Abstract
Olfaction é altamente conservada entre espécies e é necessária para a reprodução e sobrevivência.
Nos seres humanos, olfacto é também um dos sentidos que é afectado com o envelhecimento e é um forte indicador de doenças neurodegenerativas. Assim, o teste de olfacto é utilizado como um método de diagnóstico não invasivo para detectar os défices neurológicos no início. A fim de compreender os mecanismos subjacentes susceptibilidade rede olfativo, a investigação olfativa em roedores ganhou impulso na última década.
Aqui, apresentamos um tempo método muito simples, eficiente e reproduzível teste olfativo de percepção de odor inata e sensibilidade em ratos sem a necessidade de qualquer restrição de alimentos ou água antes. Os testes são realizados em um ambiente familiar para os ratos, requerem apenas os aromas e uma sessão de 2 min de exposição odorante. A análise é realizada, post-hoc, usando comandos assistidas por computador em ImageJ e pode ser, portanto,, Realizado do início ao fim por um pesquisador.
Este protocolo não requer nenhum hardware ou configuração especial e é indicado para qualquer laboratório interessado em testar percepção olfativa e sensibilidade.
Introduction
Olfaction é uma das funções sensoriais e mais desenvolvidos importantes em mamíferos. Qualquer prejuízo na atividade olfativa pode afetar a ingestão de alimentos, comportamento social e, no pior dos casos, até mesmo a sobrevivência. Nos seres humanos, a deterioração olfactiva é dependente 1 idade e é considerado um forte indicador de distúrbios neurológicos 2-6. O teste de identificação olfatória desenvolvido pela Universidade da Pensilvânia atualmente representa um dos testes mais utilizados, não-invasivos e quantificáveis, de diagnóstico, que pode avaliar primeiros déficits neurológicos 7 e prever com elevada probabilidade, a progressão da demência 8,9.
A acessibilidade do sistema olfativo ea proeminência do olfato em roedores, provocou uma intensa linha de pesquisa abordando os mecanismos subjacentes funções olfativas 10. Nós já demonstrado que a perda de função do recept sinalizaçãoou Notch1 afeta evitar olfativo 11. Neste protocolo, usamos ratos que faltam o ligando sinalização, Jagged1, em neurônios ou células gliais para estudar o desempenho olfativo.
Olfaction inata é definido por três parâmetros como percepção, discriminação entre odores e sensibilidade olfativa 4. Teste olfativo em roedores pode ser feito de uma variedade de formas e alguns estudos comportamentais fazer uso de olfatômetros, que fornecem o odor para o animal a uma concentração de vapores específicos e num período de tempo preciso 12-14. No entanto, esta instrumentação é caro e pode estar disponíveis apenas em instalações especializadas. No nosso trabalho, nós fornecemos um protocolo de teste olfactivo simples, rápido e reprodutível, que é levada a cabo usando aromas voláteis. Os testes descritos percepção medida para um atrativo ou um odor repelente e avaliar a discriminação entre o cheiro eo 11,15,16 água. Usando a mesma configuração, we também se pode medir a sensibilidade a um odor a diferentes concentrações 16,17. O processamento de vídeo assistida por computador post-hoc, inspirada no trabalho da página e colegas 18, fornece resultados imparciais, sem a necessidade de cegueira experimental e permitindo para uma única pessoa para levar a cabo todo o experimento.
Este protocolo destina-se a fornecer um ponto de partida para estudar o comportamento olfativo em camundongos.
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Protocol
Todos os procedimentos com animais estão em conformidade com a directiva comunitária 2010/63 / UE relativa à protecção dos animais utilizados para fins científicos e são aprovados pelo Comitê Animal Care locais (cantão de Fribourg, Suíça).
1. Preparação de animais
- Os animais experimentais
- Realizar experimentos sobre tipo selvagem macho adulto e camundongos transgênicos (C57BL / 6 background) de 3-5 meses de idade. Os três grupos de ratos correspondem a controlos de tipo selvagem da mesma ninhada (grupo A, Jagged1 Flox / Flox 19) e duas linhas de ratinhos KO condicionais (grupo B, e C Jagged1ncKO, Jagged1gcKO).
- Os ratos domésticos em condições de laboratório padrão em uma sala ventilada, com um ciclo de 12 hr controlado claro / escuro e fornecer comida e água ad libitum.
2. Setup Experimental
- Arena Experimental
- Para a arena experimental, use uma gaiola de rato esterilizado limpo (36 cm de comprimento x 20,5 centímetros de largura x 13,5 centímetros de altura) (Figura 1A).
- Atribuir a cada rato para uma gaiola contado com camas frescas, 3 centímetros de altura. Se gaiolas são reutilizados, como no teste de sensibilidade odor, tomar as seguintes medidas para evitar a contaminação cruzada entre odores e camundongos.
- Marque lado da água.
- Limpar as paredes mais estreitas das gaiolas com dois papéis de seda pulverizados com etanol a 70%, um para cada lado.
- Empilhe gaiolas de acordo com o genótipo dos ratos e armazenar temporariamente sob uma capa laminar.
- Câmera
- Montar uma câmara num tripé personalizada com o objectivo em 58 cm a partir do fundo da gaiola (Figura 1A). Fixar a posição do tripé e a gaiola e delimitar com marcas para permitir que a câmara seja centrado sobre a parte superior da gaiola.
- Gravar vídeos em 320 pixels x 240 pixels, 15,08 quadros por segundo como arquivos MOV.
- Odores
- Ressuspender o scents, quando indicado, no solvente em que são solúveis.
- Para o teste de preferência manteiga de amendoim uso. Ressuspender a manteiga de amendoim em óleo de amendoim (10% w / v).
- Para evitar o uso de testes puro 2-metilbutírico (2-Mo) de ácido (98%).
- Para o teste de sensibilidade, use urina feminina da mesma colônia mouse e fundo (C57BL / 6).
- Por conveniência recolher a urina de 1-2 dias antes do teste olfactivo. Contenha e segure o mouse sob o capô com a barriga acima da grade da gaiola. De acordo com a grelha de gaiola colocar uma placa de petri de plástico para recolher as gotas de urina.
- Recolhe-se o de urina a partir de cada uma das fêmeas em um tubo de 1,5 ml e misturar todas as amostras de urina para normalizar para a variabilidade entre os animais. Armazenar a -20 ° C até à sua utilização.
- No dia da experiência, descongelar a urina e executar quatro diluições em água destilada duas vezes com um factor de diluição de 10 (1:10, 1: 100, 1: 1000, 1: 10.000).
3. Teste Olfativo
Nota: Neste protocolo odores foram deliberadamente escolhidas que são percebidos como atractivos fortes (manteiga de amendoim e de urina feminina) ou forte repelente (ácido 2-MB) 15. É importante realizar a preferência e testes de sensibilidade aos odores agradáveis antes do teste de esquiva para eliminar a possibilidade de qualquer interferência com o comportamento olfactiva. No entanto, por uma questão de simplicidade, neste artigo, a preferência ea evasão teste será ambos descritos sob o teste de percepção. Cada sessão comportamental começa com uma fase de habituação.
- Habituação Fase
- Colocar o animal na gaiola atribuído limpo e deixá-lo explorar durante 5 minutos (Figura 1B). Uma vez que o ambiente da gaiola experimental é familiar para a gaiola de origem, este curto período de tempo é suficiente para permitir a habituação.
- Se o teste de sensibilidade é concluído em um dia, realizar habituação apenas uma vez antes do application maior do odor diluído. Se o teste de sensibilidade é levada a cabo em dias diferentes, em cada dia é necessária uma fase de habituação de uma nova gaiola limpa.
- Teste de Percepção
- Depois de habituação, activar a câmara imediatamente e de pipeta 60 ul de aroma agradável (manteiga de amendoim) e 60 ul do aroma neutro (água da torneira) sobre as paredes opostas da gaiola em cerca de 10 cm a partir da parte inferior (Figura 1C).
- Deixe o rato explorar os odores durante 2 minutos (Figura 1D). Depois disso, desligue a câmera.
- Neste ponto, prosseguir com o próximo do rato a partir da fase de habituação. Realizar o teste de esquiva exactamente da mesma maneira através da aplicação de 60 ul de odor repelente (ácido 2-MB) e 60 ul de água.
- Teste de sensibilidade
- Avaliar o limiar de captação de ratos macho a concentrações crescentes de urina feminina na seguinte ordem: 1: 10.000; 1: 1000; 1: 100; 1:10 e urina puro.
- Depois de habituação, cada rato para expor a diluição mais elevada pipetados pelo experimentador como anteriormente descrito em 3.2.1.
- Grave o comportamento exploratório de urina contra água, dentro de um prazo de 2 minutos em uma câmara de vídeo. Depois de todas as coortes ratos são testados para a mais alta diluição (1: 10.000), para expor uma concentração mais elevada de urina, como indicado acima.
4. Post-hoc de Análise de Dados
Nota: Todos os testes comportamentais descritas são processadas post hoc seguindo as instruções de análise de dados.
- Abrir arquivos MOV em ImageJ para sistemas Windows
- Instale Quick Time for Java usando as configurações personalizadas de http://www.apple.com/quicktime/download.
- Instale o plugin do Quick Time do site da ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/qt-capture.html).
- Importar o QTJava.zip (C: Program Files QuickTime QTSystem) nas extens bibliotecaion de ImageJ (.ImageJ jre lib ext).
- Copie também o QTJava.zip na pasta plugins e renomeá-lo como QTJava.jar.
- Instale as seis scripts anexados na pasta Macros (ImageJ plugins Macros).
- Abrir ImageJ e compilar e executar o plugin do Quick Time, a partir daí perto ImageJ.
- Reabrir ImageJ e abra o arquivo MOV usando Arquivo> Importar> usando Quick Time.
- Ajuste de Vídeo
- Uma vez que o ficheiro de vídeo é aberto no ImageJ, cortar o vídeo a fim de obter uma constante de 2 minutos a partir do tempo de exploração do experimentador pipetados os odorantes na gaiola (T0). Identificar o quadro correspondente ao T0 e remover os quadros anteriores usando incrementos de 1 (ImageJ Imagem Stacks ToolsSlice removedor). Use o mesmo comando para excluir todos os quadros superiores a 2 min exploração.
- Certifique-se de que a gaiola é centrado e se necessário, use a Imagem> Transform> comando Girar para alinhá-lo.
- Video Processamento
Nota: O processamento de vídeo é totalmente assistida por computador e utiliza comandos macros que acompanham este papel.- A fim de diminuir a superfície para a gaiola de um 127 pixels x 218 pixels tamanho executar o Passo 1 macro do Plugin> Macros> Executar comando. Mover o rectângulo fixado sobre a gaiola (Figura 2, Passo 1).
- Cortar a área da gaiola sobre a região de interesse (ROI), utilizando o Passo 2 macro (Figura 2, Passo 2).
- Use a macro Passo 3 para extrair a imagem do rato do fundo, atribuindo um sinal de limiar, despeckling e filtrando a variação do sinal. Os valores de saída da parcela do eixo Z indicam os valores de cinzentos médios, correspondendo à intensidade da sombra rato mover-se dentro da ROI da "câmara de água" durante 2 min a exploração. Copie os resultados em uma planilha nomeada de acordo com o ROI em um arquivo de planilha (Figura 2, Passo 3).
- Use a macro Passo 4 paraextrair os valores de cinza médios do rato na ROI "câmara de odor". Copie os resultados em uma planilha nomeada de acordo com o ROI no mesmo arquivo de planilha como em 4.3.3 (Figura 2, Passo 4).
- Para restringir ainda mais a análise do movimento do mouse no ROI "perímetro água" usar o Passo 5 macro. Copie o resultado na planilha nomeada de acordo com o ROI no mesmo arquivo de planilha como em 4.3.3 (Figura 2, Passo 5).
- Para restringir a análise do movimento do mouse no ROI "perímetro odor" usar a macro Passo 6. Copie o resultado na planilha nomeada de acordo com o arquivo de ROI planilha como em 4.3.3 (Figura 2, Passo 6).
- Processar todos os vídeos e verificar a consistência do número de quadros por animais. Aqui, gravar todos os animais para 1.810 quadros correspondentes a uma sessão de exploração 2 min.
- Para cada animal e para cada ROI tipo quadros com va cinzento médiolues maior do que 0. Divide o número de quadros pelos valores correspondentes a 1 segundo e obter os segundos gastos em cada ROI.
5. Análise Estatística
- Para cada ensaio, verificar homogeneidade da variância dentro de grupos / genótipos pelo teste de Bartlett utilizando a fórmula disponível no http://www.real-statistics.com/one-way-analysis-of-variance-anova/homogeneity-variances/.
- No teste de atração e de evasão, proceder a comparações entre os tempos passados com água contra odor dentro de um grupo usando um teste t de Student não-direcional assumindo variâncias iguais ou desiguais, dependendo dos resultados de teste de Bartlett. Compare os tempos passados com os odores subtraídos pelo tempo gasto com água entre os genótipos por ANOVA one-way com teste post-hoc de Bonferroni.
- No teste de sensibilidade analisar as comparações entre o tempo gasto com o odor subtraído do tempo gasto com water entre os grupos em diluições específicas de urina por ANOVA one-way com teste post-hoc de Bonferroni. Comparar a sensibilidade entre grupos às crescentes concentrações de odor por 2-Way ANOVA com repetições com teste post-hoc de Bonferroni.
- Interação entre genótipos e tratamentos no teste de atração e evasão são investigados por 2-way ANOVA com o teste post-hoc de Bonferroni.
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Representative Results
O teste mede a percepção atração a manteiga de amendoim e evasão de ácido 2-MB. Três grupos de ratinhos são testados e o tempo gasto no "perímetro odor" são quantificadas em relação à água. No teste de preferência, o grupo controlo exibe uma significativa preferência para o odor em comparação com a água (8 t = 2,52, p <0,05). Por outro lado, o grupo B não apresenta qualquer atracção significativa para a manteiga de amendoim e gasta mais tempo com água (6 t = 3,22, p <0,05). Deste modo, comporta-se de forma diferente a partir de um grupo de controlo (1,7 M = 26,39, p <0,005). Além disso, o grupo C não mostra a discriminação e gasta aproximadamente ao mesmo tempo com água e manteiga de amendoim (8 t = 0,78, p = 0,45). No seu conjunto, os três grupos de se comportar de forma diferente (2,9 M = 19,83, p <0,005) e existe uma interacção significativa entre o genótipo e de tratamento (manteiga de amendoim e de água) (2,1 F = 4,90, p <0,005) ( Em resposta ao ácido 2-MB do grupo controlo exibe um reflexo evitação e, como resultado gasta mais tempo com água (8 t = 2,67, p <0,05). Do mesmo modo, o grupo B mostra um reflexo evitar pronunciado a 2 MB-ácido (6 t = 3,71, p <0,01). Por outro lado, o grupo C não discrimina entre os dois odores e gasta vezes comparáveis com 2-MB ácido e água (8 t = 2,2, p = 0,6) (Figura 3B). No seu conjunto, comparando a resposta de evitação os três grupos não exibem um comportamento diferente significativo (F 2, 9 = 0,76, p = 0,49) como um resultado que não há interacção entre o genótipo e de tratamento (F 1, 2 = 0,52, P = 0,63). No teste de sensibilidade olfativa para urina feminina, a curva mostra a preferência para a urina em diferentes concentrações contra água (de preferência index = tempo gasto com a urina subtraído pelo tempo gasto com água). Em thé um teste, observamos que o grupo controle A tem um limiar de atração para a urina a uma diluição de 1: 1000 e exibe crescentes atração a urina com o aumento da concentração. Grupo B e C exibem um 100 vezes superior ao limiar de atracção (1:10), em comparação com o grupo A (2,9 F = 4,78, p <0,05). Grupo B e C exibição curvas de sensibilidade comparáveis (F 1,19 = 0,36, p = 0,55). Comparando a sensibilidade entre os grupos, verifica-se que o grupo A tem maior sensibilidade à urina feminina em relação ao grupo B e C (F 2,19 = 7,12, p <0,01) (Figura 4). 
Figura 1: Representação da instalação usado para realizar os testes olfativos. (A) da câmara por cima da gaiola. (B) Os ratinhos são colocados numa gaiola durante um período de 5 minutos de habituação. (C) A odorants são pipetados na parede da gaiola. (D) A atividade exploratória de um odorante contra água é testada em um 2 min janela. 
Figura 2:.. Fluxo de trabalho de processamento de vídeo assistida por computador usando comandos de macros no ImageJ O exemplo refere-se a um rato do grupo A expostas a urina em uma diluição de 1:10 Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 3:. Os resultados representativos de testes de preferência e para evitar o olfactivos Os ratos dos três grupos (n = 5 para o grupo A, n = 4 para o grupo B e n = 5 para o grupo C) foram expostos a (a) mas amendoimTer ácido e (B) 2-MB para uma sessão de exploração 2 min. O tempo total de explorar o odor (círculos pretos), versus água (círculos a cinzento) é representado. Diferenças significativas no comportamento olfativo entre os grupos são indicados por barras horizontais pretas e asteriscos. As diferenças significativas de vezes entre o odor e água dentro de grupos sniffing são mostradas por barras horizontais cinzentas e asteriscos. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,01 (barras horizontais cinzento, teste t de Student; barra horizontal preta, one-way ANOVA). As barras de erro são erros padrão da média (SEM). 
Figura 4:. Resultados representativos de testes de sensibilidade para o aumento das concentrações de urina feminina A curva de índice de preferência, dada pelo tempo de exploração com a urina em diferentes concentrações subtraídos pelo tempo gasto com água, mostra que grupoA (n = 5) tem a maior sensibilidade para a urina em relação ao grupo B (n = 4) e C (n = 5). * P <0,05 (barras pretas horizontais, one-way ANOVA). As barras de erro são SEM.
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Discussion
Os testes propostos neste protocolo permitem avaliar diferentes aspectos do comportamento olfativo inata em camundongos: a percepção de odores, uma discriminação entre os odores contra água e sensibilidade aos odores. Este protocolo pode ser aplicado a qualquer odor de acordo com a preferência e escala evitar mostrado previamente 15. Uma vez que o protocolo baseia-se na actividade exploratória é importante que os ratinhos não exibem qualquer deficiência motora ou ansiedade que podem afectar o seu movimento e interferir com a exploração olfactiva. Os ensaios descritos destinam-se a ratos macho adulto no entanto elas podem ser adaptadas para investigar olfacto também em murganhos fêmeas adultas ou idosas.
Antes de iniciar tal estudo investigando um olfato em ratos é importante prestar atenção aos seguintes aspectos: 1) realizar cada teste com um intervalo de pelo menos 3 dias. Evitar devem ser testados com a última para minimizar a interferência da memória olfativa 20; 2) realizar o experiments ao mesmo tempo do dia, de preferência no final da tarde, quando os ratos estão em seu ciclo ativo 21 e utilizam uma fonte de luz esmaecida. Além disso, agendar o teste olfatório às vezes definidos controles para possíveis mudanças circadianas em funções olfativas 22; 3) antes de começar o teste de esquiva, que utiliza odorantes repelentes, tais como ácidos, trazer uma gaiola no tempo no conjunto experimental e manter a gaiola sob um capuz laminar. Esta etapa é importante para evitar a habituação à odorante e obter uma resposta mais homogéneo do mesmo grupo; 4) separar temporariamente os murganhos a que foram testadas até que todos os ratos de uma mesma jaula são expostos para o odorante, para minimizar a contaminação olfactivo; 5) usar animais da mesma estirpe, uma vez que diferentes cepas podem se comportar de forma heterogênea, quando expostos a um odorante 23; 6) o pesquisador deve usar um jaleco em todos os momentos e mudar luvas entre os animais para evitar a mistura de odores; 7)depois pipetando o operador deve mover-se lentamente para longe da gaiola a uma distância de 1,3 metros para evitar qualquer confusão estimulação para os ratos durante a exploração olfactivo; 8) ratos que apresentam valores de cinza médios apenas em uma câmara devem ser excluídas do estudo, uma vez que são esperados ratos para explorar ambas as câmaras em diferentes graus.
O método descrito oferece várias vantagens sobre outros protocolos: é extremamente simples de configurar, utiliza materiais de baixo custo, é de conclusão rápida e tira proveito do software de código aberto, como ImageJ. Além disso, nós fornecemos macros que estão prontos para ser instalado e que pode ser personalizado usado e adaptado para qualquer arena e mais de dois perímetros de odor. Tem de ser notado que apenas o tempo gasto no perímetro odor atribuído é uma medida da actividade olfactiva. Considerando que o tempo gasto em cada câmara dá uma leitura da actividade exploratória do rato e é apenas uma estimativa grosseira do comportamento olfactivo. Como com outros métodos, poder estatístico pode ser obtida pelo aumento do número de animais por grupo.
Em comparação com o teste olfativo usando olfatômetros, que pode controlar automaticamente a pressão de vapor e tempo de entrega 12-14, o protocolo proposto é menos controlada. No entanto, todos os odores são aplicados em volumes iguais, a uma distância definida e para a mesma janela de tempo. Assim, mantendo-se estas variáveis constantes, neste teste de um olfactómetro não é necessária. Há uma outra limitação potencial para este protocolo que consiste em o tempo necessário para o ajuste e corte de cada vídeo para obter um número fixo de quadros. No entanto, a mesma análise assistida por computador pode também ser usado em configurações mais sofisticados com portas de odor entregar o odor em momentos específicos. Neste caso, o corte de vídeo pode ser ajustado automaticamente.
Em comparação com outros protocolos utilizando almofadas de algodão impregnated com odor para testar atração e evasão, o presente protocolo fornece uma informação adicional sobre a discriminação olfativa entre uma novela odor e um odor neutro (água) 15,16 em uma única sessão experimental. Além disso, o protocolo não necessita de mascaramento e experimental pode ser inteiramente realizado por um único experimentador usando a análise assistida por computador imparcial.
Estes testes simples pode ser utilizado para monitorizar a progressão de défices neuronais em modelos de rato de doença de Alzheimer ou de Parkinson e para investigar os mecanismos de transmissão olfactiva.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse cage | Italplast (Italy) | 1144B | 36 cm length x 20.5 cm width x 13.5 cm height |
| Chipped wood bedding | Abedd (Austria) | LTE E-001 | 3 cm high |
| Peanut butter | Migros (Switzerland) | NA | 1:10 |
| 2-Methylbutyric | Sigma Aldrich (Switzerland) | W269514 | Pure |
| Female urine from fertile females of same mouse strain | NA | NA | Dilution series |
| Camera | Olympus (US) | Camedia C-8080 | MOV files |
| Quicktime for Java (Windows) | Apple (USA) | NA | video plugin for visualizing MOV files |
| ImageJ for Windows | NIH (USA) | NA | Video Processing/Analysis |
References
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