 6) l'expérimentateur devrait porter une blouse de laboratoire à tout moment et changer de gants entre les animaux pour éviter les odeurs mélange; 7)après pipetage l'opérateur devrait se déplacer lentement de la cage à une distance de 1,3 mètres pour éviter toute stimulation de confusion à la souris lors de l'exploration olfactive; 8) des souris présentant des valeurs de gris moyennes que dans une chambre doivent être exclus de l'étude, puisque les souris sont attendus pour découvrir les deux chambres à des degrés différents.
La méthode décrite offre plusieurs avantages par rapport à d'autres protocoles: il est extrêmement simple à configurer, utilise des matériaux peu coûteux, il est de l'achèvement rapide et prend avantage de logiciels open source, tels que ImageJ. En outre, nous fournissons des macros qui sont prêts à être installés et qui peuvent être personnalisées-utilisés et adaptés à toute arène et plus de 2 périmètres d'odeurs. Il est à noter que seul le temps passé dans le périmètre de l'odeur attribuée est une mesure de l'activité olfactive. Alors que le temps passé dans chaque chambre donne une lecture de l'activité d'exploration de la souris et est seulement une estimation approximative du comportement olfactif. Comme avec d'autres procédés, la puissance statistique peut être obtenue en augmentant le nombre d'animaux par groupe.
Par rapport à l'essai olfactif utilisant olfactomètres, qui peuvent contrôler automatiquement la pression de vapeur et le temps de livraison de 12 à 14, le protocole proposé est moins contrôlé. Néanmoins, toutes les odeurs sont appliqués dans des volumes égaux, à distance définie et pour la même fenêtre de temps. Ainsi, le maintien de ces variables constantes, dans ce test d'un olfactomètre est pas nécessaire. Il existe une autre limitation potentielle à ce protocole consistant en le temps nécessaire pour le réglage et la découpe de chaque produit afin d'obtenir un nombre fixe de trames. Néanmoins, la même analyse assistée par ordinateur peut également être utilisé sur des configurations plus sophistiquées avec des ports d'odeurs délivrer l'odeur à des moments précis. Dans ce cas, le découpage de la vidéo pourrait être automatiquement réglé.
Par rapport à d'autres protocoles utilisant des tampons de coton impregnated avec une odeur de tester l'attraction et l'évitement, le présent protocole fournit une information supplémentaire au sujet de la discrimination olfactive entre un roman odeurs et une odeur neutre (eau) 15,16 en une seule session expérimentale. En outre, le protocole ne nécessite pas aveuglement expérimental et peut être entièrement réalisée par un seul expérimentateur en utilisant l'analyse assistée par ordinateur impartiale.
Ces essais simples peuvent être utilisés pour surveiller la progression des déficits neuraux dans les modèles murins de la maladie de Parkinson ou la maladie d'Alzheimer et d'étudier les mécanismes de transmission olfactif.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse cage | Italplast (Italy) | 1144B | 36 cm length x 20.5 cm width x 13.5 cm height |
| Chipped wood bedding | Abedd (Austria) | LTE E-001 | 3 cm high |
| Peanut butter | Migros (Switzerland) | NA | 1:10 |
| 2-Methylbutyric | Sigma Aldrich (Switzerland) | W269514 | Pure |
| Female urine from fertile females of same mouse strain | NA | NA | Dilution series |
| Camera | Olympus (US) | Camedia C-8080 | MOV files |
| Quicktime for Java (Windows) | Apple (USA) | NA | video plugin for visualizing MOV files |
| ImageJ for Windows | NIH (USA) | NA | Video Processing/Analysis |
References
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